（环境科学专业论文）微生物对石油烃的降解作用及环境因素的影响.pdf

的。微生物采油是生物工程在石油工业领域的开拓性应用，是一项利 用微生物的活动及其代谢产物强化采油的技术，其突出的优点是实施 简便、费用低、注入微生物和营养物既便宜又容易获得、在矿场条件 下易于监测等。微生物提高石油采收率技术( m e o r ) 的主要原理是 微生物使重烃降解，降低原油粘度，代谢产物能降低油一水一岩石界 面张力，代谢过程产生的气体能改变油的流动能力。目前，我国应用 1 4 e o r 技术的油田有大庆、胜利、辽河、大港等，并均取得了阶段性 的成果。 本文对筛选出的降解石油烃的菌种n s 0 的性能进行了研究。原 油被n 8 0 菌降解后，其粘度降低，饱和烃、芳香烃和非烃均发生了 降解。g 6 9 8 原油中气相色谱能检测到的烃类( 包括饱和烃和芳香 烃) 基本上都有降解作用，并且烃类的降解量与降解时间成对数关 系。另外，温度和矿化度对n 8 0 菌的降解活性有显著影响，对n 8 0 菌来说，最适降解温度为6 0 7 3 ；矿化度的增加一般会促进微生物 对原油的降解，但太高时会造成高渗透压环境，使细胞原生质脱水 而发生质壁分离，因而会抑制微生物的生长。本文结果表明n 8 0 菌 是一种能在高温高盐环境中应用的高效的石油烃降解菌，能够应用于 提高原油采收率和高温高盐环境中石油烃污染物的微生物整治。 本文通过实验筛选出在高温高盐特殊环境下能够有效的降解石 油烃的菌n s 0 ；并且通过在不同条件下对饱和烃、芳香烃和非烃的降 解实验，研究了n 8 0 菌对石油烃中各种成分的降解作用，探讨了微 生物对石油烃各组分降解作用的差异性及引起这种差异性的原因；分 析了n 8 0 菌对原油的降粘作用机理，同时研究了温度和矿化度对微 生物降解活动的影响作用。结果表明，n s 0 菌是一种能在高温和高盐 环境下有效降解石油烃的菌种。 青岛海洋大学硕士论文 摘要 本文应用室内模拟方法研究了n 8 0 嗜高温菌对原油( 大港油田 g 6 9 8 原油) 的降解作用。分别研究了n 8 0 菌对饱和烃、芳烃的降解 作用，并就n s 0 菌对原油中不同组分的降解能力进行了分析研究。 ( 通过实验，得出如下一些有价值的结果： 1 ) n s 0 菌对g 6 9 8 原油中气相色谱能检测到的石油烃化合物( 包 括饱和烃和芳香烃) 中，除生物源的植烷、姥鲛烷和藿烷具有较好的 保守性以外，其它烃类基本上都发生了降解。 在整个发酵过程中，石油烃化合物的消耗量( 降解过程中原油中 的沥青质基本上是保守的) 与n 8 0 菌作用时间成对数关系；气相色谱 检测到的正构烷烃的相对含量( 以藿烷为标准) 也与n s 0 菌作用时 间成对数关系。 2 ) 对原油及微生物作用后的原油的族组分分析表明，g 6 9 8 原 油被n s 0 菌降解后，饱和烃、芳香烃和非烃发生了降解，并且对饱 和烃的降解作用最为显著，对非烃的降解作用相对弱一些，而对化学 性质稳定的芳香烃而言，微生物的降解作用比起饱和烃和非烃还要差 一些。 3 ) 实验条件下，g 6 9 8 原油经n 8 0 菌作用后，原油的粘度和熔 点都降低了。原油粘度和熔点的降低有利于地层中的原油在地层压力 的作用下向油井方向流动。这是微生物技术提高原油采收率的主要机 理之一。 4 ) 温度和矿化度对n s 0 菌的降解活性有显著影响，对n s 0 菌来 说，最适降解温度为6 0 一7 3 。c ；矿化度增加一般会促进微生物对原油 的降解，但太高时会造成高渗透环境，使细胞原生质脱水而发生质壁 分离，因而会抑制微生物生长，对降解不利。实验证明n s 0 菌是一 种能够在高温高盐环境中应用的菌种。 5 ) 微生物对石油烃的降解作用不仅取决于所用菌种的特性及所 处的环境条件，而且也取决于石油烃本身的结构和物理、化学性质。 n s 0 菌降解对石油烃的优先顺序是短链正构烷烃 长链正构烷烃 异 构烷烃 芳香烃。并且异构烷烃支链越多，芳香烃环上取代基越多， 2微生物对石油烃的降解作用及环境因素的影响 ， 越难降解。一， 总之j 本文的研究结果对新型微生物菌种的开发和应用有重 要意义和实用价值。 关键词：石油烃，微生物，微生物降解 a b s t r a c t t h e b i o d e g r a d a t i o n o fc r u d eo i l ( c r u d eo i lg 6 9 8 ，d a g a n go i lf i e l d ) b y t h e t h e r m o p h i l i c f a c u l t a t i v e b a c t e r i an 8 0w e r es t u d i e d t h r o u g h s i m u l a t e d e x p e r i m e n t s w e d i d e x p e r i m e n t s t o s t u d y t h e n 8 0 s d e g r a d a t i o no ns a t u r a t e dh y d r o c a r b o n sa n da r o m a t i c s ，a n da n a l y z e dt h e d i f f e r e n c e sa m o n gt h ec o m p o u n d so ft h ec r u d eo i l b a s e do nt h es t u d y ， w ea c h i e v e ds o m ev a l u a b l er e s u l t s ： ( 1 ) t h ec o m p o u n d s o fc r u d eo i lg 6 9 - 8t h a tc a nb ed e t e c t e d b yg c - m s ，e x c e p tp r i s t a n e ，h o p a n e a n d p h y t a n e ，w e r e a l l d e g r a d e d t h e e x p e r i m e n t s h o w e dt h a tt h ed e c r e a s eo f p e t r o l e u mh y d r o c a r b o n c o n c e n t r a t i o nw a s l o g a r i t h m i cw i t ht i m eo f t h eb i o d e g r a d a t i o n t a k et h e h o p a n e sa s t h ei n t e r n a l s t a n d a r d ，t h ed e c r e a s eo fn o r m a la l k a n e sa l s o w e r e l o g a r i t h m i cw i t ht i m eo f t h ef e r m e n t a t i o n ( 2 ) t h ea n a l y s i so ft h ef a m i l yi n g r e d i e n t ss h o w e dt h a ta f t e rt h e y w e r e b i o d e g r a d e d ，s a t u r a t e dh y d r o c a r b o n s ，a r o m a t i c s a n dn o n h y d r o c a r b o n s t h eb i o d e g r a d a t i o no ns a t u r a t e dh y d r o c a r b o n si st h em o s t v i s i b l e ，a n db i o d e g r a d a t i o n so nn o n h y d r o c a r b o n sa n da r o m a t i c sw e r e l e s sv i s i b l et h a ns a t u r a t e dh y d r o c a r b o n s ( 3 ) a f t e rt h ed e g r a d a t i o n ，t h ev i s c o s i t y a n dm e l t i n g p o i n t w e r e d e c r e a s e d t h ef a l lo ft h e v i s c o s i t y a n d m e l t i n gp o i n t a d v a n c e dt h e f l u i d i t yo f t h ec r u d eo i li nt h es t r a t u m i ti so n eo ft h em a i nm e c h a n i s m s o f m e o r ( 4 ) t h eb i o d e g r a d a t i o nm a i n l yd e p e n d e do nt h ec h e m i c a ls t r u c t u r e o ft h ep e t r o l e u mc o m p o u n d s d i f f e r e n th y d r o c a r b o n sh a v et h ed i f f e r e n t c a p a b i l i t yo fr e s i s t i n gb i o d e g r a d a t i o nf o rt h e i rd i f f e r e n ts t r u c t u r e s t h i s e x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ep o s i t i v es e q u e n c eo ft h eb i o d e g r a d a t i o no f n 8 0b a c t e r i a l s p e c i e so nc r u d e o i li s ：s h o r t e r c h a i nn o r m a la l k a n e s l o n g e r c h a i na l k a n e s b r a n c h e da l k a n e s a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( 5 ) t h eb i o d e g r a d a t i o nm a i n l yd e p e n d e do nt h ec h e m i c a ls t r u c t u r e o ft h ep e t r o l e u mc o m p o u n d s ，b u ta l s ow a sa f f e c t e db yt h ee n v i r o n m e n t a l f a c t o r ss u c ha s t e m p e r a t u r ea n ds a l i n i t y t h et e m p e r a t u r ea n ds a l i n i t y h a dp r o m i n e n ti n f l u e n c eo nt h em i c r o b i a l d e g r a d a t i o n a sf o rb a c t e r i a n 8 0 ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a sb e t w e e n6 0 7 3 ：t h ei n c r e a s eo f s a l i n i t yu s u a l l yw a sh e l p f u lt ot h em i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fc r u d eo i l b u t i ft h es a l i n i t yi st o oh i g h ，t h eg r o w t ho ft h eb a c t e r i aw i l lb er e s t r a i n e d t h e e x p e r i m e n t s s h o w e dt h a tb a c t e r i an 8 0c a nb eu t i l i z e d i n h i g h t e m p e r a t u r ea n dh i g h s a l i n i t ye n v i r o n m e n t i naw o r d ，t h er e s e a r c h e so ft h i st h e s i sh a v et h e i re x p l o i t a t i o n sa n d g o o dp r o s p e c t s k e y w o r d s p e t r o l e u m h y d r o c a r b o n s ，m i c r o o r g a n i s m s ，m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n 第一部分：文献综述 自从本世纪四十年代石油和微生物的关系最初被认识以来，石 油微生物学已经取得了很大的发展。四十年代，人们对石油微生物学 的兴趣大都集中在微生物与石油成因的关系上。五十年代和六十年 代，烃类代谢作为一个研究领域引起人们的极大关注，一方面作为一 种基础理论来研究，另一方面则是石油烃作为发酵工业底物的应用潜 力。七十年代以来，利用微生物技术在提高石油采收率和保护环境方 面都取得了很大进展，特别是在环境保护方面，微生物技术被认为是 很有应用前景的环境保护技术之一。 由于石油资源短缺，勘探费用不断增加，并且经注水采油后几乎 6 5 7 0 的原油仍留在油藏中，三次采油方法日益受到广泛的重 视，其中利用烃代谢微生物提高原油采收率的技术( m i c r o b i a l e n h a n c e0 i lr e c o v e r y ，m e o r ) 是最有希望的方法之一。 环境污染是人类目前面临的严峻挑战之一，其中石油工业的发 展所造成的环境问题更受到全世界的普遍关注。石油在储存、运输和 加工过程造成的环境污染已威胁到人类和其他生物的生存和发展。了 解石油烃污染物在自然界的生物降解转化规律，研究石油烃污染物生 物降解的技术和方法，培养能高效地降解石油烃的工程菌，消除和减 少污染石油烃在环境中的滞留，将有利于维护和创造高质量的人类生 存环境。 1 1 微生物对石油烃的降解作用及机理 石油是天然生成的各种烃类化合物的混合物，并含有少量氮、 氧、硫等杂质。石油的组成十分复杂。根据石油中不同化合物的成 分和结构特点，将石油中化合物分为饱和烃、芳香烃、非烃和沥青质 1 1 】。自然界中能降解石油烃的微生物广泛存在于土壤、地下水、海 洋、湖泊等环境中 2 1 ，天然微生物种群对石油烃的降解作用是石油烃 和其他烃类污染物从环境中消除的基本原理之- - k 钔。 每年都有大量的石油污染物进入土壤、地下水等环境体系中， 被石油烃污染的土壤和地下水利用微生物的降解作用可有效的除去烃 类污染物，把烃类转化为无毒产物一二氧化碳和水拈l 。a t l a s 等发现 被油污染的土壤和地下水利用微生物的降解作用可有效地除去石油烃 污染物，把烃类转化为无毒的产物一二氧化碳和水 6 1 。w a n g 和 b a r t h a f 7 1 对泄露燃油污染的土壤进行的实验表明生物降解可极大的降 低燃油残留物的毒性和持久性，燃油污染的土壤在4 - 6 周的微生物处 理后，植物就可以在其上生长。w a n g 等人【8 1 报道微生物降解处理可 在十二周内将石油芳香烃几乎完全除去，而在无微生物处理的情况 下，1 2 5 一3 2 5 的较高分子量的芳香烃依然存在。s o n g 等人吲用 汽油、航空燃料、机油、加热油和船舱油在土壤中进行了生物降解研 究发现微生物降解处理在一年内就可把污染石油烃减少到极低的程 度。1 9 8 9 年，e x x o n 石油公司的油轮在阿拉斯加p r i n c ew i l l i a n 海湾 发生溢油事故，溢油量达4 1 7 0 m 3 ，污染海岸线长达5 0 0 6 0 0 公里， 该公司用土著微生物及添加营养物的方法取得成功【1 0 】。约1 0 1 4 天 后，经过处理的岩石表面的油量显著减少，与未处理区域形成鲜明对 比。美国东部的一家木材处理厂用微生物技术处理受杂酚油污染的污 泥，一周后，使菲、蒽混合物的含量从3 0 0 0 0 0 m g k g 降低到 6 5 m g k g ，苯并( a ) 芘从1 1 0 0 m g k g 降到检测限以下f ( 3 m g k g ) ”。在合适的实验条件下，微生物降解石油烃的速率大约是每天 2 5 0 0 一1 0 0 0 0 0 9 m 3 ；在现场条件下，微生物降解烃类化合物的速率要 小的多，大约为每天0 0 0 1 6 0 9 m 3 1 2 1 。 相同条件下，微生物对不同种类的烃的降解能力是不同的。陈 传平等人进行了原油的好氧微生物降解实验，结果表明原油经降解后 饱和烃的含量急剧下降，而沥青质和非烃的含量均显著增加。这种现 象可能是由于微生物优先降解饱和烃，一方面使原油中其他组分相对 富集；另一方面，微生物在代谢过程中产生了大量非烃化合物，引起 了原油中沥青质和非烃化合物的急剧上升。从红外谱图可见含杂原子 化合物相对于烃类物质在不断增加。实验也表明微生物优先降解较短 链的烃类。就异构烷烃与正构烷烃而言优先降解正构烷烃。实验还表 明有有机酸生成【1 ”。v e n k a t e s w a r a n 和h a r a y a m a 用阿拉伯轻原油进 行实验发现，在反复培养中稳定的一个微生物培养基在1 0 天内把原 油中的饱和烃部分降解了4 5 ，芳香烃部分降解了2 0 ；而在残留 原油上筛选了六次而得到的一个微生物种群能把原油中7 0 的饱和 烃和3 0 的芳香烃降解掉【1 4 1 。组成原油的各种烃类，包括饱和烃、 芳香烃等，都可被微生物作为唯一的碳源而进行降解，这种降解在很 大程度上取决于化合物的化学结构和环境影响因素【”】，一般情况下 正构烷烃的氧化比芳香烃和萘的氧化都要迅速的多u 6 。高分子量芳 香烃和沥青质则具有较强的抗降解能力，尽管他们也能以极低的速率 被降解【6 1 。w a l k e r 和c o l w e l l 发现正十六烷的矿化速率大于萘，萘的 矿化速率大于甲苯，甲苯的矿化速率大于环己蒯1 7 1 。r o u b a l 和a t l a s 发现石油烃的生物降解活性有如下顺序：正十六烷大于萘 姥鲛烷 苯基蒽t 1 8 。l e e 发现烷烃和低分子量芳香烃( 如苯、甲苯、萘、甲基 萘等) 在河水中被微生物降解为二氧化碳。但高分子量芳香烃相对难 于被微生物降解【l9 1 。能降解聚核芳香烃的微生物已经分离出来了， 他们能够降解原油中的一部分芳香烃【2 0 1 。h e r b e s 和s c h w a l l 发现石油 污染沉积物中聚芳香烃转变时间从萘的7 1 小时上升到葸的4 0 0 小 时，苯基葸的1 0 0 0 0 小时，苯并芘的3 0 0 0 0 小时。聚核芳香烃倾向于 仅仅部分地而不是全部地降解为二氧化碳【2 1 1 。b e r t r a n d 等人【2 2 】发现沥 青和非烃等原来认为不能降解的烃类发生了微生物降解，能以非烃为 唯一碳源而生长的假单胞菌株已分离出来【1 4 i ；r o n t a n i 等人 2 3 】也找到 了沥青质共氧化的证据；他们发现沥青化合物在混合菌种的降解取决 于正十二到正十八烷的存在。 尽管微生物对烃类的降解作用因石油烃的不同而有很大差异， 但各类烃的降解与作用时间可能存在一定的数学关系。c h a i n e a u 等 研究了土壤微环境中石油烃的微生物降解作用。石油烃的降解量与作 用时间成对数关系【2 4 1 。实验结束，百分之七十五的原油被降解。饱 和烃中，正和支链烷烃在十六天内几乎全部降解，百分之二十二的环 烷烃未被降解；芳香烃有百分之七十一被同化；占原油总重量百分之 十的沥青质完全的保留下来。他们发现，石油烃浓度降低量与微生物 作用时间成对数关系：( h c = 1 6 9 9 4 4 1l l o g t ，r 2 = 0 9 7 7 ) ，正构烷烃的降 解量与微生物作用时间成线性关系( n a l k a n e = 2 7 8 1 7 5 t ，r 2 = 0 9 9 1 ) ，没 有观测到奇数正烷烃和偶数正烷烃的代谢差别，支链烷烃的代谢速率 比正连烷烃慢的多，其降解量亦与作用时间成线性关系f b r a n c h e d a l k a n e = 3 5 4 8 3 t ，r 2 = 1 0 0 0 ) ，姥鲛烷和植烷在6 0 天后才开始降解。饱 和烃降解与时间成对数关系( s a t u r a t e dh c = 1 0 5 8 2 6 0 1 0 9 t r 2 = 0 9 3 9 1 。 气相色谱可鉴别的化合物都发生了程度不同的降解，沥青质没有明显 变化。 石油中各种质量的烃的含量影响单个烃类组分的降解能力。 m u l k i n s - p h i l i p s 和s t e w a r t 发现委内瑞拉原油中正构烷烃的降解要 比阿拉伯原油中同一正构烷烃的降解难 25 。w e s t l a k e 等测定了原油 组成对石油烃降解的影响，发现混合菌利用烃作为唯一碳源的能力不 仅取决于不饱和部分的组成，而且取决于脂肪烃部分的组成【2 6 1 。 对石油烃化合物代谢的途径进行了一些研究。饱和烃包括正构 烷烃、支链烷烃和环烷烃。正构烷烃通常被认为是石油烃中最易降解 的化合物。通常认为，源于烷烃的醇在醇脱氢酶的作用下被氧化为相 应的醛，醛则通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸，源于烷烃的脂肪酸 经过可诱导的b 一氧化系统进行氧化，偶碳链烷烃被认为氧化成醋 酸，而奇数碳链烷烃则被氧化成丙酸，随后，醋酸在克雷伯氏循环 ( 三羧酸循环) 中被氧化。在烷烃氧化过程中，具有决定性作用的代 谢机理是脱氢作用、羟化作用及氢过氧化作用，它们都得到严密和规 范程度的实验证据所证实。烷烃氧化作用的途径有单末端氧化、双末 端氧化和次末端氧化，简单机理如下 2 7 2 8 2 9 1 ： 烷烃脱氢成为烷1 烯，随后水化形成伯醇： r c h 2 一c h 3 + n a d ( p ) + 一r c h = c h 2 + n a d ( p ) h + h + 一r c h 2 一c h 2 一o h 在有分子氧和还原剂存在时，羟化反应由种混合功能氧化酶 ( 加单氧酶) 催化，使烷烃转化为伯醇。氧分子中的一个氧原子被结 合到烷烃中，而另一个则被还原成水： r c h 2 c h 3 + 0 2 + n a d ( p ) h + h + 一r c h 厂c h 2 一o h + n a d ( p ) + 十h 2 0 氢过氧化作用包括分子氧通过加双氧酶的作用掺入烷烃中，产 生一个正烷基过氧化氢，然后还原为伯醇： r c h 广c h 3 + 0 2 一r c h 2 一c h 2 - - o o h + n a d ( p ) h + h + 一r c h r o h + n a d ( p ) + + h ，0 烷烃的双末端氧化途径是烷烃经过典型的单末端氧化途径后转化 成相应的脂肪酸，然后该脂肪酸又被氧化成u 羟基脂肪酸，最后， u 一羟基脂肪酸被氧化成二元羧酸： h 3 c 一( c h 2 ) 。- - c h 3 ( 正烷烃) + 0 2 一h 3 c 一( c h 2 ) 。- - c h 2 0 h ( 脂肪伯醇) 一h 3 c 一( c h 2 ) 。c h 0 ( 脂肪醛) 一h 3 c 一( c h 2 ) 。- - c o o h ( 脂肪酸) l l o l 2 c 一( c h 2 ) ，厂_ c 0 0 h ( 一羟基脂肪酸) 一0 h c 一( c h 2 ) ，广 c o o h ( 一醛基脂肪酸) 一h o o c 一( c h 2 ) 。一c 0 0 h ( 二羧基脂肪酸) 烷烃次末端氧化是对烷烃单端氧化的一种次要的补充途径，烷 烃次末端氧化途径的第一中间产物是一种仲醇，它随后被氧化成酮： h 3 c 一( c h 2 ) ll c h 3 ( 正十三烷) 一h 3 c 一( c h 2 ) l o c h ( o h ) 一c h 3 - h 3 c ( c h 2 ) 1 0 一一c o c h 3 h 3 c ( c h 2 ) 9 c h z - o c o c h 3 一h 3 c 一( c h 2 ) 9 一c h 2 0 h ( 十一烷基- i - 醇) + c h 3 c o o h ( 醋酸) 一h 。c 一( c h ，) 。c o o h ( 十一烷基酸) 不同的微生物氧化支链烷烃和或依靠支链烷烃生长的能力是不 图i 姥鲛烷降解途径 同的，通常，甲基支链增强烷烃的抗蚀能力，支链烷烃的氧化还会受 到正构烷烃氧化作用的抑制【3 0 】。例如，s c h a e f f e r 等发现末端支链阻 止烃类被微生物降解，b 位的甲基支链阻止b 氧化，发生氧化需通过 其他途径，如a 氧化、b 氧化或者移去d 烷基e a t 。m c k e n n a 和k a l i o 从土壤中分离出一种棒状杆菌，可把姥鲛烷氧化成4 ，8 ，1 2 一三甲基十 三烷酸及2 一甲基戊二酸( 如图i ) 。 这两种酸的分离和鉴定表明，在这种生物中存在着两条氧化途 径，b 一氧化以及一氧化接着b 一氧化 32 。通过红斑短杆菌进行的正 烷烃和支链烷烃的代谢研究进一步证明存在分支代谢途径。姥鲛烷的 进步代谢是姥鲛烷的氧化，包括姥鲛酸氧化成姥鲛烷二酸，然后进 行连续的d 一氧化，或者姥鲛烷氧化成4 ，8 ，1 2 一三甲基十三烷酸，接 着进行0 一氧化 3 引。2 ，6 ，1 0 一三甲基十一烷酸的形成被认为是代谢 终点，这是由于2 一甲基的分支模式抑止脂肪酸的活化，使其不能进 入下一个b 一氧化循环。 脂环烃类化合物的微生物降解已经有所报道。s t i r l i n g 等 3 3 1 用 甲基环己烷作底物从港湾泥坪中分离出诺卡氏菌属的一个菌株，他能 利用环己烷作为生长底物。环烷烃被氧化为元醇，并在大多数研究 的细菌中环烷醇和环烷酮通过内脂中间体的断裂而代谢。t r u d g i l l 曾报导，它们检测过的大多数利用环己醇的微生物菌株，也能在一些 脂环类化合物中生长，包括环己酮、顺一和反一环己烷一l ，2 一二醇和2 一 羟基环己酮 3 4 。环己烷分解代谢的可能途径如下 3 3 1 ( 图2 ) ： o 一0 0 h 0 0 一0 0 一氍 图2 环己烷降解途径 烷基取代的脂环化合物可能被氧化的两个位置是脂环的侧链和脂 环上，脂环化合物的化学性质、微生物的属种和环境因素都将影响反 应的初始位置。 真菌和微生物所具有的酶功能，都能氧化大小从苯到苯并蒽范 围内的芳香烃底物。起初细菌通过把分子氧的两个氧原子结合到底物 中，使芳烃氧化成一种具有顺式构型的二氢二酚e 3 5 。这种反应由加 双氧酶所催化，它是一种多成分的氧化酶系，由素黄蛋白、铁一硫蛋 白和铁氧还蛋白组成 36 i 。顺式一二氢二酚类的进一步氧化导致儿茶酚 类的形成，它是引起芳环酶裂解的另一种加双氧酶的底物t 3 7 ) 。与细 菌相反，真菌经过细胞色素p - 4 5 0 催化的加单氧酶和环水解酶反 应，把芳烃氧化成反式一二氢二酚类，这些反应看来与那些报道过的 哺乳动物酶系的作用相类似 3 引。如图3 ： 芳烃 r且 缁、o h 净o h h 威二氢二酚 一埏 顺式二氢二酚儿茶酚 图3 芳香烃降解机理 紫红假单胞菌和铜绿假单胞菌通过儿茶酚和顺式一、反式一粘康 酸降解苯 16 。甲苯在微生物作用下，在甲基处被氧化为苯甲酸，或 是在芳香烃环上形成具有顺式构型的二氢二酚n 7 一s i 。细菌对萘的初 始氧化作用，是把分子氧的两个氧原子结合到芳香烃分子上形成顺式 一l ，2 一二羟基一1 ，2 一二氢萘，然后把顺式一1 ，2 - 二羟基一l ，2 二氢萘转 变为1 ，2 - 二羟基萘，1 ，2 一二羟基萘在脱氢作用后发生环的断裂而产 生水杨醛和丙酮酸，随后水杨醛被氧化成水杨酸，后者通过水杨酸羟 化酶转化为儿茶酚 1 9 2 0 i 。图4 对各种芳香族化合物的微生物降解途 h ：y i 上：0h 嚣 也一 h ，h 付 痰一 径进行了归纳 。由图可知，苯、酚、萘、甲苯、邻氨基笨酸、扁 桃酸等经微生物氧化分解，生成儿茶酚；而苯甲酸、m 一甲酚、i n 一硝 基苯酸、p 一硝基苯酸、p 一甲氧基苯酸、奎尼酸、莽草酸、香草酸 等，经微生物氧化降解为原儿茶酚，有少量m 一甲酚可通过另一途径 降解为龙胆酸。微生物对芳香烃降解的起始途径是多样的，但关键性 的中间产物具有一致性。邻苯二羟基类化合物儿茶酚和原儿茶酚就是 大多数芳香烃化合物在微生物代谢过程中的中间产物，又是环开裂前 共同的先导性中间产物。所以，各种芳香烃化合物降解的最初步骤可 能各不相同，但他们往往有共同的中问产物双酚类化合物。关键 性中间产物进一步的生物降解途径也是多样的，儿茶酚和原儿茶酚的 环若按邻位断开，生成1 3 一酮己二酸，然后进一步代谢；儿茶酚和原 儿茶酚的环若按间位断开，则生成丙酮酸和乙醛。 b 一酮己二醴j 阿酮艘- 己醛 蜒胡索隘、丙酮酸 图4 各芳香烃的降解途径 另外，在无氧的情况下，一些兼性厌氧微生物利用除氧以外的 物质作为电子受体，以芳香烃为电子供体，进行降解作用获得化学能 量，同时将芳香烃微生物降解。厌氧环境大致分为四种：发酵严格 的产甲烷环境；以硝酸盐为最终电子受体m ，；以硫酸盐为最终电子 受体【删及以f e ( i ) 为最终电子受体4 1 4 2 1 。氧化机理哪! 如图5 ： 七h 2 0 由 人 u ，c 0 鬯o “ l 、j 一 图5 芳香烃厌氧降解的一般途径 在与水中氧发生起始反应后生成醇( 苯基醇) 或酚( 对或邻甲 酚) 后，这些化合物逐渐被进步氧化为芳香酸( 苯甲酸、对羟基苯 甲酸或邻羟基苯甲酸) ；然后经过含氧芳香烃的典型转化途径，包括 环氧化、开裂和脂肪类中间产物的降解( 醇、酸) ，最终形成气体产 物。因此，可以认为芳香烃的厌氧转化遵循一般的芳香烃转化途径， 但必须通过氧化引起。产甲烷条件下转化的同素单环芳香烃包括苯、 甲苯、邻一二甲苯、间一二甲苯、对一二甲苯和乙基苯 4 85 0 。一些 聚环同素芳香烃也能在厌氧条件下进行微生物降解 5 h5 2 。 对芳香烃降解的动力学研究发现，芳香烃降解的优先顺序通常 是：单环芳香烃 双环芳香烃 三环芳香烃 22 i 。在烷基芳香烃中，由 于烷基取代基的大小、取代位置及烷基芳香烃的立体结构的影响，出 现了一些与上述顺序不一致的情形。w a r d r o p e r 等的现场和实验表 嫁 删 拶 6 一占 一 。一 6 o 明，单一和三一芳香淄族烃( 2 0 r ) 优先于单一和三一芳香淄族烃 ( 2 0 s ) 的同种烃的降解 。r a y m o n d 等报道，d 一烷基萘比a 一异构 体更易降解，且通常p 一烷基萘比a 一异构体相对降解较快 2 4 】， s o l a n a s 等发现阿拉伯轻原油中c ，和c 烷基萘降解时( b p 2 0 0 ) ，烷基萘的抗蚀性随烷基的数目和大小的不同而不同 2 5 i 。 r o w l a n d 等在室内和实地( 油储存地) 测定中表明萘和烷基萘都发生 了降解，并且随环上烷基数目和烷基的大小而降解程度不同，烷基数 目愈多，烷基愈大，降解愈困难，并且同一烷基萘的立体异构体降解 能力也不同，这可能是由于空间位阻效应的影响。基于目前的资料和 实验结果得出抗蚀性一般顺序是：双环芳香烃 - - 环芳香烃且c 。 c ， c 。 c a c 。( n 为烷取代基碳数) 2 5 1 2 8 i 。通常认为直链烷烃是最 容易被降解的 29 | ，然而有一些研究发现低分子量芳烃比烷烃更容易 地受到微生物的攻击【3 ，f o g h t 等【3 2 1 认为降解脂肪烃的微生物与降 解芳香烃的微生物是不同种的，能利用十六烷的微生物不能在菲上生 长，反之亦然。有意思的是至少一些聚环芳香烃的降解酶是由低分子 量的芳香烃来诱导的 3 州，这一发现也许可以解释这些化合物较强的 抗蚀性。尽管降解速率很低，这些化合物最终将被转化为二氧化碳和 水。 芳香烃的有氧降解是环境中污染芳香烃去除的主要途径。几乎 所有的芳香烃均可在有氧的条件下为微生物所降解，尽管这种降解有 时是极其缓慢的。 石油烃的微生物降解已是不争的事实，这一技术已得到广泛的 应用，在石油工业利用来提高石油采收率一第三次采油，在环境保护 方面利用来除去有机污染物。微生物对石油烃的降解会受到环境因素 的影响，这种影响对烃的降解具有决定性的作用。 1 2 影响石油烃生物降解的环境因素 环境中石油烃的微生物降解速率是由降解微生物种群、这些种 群的代谢能力和影响降解的非生物因素 5 4 ，5 s 。环境中石油烃的命运 很大程度上取决于影响熟化的非生物因素。影响细菌生长速率和酶活 性的因素将影响石油烃生物降解速率。石油烃的持久性取决于烃混合 物的量、所含烃类的分子量以及所在生态系的特性。石油烃在一种环 境中能无限期存在，而在另一种环境中相同烃在相当短的几天或几小 时内完全被降解掉。 石油烃物理状态对其生物降解有显著影响。在水体系中，油通 常是形成薄层，油的分散程度部分地决定了烃降解微生物能接触到的 油的表面积。烃降解微生物主要在油水界面活动。可获得的界面积的 增加将促进生物降解，不仅使石油烃更易到达微生物，而且进入水体 的乳化液滴使氧和营养物更易为微生物得到。在一些情况下，好的乳 化使烃类形成微小液滴，这种情况下烃更易发生微生物降解，类似于 溶解烃 56 5 7 , 5 8 。w o d z i n s k y 和l a r o e e a 发现液体芳香烃在水烃界面被 细菌利用，而固体芳香烃则不能被细菌利用。在3 0 。c 时二苯基甲烷 是液体并能被降解，但2 0 h e _ - 苯基甲烷是固体形式而不能被降 解，他们发现萘固体不能被降解而溶于液态烃中则可以旧9 。一些烃 降解微生物产生乳化剂 60 6 1 , 6 2 , 6 引，一些情况下乳化剂是脂肪酸或脂 肪酸衍生物。另些情况下更复杂的聚合物是活性乳化剂。乳化剂可 促进石油烃在水体系中的分散。就微生物降解而言，烃溶解和乳化对 降解速率有积极影响。如无产生抑制作用的毒性影响，油的分散应能 促进微生物烃降解。 温度对微生物降解石油烃化合物的影响主要是对石油烃物理状 态、化学组成的影响( 特别是对微生物可接触到的烃表面积的大小以 及挥发后供微生物降解的烃类的组成的影响) 以及对微生物本身活性 的影响5 4 ，5 5 | 。 z o b e l l 和t r a x l e r 报道了0 以下的降解 6 4 ，6 5 。s e x s t o n e 等 发现冻土带土壤中油降解伴随着极性类脂化合物在土壤中的积累 。66 “川。k l u g 和m a r k o v e t s 以及 f i a t e l e s 等报道了7 0 。c 左右的烃类降 解 6 8 6 9 7 0 。z o b e l l 发现烃降解在2 5 时比5 大一个数量级以上 7 1 j 。g u n k e l 发现低水温时极低的烃降解速率 7 引。l u d z a e k 和k i n k e d 发现机油在2 0 时迅速降解，而在5 时则降解缓慢m 。w a r d 和 b r o c k 研究了环境因素对温暖湖水中烃降解速率的影响。他们发现烃 降解微生物整年活动，但烃氧化速率有季节变化，石油烃降解速率与 温度相关盯4 i 。d i b b l e 和b a r t h a 发现烃从新泽西油污染区域消失速 率显示出与月平均温度有特定的关联 75 | 。较高的温度有利于烃类的 降解，特别是在3 0 4 0 ，高于此温度烃的毒性增强 76 | ，一些耐热 烃降解微生物已经从深海排热口地带分离出来了 7 7 ，7 8 | 。 a t l a s 和b r t h a 发现温度影响因石油烃混合物中烃组成不同而不 同，低温阻止轻烃挥发，其中一些具有毒性。这些毒性化合物的存在 能阻抑微生物对石油烃降解 7 9 | 。 微生物代谢需要氮、磷等营养物地参与，营养物是影响微生物 降解的重要因素之一。在被污染的环境体系中，石油烃是微生物可以 利用的大量碳底物，但它只能够提供有机碳而不能够提供其他营养 物，因而氮、磷常常是限制微生物活性的重要因素，为了使污染物完 全降解，适当的添加外源营养物具有重要作用。s t e p h e n r h u t c h i n s 等 8 0 研究了通过向含苯、甲苯、乙苯和航空燃油等石油烃 的污水中添加n 源促进生物修复的研究，苯类化合物的降解率达到 6 6 ，厌氧微生物在系统中起主要作用，通过反硝化作用，在水面下 形成可积聚石油烃的核心，从而加速石油的降解作用。f d o r a k 和 w e s t l a k e 发现不加营养物芳香烃比饱和烃更易受到土壤和海洋中微 生物的攻击。加入氮、磷对饱和烃降解的促进作用比对芳香烃降解的 促进作用强烈。w e s t l a k e 等测定了加拿大西北地区土壤中的石油降 解情况 26 i 。在那儿含氮、磷的肥料加入后，细菌数量迅速增加，正 构烷烃和异戊二烯类烃随之迅速消失，回收油中饱和烃化合物的含量 不断减少。d i b b l e 和b a r t h a 测定了海水中的铁对石油微生物降解 的影响，在轻污染且含铁少的海水样品中，该原油的微生物降解速率 要慢的多，3 天内原油只降解了2 1 。加入螯合型铁后，降解速率明 显增大8 1 | 。 添加外源营养物，并非越多越好，只有在一定量的范围内，才 能具有促进作用。o u d o t 等 1 0 2 3 在法国b r e s t 海湾进行了一个添加缓 释肥料对原油污染地的生物修复实验，结果表明，如果污泥中含有 1 0 0 u m o l l 的n ，则生物修复的所需营养物充足，无需添加外源营养 物。如果营养物的浓度很高，则只能促进n 的循环和硝化细菌的活 性，但对石油降解的促进作用很小。 微生物不仅可在有氧条件下降解石油烃，而且在无氧条件下也 可以氮、硫、铁( i i i ) 为电子受体对石油烃进行厌氧降解。可见氧并 不是石油烃微生物降解地必要条件。然而，自然环境中微生物的有氧 降解是石油烃最主要的降解方式。h a m b r i c k 等发现，p h 值在5 到8 的河口沉积物中烃降解在很大程度上取决于可获得氧量。烃降解速率 随氧含量减少而降低【82 | 。j a m i s o n 等研究了受石油烃污染的地下水 中的微生物对烃类的降解情况，加营养物而不充气则不能促进降解， 但当供给氧和营养物质时，烃降解速率大大加快 83 | 。j o h n s t o n 测定 了含原油的沙柱中氧的消耗，氧浓度在间隙水中迅速减少。1 0 摄氏 度四个月中，氧耗平均速率是0 4 5 9 m 2 天，对应于油降解速率 9 0 m g m 2 天 84 | 。w a r d 等把有氧和无氧条件下沉积物中烃的氧化速率 作了比较，发现产生二氧化碳的速率在无氧条件下比有氧条件下低几 个数量级。无氧条件下，在2 3 3 天的培养中被氧化成二氧化碳的烃 的量少于5 ，与之对照的有氧条件下1 4 天即可达到2 0 8 5 。由此可 见氧对烃的降解的重要性。 微生物所处环境的盐度和压力也会对微生物的代谢活动产生影 响。w a r d 和b r o c k 测定了高盐环境中的烃降解，当烃类加入到不同 盐度( 3 3 2 8 4 ) 的天然水样品( 来自于犹他大盐湖蒸盐池) 中，这些化合物代谢速率随盐度降低而降低 86 。s c h w a r z 等测定了 深海细菌在大气压力和现场压力下的生长和对烃类的利用。在高压和 室温下烃利用速率不如室温和大气压力下明显，此实验中，正十六烷 在1 m p a 的压力下，8 周时间内降解了9 4 ，而在5 0 0 m p a 的压力下要 达到相同程度的降解需4 0 周的时间旧7 ，8 8 , 89 | 。 1 3 微生物代谓f 石油烃在采油方面的应用 微生物能够利用烃类作为唯一的碳源和能源，而且这种利用能 力主要依赖于烃类混合物中各化合物的性质。微生物采油是这一理论 在石油工业领域的开拓性应用，它是一项利用微生物的活动及其代i 身 产物强化采油的技术( m e o r ) ，主要机理是微生物使重烃降解，降 低原油粘度，其代谢物能降低油一水一岩石界面张力，改善油一水流 度比，增加驱油效率和波及面积，代谢过程中产生的气体能改变油的 流动能力，增加油层岩石的渗透性。从而提高石油采收率。 白1 9 4 6 年z o b e l l 获得第一项微生物采油专利以来，该项技术 的研究与应用取得了明显进展。1 9 5 4 年，美国c o t y 等人首次进行了 微生物采油的矿场试验。7 0 年代，波兰、捷克、罗马尼亚、前苏 联和加拿大等国相继进行了许多矿场试验，多数取得了较好的效果， 从8 0 年代起，世界各国对m e o r 越来越重视，该领域的研究更加活 跃，几乎每年都召开这方面的地区性或国际性学术会议，出版论文集 和专著，矿场试验也逐年增加。美国是m e o r 的开创者，m e o r 的发展 现状基本上代表着世界m e o r 的水平，8 0 年代，m e o r 的研究取得了 突破性进展，现已发展到商业化应用阶段。影响较大的