（农产品加工及贮藏工程专业论文）膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理.pdf

福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 摘要 藻红蛋白是一种高分子色素物质，作为江蓠琼胶工业的副产物，这一资源目前尚 未得到充分利用。本研究应用膜分离技术提取藻红蛋白、并从江蓠碱浸提液中分离出 糖类、蛋白质等生物活性物质，同时回收废碱液，达到江蓠综合利用的目的，既节省 水资源又可降低污染，实现清洁生产。研究结果如下： 1 、藻红蛋白提取与分离采用组织捣碎及水浸等破壁方法，使胞内藻红蛋白溶 出，粗提液经膜过滤、离心，再经盐析，羟基磷灰石吸附层析以及s e p h a d e xg 一1 0 0 层 析进行分离纯化，纯化后的藻红蛋白出现三个吸收峰，分别在4 9 8 n m 、5 3 5 n m 、5 6 5 n m ， 经测定o d 5 6 5 姗与o d 2 8 0 n n 比值为5 0 。 2 、江蓠琼胶碱处理生产工艺研究在探讨不同碱处理条件，温度、时间以及碱 浓度对江蓠琼胶出胶率影响的基础上，采用正交试验优化江蓠琼胶生产工艺。提出了 江蓠琼胶生产工艺条件为：碱处理时间为6 0 m i n ，碱处理温度为9 0 ，碱浓度为5 ， 提取率达1 8 8 。 3 、江蓠藻酸化漂白工艺的研究研究有效氯质量分数、漂白时间、酸化时间、 酸化液p h 对出胶率的影响后，采用正交试验优化江蓠藻酸化漂白工艺。江蓠藻酸化 漂白工艺条件为：漂白液有效氯质量分数0 1 1 ，漂白时间6 m i n ，酸化时间为5 r a i n ， 酸化液p h 值为1 2 8 。 4 、膜分离技术回收江蓠碱处理液采用超滤技术对江蓠碱处理液进行处理，分 别采用透过孔径为0 1p 、1 0 0 k d a 、5 0k d a 、2 0k d a 、5k d a 的超滤膜，对江蓠碱处 理液进行超滤，超滤浓缩后分别测定透析液和浓缩液中总糖、还原糖以及蛋白质的含 量。结果表明，经孔径为5 k d a 的膜过滤后，透析液中总糖、还原糖以及蛋白质含量 明显降低，而浓缩液中总糖、还原糖以及蛋白质含量大幅增加。达到循环使用废碱液， 降低环境污染目的。 关键词：膜分离；藻红蛋白；琼胶；碱处理；酸化漂白：综合利用 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 a b s t r a c t a st h eb y - p r o d u c t so fg r a c i l a r i aa g a ri n d u s t r y , p h y c o e r y t h r i nw h i c hc h a r a c t e ri s s i m i l a rt ot h ep o l y m e rp i g m e n t ，b u tw eh a v en o ty e tl e a r n e dh o wt or e u s et h e ma sf u l l ya s w ec a n t h i st h e s i si sc o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fg r a c i l a r i aa l g a e u s i n gt h em e m b r a n e s e p a r a t i o nt e c h n o l o g yt oe x t r a c tp h y c o e r y t h r i n ，a g a r ， s u g a r ，p r o t e i na n do t h e ra c t i v e s u b s t a n c e s r e c y c l i n gt h ew a s t e da q u e o u sa l k a l ia n dm a k i n gt h ee f f e c t i v ei n g r e d i e n tt ob e u s e dc o m p r e h e n s i v e l y b o t hs a v i n gw a t e rr e s o u r c e s ，e l i m i n a t e dt h ep o l l u t i o na n da c h i e v i n g t h ep u r p o s eo fc l e a n i n gp r o d u c t i o nt e c h n o l o g y t h er e s u l t so f t h es t u d ya sf o l l o w s ： 1 、p h y c o e r y t h r i ne x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n u s i n g t h ei m m e r s i o na n db r e a k i n gm e t h o d st oe x t r a c t p h y c o e r y t h r i n f r o m g r a c i l a r i a t h ec r u d eo f p h y c o e r y t h r i n c o n c e n t r a t e db ym e m b r a n es e p a r a t i o n t e c h n o l o g y , c e n t r i f u g i n g ，a n d t h e n b y t h e s a l t i n g - o u t ，h y d r o x y a p a t i t ea d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y a n ds e p h a d e xg 10 0 c h r o m a t o g r a p h y a n do t h e r s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o nm e t h o d s ，t h ep r o d u c t i o nw h i c hp u r i t yc a nr e a c h5 0 i so b t a i n e d t h e r ea r e t h r e ea b s o r p t i o np e a k s ，r e s p e c t i v e l ya t4 9 8 n m ，5 3 5 n m ，5 6 5 n m 2 、s t u d yo nt h ee f f e c to fa l k a l i - t r e a t m e n td u r i n gt h ep r o c e s s i n go fa g a rf r o mg r a c i l a r i a o nt h eb a s i so fs i n g l e - f a c t o r , s t u d yt h ed i f f e r e n tc o n d i t i o n so fa l k a l it r e a t m e n t ，s u c ha s t h et e m p e r a t u r eo fa l k a l it r e a t m e n t ，t h et i m eo fa l k a l it r e a t m e n ta n da l k a l ic o n c e n t r a t i o n , u s i n gt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a lt oo p t i m i z et h ep r o d u c t i o np r o c e s s i n go fa g a rf r o m g r a c i l a d a t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sd u r i n gt h ep r o c e s s i n go fa g a rf r o mg r a c i l a r i aw a s t h a t ：t h et i m eo fa l k a l it r e a t m e n tw a s6 0m i n u t e s ，t h et e m p e r a t u r eo fa l k a l it r e a t m e n tw a s9 0 ，t h ea q u e o u sa l k a l ic o n c e n t r a t i o nw a s5 ，u n d e rt h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h e e x t r a c t i o ne f f i c i e n c yo f t h ea g a rf r o mg r a c i l a r i aw a s18 8 3 、s t u d y o nt h ee f f e c to fa c i d i z ea n db l e a c h i n gt e c h n o l o g yd u r i n gt h ep r o c e s s i n go fa g a r f r o mg r a c i l a r i a o nt h eb a s i so fs i n g l e - f a c t o r , s t u d yt h ef a c t o r sw h i c hi m p a c to fa g a rr a t e ，s u c ha sm a s s f r a c t i o no fc h i o r i n e ，t h et i m e o fb l e a c h i n g ，t h et i m eo fa c i d i f i c a t i o n ，t h ep ho fa c i ds o l u t i o n ， u s i n g t h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a l t o o p t i m i z e t h ea c i d i f i c a t i o na n db l e a c h i n g 福建农林人学硕士学位论文 膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 t e c h n o l o g y t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sd u r i n gt h ea c i d i z ea n db l e a c h i n gt e c h n o l o g yw a st h a t ： t h em a s sf r a c t i o no fc h l o r i n ew a so 11 ，t h et i m eo f b l e a c h i n gw a s6m i n u t e s ，t h et i m eo f a c i d i f i c a t i o nw a s5m i n u t e s ，t h ep ho fa c i ds o l u t i o nw a s1 2 8 4 、u s i n gt h em e m b r a n es e p a r a t i o nt e c h n o l o g yt or e c o v e r yt h ew a s t ea q u e o u sa l k a l i r e s p e c t i v e l yu s i n g 0 1p , 1 0 0 k d a , 5 0 k d a , 2 0 k d a , 5k d am o l e c u l a rw e i g h to f m e m b r a n et of i l t r a t et h ea q u e o u sa l k a l i t h e nd e t e r m i n et h ec o n t e n to ft o t a ls u g a r , r e d u c i n g s u g a ra n dp r o t e i ni nd i a l y s a t ea n dc o n c e n t r a t e ds o l u t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： f i l t r a t e da f t e r5 k d am o l e c u l a rw e i g h to fm e m b r a n e ，t h e r ea r ev e r ys m a l lc o n t e n to f t o t a ls u g a r ，r e d u c i n gs u g a ra n dp r o t e i ni nd i a l y s a t e h o w e v e r , i nc o n c e n t r a t e ds o l u t i o nt h e c o n t e n to ft o t a ls u g a r , r e d u c i n gs u g a ra n dp r o t e i nw e r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y d i a l y s a t ec a l l b er e c y c l e d ，r e u s e d ，t h u sr e d u c i n gp o l l u t i o n k e yw o r d s ：m e m b r a n es e p a r a t i o nt e c h n o l o g y ；p h y c o e r y t h r i n ；a g a r ；a l k a l i - t r e a t m e n t ； a c i d i f i c a t i o na n d b l e a c h i n g ；r e c y c l i n gd i a l y s a t e i i i 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 一虢一：珈p 胪6 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 黼一躲糨隰厕弘、莎 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：彳叮e 日期：么v 、汐 l 指导教师亲笔日期 l 二 福建农林人学硕士学位论文 膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 第一部分绪论 1 膜分离技术 膜分离技术已经被国际上公认为2 0 世纪末至2 1 世纪中期最具有发展前途、甚至 会导致一次工业革命的重大生产技术。可称为当代前沿技术，是世界各国研究的熟点 【l 】 o 1 1 膜分离技术发展的历史及其阶段 膜现象的研究是从1 7 4 8 年h b b en o l l e t 发现水会自发地扩散穿过猪膀胱而进入 酒精中开始的，但是长期以来这一现象并未引起人们的重视，直至1 8 5 4 年g r a h a m 发现了透析现象、1 8 5 6 年m a t t e u c e i 和c i m a 观察到天然膜是各向异性的这一特征后， 人们才重视了膜的研究圈。同期d u b r u n f a u t 应用天然膜制成第一个膜渗透器并成功 地进行了糖蜜与盐类的分离，开创了膜分离的历史纪元并显示了它的优点，但天然膜 的使用存在着局限性，然而新的科学技术的发展，新的产业部门的兴起，要求开发新 的分离技术，从而引发出人工合成分离膜的设想和实践，1 8 6 4 年t r a u b e 成功地制成 了历史上第一张人造膜亚铁氰化铜膜，从而结束了科学家采用动物膜的时代，从此以 后，特别是本世纪开始，相继出现了超滤膜、离子交换膜、反渗透膜、微滤膜、纳米 膜等1 3 1 。 现代高分子膜分离技术研究的发展大致可分为三个阶段【4 】：( 1 ) 5 0 年代为奠定基 础阶段，( 2 ) 6 0 年代和7 0 年代为发展阶段，( 3 ) 8 0 年代和9 0 年代为发展深化阶段。 1 2 膜分离技术在分离工程中的重要作用及存在的问题 由于膜分离技术在分离物质过程中不涉及相变、无二次污染，由于分离中具有生 物膜浓缩富集的功能，同时它操作方便、结构紧凑、维修费用低、易于自动化，因而 它是现代分离技术中一种效率较高的分离手段，可以取代传统的过滤、吸附、冷凝、 重结晶、蒸馏和萃取等分离技术，所以膜分离技术在分离工程中具有重要作用【5 l 。当 然，它也存在有一定的问题如( 1 ) 在操作中膜面会发生污染，使膜性能降低，故有 必要采用与工艺相适应的膜面清洗方法，( 2 ) 从目前获得的膜性能来看，其对耐药性、 耐热性、耐溶性是有限的，故应用范围受限制，( 3 ) 采用膜分离技术效果有限，因而 往往都将膜分离工艺与其它分离工艺组合起来使用【6 】。 1 3 膜分离在生物工程中的应用 由于膜分离技术具有防止杂菌污染和热敏性物质失活等优点，所以在生物工程中 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 应用极为广泛。 1 3 1 细胞分离和发酵液澄清 在细胞分离上应用包括( 1 ) 整细胞收集：错流过滤不仅用于发酵生产中生物量 或胞外产物的细胞收集：( 2 ) 细胞碎片分离：例如用错流过滤分离基因大肠杆菌细胞 破碎液，可得含人生长激素9 0 的活性组份并除去细胞碎片：( 3 ) 细胞循环发酵：例 如用酿酒酵母进行乙醇发酵时，使发酵液连续通过膜，膜将细胞截留而让乙醇及起抑 制作用的副产物连续排至系统外，从而促进菌体的增殖，提高乙醇的生产能力，使发 酵操作连续化【丌。 1 3 2 除菌和纯化产品 采用超滤或反渗透去除医药用水中的热原，较之传统上使用的蒸馏法更节能和方 便，如英国制药公司于1 9 8 1 年初建设的带有反渗透法去热原的游离水生产装置要比 传统的蒸馏法优越得多，盐的去除率也在9 5 以上【8 1 。同样在氨基酸生产工艺中，使 用超滤法能除菌或去热原。 1 3 3 酶、蛋白质等大分子物质的浓缩和精制 采用超滤技术将粗酶处理，使低分子物质和盐类从膜孔渗除，使酶得到浓缩和提 纯，目前该技术用于分离细菌蛋白酶、戊基葡糖甘酶、粗制凝乳酶、凝乳酶、果胶酶， 胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶、肝素以及1 3 一半乳糖苷酶等，采用超滤法后可大大简化 工序，不仅可节能、降低操作成本，还可防止酶失活，从而大大提高了酶的收率【9 】。 1 3 4 低分子量发酵产品的分离与浓缩 抗生素、氨基酸等低分子量发酵产品可用纳米过滤进行分离，例如采用m p w 公司 生产的m p f - 5 0 纳米膜可以分离含抗生素的萃取液，其中透过该膜的是纯化了的有机 溶剂如乙酸丁酯，可继续作萃取剂循环使用，而浓缩液中为高浓度的抗生素等，对这 些产品的浓缩也可用反渗透方法，降低能耗和产品损失，如浓缩抗生素能耗只有真空 蒸发的1 3 ，而浓缩赖氨酸，其损失可控制在l 以下【1 0 1 。 1 3 5 膜反应器 利用膜制作成不同类型的膜反应器，有的用来使酶循环使用而合成甘油酯，有的 进行d l 氨基酸的切割，例如使n 一乙酰基一d 、l 蛋氨酸切割成l 一蛋氨酸，也可进行淀 粉的酶转化葡萄糖并进一步用酵母转化为乙醇，此外也可用膜反应器来生产单克隆抗 体等【1 1 】。 1 4 我国膜分离技术发展水平和动向 2 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 我国开发膜分离技术研究的特点是时问早、队伍大，领域广，但技术水平低，具 体表现在膜品种少，质量差，设备加工粗糙，大型化程度差，系统控制落后等方面n 2 1 。 近年来的研究注重于( 1 ) 微滤、超滤、反渗透等技术的开发方面取得重大进展， 产品用于各个领域，有些已在引进生产线中替代进口产品使用：( 2 ) 氢气分离系统开 发取得重大成绩，已工业化：( 3 ) 进行富氧膜的研究开发也取得成效：( 4 ) 进行渗透 蒸发研究，主要对象为含水乙醇的分离：( 5 ) 开始无机膜材料的研究n 引。 与发达国家相比，尚有很大差距，所以希望能够创造一个良好的研究开发环境， 背靠大企业和大企业集团，注重向纵深开发，使我国的膜分离技术有所突破，逐渐赶 上和超过世界水平【1 4 】。 2 藻红蛋白研究概况 海藻是生长于海洋中的低等隐花植物，全世界藻类约有30 , 0 0 0 余种【1 5 1 。相对于 陆地高等植物而言，海藻的进化程度相对较低。在严酷的自然选择中，这些进化程度 较低的藻类得以生存，而且生存在化学组成极为复杂、环境条件极为特殊的海水中， 关键得益于其独特的代谢途径和代谢产物。这些代谢产物不仅可以作为工业原料或者 食品添加剂，而且对一些疾病也有特殊的疗效，因而日益受到人们的重视f 1 6 】( 隋正红 等，1 9 9 9 ) 。藻红蛋白是其中最具代表性和极具应用潜能的蛋白类天然产物。目前， 对藻红蛋白的基础研究发展迅猛，取得了较大的进展，同时人们还发现藻红蛋白有着 广泛的应用前景，因而备受关注。 2 1 藻红蛋白的分类与结构 最初根据藻红蛋白的来源不同分为r - p e ，b _ p e 和c p e 等，其中r 一表示红藻纲 ( r h o d o p h y c e a e ) ，b 表示红毛菜纲( b a n g i p h y c e a e ) ，c 表示蓝藻纲( c y a n o p h y c e a e ) 1 7 1 。 后来人们在不同类型的藻中发现光谱特性一致的p e ，故现在这些名称己不再有分类 学上的意义，仅表示其不同的特征吸收光谱，而p e 的分类也主要按其光谱特性。在 r 藻红蛋白中，有的p e 可产生两个吸收峰，其特征是在可见光谱区的4 9 8 和5 6 5n n l 有吸收峰、在5 4 0 n m 有吸收肩峰，称“双峰型r 藻红蛋白”，有的能产生3 个吸收峰， 其特征是在4 9 8 n m ，5 3 5 n m ，5 6 5 n m 分别有吸收峰，称三峰型r 一藻红蛋白。通常把 前者称为i 型r 一藻红蛋白，把后者称为i i 型r 藻红蛋白。通常认为含有i 型r 一藻红 蛋白的藻类比含有i i 型r 一藻红蛋白的具有较高的进化地位1 8 2 0 。藻红蛋白由a ，或b ， 和y 亚基组成，每种亚基又是三脱辅基蛋i 兰1 ( a p o p r o t e i n ) 和开链四毗咯结构的色基组 成【2 1 1 。在藻胆蛋白中，至今为止先后发现四种色基，分别是藻蓝胆素 3 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 ( p h y c o c y a n o b i l i n ，p c b ) ，藻尿胆素( p h y c o u r o b i l i n ，p u b ) 、藻红胆素( p h y c o e r y t h r o b i l i n ， p e b ) 和藻紫胆素( p h y c o b i l i v i o l i n ，p x b ) 。这4 种藻胆素是同分异构体，它们的差异表 现在双键位置的不同【2 2 1 。 2 2 藻红蛋白提取分离纯化以及浓度测定的研究进展 藻红蛋白作为海藻中的一种重要生理活性物质，随着人们对其认识的逐步深入， 它的价值也正逐步为人们所认识，藻红蛋白的大规模开发利用已成为当前研究的热 点，但昂贵的价格成为制约其开发利用的瓶颈，因而如何在分离纯化技术上取得突破， 低成本高效益地获得高纯度的藻红蛋白己显得极为迫切。我国在该领域的研究起步较 晚，应加大研究力度，尤其应加快有关纯化技术的研究，以实现藻红蛋白的大规模生 产和利用，造福于人类【2 3 1 。 藻红蛋白的分离纯化是藻红蛋白结构与功能研究的基础，而探索用简单经济的方 法得到高纯度的藻红蛋白制品则是进行应用研究的关键。目前从海藻中提取分离藻红 蛋白仍是获得藻红蛋白的主要途径瞄】。藻红蛋白的提取原料主要源自于红藻和蓝藻， 不同藻类中藻红蛋白的种类和含量也不同，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白在所有蓝藻和红藻 中都有分布，藻红蛋白则只出现于红藻和部分蓝藻中。藻红蛋白在藻类生长初期含量 较少，至成熟前达最高值，其后逐减。目前，大多以螺旋藻、多管藻为提取原料，如 林红卫【2 5 】( 1 9 9 7 ) 、彭卫民等( 1 9 9 9 ) 从钝项螺旋藻中提取藻蓝蛋白等藻胆蛋白，王广策 2 6 1 ( 1 9 9 6 ) 、张建平等( 1 9 9 7 ) 从多管藻中提取藻红蛋白和藻蓝蛋白。此外，条斑紫菜( 程 凌江等，1 9 9 0 ) t 2 7 1 ，坛紫菜( 高洪峰，1 9 9 3 ) 、红毛藻( 黄岩等，1 9 9 3 ) 也是常用的提取原 料。总之，选择藻胆蛋白含量高的藻类作为提取原料，对藻胆蛋白的提取分离是十分 必要的。 藻红蛋白属胞内蛋白质，提取分离藻红蛋白，首先要破碎海藻细胞的细胞壁、细 胞膜，使藻红蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性1 2 8 。细胞破碎程度越高，藻 红蛋白的得率也越高。不同材料、不同条件、不同目的，细胞破碎的方法也有所不同。 目前用于藻红白提取分离过程中的细胞破碎方法主要有下列几种： 反复冻融法将细胞在- - 2 0 以下冰冻，再于5 左右融解，反复几次，利用细 胞内冰粒的形成和细胞液盐浓度的增高引起溶胀，使细胞结构破碎。该法操作简单、 方便，适用于实验室中少量藻体材料的处理 2 9 1 。 化学试剂处理法使用一些化学试剂来破坏藻体细胞的细胞壁和细胞膜，使藻胆 蛋白渗出。但因同时加入了化学试剂，使后期纯化处理的难度增加，且操作不好易引 4 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 起藻胆蛋白变性，这是操作中应十分注意的【3 0 1 。 溶胀法直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂、释放出藻胆 蛋白。但溶胀法提取周期较长，用蒸馏水要浸泡1 0 d ，用低浓度氯化钙溶液也要浸泡 3 d 4 d 3 q 。 超声波法运用超声波破碎藻体细胞的细胞壁，使藻胆蛋白溶出。该法常作为藻 胆蛋白提取中的辅助方法。单纯用超声波来破碎藻体细胞是不够的，还必须与其它方 法合用，以最大限度地破碎藻体细胞【3 2 1 。 组织捣碎法将材料配成稀糊状液，用高速组织捣碎机来破碎藻体细胞。此法常 用于体积较大的藻体。实际操作中，上述几种方法经常混和使用，以最大限度的破碎 藻体细胞，使藻胆蛋白溶出。 细胞破壁后，藻胆蛋白随细胞内溶物一起溶出，这时选择适当的粗提方法提取藻 胆蛋白就显得十分重要。和其它蛋白质分离纯化一样，在藻红蛋白的分离纯化中，常 用的粗提方法有： 盐析法通过加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。藻胆蛋白粗提中常用的盐溶液为硫 酸铵溶液。浸提物经纱布过滤和离心得到浸提液。浸提液再经过硫酸铵分级沉淀，得 到藻红蛋白粗品。h w s i e g e l m a n 等f 3 3 】( 1 9 7 8 ) 研究表明用2 5 饱和度硫酸铵可将藻红 蛋自沉淀出。彭卫民等研究认为3 0 和5 0 饱和度硫酸铵盐析出的沉淀物中，藻蓝 蛋白和别藻蓝蛋白的比例几乎一样，即无法用硫酸铵盐析将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分 开。尽管如此，绝大多数提取分离藻胆蛋白的方法，都要用硫酸铵来沉淀藻胆蛋白， 以得到藻胆蛋自的粗提物。 结晶法利用不同藻胆蛋白在低浓度硫酸铵中可产生不同晶体的特点，用结晶的 方法来提取藻胆蛋白。程凌江掣3 4 1 对条斑紫菜粗提液先用硫酸铵盐析，然后将沉淀在 4 0 c 放置2 0 d 以上，再用1 5 饱和度硫酸铵沉淀可得到红色的藻红蛋白沉淀，该沉淀 纯度已高达a 5 6 5 硼a 2 8 0 m n ：4 0 ，这在粗提方法中是较为难得的。 等电点沉淀法调节溶液p h 至藻胆蛋白的等电点，使藻胆蛋白溶解度下降，沉 淀析出。汤赣晖等用该法沉淀得到了混有3 种藻胆蛋白的混和物，并研究了藻胆蛋白 在不同p h 值下的稳定性，认为藻胆蛋白对p h 值较敏感。因此，用该法沉淀藻胆蛋白 必须要注意藻胆蛋白随p h 变化而发生的变性【3 5 1 。 超滤法运用超滤膜过滤藻胆蛋白粗提液，获得藻胆蛋白粗制品。在藻胆蛋白的 提取中，该法报道的较少。韦萍等【3 6 1 曾报道了用该法从螺旋藻中提取藻胆蛋白，但效 福建农林大学硕士学位论文 膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 果如何，并未见有进一步的报道。 上述方法中，硫酸铵盐析法在藻胆蛋白的提取中较为常用，而结晶法是粗提中效 果较好的方法，但提取周期较长。藻胆蛋白粗提液中，杂蛋白含量较高。要达到商品 应用标准，还必须进一步的分离纯化，清除杂蛋白，使纯度至少应大于4 0 以上，才 具有实际应用价值f 3 刀。 藻胆蛋白纯化的研究中常用的方法：离子交换( i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ) 羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e c h r o m a t o g r a p h y ，h a ) 凝胶过滤( g e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ) 等柱层析纯化方法。还有一些学者利用藻胆蛋白的稳定性差异进行 藻胆蛋白的分离纯化( 吴萍，1 9 8 6 ) t 3 引。其中值得一提的是羟基磷灰石柱层析法在藻红 蛋白分离纯化中的应用。 羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ) 是一种吸附剂，表面带c a 2 + 和p 0 4 3 一两种带电基团， 带正电荷的物质可以和c a 2 + 离子交换，带负电荷的物质可以和p 0 4 离子交换。在分 离缓冲液中带正电荷的蛋白质，可以用含不同离子强度的c a c l 。洗脱液洗脱下来【3 9 1 。 相反地，带负电荷的蛋白质则用不同离子强度的磷酸盐缓冲液来洗脱。用离子交换或 凝胶过滤法不能较好分离的蛋白质，用此方法分离时也许会得到一个较好的分离结果 【4 0 】。羟基磷灰石柱层析分离蛋白质的方法简单易行，而且往往具有令人满意的分离效 果，尤其是对带有色基的蛋白质。同时羟基磷灰石可以自行制备且制各经济，所以现 在广泛的应用于藻红蛋白和其它藻胆蛋白的分离中。殷钢等【4 1j ( 2 0 0 0 ) 在提取螺旋藻藻 胆蛋白时，对阴离子交换和羟基磷灰石色谱作了比较，结果表明用阴离子交换只能得 到藻胆蛋白的混合物：在阴离子交换的基础上利用羟基磷灰石色谱得到了两种藻胆蛋 白的纯品。 中国科学院海洋研究所王广策【4 2 】比较了藻胆蛋白分离纯化中常用的两种方法，认 为用羟基磷灰石柱层析法纯化的藻胆蛋白纯度较疏水基相互作用柱层析和离子交换 柱层析结合法的纯度高。可能原因是羟基磷灰石对核酸的吸附能力高于对蛋白质的吸 附能力，因此用洗脱藻胆蛋白的缓冲液不会将核酸洗脱下来，经过两次柱层析后，得 到的藻胆蛋白溶液几乎不含有核酸，因而在2 8 0 n m 处的吸收值较低，藻胆蛋白的纯 度升耐4 3 1 。韦萍【删提出了一种简易可行而高效的羟基磷灰石制法，此方法制备的羟 基磷灰石在藻胆蛋白分离纯化中实际效果较好。 研究表明，实际应用中，上述几种纯化方法要混和使用，才可能取得较好的纯化 效果。王勇等【4 5 】经过反复探索研究建立了s e p h a d e xg 一2 0 0 ，d e a f s e p h a d e xa 一2 5 ，羟 6 福建农林大学硕士学位论文 膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 基磷灰石柱、s e p h a d e xg 1 0 0 的分离纯化程序，得到了高纯度的藻蓝蛋白，纯度值 ( a 6 1 5 哪a 2 8 0 哪) 高达1 4 ，突破了国内外报告的最高值。这也是将上述几种纯化方法混 和使用的典型例证。g l a z e r h 6 1 认为在进行藻胆蛋白的分离纯化时，从某种海藻中分离 纯化藻胆蛋白的分离纯化方案，并不一定适用于另一种海藻中藻胆蛋白的分离纯化。 因此，在分离藻胆蛋白时，为建立一套能够达到自己既定目的，应该在参考前人方法 的基础上，设计分离纯化方案。 藻红蛋白的纯度一般用其在可见光范围内的最大吸收峰的吸收值与其在2 8 0 n m 的蛋白质吸收值的比值来表示。例如，双峰型的r 一藻红蛋白在4 9 8 n m 和5 6 5 n m 存在 完全的吸收峰，通常5 6 5 n m 的光吸收值高于4 9 8 n m 的光吸收值，所以其纯度为0 d 5 6 5 o d 2 8 0 的比值。目前一般认为，藻红蛋白纯度 4 表示此藻红蛋白溶液中已经不再含 有其它的杂蛋白质【4 7 】【4 羽。 藻红蛋白的浓度测定一般采用比色法【4 9 】，即己知藻胆蛋自在某一波长处的摩尔消 光系数后，测定在此波长处的光密度值，再根据l a m b e n t b e e 公式计算藻红蛋白的浓 度。由于藻红蛋白的摩尔消光系数受溶液的p h ，离子强度、藻红蛋白的浓度和缓冲液 类型等的影响，以及生长在不同的环境的同种海藻或者不同种藻类的藻红蛋白的摩尔 消光系数均各不相同，所以虽然前人已经测定了很多藻类藻红蛋白的摩尔消光系数， 并针对不同的藻类提出了不少经验公式，但用这些公式得到的结果只是近似值【5 0 5 2 1 。 3 琼胶的研究现状 琼胶是一种从某些红藻中提取出来的水溶性多糖。琼胶是构成这类红藻细胞璧的 主要成分【5 3 1 。由于琼胶具有许多独特轻工、医药及其它科研领域的理化性质和流变性 能，使之在食品、医药领域有着广泛的应用。尤其是近十多年来，琼胶作为一种低热 值保健食品原料，欧美、日本等发达国家广泛应用琼胶加工成各种保健食品，很受消 费者的欢迎，使琼胶的需求量大大增加【蚓。 3 1 琼胶及其原料研究进展概况及国际市场对琼胶的质量要求 据报道，目前世界琼胶年需求量在1 0 ，0 0 0 t 以上，但世界琼胶产量仅为1 0 ，0 0 0 t 左右，我国目前琼胶产量约为5 0 0 t 年，仅占世界总产量的5 ，而且生产出的琼胶 质量差，主要体现在凝胶强度低，很大一部分在4 0 0 9 c m 2 ，色泽达不到要求，因此， 我国目前琼胶生产远远满足不了国内外市场的需要【5 5 1 。我国是海洋资源丰富的国家之 一，海洋资源的开发利用和深加工是我国目前科研和生产领域的主攻方向之一，海藻 资源的深加工和综合利用是海洋资源开发利用的一个重要方面，因而根据我国原料特 福建农林大学硕十学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 点和国情，探讨琼胶加工机理，对指导工业生产，解决生产中技术性难题，促进我国 琼胶工业的发展，提高产品质量，充分利用海藻资源出口创汇具有重大的社会效益和 经济效益。 最早报导琼胶研究的是p a y e n ( 1 8 5 9 ) ，1 8 8 4 年b a u e r 证实琼胶的主要组成是半乳 聚糖【5 6 1 。但对琼胶的大量研究和工业化生产始于本世纪四十年代，据大量的化学及生 物分析测定证实，琼胶主要由琼胶糖( a g a r o s e ) 和琼胶果胶( a g a r o p e c t n ) 两部分组成， 琼胶糖理想化的结构是由c 1 3 糖苷键连接的1 3 - d - 半乳糖与c 1 4 糖苷键连接的3 6 内醚a l 半乳糖交替连接而成的中性多糖，又称琼胶素【5 7 】。琼胶糖是琼胶主要的凝 胶形成因子，琼胶果胶组成除含有d 半乳糖和3 ，6 内醚半乳糖外，结构中还带有硫 酸基团和丙酮酸等【5 引，并带电荷，结构比琼胶糖复杂，硫酸基、丙酮酸等连接在半乳 糖的第6 或第2 个碳原子上，阻碍琼胶凝胶的形成，硫酸基、丙酮酸等是造成琼胶凝 固性能差的主要原因之一，加工过程中必须设法除去，以利于提高琼胶的凝胶性能1 5 引。 从琼胶中完全分离出琼胶糖是很困难的，因此，商品化的琼胶糖仍然含有少量半 酯式硫酸基团、丙酮酸等，琼胶的结构和性能明显地与提取原料和加工方法有关。琼 胶是一种典型的热可逆性凝胶，表现出明显的热滞后现象，即熔化温度远高于琼胶凝 胶温度，对食品加工很有实用价值。优质琼胶在浓度低于o 1 仍然具有明显的凝胶 作用，但高硫酸基含量的琼胶要达到2 - - - - 3 的浓度才能形成凝胶【删。 国际市场琼胶缺口很大，但对琼胶的质量要求较高，优质琼胶要求凝胶强度在 5 0 0 9 c m 2 以上，产品为白色粉末状或无色透明条状。 3 2 琼胶在生物技术领域的应用 琼胶最早用于生物领域是用作微生物培养基，现在这一用途仍被广泛使用，而 且被更广泛地应用于其它实验的基质【6 2 】。例如进行组织培养，研究组织成分变化培养 病毒合成，用于癌症研究等f 6 3 】。琼胶糖或其衍生物可作为稳定的基质来固定细胞、酶、 微生物如酵母菌等，用来研究细胞、酶的一些作用过程或者它们的功能、特性，有时 还利用被固定物质起某些作用。例如将细胞固定后研究它的新陈代谢、光合作用或利 用它水解蛋白质，给原油脱硫等将酵母菌固定用来生产乙斟删。琼胶或琼胶糖及衍生 物作为亲和吸附剂，可用来分离核酸，纯化蛋白质、酶等，还可用来做免疫亲合色谱， 进行血液灌注【6 5 1 。以琼胶糖或其衍生物作为分离介质，通过普通电泳、制备等电聚焦 电泳、脉冲场凝胶电泳等技术检测、分离和制备、蛋白质、多肽、酶、脂蛋白、糖蛋 白、血红蛋白、抗原、小细胞器和微粒、噬菌体及相关微粒等【6 6 瑚】。这已成为生命大 8 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 分子研究中不可或缺的手段。还有人用它做病因研究。琼胶糖还被应用到尺寸排阻色 谱疏水相互作用等色谱技术中。在免疫学研究中，也常用琼胶来做凝胶扩散基质6 9 】。 3 3 江蓠琼胶生产特点及存在问题 江蓠是一种经济价值较高的红藻，藻体含有大量的胶质，江蓠干品含胶量在 1 5 - 4 5 不等。由于江蓠藻体生长快，个体也较大，生长在潮间或浅水处，易于人工 栽培和采集，目前已成为国内外琼胶制造业的主要原料7 1 1 。但江蓠琼胶分子中硫酸基、 丙酮酸等基团含量高，天然江蓠琼胶凝胶性能差，几乎没什么商业价值，必须通过化 学改性去除半酯式硫酸基、丙酮酸等，即要通过碱处理，此外江蓠藻体较硬，且藻体 颜色深，必须通过酸化漂白处理才易出胶7 2 1 。碱处理虽然可去除硫酸基等阻碍凝胶形 成的因素，提高凝胶性能，一旦控制不好易造成琼胶分子降解，造成琼胶凝胶强度降 低。此外，江蓠藻的种类，生长环境、季节、产地和养殖方法都会影响到藻体琼胶的 含量，琼胶的结构及性能【7 3 1 。因此，江蓠琼胶生产工艺复杂，影响琼胶质量和出胶率 的因素多，工艺条件控制不当，就生产不出优质的琼胶产品。 近年来，随着水污染问题的日渐加重，人们对环境保护认识的进一步深化，污水 处理已越来越引起人们的重视。在以往的污水处理中，人们往往侧重于使污水达标排 放。但随着污染物总量控制的深入开展和水资源的日益匮乏，实现清洁生产和污水回 用已成为大势所趋。在各种废水中，有机废水是分布最为广泛和量最大的一种废水种 类，这就注定了处理有机废水在较长的时间内仍然是环保界研究的重点。但是，常规 的生物处理方法由于其占地面积广、出水水质难以满足回用要求等缺点已很难满足人 们的要求，探索更新、更好的处理工艺已势在必行。 4 本文研究内容 本研究内容分为以下三个部分：( i ) 膜分离技术应用于江蓠藻红蛋白的提取与纯 化，确定藻红蛋白的提取纯化方案：( 2 ) 确定琼胶生产的最佳工艺条件；( 3 ) 测定碱 处理液中的粗蛋白、总糖的含量，采用膜技术回收碱处理液，使之循环利用，实现清 洁生产工艺。 5 本项目研究的目的和意义 藻红蛋白作为藻胆体的一个重要组成部分，在海藻正常的生理代谢过程中起重 大作用。有关它的理论研究多集中在蛋白结构、光谱特性和光能传递上。到目前为止， 国外已从螺旋藻、蓝藻、坛紫菜、紫球藻等藻类上分离出1 0 多种藻红蛋白、藻蓝蛋 白、藻红蓝蛋白和异藻蓝蛋白。 9 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 我国海域纵跨热带、亚热带和暖温带三个气候带，藻类资源十分丰富，海藻年产 量7 0 万t ，占世界总产( 2 4 0 万t ) 的2 9 2 ，但基本上都是直接利用而未深加工， 浪费严重。我国对藻胆蛋白研究起步较晚，直到2 0 世纪8 0 年代末才开始藻胆蛋白研 究，而且大部分研究集中在螺旋藻、紫菜、红毛藻等藻类的藻胆蛋白上，研究深度和 商品化程度尚不高。福建省地处沿海，具有漫长的海岸线和广阔的海域，海藻资源丰 富，其中不乏一些特有的藻类。为此，我们在福建沿海部分海域采集了数量可观的天 然藻类，对其中一种红藻藻红蛋白的分离纯化方案进行了研究。 江蓠琼脂加工过程中，碱处理是江蓠琼胶生产中必不可少的工序，其对江蓠琼胶 的凝胶强度和出胶率均有很重要的影响。国内外对江蓠碱处理方法做过许多研究，概 括起来有三种类型，既低温浓碱法、中温浓碱法、高温稀碱法。前两种方法的共同缺 点是碱的浓度高，碱耗量大，对环境污染严重，生产周期长，其优点是生产上较易控 制；后一种方法的优点是碱的浓度底，碱耗量小，生产周期短，但如果技术控制不好， 容易造成胶质进入碱液而损失。目前国内江蓠琼胶加工生产普遍采用前两种处理方 法。 随着国家对环境污染的严格控制和碱的价格上升，对江蓠碱处理液进行研究已成 为必然，碱处理液中粗蛋白、糖、多肽类有机物和氨基酸是预防和治疗某些疾病的重 要成份，具有很高的保健医疗实用价值。恰恰这些未经提取利用的宝贵资源，无端白 自流失，反过来却污染环境，采用合适的工艺技术，对碱液进行有效的处理，从中提 取有效成分，使有效成分得到综合利用，使碱液中的营养物质含量减少，重复利用碱 液，对提高我国江蓠琼胶生产加工业的水平、降低成本、控制环境污染具有重要的意 义。 1 0 福建农林大学硕士学位论文膜分离法用于分离红藻藻红蛋白及废碱液处理 第二部分超滤法用于江蓠藻红蛋白的提取分离纯化研究 膜分离技术是一项简单、快速