（农产品加工及贮藏工程专业论文）虾仁的超高压杀菌工艺研究.pdf

虾仁的超高压杀菌工艺研究 摘要 虾仁是一种常见的水产品，本文以小龙虾仁为研究对象，研究虾仁的超高 压杀菌工艺以及超高压对虾仁的质构影响。 ( 1 ) 利用国标的检测方法，初步分析了小龙虾仁中所感染的微生物种类。 并采用v i t e k 3 2 自动化微生物分析仪对小龙虾加压前后所残留菌种进行鉴定， 证明了在超高压杀菌中革兰氏阳性细菌耐压性强于革兰氏阴性细菌。 ( 2 ) 超高压杀菌工艺条件优化证明，在对超高压杀菌效果影响的三个因 素中，主次顺序为：压力 协同温度 保压时间。重点考察茵落总数和金黄色 葡萄球菌两个指标，最适的工艺条件为压力3 2 0 m p a ，温度3 8 ，保压时间9 r a i n 。 此工艺条件下的菌落总数8 7 0 c f u g ，金黄色葡萄球菌3 0 c f u g ，大肠菌群数 s y n e r g e t i ct e m p e r a t u r e d w e l lt i m e b a s e do nt h em i c r o f l o r aa n ds t a p h y l o c o c c u s a u r e u s t h eb e s te c o n o m i c a lp a r a m e t e ro fs t e r i l i z a t i o nt e c h n o l o g yw a st h a t ：3 2 0 m p a o fp r e s s u r e ，3 8 co fs y n e r g e t i ct e m p e r a t u r e ，9 m i no fd w e l lt i m e t h er e s u l to ft a x t p l u sd e t e c t i o ns h o w e dt h a tt h eu h ph a dt h ee f f e c t 7o i lt h e t e x t u r eo fs h e l l e df r e s hc r a y f i s hs u c ha sf i r m n e s sa n ds h e a rf o r c e t h eo fm u s c l e f i b r eb yt e ms h o w e dt h a td a m a g eo ft h em u s c l ef i b r eb yu h pl e a dt ot h ec h a n g eo f s h e l l e df r e s hc r a y f i s h st e x t u r e a n dm i c r o s t r u c t u r eo fm y e l i n a t e dn e r v ef i b e rw a s b r e a c h e db yu h p - k e y w o r d s ：u h p ；s h e l l e df r e s hc r a y f i s h ；s t e r i l i z a t i o n ；t e x t u r e ；m i c r o s t r u c t u r e n 表格清单 表l 一1龙虾肉中氨基酸的含量2 表4 1小龙虾仁中常规微生物检测结果1 8 表4 2小龙虾仁中存活菌的种类和相对量1 9 表4 3小龙虾仁高压杀菌后耐压存活菌的种类和相对量2 0 表4 4 压力对超高压杀菌效果的影响2 1 表4 5保压时间对超高压杀菌效果的影响2 4 表4 6 温度对超高压杀菌效果的影响2 7 表4 7因素水平表2 9 表4 8 正交试验方案及结果2 9 表4 9菌落总数的正交试验方案及结果3 0 表4 1 0 菌落总数的正交试验结果的极差分析表。3 0 表4 1 1 金黄色葡萄球菌的正交试验方案及结果3 1 表4 1 2 金黄色葡萄球菌的正交试验结果的极差分析表3 1 表4 1 3 压力对小龙虾仁韧度的影响3 3 表4 1 4 压力对小龙虾仁剪切力的影响3 5 v i 插图清单 图4 1压力对菌落总数的影响2 2 图4 2 压力对大肠菌群的影响2 2 图4 3压力对霉菌和酵母菌的影响2 3 图4 4 压力对金黄色葡萄球菌的影响2 4 图4 5保压时间对菌落总数的影响2 5 图4 6 保压时间对大肠菌群的影响2 5 图4 7 保压时间对霉菌和酵母菌的影响2 6 图4 8 保压时间对金黄色葡萄球菌的影响2 7 图4 9 温度对菌落总数的影响2 7 图4 1 0 温度对金黄色葡萄球菌的影响2 8 图4 1 1 小龙虾仁的韧度曲线3 4 图4 1 25 0 0 m p a 处理后的小龙虾仁的韧度曲线3 4 图4 1 3 压力对小龙虾仁韧度的影响3 5 图4 1 4 小龙虾仁的剪切力曲线3 6 图4 1 55 0 0 m p a 超高压处理后的小龙虾仁剪切力曲线3 6 图4 1 6 压力对小龙虾仁剪切力的影响3 7 图4 1 7 小龙虾仁的显微结构图3 8 图4 1 8 小龙虾仁的髓鞘结构图3 9 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得金壁王些盔堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：7 譬诳签字日期：未啼( 月 日 i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金目b 王些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金目b 王些盘 ! l 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。 两 间 、j 电话： 邮编： 致谢 我有幸在研究生三年期间受到两位导师潘见教授和曾庆梅教授的悉心指 导，并在指导下完成论文。从论文的选题、试验方案的制定到论文的成稿都凝 聚着曾老师的心血。曾老师渊博的学识，严谨科研作风和对事业孜孜以求的精 神，使我受益菲浅，是我终生学习的榜样! 潘老师严谨的治学态度、广博的专 业内外知识和高尚正直的品德使我在做人和做事方面不断得到启发。两位老师 在生活上和精神上给予我的鼓励和帮助更让我铭记在心，在此我衷心的向潘老 师和曾老师表示我最崇高的敬意和感激! 在三年的研究生学习生活中，谢慧明老师、袁传勋老师、张文成老师、王 武老师、黄训端老师、杨毅老师等也同样给予我很多的关怀和指导，还有王海 翔、徐迪、胡斌、张冬冬、韩抒等同学以及学院其他老师在试验实施过程中也 给予了大力支持，感谢王国霞老师三年来在生活上的照顾。借此机会向他们表 示忠心的感谢! 感谢安徽出入境检验检疫局徐惹群老师和张萍老师在微生物鉴定方面给 与的细致的指导和帮助。感谢安徽省立医院的胡闻老师在电镜操作和分析方面 给与的指导。 感谢我的室友程璐和张慧民陪伴我度过三年的美好时光。 最后，我更要感谢我的家人和朋友，他们给了我莫大的支持和鼓励l 作者：殷允旭 1 1 小龙虾简介 1 1 1小龙虾的分类 第一章前言 小龙虾学名克氏螯虾【l l ( p r a c a m b a r u sc l a r k i i ) ，与龙虾、大螯虾、蟹、河 虾及对虾一起属于甲壳纲动物，隶属于节肢动物门，甲壳纲，十足目，螯虾科， 原螯虾属，也称克氏原螯虾，通常又称为淡水小龙虾。其头胸部较大，头呈只 角形，第2 对步足粗壮里蟹螯形，所以又被称为“蟹虾”。螯钳强有力，形状短 而粗，其全身紫红，所以俗称红螯虾或红色沼泽螯。小龙虾体型粗壮【甜，成虾 体长7 0 1 3 0m m ( 1 i 1 至尾扇距离) ，甲壳厚，呈深红色，虾体分头胸和腹2 部分。 头部有5 对附肢，前2 对为发达的触角。胸部有8 对附：前3 对为愕足，与头 部的后3 对附肢形成口器；后5 对为步足，具爬行和捕食功能；前3 对步足呈 钳状，以第1 对特别发达，用来御敌；后2 对步足呈爪状腹部较短，有6 对 附肢：前5 对为游泳足，不发达；最后1 对为尾肢，与尾节合成发达的尾扇。 同龄的雌虾比雄虾个体大【3 】。雄虾第2 腹足内侧有1 对细棒状带刺的雄性附肢， 雌虾则无此对附肢，这也是识别克氏螯虾雌雄的主要特征之丁。此外，性成熟 的雄性螯足粗大，螯足两端外侧有一明亮的红色软疣，雌虾螯足相对较小，大 部分雌虾在赘足上没有红色软疣，即使有，颜色也偏淡。成虾个体较大，雌虾 体长( 眼至尾扇距离) 可达1 6 5c m ，体重5 0 ，7 0g ；雄虾体长1 0c m 左右，体重约 5 0g 【4 1 。， 据j a yvh u n c r 报道【5 】，全世界淡水螯虾的总产量为l 1 0 0 0 0 t ，其中美国占 5 5 ，中国占3 6 欧洲占8 ，澳大利亚占不到2 ，小龙虾占整个螯虾产量 的7 0 8 0 。 小龙虾原产于北美洲，是美国淡水虾类养殖的重要品种。1 9 1 8 年，日本从 美国引进小龙虾作为饲养牛蛙的饵料，小龙虾在日本得到大面积的繁衍和扩散。 二战期间，小龙虾从日本传入我国，开始在江苏省南京市以及郊县繁衍，经过 长时间的扩展，种群数量不断增加，生存空间不断扩展，现在，已经成为我国 淡水虾类中的重要资源，广泛分布于江苏、湖北、江西、安徽等长江中下游地 区，生长在江、河、湖泊等水体中，数量在6 万吨以上。2 0 0 2 年出版的淡水 虾类养殖技术一书中记录【“，世界各国养殖和加工小龙虾已经有超过百年的 历史。苏联早在2 0 世纪初就开始了淡水螯虾的养殖，对大湖泊实施虾苗人工放 流，1 9 6 0 年工厂化育苗实验成功。澳大利亚是近2 0 年来淡水螯虾养殖发展最 快的国家，目前年产量在5 0 0 0 吨以上。美国是淡水螯虾养殖最有成效的国家【7 1 ， 1 9 8 5 年到1 9 8 6 年，螯虾产量达到2 7 万吨，除了食用外，主要用于钓鱼饵料。 据资料显示【8 l ，在美国年消费淡水小龙虾6 万8 万吨，7 0 需要进口。在欧 洲，年消费淡水小龙虾也超过6 万吨，其中8 0 需要进口。 1 1 2小龙虾的营养价值 小龙虾味道鲜美【叭，是一种低脂肪、低胆固酵、高蛋白的营养食品。特别 是占其体质量5 左右的肝胰脏( 俗称虾黄) ，则更是营养丰富。虾黄具有独特 的蟹黄味i l o l ，含有丰富的不饱和脂肪酸、蛋白质、游离氨基酸和微量元素。且 含有丰富的硒，v a 和v c 以及和等。 小龙虾蛋白质含量【n j 高于大多数的淡水和海水鱼虾。每1 0 0 9 龙虾肉中， 含水分8 2 蛋白质5 8 5 ，脂肪6 ，几丁质2 1 ，灰分1 6 8 ，矿物质6 6 。 其氨基酸组成优于普通的肉类，如表1 1 【9 l 所示。特别是含有人体所必需的，而 体内又不能合成或合成量不足的8 种必需氨基酸。包括异亮氨酸、色氨酸、赖 氨酸、苯丙氨酸、撷氨酸和苏氨酸。而且还含有脊椎动物体内含量很少的精氨 酸。此外龙虾还含有幼儿所必需的组氨酸。1 8 种氨基酸种胱氨酸含量最低为 2 4 5 0 m g k g ；苯丙氨酸含量最高为8 3 5 0 0 m g k g 。 表1 1 龙虾肉中氨基酸的含量 ! 垒垒! ! ! = ! 2 翌! 竺翌12 1 璺堕i 碧2 苎! 璺i 坚坠! ! ! 竺璺! ! 兰! 垒兰! 璺z ! i ! 坠 氨基酸种类 召 i l m g k g 1 氨基酸种类 含量，m g k g 1 小龙虾的脂肪含量f 1 2 1 不但比畜禽肉低得多，比青虾、对虾还低许多，而且 其脂肪大多是由人体所必需的不饱和脂肪酸组成，易被人体消化和吸收，并且 2 具有防止胆固醇在体内蓄积的作用。 小龙虾与其他水产品一样，含有人体所必需的矿物成分。其中含量较多的 有钙、钠、钾和磷。含量比较重要的有铁、硫和铜等。龙虾中矿物质总量约为 1 6 ，其中钙、磷、钠及铁的含量都比一般畜禽肉高，也比对虾高。因此，经 常食用龙虾肉可保持神经和肌肉的兴奋性。 小龙虾是脂溶性维生素的重要来源之一，龙虾富含v a 、v c 和v d ，而且 大大超过陆生动物的含量。 1 1 3小龙虾仁制品的生产现状 1 9 8 8 年【”l ，江苏省大丰县冷冻加工厂在原盐城商检局的帮助下，捕捉淡水 小龙虾研制加工熟产品试销欧美市场，当年出口2 1 吨，从此拉开了我国出口淡 水小龙虾行业兴起的序幕。随着淡水龙虾产品在欧美市场受到欢迎，国内的淡 水小龙虾原料捕捉、经销商、加工商、外贸经营商如雨后春笋，很快形成捕捉、 收购、加工、对外销售和生物化工一条龙的出口淡水龙虾经济行业。并从江苏 逐步蔓延至以长江流域为主的多个省、市和地区。 我国盛产各类虾产品，是虾仁出口的大国之一【1 4 l ，安徽省则是中国淡水小 龙虾资源、虾仁产出和出口大省，年产小龙虾达到1 0 万吨，居全国之首。2 0 0 3 年仅经由安徽检验检疫局检验出口欧美淡水小龙虾及其制品就达3 2 0 0 余吨，创 汇1 3 0 0 余万美元。此外，河南、江苏、江西、浙江和湖北等富水域的省份，每 年的虾源资源都达数万吨。 但是过去的十几年，出口淡水龙虾产品质量问题可以说年年都有【1 5 】，引发 了一系列的外贸质量纠纷事件和政府间的贸易摩擦，如美国f d a 的“黑名单”、 欧盟的全面禁运、入关时扩大抽样检查。焦点【1 6 l 集中在品质差、包装低劣和金 黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、李斯特杆菌、沙门氏菌、刨伤弧菌、 溶藻弧菌等细菌卫生指标问题。 1 1 4 小龙虾制品的杀菌工艺进展 目前的常见的杀菌方法有很多种，大致如下。 ( 1 ) h a c c p 在虾仁杀菌中的应用 速冻小龙虾仁一般生产工艺为【1 7 】：原料验收一清洗虾一蒸煮一冷却一剥虾 壳一去头一去肠腺一分级一称重一真空封装一速冻一装箱一金属探测一冷藏贮 存。其中【1 8 】，冷却水，工作人员手部，盛放虾肉的容器，车间空气细菌污染较 高，冷却时的冷去温度和冷却时间是很关键的因素 1 9 l ，过长的冷却时间是微生 物超标的重要因素。通过关键点控制，可以达到卫生要求。 3 ( 2 ) 热杀菌在虾仁杀菌中的应用 余晓蜂等1 2 0 1 研究表明，克氏螯虾作为商品冷冻贮藏，可采用巴氏法消毒， 温度8 0 ( 2 ，处理时间2 0 r a i n ，这样既达到食品微生物卫生标准，又接近原料的 感官品质，保持商品价值。 在小龙虾仁的生产工艺中有个关键的蒸煮步骤【2 1 1 ，能杀灭大部分微生物 2 2 , 2 3 l ，但过长的蒸煮时间会造成能源浪费、影响虾仁弹性【2 4 1 。 ( 3 ) 辐照在虾仁杀菌中的应用 刘言宁等研究表明1 2 ，对熟制对虾虾仁食品低剂量辐照试验结果表明，低剂 量辐照足以杀灭高污染的腐败菌、致病菌。丁增成等【2 5 1 研究了一般有效剂量控 制在1 5k g y 即可使杂菌总数控制在1 万个g 以下。在o 一1 0k g y 处理剂量下， 辐照对蛋白质无明显影响，并延长了保鲜期。崔登来等【2 6 1 研究表明电子束处理 提高了冻虾仁的产品质量，使其完全符合海虾卫生标准的要求。辐照对于延长产 品的货架期效果明显，但会引起产品一系列理化性质的变化【2 7 1 ，主要表现为会在 一定程度上引起产品中的营养物质，风味物质，质构和色泽等发生变化。其中 维生素a 和e 随辐照剂量的提高而下降迅速。 ( 4 ) 其它保鲜方式 孙爱东1 2 s 等将臭氧技术运用在小龙虾生产工艺上，不仅可以起到杀菌作 用，而且对农残、氯霉素都具有较好的降解效果。何耀辉等f 2 9 】将气调包装技术 ( m o d i f i e da t m o s p h e r ep a c k a g i n g ) 用于草虾保鲜研究，证明其可以延长保存期。 罗水忠等【3 0 l 将乳酸链球菌素用于虾肉糜的保鲜，结果证明将乳酸链球菌素与山 梨酸钾联合使用，保鲜效果明显。 在这些方法中，h a c c p 在目前的工厂生产规模不大的情况下很难适用； 热加工的高耗能、破坏营养成分和口感；欧盟和美国日本对辐照食品有着严格 的限制；其它方式应用范围不广。 近来，超高压技术被引入到水产品加工中来1 3 1 1 ，开辟了一个龙虾杀菌的新 途径。 1 2 超高压杀菌技术 食品超高压杀菌技术( u l t r ah i g hp r e s s u r ep r o c e s s i n g ，u h p ) 简称高压技术 或静水压技术( h i g hh y d r o s t a t i cp r e s s u r e ) 。超高压技术【3 2 】是指利用i o o m p a 以 上压力，在常温或较低温度下，使食品中的酶、蛋白质、核糖核酸和淀粉等生 物大分子改变活性、变性或糊化，同时杀死微生物达到杀菌保鲜，而食品的天 4 然味道、风味和营养价值不受或很少受影响、低能耗、高效率、无毒素产生的 一种加工方法。超高压加工食品的原理【3 3 】为在高压下食品中的小分子之间的距 离将缩小，而蛋自质等大分子团组成的物质还仍保持现状。这时水分子等小分 子就要产生渗透和填充效果，进入并黏附在蛋白质等大分子团内的氨基酸周围， 使蛋白质等的大分子链在压力的效果下降为常压后被拉长，而导致其部分立体 结构被破坏。这样便改变了蛋白质的性质，使其变性以达到杀菌的效果。 1 2 1 超高压杀菌的优点 除了食品杀菌保藏外，超高压技术也可用于生产新的组织结构的食品，改 善食品的品质，形成特色的超高压食品。到目前为止，几乎所有的研究都表明。 超高压食品克服了传统热处理的很多不足，而具有独特的优点，主要表现在 ( 1 ) 超高压处理只作用于非共价键【3 ”，而保证共价键完好无损，不会使 维生素、色素、香气成分等低分子物质发生变化f 3 5 】及产生异臭物等，加压后的 食品仍能保持原有的生鲜风味和营养成分【3 6 】； ( 2 ) 超高压处理后，蛋自质的变性状态【3 7 】及淀粉的糊化状态【3 8 j 与加热处 理也有所不同，可以期待具有新物性的食品【3 9 】； ( 3 ) 高压加工可以同热加工组合【4 0 】，使食品加工多样化，能开发出未来 新型食品及食品加工工艺【4 1 】； ( 4 ) 高压处理是液体介质短时间内等同压缩过程1 4 引，从而实现杀菌的均 匀、瞬时、高效性、且跟加热法比较能耗要低很多。 1 2 2 超高压杀菌进展 超高压处理食品的研究起源于1 9 1 4 年，美国物理学家p w b r i a g m a n 4 3 】提 出了在静水压下蛋白质变性、凝固的报告。但由于高压技术上的难题，这一研 究成果没有被实际应用。1 9 8 6 年日本京都大学的林力丸教授1 4 4 】率先开展了高压 食品的试验，引起了日本工业界的浓厚兴趣。到1 9 9 1 年4 月日本开始试售第 一种高压食品一果酱，在日本引起了轰动，被称为二十一世纪的食品。这一技 术引起世界各国的关注，德、美、英、法等国进行了许多研究，取得了不少成 果。目前在美国、日本及西欧的超市货架上可以看到很多超高压处理食品出售 且价格不菲。 近几年来国内少数学者和科研单位开始重视超高压技术在食品加工上的应 用研究。目前大部分报道处于介绍国外超高压技术在食品加工中的研究成果或 介绍设想，进行实用性试验研究，特别是产业化应用研究还没有。 国内的吉林工业大学f 4 甜、杭州商学院f 4 引、兵器工业第五十二研究所1 4 7 】， 华南理工大学等【4 8 j 在地方政府的资助下先后成立了课题组，开展过应用基础研 5 究，如高压引起的玉米淀粉糊化、黄酒催陈、蛋白质变性等方面。但国产超高 压食品仍为空白。合肥工业大学早在1 9 9 4 年就与东京大学合作开展食品超高压 浸渍、超高压解冻技术 4 9 】研究，取得可喜进展，在国内同行中，属起步较早单 位。2 0 0 2 年又完成了国家发展计划委员会“西瓜汁加工关键技术前期研究”重大 产业化专项课题i 如】，开发的果蔬汁超高压动态杀菌技术达到国际先进水平，建 成了国内最大的“3 0 l 6 0 0 m p a ”食品超高压处理装置【5 1 j ，为我国食品超高压处理 产业化技术研究和实施奠定了理论和工程基础。 与国外相比，国内在超高压食品加工技术方面存在的差距主要表现为：由 于每种食品的超高压杀菌特性各异，到目前为止，超高压杀菌试验研究的食物 种类不多，实现工业化需要的超高压杀菌工艺技术基础数据掌握不够。应用技 术研究与设备开发研制两方面的结合不够紧密。高等院校或科研院所缺少设备 开发资金与手段，设备制造厂家缺乏工艺技术，难以开发具有应用前景的工业 化装置。此外，超高压杀菌机理有待进一步研究深入。 加强超高压杀菌保鲜技术研究，促进其在食品加工工业中的应用，加速试 验室研究成果向产业化转变，填补国内超高压食品领域的空白，缩小与国际水 平的差别是当务之急。 1 2 3 超高压处理的影响因素 ( 1 ) 压力大小和加压时间 在定范围内，压力越高，杀菌效果越好【52 1 。在相同压力下，杀菌时间延 长，杀菌效果也有一定程度的提高。但应用中，压力和加压时间有一定的上限， 所以有必要进一步研究微生物的耐压性。有人研究了高压对鲜牛奶中细菌行为 的影响，鲜牛奶中细菌菌落尺寸取决于处理压力的高低以及保压时间的长短。 保压时间越长，处理压力越高，细菌菌落直径越小。 ( 2 ) 温度 受压时的温度对杀菌效果有明显影响f 5 3 1 ，沙门菌在2 0 、2 0 0m p a 的压力 下仍有少量存活，当温度为2 0 时，在相同压力下可全部杀灭。2 8 0m p a 压力 和2 0 温度下的杀菌效果与2 3 0m p a 、4 0 或1 5 0m p a 、5 0 下的杀菌效果相 同。因此，采用单纯加压方式处理不是一个有效的途径，采用温度和压力共同 处理则会产生协同增效的作用。 ( 3 ) p h 值 每一种微生物生长繁殖所适应的p h 值都有一定的范围，因此，p h 值是影 响微生物在受压条件下生存的主要因素之一【5 4 】。p h 值的影响在常温加压时不 明显，而在低温加压时明显。低p h 值和高p h 值环境都有助于杀死微生物。 ( 4 ) 食品成分和添加物 k 6 a y a m a l 5 5 】等用大肠杆菌菌悬液做超高压实验，发现当基质中有5 0 的豆 油或猪油时，4 0 0m p a 杀菌分别需1 5r a i n 或1 0m i n ；当菌种置于油雍蛋白质形 成的乳浊液中，加压时间则要延长至3 0r a i n 。刘成梅等的实验表明，添加在某 些食品( 介质) 中的大肠杆菌比添加在蒸馏水的大肠杆菌存活机率更大一些。 ( 5 ) 加压装置及施压方式 直接加压和间接加压杀菌效果的差异，因加压方法、加温方法和压力容器 的类型不同而不同，这些影响是由升压时温度变化幅度不同引起的。 ( 6 ) 水分活度k 水分活度对杀菌效果影响很大。阮征等【5 6 l 的实验是用蔗糖等调节水分活 度，结果表明，水分活度低于0 9 4 时，室温下4 0 0m p a 处理红酵母1 5m i n 所 产生的致死作用会受到抑制。3 0 。c ，水分活度为0 9 6 时，4 0 0 m p a ，1 5 r a i n 的处 理可使酵母细胞减少1 个数量级；当水分活度减至0 9 4 ，酵母失活不足两个数 量级；当水分活度低于0 9 1 ，几乎没有失活现象。研究表明，水分活度大小对 微生物抵抗压力非常关键，对于同体与半固体食品的超高压杀菌，考虑水分活 度的大小十分重要。 1 3 课题来源和意义 本课题来源于2 0 0 5 年国家质量监督检验检疫总局科技项目虾仁超高压杀 菌保鲜关键技术研究。( 项目编号：2 0 0 5 i k 0 2 6 ) 1 3 1课题主要研究内容 ( 1 ) 运用v i t e k 系列全自动微生物分析系统检测小龙虾仁中常见的的感 染菌种，并针对性地提出超高压杀菌方案； ( 2 ) 中温协同超高压处理小龙虾仁，使其达到商业无菌要求，研究最经济 的高压处理工艺。 ( 3 ) 研究超高压处理对小龙虾仁的质构和感官影响，并从微观角度分析造 成这种变化的原因。 1 3 2 本课题的意义 本项目以虾仁保鲜加工为目标，充分利用国内虾仁资源丰富，生产高技术 含量和高经济效益的出口虾仁，实现由低档产品加工向高档产品加工的转交， 可提高水产品加工业的经济效益与水产资源的利用率，促进农业经济的快速发 展。项目建设符合国家科技产业政策和发展规划。 本项目实施，可以充分利用优势资源，促进外向型农业经济发展、优化产 业结构 我国盛产各类虾产品，是虾仁出口的大国之一，安徽省则是中国淡水小龙 7 虾资源、虾仁产出和出口大省，年产小龙虾达到1 0 万吨，居全国之首。2 0 0 3 年仅经由安徽检验检疫局检验出口欧美淡水小龙虾及其制品就达3 2 0 0 余吨，创 汇1 3 0 0 余万美元。但是虾仁杀菌保鲜一直困扰出口加工企业的难题。 利用被称为食品工程界列为“2 1 世纪走向实用化的十大尖端技术”超高压 食品保鲜技术来加工处理出口虾仁，实现虾仁的无害和绿色保鲜加工，可以跨 国欧美国家的“绿色门槛”和“绿色壁垒”。保障虾仁实现卫生无障碍通关。不仅 可以保障虾仁等水产品出口持续稳定的增长。继而保证淡水下龙虾的养殖业的 兴旺，使数十万农渔户受益，扶持农民以农致富，振兴乡镇企业和农村工业， 壮大农业经济，充分发掘合理利用农业资源，建设高效农业，进而带动整个农 村经济的发展。 本项目属绿色安全加工技术，是水产品保鲜加工可靠最优前途的替代技术 由于众所周知的原因，我国出口水产品的杀菌保鲜存在极大的隐形问题， 亟须找到可按受的绿色安全加工处理技术，否则一旦遭到起诉不仅将大多数水 产品出口市场丢失，而且将面临巨大的经济赔偿，将对我国水产品业、农渔民 和相关生产出口企业毁灭性的打击。本项目在国家计委高技术重大关键性技术 攻关等研究成果的基础上，研究虾仁超高压杀菌保鲜技术，有利于虾仁加工和 水产业的持续稳定发展。对提高科技持续创新能力，推进科技成果的产业化， 提升科技对经济的贡献率具有现实意义。 综上所述，本项目可推动科教兴国战略的贯彻落实，形成示范工程，加速 推广高新技术成果产业化，发挥科技先导与推动作用，促进工业结构调整与产 业升级。本项目的实施，将形成安徽省工业高技术标志性产业化工程，填补超 高压食品在国内的空白史，实现虾仁保鲜加工技术跨越式发展，促进农产品的 高效利用并向高附加值转化，增加农民收入，提高农业规模经济效益。 8 2 1 超高压杀菌原理 第二章理论分析 由于超高压能破坏蛋白质二硫键和离子键的结合p ”，而且微生物的基本物 性和形态也发生多方面的变化，包括细胞外形变长、细胞壁脱离细胞质膜、无 膜结构细胞壁变厚。在压力作用下，细胞膜双层结构的容积随着每一磷脂分子 横切面积的缩小而收缩。超高压还能使菌体内的成分产生泄漏和细胞膜破裂等 多种菌体损伤【58 1 。加压的细胞膜常常表现出通透性的变化，压力引起的细胞膜 功能劣化将导致氨基酸摄取受抑制。故由于在超高压下蛋白质的变性，致使微 生物内部组织被破坏而失活，所以超高压在常温下具有微生物灭活的作用。 2 2v i t e k 系列全自动微生物分析系统原理 v i t e k 系列全自动微生物分析系统1 5 9 】是法国生物梅里埃( b i o s m e r i e u m x ) 生产的全自动微生物分析仪的一个系列，包括：v l t e k 一3 2 、v i t e k - - 6 0 、v i t e k 一1 2 0 、v i t e k 一4 8 0 等。 v i t e k 自动化微生物分析仪由充填机封口机、读取器恒温器、电脑主机 及打印机组成，充填机封口机三分钟内把样本注入试验卡中及封口；读取器 恒温箱自动恒定培养温度并同时读取卡内生化反应变化，电脑主机负责分析资 料的储存、系统的操作及分析程式的运作。 真空充液泵三分钟内把样本注入试验卡中；读数器恒温箱可同时容纳3 2 个反应卡，自动恒定培养温度3 5 5 c ，每小时读取每张卡内反应变化数值；电 脑主机负责分析资料的储存、系统的操作及分析程式的运作。分析仪自动进行 细菌生化鉴定，v i t e k 试卡的反应池内含各种风干生化反应底物或抗菌药物， 试卡由标准浓度菌液填充，然后放入测试架槽内，采用比色法比浊法，应用动 态学方法原理，读数器每小时光扫描测试卡，以获取卡片内样本在培养介质内 生长变化值，自动检测每张卡片的反应情况，与数据库中的数据进行比较分析， 达到系统预设的阈值时，自动报告检测结果。 2 3t a x tp l u s 质构仪检测原理 2 3 1物性分析仪的测定原理 德国人在1 8 6 1 年设计出世界上第一台食品品质特性测定仪，用来测定胶状 物的稳定程度。s z c z e n i a k 等 6 0 1 1 9 6 3 年确定了综合描述食品物性的质构曲线 9 解析法( t p a ) 。现多使用英国s t a b l em i c r os y s t e m si n c 生产的t a x t 系列物性 分析仪。 物性分析仪主要包括主机、专用软件、备用探头及附件。其基本结构一般 是由一个能对样品产生变形作用的机械装置，一个用于盛装样品的容器和一个 对力、时间和变形率进行记录的记录系统组成。测试围绕着距离( d i s t a n c e ) 、 时间( t i m e ) 、作用力( f o r c e ) 三者进行测试和结果分析，也就是说，物性分析 仪所反映的主要是与力学特性有关的食品质地特性，其结果具有较高的灵敏性 与客观性，并可通过配备的专用软件对结果进行准确的数量化处理，以量化的 指标来客观全面地评价食品，从而避免了人为因素对食品品质评价结果的主观 影响。 2 3 2常用的质构测定探头 ( 1 ) 圆柱形探头 用来对凝胶体、果胶、乳酸酪和人造奶油等作钻孔和穿透力测试以获得关 于其坚硬度、坚固度和屈服点的数据。钻孔测试可用来测压缩力和剪切力。 ( 2 ) 圆锥形探头 作为圆锥透度计，测试奶酪、人造奶油等具有塑性的样本，测得的结果 比流变学方法精确。 ( 3 ) 压榨板 用来测试诸如面包、水果、奶酪和鱼之类形状稳定不流动的产品。可直接 测或切成块测。压榨测试要求被测样本面积小于压榨板，可测量压缩恢复、 断裂方式和兼具粘着性和伸缩性的材料的蠕变特性。 ( 4 ) 球形探头 用于测量薄脆的片状食物的断裂性质。还可用于锯齿测试，测量水果、 奶酪和包裹着的材料的表面坚硬度。 ( 5 ) 咀嚼式探头 模仿门牙咬穿食物动作的模拟测试。可以测试肉类样本的韧度和柔软度， 还可以测生的和熟的蔬菜纤维。 2 3 3物性分析仪在水产品中的应用 随着人们生活水平的提高，越来越多的水产加工食品受到了欢迎，从而 对水产品的质构认识也越来越受到重视。 s s l g u r g i s l a d o t t i r 等【6 1 使用柱型和球型探头来测定新鲜的大马哈鱼片的 硬度，用刀型探头来测定剪切力，得出从鱼头到尾部硬度和剪切力均呈增加的 趋势，并且在鱼身中部位置更加可信，剪切力的方法比前两种按压方法更加 适用于实际操作。 1 0 j o no l a yv e l a n d 等【6 2 】使用物性分析仪对新鲜大马哈鱼和冰冻2 4 d 的鱼进 行了测试，得出鱼片的厚度在测试中起着重要的作用。并且进一步对喂食和饥 饿两周后杀的鱼进行了测试，发现在最初切碎储存的2 d 内，喂食的鱼比饥饿的 鱼的硬度下降得快。 c a l a s a l v a r 6 3 使用2 0 r a m 直径的柱型探头进行质构测定。同样厚度的鱼 片，从头到尾的硬度逐渐降低。在储存过程中，随着时间的延长，相同部位的 鱼片的硬度逐渐降低。使用物性分析仪测定与感官和化学的结果有良好的一致 性。 k a n g s u p a n i c h 等人【6 4 将鳕鱼分别在0 、2 0 0 、4 0 0 、6 0 0 、8 0 0 m p a 下处理 后，用3 8 r a m 直径的柱型探头对硬度、弹性、粘附性、黏性、粘着性和咀嚼性 进行了测定，得出在o - 2 0 0 m p a 下粘附性、黏性、粘着性增加，在2 0 0 4 0 0 m p a 下硬度、粘附性、黏性和咀嚼性增加，在4 0 0 8 0 0 m p a 下硬度和粘附性下降。 t m o r k o r e n 和o e i n e n 6 5 使用物性分析仪对熏鱼和熏鱼用鱼的鱼片进行 了分析，并与感官评的结果做了比较。发现对熏鱼感官硬度评定的结果与用仪 器测定的熏鱼用鱼的数据有高度的相关性。并且使用平头1 2 5 2 3 m m 探头要比 使用咀嚼式探头和球形探头的效果要好。 1 1 第三章材料与方法 3 1 试验材料、试剂与主要设备 3 1 1试验原料 小龙虾仁，由安徽出入境检验检疫局提供，于0 6 年8 月产自安徽寿县，存 放于一1 8 c 下，使用前解冻。 p v c 薄膜，购于合肥城隍庙市场。使用前剪成1 0 x 1 5 c m 大小，在紫外灯下 照射2 0 m i n 。 3 1 2 试验主要试剂 使用的主要试剂见下表： 试剂 营养琼脂培养基 虎红营养琼脂培养基 乳糖胆盐发酵培养基 b a i r d - - p a r k e r 培养基 伊红美蓝琼脂平板 革兰氏染色液 血平板 兔血浆 无菌生理盐水 3 1 3 试验仪器设备 生产单位 江苏宜兴永信生物有限公司 江苏宜兴永信生物有限公司 江苏宜兴永信生物有限公司 江苏宣兴永信生物有限公司 江苏宜兴永信生物有限公司 自制 安徽出入境检验检疫局 安徽出入境检验检疫局 自制 超高压设备：容积1 l 、压力0 6 0 0 m p a 、可调温度室温6 0 。c ， 内蒙古 包头5 2 所。 v i t e k 3 2 微生物种属的鉴别仪：法国生物梅里埃( b i o sm e r i e u m x ) ，安徽 省出入境检验检疫局； 透射电子显微镜：j e m 一1 2 3 0 e x ( 日本电子株式会社) ； 光学显微镜：日本奥林巴斯； t a x tp l u s 质构仪：英国s t a b l em i c r os y s t e m si n c ； d z 一4 0 0 2 s 型多功能薄膜封口机：浙江金华市包装机械厂。 3 2 加压前后小龙虾仁中微生物检测 3 2 1小龙虾仁的常规菌种检测 按照国家标准的检测方法，对以下菌种进行检测： 菌落总数 g b 4 7 8 9 2 2 0 0 3 霉菌和酵母菌 金黄色葡萄球菌 出口小龙虾仁微生物指标： 菌落总数： 大肠菌群数： 金黄色葡萄球菌： 霉菌和酵母菌： 3 2 2 小龙虾仁的v i t e k 3 2 检测 1 0 0 0 0c f u g 5 0m p n 1 0 0 9 5 0c f u g 5 0c f u g 3 2 2 1 小龙虾仁中的菌种检测与纯化 按照g b 4 7 8 9 2 2 0 0 3 中的总菌落数的培养方法对未经过超高压处理和加 压4 5 0 m p a 、1 5 r a i n 、2 0 下处理小龙虾仁进行微生物培养2 4 小时后，于菌落 数为2 0 左右的平板中挑出每个单独的菌落在营养琼脂平板中进行划线培养，将 培养好的菌种进行革兰氏染色镜检，判断革兰氏染色阴性和阳性，每个平板挑 出较纯的菌落再次培养。 3 2 2 2 革兰氏阴性细菌的鉴定 ( 1 ) 按照3 2 2 1 中的方法对小龙虾仁中的细菌进行平板纯化培养。 ( 2 ) 取平板上单个菌落制片，做革兰氏染色镜检，分检出呈阴性球菌或无 芽胞杆菌的蔚落。 ( 3 ) 做氧化酶试验，阳性者记录在卡片上( 空圈涂黑) 。 ( 4 ) 从冰箱取出鉴定卡( g n i ) ，待恢复至室温后取出编号，放到卡片架 上，手不要接触吸液口，整个过程保持无菌。 ( 5 ) 浊度计用0 4 5 的盐水管调零和1 0 0 。 ( 6 ) 取2 4 h 内的纯单个菌落配制成菌悬液，按鉴定要求制成不同使用麦氏 单位浓度的菌悬液。 ( 7 ) 选好鉴定卡，编上卡号，接上充填装置。 ( 8 ) 充填：把充填装置放入充填箱，先按o n ，听到“嘀”一声以后，再 按f i l l 键即开始充填工作。 ( 9 ) 充填完毕，取出鉴定卡用塞子封口，检查和排除气泡。 ( 1 0 ) 从控制电脑系统菜单中打开v i t e k 查看r e a d e rs t a t u s ，了解仪器即将 读的卡片架编号。把卡平稳放入仪器即将读的卡片架内，关闭箱门。 机器自动读卡。 ( 1 1 ) 待系统显示所有反应结束，打印实验结果，记录数据。 ( 1 2 ) 将鉴定卡取出，关闭读取状态。 3 2 2 3 革兰氏阳性细菌的鉴定 ( 1 ) 取平板上单个菌落制片，做革兰氏染色镜检，分检出革兰氏阳性球菌 或无芽胞杆菌。 ( 2 ) 做过氧化氢酶试验，阳性者记录在卡片上( 小圆圈涂黑) 。 ( 3 ) 做试管法凝固酶试验：挑取3 5 个菌落子稀释人血浆( 血浆1 0 虮l 加 0 9 生理盐水3 0 0 芦t ) ，置3 5 c 孵箱内4 6 小时记录结果。如凝固酶 试验阳性，需将卡片上的椭圆涂黑。 ( 4 ) 从冰箱取出鉴定卡( g p i ) ，待恢复至室温后取出编号，放到卡片架 上，手不要接触吸液口，整个过程保持无菌。 ( 5 ) 浊度计校零及1 0 0 ，用0 4 5 的盐水管调零和1 0 0 。 ( 6 ) 挑取经纯化的单个菌落，用浓度为0 4 5 盐水2 m l ，配制成o 5 麦氏 单位浓度的菌悬液。 ( 7 ) 将鉴定卡放入填充箱内填充，待填充完成后取出用塞子封口，检查和 排除气泡。 ( 8 ) 从控制电脑系统菜单中打开v i t e k 查看r e a d e rs t a t u s ，了解仪器即将 读的卡片架编号。把卡平稳放入仪器即将读的卡片架内，关闭箱门。 机器自动读卡。 ( 9 ) 待系统显示所有反应结束，打印实验结果，记录数据。 3 3超高压前后小龙虾仁的质构检测 室温2 0 ，将小龙虾仁分别在1 0 0m p a 、2 0 0m p a 、3 0 0m p a 、4 0 0 m p a 、 5 0 0 m p a 的压力下处理1 5 r a i n ，另取未加压样品作对照。分别将超高压处理前后 的小龙虾仁分别取出，选取大小均一、直径一致的进行韧度和剪切力检测。每 组1 0 枚，取平均值。 剪切力测定：选用通用刀具h d p b s k ，进刀速度：2 m m s ，刀具行程：2 5 r a m 。 韧度测定：选用检测钳口h d p v b ，进刀速度：2 m m s ，刀具行程：7 0 。 1 4 3 4 透射电镜观察 将小龙虾仁于2 0 、5 0 0 m p a 的压力下处理1 5 r a i n 。 固定；取高压前后小龙虾仁，在蜡板上切成l c m 3 大小，立即放入2 5 戊 二醛溶液中固定1 2 h ，取出放入p b s 中4 小时，再放入1 锇酸后固定1 5 h 。 脱水：取出以3 0 乙醇脱水1 5 r a i n ，5 0 乙醇脱水1 5 r a i n ，7 0 乙醇醋酸 铕饱和溶液脱水1 2 m i n ，8 5 乙醇脱水t o m i n ，9 5 乙醇脱水1 5 r a i n ，无水乙醇 脱水5 0 m i n 。 包埋：放入环氧丙烷透明3 0 m i n ，环氧丙烷：环氧树脂1 ：1 浸树脂2 h ， 环氧树脂浸2 h ，包埋，于6 0 烘箱中4 8 小时。 切片：取出包埋好的组织修片，于切片机进行切片，片厚7 0 n m ，醋酸铕染 色1 h ，水洗，柠檬酸铅染色3 0 m i n ，水洗，晾干。 于透射电镜下观察，拍摄照片。 3 5 超高压杀菌实验设计 3 5 1小龙虾仁的超高压杀菌工艺流程 ( 1 小龙虾仁放在流动的水中解冻，放在4 一下的环境保存，并在半小 时内包装，整个过程保证虾仁处于无菌状态。 ( 2 ) 将虾仁分装成5 0 9 袋，用p v c 薄膜。整个过程在无菌环境中完成， 包装材料及工作台用紫外杀菌，器具用7 5 消毒。 ( 3 ) 将成袋的虾仁二次真空包装，立即使用。如不立即使用，可暂时放入 冰箱在4 c 以下冷藏保存，保存的虾仁应在8 小时内处理完毕。 ( 4 ) 打开水浴，调整超高压设备的油温达到实验要求，同时调整高压自动 控制装置的零点和需要值。 ( 5 ) 将包装好的龙虾仁放入超高压杀菌釜，等到物料的温度和油温一致时， 密封高压杀菌釜，开启设备。 ( 6 ) 按试验设计方案要求的压力、时间、温度对物料迸行超高压处理。 ( 7 ) 处理后的样品应立即进行微生物检测或感观评测，放置不得超过8 小时，且在4 c 以下。 3 5 2压力大小对杀菌效果的影响 一般来说，压力越大，超高压杀菌的效果越好。但是随着压力的增大，压 力对微生物的影响越来越小，而设备的制造和维护成本会成倍增加，设备运行 安全性也会降低。所以，选择合适的压力，会大大降低生产成本。本实验期望 得到在符合卫生标准情况下较低的杀菌临界值，选取其中的合适水平，进行正 交实验。 选取1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 m p a