（农产品加工及贮藏工程专业论文）菜籽蛋白酶解及产物抗氧化活性的研究.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕 ：学位论文 摘要 油菜籽加工油脂过程中的副产品菜籽粕具有广阔的应用前景，然而由于菜籽粕 中硫代葡萄糖营以及其他一些抗营养因子的存在，使菜籽粕的合理利用受到制约。 本文研究了超声微波辅助提取菜籽蛋白的工艺、双酶分步酶解制备菜籽肽的工艺、 菜籽蛋白酶解物的脱色及分子量分布范围，同时比较了三种不同分子量的菜籽蛋白 酶解物的抗氧化能力，从中选出抗氧化能力较强的菜籽蛋白酶解物进行动物体内实 验的研究。实验结果如下： ( 1 ) 选用双低菜籽粕为原料，采用超声微波辅助提取的方法，通过对各种单因 素的分析得到基本工艺条件，根据b o x b e n h n k e n 的中心组合试验设计原则，选取对 提取菜籽蛋白影响较大的3 个因素：微波功率、提取时间和料液比值进行实验和响应 面分析，得到制备菜籽蛋白的最佳工艺条件为：p h 为1 1 5 ，微波功率7 3w ，料液 比1 ：2 8 ，提取时间4 8 4 秒，在此条件下提取3 次，产品蛋白含量8 3 6 7 ，蛋白得率 3 8 7 6 。 ( 2 ) 实验选取a l c a l a s e 碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步水解菜籽蛋白，结果表 明双酶分步水解制备菜籽肽的最佳工艺为a l c a l a s e 碱性蛋白酶在p h 9 5 ，温度5 5 ， 底物浓度3 ，酶浓度5 5 0 0 u g 条件下酶解5 5 4 , 时，水解度为2 1 1 4 ，再用复合风味酶 在p h 6 ，温度5 0 c ，酶浓度9 0 0 u g 条件下继续酶解3 d 时，酶解液中游离氨基氮达到 1 3l m g m l ，且酶解液苦味值最低。 ( 3 ) 研究粗肽液用活性炭脱色得到最佳的脱色条件：活性炭用量1 5 ，p h 4 5 ， 温度5 5 ，脱色5 0 m i n ，脱色率可达3 2 1 5 ，氨基酸损失率2 5 1 2 。将脱色后的菜 籽蛋白酶解物进行高效液相色谱和质谱分析表明：菜籽蛋白酶解物主要是由1 0 0 0 d a 以下的小分子肽组成。 ( 4 ) 通过比较研究三种菜籽蛋白酶解物的抗氧化能力，发现组分3 的抗氧化的 效果最好，抗氧化能力最强。于是进一步研究菜籽蛋白酶解物( r p h s ) 对在拘束应激 状态下的小鼠抗氧化作用。4 8 只昆明系小鼠分为4 组：空白组、拘束应激模型组、 菜籽肽低剂量组和菜籽肽高剂量组。空白组和拘束应激模型组灌胃生理盐水，其余 两组分别按3 0 0 m g k g d ，9 0 0m g k g d 的剂量灌胃菜籽蛋白酶解产物。各组灌胃2 1 d 后，处死小鼠，检测小鼠血清和肝脏中超氧化物歧化酶( s o d ) 、丙二醛( m d a ) ，谷 胱甘肽( g s h ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) 、过氧化氢酶( c 卸以及总抗氧化能力 菜籽篮 j 的酶法水解及产物的抗钒化研究 ( t - a o c ) 。结果表明，菜籽蛋白酶解物对在拘束应激状态下的小鼠有明显的抗氧化 作用。 关键词：菜籽饼粕；菜籽蛋白；束缚应激；抗氧化能力 华中农业人学2 0 0 9 届硕：l f ：学位论文 a b s t r a c t r a p e s e e dm e a l ，ab y p r o d u c to fr a p e s e e do i lp r o c e s s i n g ，h a sa l le x t e n s i v ea p p l i c a t i o n p r o s p e c t h o w e v e r ，r a p e s e e dm e a lc o n t a i n sg l u c o s i n o l a t e sa n do t h e ra n t i - n u t r i e n t s ，w h i c h l i m i t si t su t i l i z a t i o n w i t ht h es u c c e s s f u lc u l t i v a t i o no fd o u b l e l o wr a p e s e e dv a r i e t i e s ，t h e c o n t e n to fg l u c o s i n o l a t e si nr a p e s e e dh a sb e e ng r e a t l yd e c r e a s e d ，t h u st h eu s eo fr a p e s e e d m e a lh a v eb e e nf u r t h e rw i d e n e d t h i sp a p e rm a i n l yi n v e s t i g a t e dt h er a p e s e e dp r o t e i n e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y ，m u l t i p l es t e ph y d r o l y t i cc o n d i t i o n so fr a p e s e e dp r o t e i n 诵t hd o u b l e e n z y m e s ，d e c o l o u r i n go fr a p e s e e dp r g t e i nh y d r o l y s a t e s ，t h ed e t e r m i n a t i o no fm o l e c u l a r w e i g h to fr a p e s e e dp r o t e i nh y d r o l y s a t e sa n da n i m a le x p e r i m e n tw i t ht h er a p e s e e dp r o t e i n h y d r o l y s a t e sw 池t h eh j 曲e s ta n t i o x i d a t i o nc a p a b i l i t y ( 1 ) u s i n gd o u b l e l o wd e f a r e dr a p e s e e dm e a la sr a wm a t e r i a la n de x t r a c t i o nm e t h o d a s s i s t e db yu l t r a s o n i cw a v ea n dm i c r o w a v e ，b a s i ce x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d b yi n v e s t i g a t i n gt h es i n g l ee x p e r i m e n t a lf a c t o r ，t h e na c c o r d i n gt ot h eb o x - b e n h n k e n e x p e r i m e n t a ld e s i g np r i n c i p l e s ，t h e3i m p o r t a n te x p e r i m e n t a lf a c t o r sm i c r o w a v ep o w e r ， t i m ea n dt h er a t i oo fm e a lt os o l v e n tw e r es t u d i e da n da n a l y z e dw i t hr s m ，t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：p h1 1 5 ，7 3 wm i c r o w a v ep o w e r ，t h er a t i oo fm e a lt os o l v e n t 1 ：2 8 ，e x t r a c t i n gt i m e4 8 4s e c o n d s ，e x t r a c t e df o r3t i m e s t h ec o n t e n to fp r o t e i nw a s 8 3 6 7 ，a n dt h ey i e l dr a t eo f p r o t e i ne x t r a c tw a s3 8 7 6 u n d e rs u c hc o n d i t i o n s ( 2 ) t h er e s u l t so ft h em u l t i p l es t e ph y d r o l i z a t i o no ft h er a p e s e e dp r o t e i nw i t i l a l c a l a s ea n df l a v o u r z y m es h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r eh y d r o l y i z a t i o nt i m e5 h o u r sw i t ha l c a l a s ea tp h 9 5 ，5 5 ，3 s u b s t r a t ea n d e n z y m ec o n c e n t r a t i o n5 5 0 0 u g ，t h e h y d r o l y s i sr a t ec o u l dr e a c ht o2 1 1 4 ，t h e nh y d r o l i z a t i o nw i t hf l a v o u r z y m ef o r3h o u r sa t p h 6 ，5 0 a n de n z y m ec o n c e n t r a t i o n9 0 0 u g ，t h ec o n c e n t r a t i o no ff l e ea m i n oni nt h e h y d r o l y s a t e c o u l d r e a c ht o1 31m g m l ，a n dt h eb i t t e rv a l u eo fr a p e s e e d p r o t e i n h y d r o l y s a t e sw a sv e r yl o wu n d e rs u c hc o n d i t i o n s ( 3 ) t h er e s u l t so fd e c o l o r a t i o ne x p e r i m e n to fr a p e s e e dp r o t e i nh y d r o l y s a t e sw i t h a c t i v ec a r b o ns h o w e dt h a tt h eo p t i m u md e c o l o r a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：a c t i v ec a r b o n d o s a g e1 5 ，p h4 5 ，t e m p e r a t u r e5 5 ，a n dr e a c t i o nt i m e5 0 m i n , t h ed e c o l o r a t i o nr a t e c o u l dr e a c ht o3 2 15 a n dt h ea m i n oa c i dl o s sr a t ew a s2 5 15 u n d e rs u c hc o n d i t i o n s i i i 菜籽蛋白的酶泫水解及产物的抗氧化研究 t h er a p e s e e dp r o t e i nh y d r o l y s a t e sw i t hd e c o l o rw e r ea n a l y z e db yh p l c - m sa n dt h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a ti t sm a i n l yc o n s i s t e do fs m a l lm o l e c u l a rw e i g h t sp e p t i d e ( 4 ) t h ec o m p a r i s o no ft h ea n t i o x i d a t i o nc a p a b i l i t yo ft h r e er a p e s e e dp r o t e i n h y d r o l y s a t e si n d i c a t e dt h a tt h et h i r do n eh a dt h eb e s ta n t i o x i d a t i o nc a p a c i t yi nv i t r o t h e a n t i o x i d a t i o ne f f e c to fr a p e s e e dp r o t e i nh y d r o l y s a t e s ( r p h s ) o nm i c eu n d e rr e s t r a i n t s t r e s sw a sf u r t h e ri n v e s t i g a t e d f o r t ye i g h tk u n m i n gm i c ew e r ed i v i d e di n t o4g r o u p s ： c o n t r o lg r o u p ，r e s t r a i n ts t r e s sc o n t r o lg r o u p ，l o wd o e sr p h sg r o u pa n dh i g hd o e sr p h s g r o u p t h em i c eo ft h ec o n t r o lg r o u pa n dr e s t r a i n ts t r e s sc o n t r o lg r o u pw e r ef e db y p h y s i o l o g i c a ls a l i n e ，a n dl o wd o s er p h sg r o u pa n dh i g hd o s er p h sg r o u pw e r ef e db y r p h sa t3 0 0a n d9 0 0 m g k g 。db yg a v a g eo n et i m ead a y , r e s p e c t i v e l y t h em i c ew e r e e u t h a n a t i z e da f t e r21d a y s t h ea c t i v i t i e so fs o d ，g s h - p x ，c a ta n dt h el e v e lo fm d a ， g s h ，t o o cw e r ed e t e r m i n e di ns e r u ma n dl i v e ro fm i c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr p h s h a ds i g n i f i c a n ta n t i o x i d a t i o na c t i v i t yo nm i c eu n d e rr e s t r a i n ts t r e s s k e yw o r d s ：r a p e s e e dm e a l ；r a p e s e e dp r o t e i n ；r e s t r a i n ts t r e s s ；a n t i o x i d a t i o nc a p a c i t y i v 华中农业火学2 0 0 9 扁硕上学位论文 缩略表 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 虿 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生张锄 帆护c 年6 月f 日 糊黼虢参 新始歹每。宅 。 签名慨扣c 7 年易月丫日签名日 9 j ：。1 年月日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业人学2 0 0 9 届硕_ j ：学位论义 第一章前言 油菜( r a p e ) 是世界最主要的油料作物之一。1 9 7 8 年以来，我国的油菜种植面积和 产量都居世界第一位，单产也已超过世界平均水平，2 0 0 0 年油菜种植面积已达l 亿亩， 产量1 0 5 9 万吨。菜油已占到我国食用油的5 0 以上，且还在不断上升( 吴谋成和袁俊 华，2 0 0 0 ) ，由菜籽油产生的副产物菜籽粕每年约5 0 0 万吨，由于其价格便宜，蛋白 含量高，是一种潜在的植物蛋白来源，极具研究开发价值。 菜籽中含有2 1 0 o - 2 4 的蛋白质，脱脂菜籽粕中含有3 3 3 9 的蛋白质烈本6 2 5 ) ， 其中8 0 一8 7 是真蛋白。菜籽蛋白主要是由高分子量1 2 s 蛋白和低分子量2 s 蛋白组 成，其含量随菜籽种类的不同而有所改变( 王车礼和史美仁，1 9 9 7 ) ，1 2 s 球蛋白分子 量大约3 0 0k d ，2 s 蛋白的分子量1 2 k d 一1 7 k d 。菜籽蛋白氨基酸组成合理，富含赖氨 酸，几乎不存在限制性氨基酸，接近联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 的推荐值( 历秋岳，1 9 7 8 ) 。刘志同( 刘志同，2 0 0 4 ) 等研究了菜籽蛋白与大豆、花生、 棉籽等其他植物蛋白的氨基酸组成比较，菜籽蛋白中赖氨酸含量和大豆蛋白接近， 而蛋氨酸含量比大豆蛋白还高。同时，研究还表明菜籽蛋白的生物价和营养效价也 比它们高，说明了菜籽蛋白是人类和动物理想营养源。由于菜粕中含有硫代葡萄糖 苷能水解生成致甲状腺肿大和其他有毒的物质以及一些抗营养因子如植酸、多酚类 物质，其合理利用一直受到制约。 1 1 菜籽粕中的抗营养因子 1 1 1 硫代葡萄糖甙( g l u c o s i n o l a t e s ，g l ) 的毒性和抗营养作用 硫代葡萄糖甙( g l u c o s i n o l a t e s ，g l s ) 简称硫甙，其以钾盐的形式存在于菜籽粕中， 它有7 0 余种，依据r 基团中是否有羟基存在，可分为带羟基硫甙( 简称p g 硫甙) 和不带 羟基硫甙( 彭健和蒋思文，2 0 0 1 ) 。硫代葡萄糖甙一般比较稳定，遇酸性溶液，转变 成羧酸；在碱性溶液中，它能转变成氨基酸和其它产物。硫甙自身和其分解产物均有 毒性，其主要分解方式有两种，酶分解和热分解。酶分解主要有两种：种利用植 物本身的芥子酶，在天然的p h 值下发生的自体分解的水解反应；另一种是利用外加 的芥子酶，在人工控制的最适宜的p h 值下发生的非自体的水解作用( 彭小华等， 2 0 0 2 ) 。两种水解反应的水解产物数量相差较大，自体分解时的产物是氰化物较多， 菜籽蛋白的酶法水解及产物的抗氧化研究 而异硫氰酸盐少；非自体分解作用则正好相反，其分解产物对甲状腺、肝脏、肾脏 有毒害作用，对动物的繁殖机能产生影响，并严重影响饲料适口性。热分解的主要 产物是腈类物质( r e d d ye ta l ，1 9 9 9 ) 。 恶唑烷硫酮( o x a z o l i d i n et h i o n e ，o z t ) ：是一种水溶性物质，由含羟基的芥子苷 酶解硫甙而成，是菜籽粕的主要毒素，对甲状腺的毒害作用最大，被称为甲状腺肿 素( g o i t r i n ) ，其毒性作用主要表现在两个方面：一是抑制甲状腺内活化碘和甲状腺结 合，影响甲状腺素的生成，从而抑制甲状腺的生长；二是干扰甲状腺球蛋白分解， 抑制甲状腺素释放，导致甲状腺肿大。游离状态下没有毒性作用，只有跟酶反应产 生有活性的恶唑烷硫酮才能起到毒性作用。 异硫氰酸盐( i s o t i o c y a n a t e ，i t c ) ：异硫氰酸盐不溶于水，易挥发，有腥味。异硫 氰酸盐和硫氰酸盐都具有强烈的刺激性和穿透性，长期饲喂含硫氰酸盐的饲料，易 对动物的消化道粘膜产生强烈的刺激和损伤，当异硫氰酸盐在动物体内累积到一定 程度，会使动物体重下降，耗料量增加，高浓度异硫氰酸盐对动物生理有明显的影 响，尤其是甲状腺功能。 硫氰酸盐( t h i o c y c a u a t e ) 硫氰酸盐的硫氰根离子( s c n 3 与i 的摩尔体积相似，在 甲状腺细胞聚碘过程中，s c n 。与i 竞争，从而减少了甲状腺对碘的浓聚，这样使饲 料的碘难于被甲状腺利用，导致甲状腺素生成不足，继而发生甲状腺肿大，引起机 体代谢紊乱和生长受阻等不良现象( 王立峰，2 0 0 6 ；t r i p a t h ia n dm i s h r a , 2 0 0 7 ；b u r e l ， 2 0 0 1 ；陈刚和彭健，2 0 0 1 ；何国菊等，2 0 0 3 ) 。 腈类化合物( n i t r i l e ) ：抗甲状腺作用较其他分解产物较弱，但其毒性是分解产物 中最强的，易使动物的肝脏和肾受到损伤，导致肝出血和肝坏死( 何国菊，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 植酸( p h y t i ca c i d ) 的抗营养作用 植酸普遍存在于植物性饲料尤其油料粕中，植酸的化学结构为环己六醇磷酸酯， 分子式为c 6 h l 9 0 2 4 p 6 ，分子量为6 6 0 0 8 ，分子中有六个磷酸基团，是菜籽中磷的主要 贮存形式。植酸在很宽的p h 范围内带有负电，是一种很强的金属鳌合剂，与钙、镁、 钾、钠、铁等金属离子结合，生成植酸盐，植酸盐必须在消化道内经植酸酶将其水 解成无机盐形式才能被利用，非反刍动物尤其单胃动物消化道内缺乏植酸酶，因此 植酸会降低这些矿物质元素的利用率，从而降低它们的效价。另外，植酸也易与带 正电的蛋白质结合生成不易溶解的复合物，使其不易消化并抑制胃蛋白酶、胰蛋白 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕- 1 ：学位论文 酶、淀粉酶和胰脂肪酶的活性，这不仅降低了营养成分的利用率，而且造成后肠营 养物蓄积，从而为病原菌的入侵提供“温床”( l i e n e r ，1 9 9 4 ；g u g g e n b u h la n dn u n e s ， 2 0 0 7 ) 。 1 1 3 单宁和芥子碱( t a n n i na n ds i n 印i n e ) 的抗营养作用 单宁和芥子碱都属于酚类化合物，主要分布于莱籽的子叶和皮壳中，总含量约 为1 5 4 1 6 4 e c k g ，它们不是双低菜籽粕中主要的抗营养因子。 单宁( t a n n i n ) 是水溶性多酚类物质，又称单宁酸或鞣质，是一种不含氨的酚类植 物毒素。单宁通常存在于油菜籽外壳中，是使菜籽饼粕呈黑色的重要因素，含量为 1 6 - 3 1 ，主要是缩合单宁，它能使动物的生长机能减退，大概有以下四种原因： 一因其味苦，影响适口性，减少动物的采食量；二因其在动物的消化道中与日粮中 的蛋白质结合，生成不溶性化合物，使动物不能消化；三是单宁对蛋白质的亲合性 可以引起蛋白消化酶、脂肪酶和淀粉酶的失活以致影响动物的生长和食物转化；四 其可与多种金属离子如钙、铁、锌等发生沉淀作用，从而降低它们的利用率( m a k k a r , 19 8 9 ；k u m a ra n ds t n g h , 19 8 4 ) 。 菜籽粕中含有约1 o 一1 5 的芥子碱( s i n a p i n ) ，芥子碱是芥子酸( s i n a p i c ) 和胆碱 ( c h o l i n e ) 作用生成的酯类物质，称为4 羟基3 ，5 - - - - 甲氧基苯丙烯胆碱酯，分子式为 c 6 h 2 5 0 6 n ，能溶于水，易发生非酸催化的水解反应，生成芥子酸和胆碱，芥子碱是 使菜籽粕产生苦味的主要原因之一。 1 2 脱毒的方法 由于菜籽粕中的有毒物质主要是硫代葡萄糖苷，因此对去除硫代葡萄糖苷的方 法研究较多。 1 2 1 物理方法 1 2 1 1 脱壳处理 菜籽中大部分抗营养因子主要集中在菜籽的壳中( 彭健和蒋思文，2 0 0 1 ) ，因此， 菜籽经脱壳处理后可以减少菜籽中的大部分抗营养因子，提高菜籽粕的营养价值和 利用价值。但此方法不能彻底除去抗营养因子，残留的抗营养因子需进一步处理。 菜籽蛋白的酶法水解及产物的抗氧化研究 1 2 1 2 钝化芥子酶 以前的研究( 肖世平，1 9 9 5 ) 认为硫甙本身没有毒性，菜籽破碎后硫甙与硫甙酶 相互接触并发生反应，使硫甙被酶分解成有害物质。如果将硫甙酶钝化，便可起到 阻止硫甙分解产生有毒物质的作用。但最近的研究发现，硫甙本身也是有毒的，所 以此法只能作为一种辅助的去毒方法( l e m i n ge ta l ，2 0 0 4 ) 。 1 2 1 3 超滤法 所谓超滤是指以压力差为推动力，利用超滤膜对分离组分选择性截留分子量大 的物质，而溶剂和小分子物质透过。刘志强等( 刘志强等，2 0 0 4 ) 将用水相酶解法提 取的菜籽蛋白在操作压力0 2 0 0 3 0 m p a ，温度5 0 。c ，料液p h 9 1 0 下进行超滤，所得 菜籽蛋白不含毒素、纯度及回收率在9 0 以上。胡志和等( 胡志和等，1 9 9 8 ) 乖1 j 用超滤 膜分离菜籽蛋白，可得到不含毒素的纯度在9 0 以上的菜籽蛋白。目前，此方法脱 毒的效果最好，但由于成本较高，无法进行大规模工业化的生产。 1 2 1 4 水剂脱毒法 水剂脱毒法是具有较高的脱毒效果和营养价值的一类方法，其去毒原理是：菜 籽粕中有毒物质硫甙及其降解产物均易溶于水；其它抗营养因素中芥子碱可遇水水 解，生成胆碱和芥子酸，两者均溶于水( t y a g i ，2 0 0 2 ) 。另外，大部分单宁是水溶性物 质。 陆艳等( 陆艳等，2 0 0 7 ) 用醋酸：乙醇：水= 5 ：9 0 ：5 ( 体积比) ，固液比为1 ：1 0 ， 7 6 下搅拌4 5 m i n ，此条件下，植酸脱除率为8 4 2 硫甙含量为0 7 8 ，残油率为 2 6 6 ，且干物质损失少，油菜籽饼的营养成分均得到提高。 另外，提取分离菜籽蛋白时，由于抗营养因子在不n p h 值时溶解度不同，也可 以起到脱毒的作用。e ln o c k r a s h y ( n o c k r a s h ye ta l ，1 9 9 7 ) 采用n a o h 溶液四级逆流萃 取，可萃取出粕中9 4 的氮，然后相继以p h = 6 0 和p h = 3 6 二段沉淀蛋白质，总收率 可达原始饼粕中氮的7 2 ，分离蛋白含粗蛋白质9 0 以上，且不含硫甙。此过程经 改进和放大( l a i c h e re ta l ，1 9 8 3 ) ，在p h i 9 5 和1 2 0 下进行二段萃取，然后再进行两段 沉淀，其结果只是植酸含量偏高，两段沉降得到的分离蛋白中植酸含量分别为9 8 和4 3 。严奉伟等( 严奉伟等，2 0 0 4 ) 用7 0 丙酮和其它溶剂依次提取菜籽饼粕中多酚 4 华中农业人学2 0 0 9 届硕j i ：学位论文 和植酸后得到含7 0 2 3 蛋白质，而有害物硫代葡萄糖甙及抗营养物质多酚与植酸量 分别为o 7 6 9 m o l g ，1 3 3 m g g ，3 0 1 ，分别比处理前下降9 6 5 5 ，9 5 8 8 ，3 8 4 5 。 1 2 2 化学方法 常采用加碱、氨和硫酸亚铁等进行处理。碱处理法可破坏硫代葡萄糖甙和绝大 部分芥子碱，通常采用n a o h 、c a ( o h ) 2 或n a 2 c 0 3 ，氨处理法通过加热氨使其与硫 葡萄糖甙反应生成无毒的硫脲。硫酸亚铁处理法的作用在于铁离子与硫葡萄糖甙及 其降解产物分别形成螯合物不被畜禽吸收，从而使其失去毒性( 张振红等，2 0 0 6 ) 。 1 2 3 生物方法 利用外加的酵母菌，对菜籽粕进行发酵脱毒，有关资料表明菜籽粕经发酵处理 以后，除异亮氨酸，赖氨酸外，含量均有提高，饼粕蛋白及维生素的含量都有所提 高，粘性好。钙、磷易吸收，恶唑烷硫铜( o z t ) 币i 异硫氰酸脂( i t c ) 含量显著降低( v i g a n dw a l i a , 2 0 0 1 ) 。蒋玉琴( 蒋玉琴等，1 9 9 9 ) 等采用少孢子根霉菌、乳酸菌等复合菌溶 液，在适宜的条件下进行菜籽粕的发酵脱毒，试验结果表明：菜籽粕中硫代葡萄糖 苷的降解率在5 0 6 0 。 1 2 4 遗传学方法 此方法是最有前景的方法，利用遗传学方法培育出双低油菜，双低油菜是指芥 酸、硫苷含量均低的油菜。前者改良了菜油的品质，后者改良了菜饼的品质，都提 高了经济效益。这是一个从根本上解决菜籽中抗营养因子的方法。1 9 7 4 年加拿大曼 尼托巴大学的保德斯蒂芬森博士( d r b a l d u rs t e f a n s s o n ) 育成了世界上第一个低芥酸 和低硫甙的“双低油菜”品种，也产生了油菜名称的新术语一卡诺拉( c a n o l a ) 。华中农 业大学用温敏型波里马细胞质雄性不育两用系“1 9 5 a ”与恢复系“7 5 ”配组的两系 杂交油菜品种。该品种经农业部农作物种子质量监督检验测试中心( 武汉) 测定，粗 脂肪含量4 1 4 9 ，芥酸含量0 2 7 ，饼粕硫甙含量为2 2 4 1 “m o v g ，品质达到“双低 油菜品种标准。 另外，国内外的科学家正在将遗传学和基因工程学的方法联合起来培养更加优 良的无毒油菜品种。 菜籽虽 j 的酶泫水解及产物的抗氧化研究 1 3 菜籽蛋白改性的研究 过去人们认为，蛋白质在消化道内经蛋白酶和肽酶的作用降解为短肽片段和游 离氨基酸，而只有游离氨基酸才能被动物直接吸收利用，短肽则只有再降解成游离 氨基酸才能被利用。现代营养学研究发现( 冯秀燕等，2 0 0 1 ；王进波等，2 0 0 0 ) ：人类 摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以2 7 个氨基酸组成的短肽形式被消化吸收 的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。短肽不但吸收机制优胜于氨基酸，而且还 具有氨基酸不可比拟的功能活性。相关研究证明，短肽的功能活性主要包括抗氧化 作用、抗高血压、免疫调节、抑制细菌、病毒和抗癌作用等。 目前，蛋白肽的生产方法有微生物发酵法、提取法、化学合成法和水解法。微 生物发酵法主要是利用从自然界中筛选出的有益菌株，接种在蛋白质中发酵，对菌 种进行鉴定和特性研究，同时研究各菌种在生长繁殖时分泌的蛋白酶的酶学特性和 对底物蛋白分子的利用特点，根据不同的菌种组合发酵产生合适的肽链段；提取法 主要从富含肽的天然植物、微生物菌株中，或应用基因重组技术改造过的体内能大 量合成目标肽的植物、微生物中通过一定工艺进行提取( 刘利军，2 0 0 5 ) 3 化学合成 法是根据目标肽的氨基酸排列顺序，用人工方法进行化学合成；水解法主要有碱水 解法、酸水解法及酶水解法。碱水解法由于产物有异味，食品工业中通常不采用； 酸水解法能使蛋白质变性生成有毒物质( t a y l o r , 1 9 8 7 ) ，也很少采用；现在，蛋白肽主 要用酶水解法制备，酶水解法是选择合适的蛋白酶并在其最适温度和p h 条件下进行 酶解反应，水解蛋白质，从而得到具有活性的蛋白肽( 陈亮，2 0 0 6 ) 。酶法水解仅使 肽键断裂、而氨基酸的结构和构型保持不变，不会产生有毒有害物质( 赵利等，1 9 9 7 ) 。 在酶水解法中，正确选择蛋白酶是关键。现在蛋白酶的种类很多，蛋白酶按水 解蛋白质的方式不同可分为内切酶和外切酶，内切酶主要切开蛋白质分子内部肽键 - c o - n h ，将蛋白质水解成分子量较小的多肽类。外切酶主要是切开蛋白质或多肽 分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸。其中又把作用与氨基末端的称为氨 肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。外切酶的一个重要特性就是能够把处于肽链 末端的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味( 吴建中，2 0 0 3 ) 。郭兴凤等( 郭兴凤 等，2 0 m a ) 用枯草杆菌中性蛋白酶a s l 3 9 8 在温度4 9 6 c ，p h 7 6 ，酶与底物e i 7 4 2 0 p u g ， 底物浓度9 4 条件下水解自制菜籽蛋1 兰t 6 h ，得到水解度为1 6 2 。刘海梅等( 刘海梅 等，2 0 0 3 ) 以脱脂菜籽粕为原料，在碱性蛋白酶和风味蛋白酶的最适作用温度和起始 6 华中农业人学2 0 0 9 届硕l ：学位论文 p h 值下，先, 用3 0 0 0 u g 碱性蛋白酶水解4 h 后，在用3 0 0 0 u 儋的风味蛋白酶7 懈4 h ，水 解产物的水解度为1 0 ，水解产物口味平淡。 1 4 蛋白肽的抗氧化作用 人体内各器官、系统均会产生不同程度的自由基，但在体内同时存在有消除氧 自由基的防御系统，即由一些酶和非酶物质组成的抗氧化系统，此系统从氧化过程 的开始到最后生成过氧化氢这一自由基连锁反应的不同环节起作用，使体内自由基 形成和消除处于一种动态平衡中，使自由基不会对机体造成严重的损害。但是当机 体剧烈运动后、应激后、处于环境毒物影响下或当机体处于生病、衰老等情况下时， 自由基生成过多，机体消除自由基能力降低，打破了机体的自由基与抗氧化剂之间 的平衡( 徐鑫镁和施文忠，2 0 0 0 ；孙德玉和陈祚修，1 9 9 8 ；吴建中，2 0 0 3 ) ，从而会 损伤生物膜，使d n a 断裂，蛋白质变性，酶失活，最后导致细胞解体和死亡。所 以需要适当补充外源性抗氧化剂来提高抗氧化水平，防止脂质过氧化，帮助机体防 御疾病( p a p a s ，19 9 9 ；a n n ea n dm e y e r ，19 9 5 ；n a r a s i m h a n ，19 9 5 ) 。 生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类，而且蛋白质具有优良的 乳化型特性，能够在油水界面起到介导作用，对于清除生物体内过量自由基，抑制 膜脂质过氧化具有重要意义。作为抗氧化剂，蛋白质类物质中最有前途的当属肽类。 因为蛋白质水解成多肽后，具有抗氧化作用的基团充分暴露出来，能够更好的发挥 抗氧化作用。肽类不仅在油溶体系中有良好的增效作用，而且在水溶体系、乳化体 系及干燥体系中也有较高的抗氧化活性，构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸的排 列顺序决定着肽的抗氧化能力( 吴建中，2 0 0 3 ) 。薛照辉等( 薛照辉等，2 0 0 6 a ) 制备的 菜籽肽粗品及各组分均可抑制小鼠肝组织匀浆m d a 的生成，其中粗品r s p r 和级 分r s p 1 的作用效果最佳。对体外温育和h 2 0 2 诱导的小鼠肝组织匀浆m d a 生成有 较强的抑制作用。另外，薛照辉等( 薛照辉等，2 0 0 6 b ) 将双酶分步水解的菜籽清蛋白 粗品( r s p r ) 和经s e p h a d e xg 2 5 凝胶层析分离得到的三个级分限s p 1 ，r s p 2 和 r s p 3 ) 经离体实验，结果表明菜籽肽具有较强的还原能力及抑制o h 的作用；r s p r 和r s p 1 对活性氧的产生有抑制作用。 7 菜籽蛋 j 的酶法水解及产物的抗氧化研究 1 5 本课题研究的目的、意义和内容 1 5 1 研究的目的和意义 菜籽粕是一种潜在的营养价值很高的廉价植物蛋白资源，其最大的特点是含硫 氨基酸和赖氨酸的含量高。菜籽蛋白除了具有较高的营养特性外，其功能性也优于 其它蛋白，尤其是吸油性和乳化性( 陆恒，2 0 0 4 ) 。目前对于菜籽饼粕的食用开发研 究较少，除部分的菜籽粕经脱毒后作饲用蛋白源外，绝大部分还没有很好的加以开 发利用。我国是蛋白质资源严重匮乏的国家，将大量的廉价优质的菜籽蛋白转化为 人类优质的食品蛋白源具有重要的社会和经济意义。 在生物体内活性氧不断地通过非酶反应和酶反应产生，但在抗氧化酶和内源性 抗氧化剂的协同作用下不断被清除，在正常人体中维持有利无害的极低水平。但是 当机体处于年老、生病、疲劳和强烈的身心应激状态时，体内自由基的平衡可能出 现破坏，过量的氧自由基对机体大分子造成一系列的氧化性损伤。当这种损伤不能 及时修复或修复出错时就可能引发或加重细胞、组织乃至全身的机体紊乱与病理变 化。菜籽肽是菜籽蛋白经酶水解获得的短肽混合物，氨基酸组成合理，且必需氨基 酸平衡良好，含量丰富，具有许多优良的理化特性。目前已发现菜籽肽具有抗氧化、 降血糖、降血压、免疫、抗癌等生理活性( 吴建中，2 0 0 3 ) 。但菜籽肽对小鼠束缚应 激作用的研究较少。本实验主要探讨了菜籽蛋白酶解物( r r h s ) 对在束缚应激状态下 的小鼠抗氧化作用。 1 5 2 研究的内容 ( 1 ) 菜籽蛋白的提取及工艺优化。选用双低菜籽粕为原料，采用超声微波辅助 提取的方法，通过对各种单因素的分析得到基本工艺条件，根据b o x b e n h n k e n 的中 心组合试验设计原则，选取对提取菜籽蛋白影响较大的因素进行实验和响应面分析， 得到制备菜籽蛋白的最佳工艺条件。 ( 2 ) 菜籽蛋白酶解条件的研究。实验选取a l c a l a s e 碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶 分步水解菜籽蛋白。先用a l c f l a s e 碱性蛋白酶进行酶解菜籽蛋白单因素实验，在单因 素实验的基础上进行正交实验，实验中以水解度为指标，选出最佳酶解工艺，然后 选用复合风味酶对酶解液进行二次酶解，以游离氨基氮为指标，综合考虑风味酶对 菜籽蛋白酶解液苦味的影响。 8 华中农业人学2 0 0 9 属硕士学位论文 ( 3 ) 菜籽蛋白酶解液脱色及分子量分布的研究。选用活性炭作为吸附剂，对菜 籽蛋白酶解液进行脱色的实验，根据单因素和正交实验，以脱色率和氨基酸损失率 为双指标，得出效果较佳的脱色工艺。将经脱色后的菜籽蛋白酶解物进行高效液相 色谱和质谱分析，得出脱色后的菜籽蛋白酶解物的分子量的范围。 ( 4 ) 菜籽肽的抗氧化活性研究。将脱色后的菜籽蛋白酶解物经不同超滤膜进行 超滤，得到三种不同组分，进行抗氧化实验，确定抗氧化能力较强的组分用于小鼠 抗氧化实验。 ( 5 ) 研究菜籽蛋白酶解物( r p h s ) 对在束缚应激状态下的小鼠的抗氧化作用。 9 菜籽蛋 j 的酶法水解及产物的抗氧化研究 第二章菜籽蛋白的提取及工艺优化 油菜( r a p e ) 是世界最主要的油料作物之一。1 9 7 8 年以来，我国的油菜种植面积和产 量都居世界第一位，单产也已超过世界平均水平。2 0 0 0 年油菜种植面积已达1 亿亩， 产量1 0 5 9 万吨，产量和种植面积均居油料作物之首( 吴谋成和袁俊华，2 0 0 0 ) 。菜籽 粕作为菜籽油加工的主要副产品，蛋白含量较高，氨基酸组成合理，富含赖氨酸， 几乎不存在限制性氨基酸，接近联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 的推荐 值( 王立峰等，2 0 0 5 ) ，是重要的蛋白质资源，可进一步加以开发和利用。 目前，提取菜籽蛋白的方法有碱溶酸沉法( 郭兴凤等，2 0 0 1 b ) 、双液相萃取法( 王 车礼和史美仁，1 9 9 7 a ；王车礼和史美仁，1 9 9 7 b ) 、水相酶解法( 刘志强等，2 0 0 4 ) 、 有机溶剂法( 曾晓波等，2 0 0 1 ) 等方法，但这些方法提取时间较长或提取成本较高， 不适合工业化生产的要求，本研究从提高效率入手，在碱溶酸沉法的基础上，首次 采用超声微波辅助法这一新方法提取双低菜籽蛋白，将超声振动与开放式微波两种 作用方式相结合，充分利用超声振动的空化作用以及微波的高能作用缩短了提取时 间，通过实验确定此法的最优工艺参数，探讨高效提取菜籽饼粕中的蛋白的新途径。 2 1 材料与方法 2 1 1 主要材料与试剂 “双低”菜籽粕( 低硫甙、低芥酸) ，由华中农业大学提供蛋白质含量为3 4 3 1 ， 水分9 6 8 ，硫甙含量为0 2 5 m g g ，脂肪2 1 ，灰分8 5 ； 其它试剂均为分析纯。 2 1 2 主要仪器与设备 仪器名称 型号生产产家 超声微波协同萃取仪c w - 2 0 0 0 型上海新拓微波溶样测试技术有限公司 台式离心机t d l 5 型上海安亭科学仪器厂 ph计phs3c型上海理达仪器厂 分析天平f a 2 0 0 4 型上海精科天平厂 分光光度计u v - 1 7 0 0 美国s i g m a 公司 冷冻干燥机 f d 1北京博医康实验仪器公司 恒温水浴振荡器 s h a ，c金坛市精达仪器制造厂 1 0 华中农业人学2 0 0 9 届硕土学位论文 2 1 3 菜籽蛋白的制备工艺流程 本实验根据传统的碱提酸沉法的条件( x u ez h a o h u i ，2 0 0 4 ；张寒俊等，2 0 0 4 ) ，用 超声微波萃取仪进行菜籽蛋白的提取。 称取一定量的菜籽粕- 粉碎一过筛一选取相应的料液比和p h _ 超声微波辅助 提取_ 离心分离_ 收集上清液_ 酸沉_ 离心分离_ 收集沉淀_ 水洗调p h _ 冷冻干 燥- 称重。 2 1 4 测定方法 2 1 4 1 粗蛋白质测定方法 准确称取1 0 m g 3 0 m g 固体样品于干燥的消化瓶中，接着向消化瓶中加入3 9 硫 酸钾、0 2 9 硫酸铜、2 0 m l 浓硫酸和数粒玻璃珠。在消化瓶1 2 放一个小漏斗，并使