（农产品加工及贮藏工程专业论文）蜂胶乳化工艺及抑菌性研究.pdf

福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 摘要 蜂胶又称为紫色黄金，是西方蜜蜂的工蜂从植物体上采集的树脂和树胶，并混入 其上额腺分泌物经加工咀嚼成的一种具有粘性的天然胶状物质。本研究通过对蜂胶提 取和乳化工艺条件的调控，结合抑菌试验验证，为蜂胶乳化的加工利用提供了重要的 科学依据。 1 、，通过单因素试验探讨和确定蜂胶最优提取参数，由单因素实验结果得出正交试验 的因素水平。根据正交试验及其方差分析结果确定乙醇提取蜂胶的较优工艺参数为： 乙醇浓度8 0 、提取温度6 0 、提取时间3h 、超声时间2 0m i l l ；在此条件下蜂胶提 取结果，黄酮含量2 1 4 干物质得率5 0 7 。 2 、选用吐温- 2 0 、吐温枷、吐温6 0 、吐温8 0 、曲3 垃通- 1 0 0 五种乳化齐i 及其组合，以蜂胶乳剂 的透升辫呼l 化蓟蟹抬量为指标，在乳“钧束条件乳化温度5 0 、乳化剂用量2 ( 体 积百分比) 、搅拌时间2h ，分别对蜂胶进行乳化，确定适于蜂胶乳化的乳化剂为吐 温，4 0 、吐温一6 0 及吐温- 4 0 与吐温6 0 组合。 3 、通过探讨吐温4 0 和吐温一6 0 乳化过程中乳化温度、乳化剂用量、超声时间、搅拌 时间对蜂胶乳剂透光率和乳化黄酮含量的影响规律，吐温4 0 乳化蜂胶的较优工艺参 数为：乳化温度6 0 ，t w e e n - 4 0 用量2 ( 体积百分比) ，超声时间1 0r a i n ，搅拌 时间1 2 0m i n ，所得蜂胶乳剂的透光率8 0 5 ，乳化黄酮含量3 8 1 ；吐温一6 0 乳化蜂 胶的较优工艺参数为：乳化温度6 0 ，吐温6 0 用量2 ( 体积百分比) ，超声时间 1 0m i n ，搅拌时间6 0m i n ，所得蜂胶乳剂的透光率8 2 9 ，乳化黄酮含量3 7 5 。 4 、通过探讨吐温一4 0 与吐温6 0 的组合比例对蜂胶乳剂影响规律，确定二者的最佳比 例；采用二次正交旋转组合试验方案，分别建立蜂胶乳化工艺中乳剂透光率y l 、乳 化黄酮含量y 2 与乳化温度x 卜超声时间x 2 、搅拌时间x 3 的数学回归模型，置信度 均达9 5 ： y 1 = 8 0 0 8 + 0 7 6 x l + 0 5 8 x 2 + 0 9 4 x 3 y 2 = 3 6 4 8 + 0 6 6 x 2 + 1 2 1 x 3 5 、通过对吐温4 0 蜂胶乳剂、吐温6 0 蜂胶乳剂、复合蜂胶乳剂和含蜂胶乙醇溶液稀 释液对金色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌进行抑菌试验，得到这四种蜂胶液稀释度 小于等于4 倍时抑菌效果均良好；稀释至8 倍时，乙醇液抑菌效果也很显著，吐温_ 4 0 蜂胶乳剂、吐温6 0 蜂胶乳剂、复合蜂胶乳剂抑菌效果不显著；比较四种乳剂抑菌效 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 果比较可得：蜂胶乙醇液 复合蜂胶乳剂 吐温6 0 蜂胶乳剂 吐温- 4 0 蜂胶乳剂。 关键词：蜂胶；乙醇提取；单一乳化；复合乳化；抑菌试验 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 s t u d yo ne mu l s i f i c a t i o n t e c h n o l o g ya n d a n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fp r o p o l i s a b s t r a c t p r o p o l i sw a sa sw e l lk n o w na st h ep u r p l eg o l d t h ew o r k e rb e e so fa p i sg a t h e rt h er e s i n f r o mt h ep l a n tb o d y ，a n dm i xi nt h ep a l a t i n es e c r e t i o nw h i c h c h e w sa f t e rt h ep r o c e s s i n g i t w a st h ec o h e r e n tn a t u r a lp o r o d i n em a t e r i a l i nt h i sp a p e r , t h r o u g ht h ee x t r a c t e da n d e m u l s i f y i n gp r o p o l i sp r o c e s sc o n t r o l ，a n db a c t e r i o s t a t i ct e s t ，i tp r o v i d e da l li m p o r t a n t s c i e n t i f i cb a s i sf o rp r o p o l i se m u l s i o nt op r o c e s sa n du s e 1 t h ep r o p o l i sw a se x t r a c t e d 丽t l le t h a n 0 1 t h eo p t i m a lp a r a m e t e r so fe x t r a c t i o nw a s d e t e r m i n e db yt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t so fs i n g l e f a c t o r i tw a st h eo r t h o g o n a lf a c t o r st e s t l e v e l a c c o r d i n go r t h o g o n a lt e s tr e s u l t sa n da n a l y s i so fv a r i a n c ed e t e r m i n e de t h a n o le x t r a c t o fp r o p o l i so p t i m u mp r o c e s sp a r a m e t e r sa sf o l l o w s ：e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n8 0 ，e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e6 0 。c ，t h ee x t r a c t i o nt i m e3k u l t r a s o u n dt i m e2 0m i ni nt h i sc o n d i t i o n , t h e r e s u l t so fp r o p o l i se x t r a c ti st h ef l a v o n o i dc o n t e n to f21 4 ，t h ee x t r a c ty i e l d5 0 7 2 t h ee f f e c t so ft w e e n - 2 0 ，t w e e n - 4 0 ，t w e e n 一6 0 ，t w e e n 一8 0a n dt r i t o nx 一10 0f i v e e m u l s i f i e r sa n dc o m b i n a t i o n so np r o p o l i se m u l s i o nu n d e rt h ee m u l s i o nt e m p e r a t u r e5 0 。c ， e m u l s i f i e rc o n t e n t2 ( v o l u m ep e r c e n t a g e ) ，s t i r r i n gt i m e2hw e r ec o m p a r e df r o mt h e t r a n s m i t t a n c ea n de m u l s i f y i n gf l a v o n o i dc o n t e n to f p r o p o l i se m u l s i o n a c c o r d i n gt h er e s u l t , t w e e n 一4 0 ，t w e e n 一6 0a n dt w e e n - 4 0a n dt w e e n 6 0c o m b i n a t i o n sw e r es e l e c t e dt o e m u l s i f i c a t i o nf o rp r o p o l i s 3 t h ep r o p o l i sw a se m u l s i f i e d 、析mt h es o l ee m u l s i o nt e c h n o l o g y s e p a r a t e l yt h r o u g ht h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，w es t u d i e dt h ee f f e c t so fe m u l s i f y i n gt e m p e r a t u r e ，e m u l s i f i e r q u a n t i t y ，u l t r a s o n i ct i m e ，s t i r r i n gt i m ec o m p a r i n gt ot h e t r a n s m i t t a n c ea n dp r o p o l i s e m u l s i o ni nt h ee m u l s i o n t h eo p t i m u me m u l s i f y i n gb ys o l ew a so b t a i n e d 、 ，i t l lt w e e n - 4 0a t f o l l o w i n gc o n d i t i o n ：e m u l s i f y i n gt e m p e r a t u r e6 0 ，t w e e n - 4 0d o s a g e2 ( v o l u m e p e r c e n t a g e ) ，u l t r a s o n i ct i m e10m i n ，s t i r r i n gt i m e12 0r a i n , a n dt h ee m u l s i o nf r o mp r o p o l i s t r a n s m i t t a n c er a t eo ft h ee m u l s i o np r o p o l i sw a s8 0 5 ，e m u l s i o nf l a v o n o i dc o n t e n tw a s 3 8 1 t h eo p t i m u me m u l s i f y i n gb ys o l ew a so b t a i n e d 埘t ht w e e n 一6 0a tf o l l o w i n g c o n d i t i o n ：e m u l s i f y i n gt e m p e r a t u r e6 0 。c ，t w e e n 一6 0d o s a g e2 ( v o l u m ep e r c e n t a g e ) ， u l t r a s o n i ct i m e10i 如咄s t i r r i n gt i m e6 0i n 哦a n dt h ee m u l s i o nf r o mp r o p o l i st r a n s m i t t a n c e i i i 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 r a t eo ft h ep r o p o l i se m u l s i o nw a s8 2 9 ，e m u l s i o nf l a v o n o i dc o n t e n tw a s37 5 4 t h ep r o p o l i sw a se m u l s i f i e dw i t l lt h ec o m p o u n de m u l s i f i c a t i o nt e c h n o l o g y t h r o u g ht h e s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，w es t u d i e dt h el i g h tl r a n s m i t t a n c ea n df l a v o n o i d sc o n t e n to ft h e e m u l s i o n sw h i c hw e r ee m u l s i f i e db yd i f f e r e n tc o m b i n a t i v et w e e n - 4 0a n dt w e e n 一6 0 i n o r d e rt os t u d yt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h el i g h tt r a n s m i t t a n c ey i ，c o n t e n to ff l a v o n ey 2 a n de m u l s i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ex 1 ，u l t r a s o n i ct i m ex 2 ，s t i 雨唱t i m ex 3 ，ad u a lq u a d r a t i c r o t a r yc o m b i n a t i v ed e s i g ns c h e m ew a se m p l o y e da n dt w or e g r e s s i o nm o d e l sw e r eo b t a i n e d ， w h i c hc o n f i d e n c ew e r ea l l9 5 y 1 = 8 0 0 8 + 0 7 6 x l + 0 5 8 x 2 + 0 9 4 x 3 y 2 = 3 6 4 8 + 0 6 6 x 2 + 1 2 1x 3 5 a p p e n d e dt h ed i l u t es o l u t i o no ft w e e n - 4 0p r o p o l i se m u l s i o n ，t w e e n - 6 0p r o p o l i s e m u l s i o n , p r o p o l i sc o m p o s i t ee m u l s i o na n dp r o p o l i se t h a n o ls o l u t i o nf o ra n t i b a c t e r i a lt e s t t ot h ea u r e u ss t a p h y l o c o c c u s ，e s c h e r i c h i ac o l i ，p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a t h e i rr e s u l tw e r e t h ei n h i b i t o r ye f f e c t sa l eg o o dw h e nt h e yw e r ed i l u t e db e l o wo rt h ee q u i v a l e n tt of o u r t i m e s ，b u ti tw a sv e r ys i g n i f i c a n tw h e nt h ea n t i b a c t e r i a le f f e e td i l u t e dt o8t i m e s f o u r e m u l s i o ni n h i b i t o r ye f f e c tc o m p a r e dt oac o m p a r i s o n ：p r o p o l i se t h a n o ll i q u i d p r o p o l i s c o m p o s i t ee m u l s i o n t w e e n - 6 0p r o p o l i se m u l s i o n t w e e n - 4 0p r o p o l i se m u l s i o n k e yw o r d s ：p r o p o l i s ；e t h a n o le x t r a c t i o n ；s o l e e m u l s i o n ；c o m p o u n de m u l s i o n ； b a c t e r i o s t a t i ct e s t i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔虢哿艳萍 日期。 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文作 指导教师亲笔签名： 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 b 期：矽驴g 否。1 3 - 日期：刀矿多c 萍 艳巴 灯 名 夕 鹕 笔 l 漆 门 一 俨 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 第一章文献综述 蜂胶( p r o p o l i s ) 是西方蜜蜂的工蜂从植物体上采集的树脂和树胶，并混入其上额腺 分泌物经加工咀嚼成的一种具有粘性的天然胶状物质【1 】，有令人愉快的芳香气味【2 1 。 蜂胶是蜜蜂用来防护、抵御病虫害和病原微生物入侵巢房的御敌物质，同时也是作为 修补巢房和内环境消毒杀菌的一种特殊物质【3 4 】。对于人类而言蜂胶一种独特、神奇 的天然物质，欧洲称蜂胶为“神奇的药物”、“上帝的恩赐”，亚洲称其为“天外之物”、 “现代万能药”、“本世纪最伟大的天然药物”等【5 】。 随着经济的发展，人们对自身健康的重视，蜂胶作为天然的营养保健品和食品添 加剂日益受到了世人的关注。然而，蜂胶在被利用之前，必须经过提取加工过程。蜂 胶中的有效因子很多，加工过程就是将这些有效因子提取出来【6 j 。为此，研究如何安 全的、经济有效的将蜂胶进行提取和加工已经成为目前迫切需要解决的问题。 1 蜂胶概述 1 1 蜂胶的开发 人们使用蜂胶的历史已有数千年之久，古埃及祭司掌握着医药、化学和制木乃伊 的方法，人们对蜂胶的防腐性已经有所了解【7 棚。上个世纪初，荷兰裔非洲人( 布尔 人) 与英国人的布尔战争期间，就曾采用“蜂胶凡士林”治疗创伤，并认为它具有促进 组织再生的作用【9 】。 现代临床医学研究表明，蜂胶具有增强人体免疫力，抑制恶性肿瘤的生长；对高 血脂、高胆固醇、动脉粥样硬化有预防作用；还具有抗菌防腐、抗原虫、止痛及促进 组织再生、抗氧化、补益身体和活血化瘀等作用，能治疗多种疾病。蜂胶一种既能调 节机体免疫能力、补益身体，又能预防和治疗疾病，全面增进人体健康，有效提高生 命质量的天然佳品【1 0 1 。 现代食品工业为了提高食品的保鲜期，用蜂胶酊喷洒或涂抹水果表面，延长水果 的储藏期；还有报道将蜂胶的水提物用于香肠的保鲜等等i l l 】。 1 2 蜂胶的化学成分 蜂胶的化学成分取决于蜜蜂采集树脂的地区和植物，不同地区的蜂胶化学成分存 在很大差异，特别是来自温带地区的蜂胶和来自热带地区的蜂胶化学成分差异很大 1 2 - 1 3 1 。蜂胶的化学成分研究始于德国，1 9 1 0 年k u s t e n m a c h e r 从蜂胶中鉴定出肉桂醇 和肉桂酸u 训。蜂胶基本由5 0 * * 5 5 的树脂类、芳香油、3 0 * , - 4 0 的蜂蜡、5 1 0 的花粉组成。化合物主要包括类黄酮化合物、有机酸类化合物、酯、醛、醇类化合物 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 以及烯、烃、萜类化合物等【1 5 】。蜂胶的最大特点是含有丰富的黄酮类和萜烯类物质， 它们赋予了蜂胶许多奇妙而独特的生物学作用。蜂胶成分之复杂、作用之广泛、成分 间配合之奇妙，使许多科学家感到震惊，即使在科技高度发达的今天，人类也无法合 成具有同样效力的蜂胶【5 】。经现代科学分析，已从蜂胶中鉴定出2 0 余类、5 0 0 多种天 然成分，其中包括3 0 多种黄酮类物质、3 0 多种人体必需的矿质元素、2 0 种氨基酸、 数十种芳香族化合物，还有丰富的有机酸、萜烯类、维生素、木质体、酶类、多糖等 具有生物活性的天然成分【l q 。 1 3 蜂胶的保健药用价值 经大量研究表明，蜂胶具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫、软 化血管、净化血管、调节血脂、降血压血糖、改善微循环、延缓衰老、促进组织再 生等广泛的生物学作用 1 9 1 。在日本，蜂胶有糖尿病人第二个太阳之称；在欧洲，把 蜂胶比喻为“紫色的黄金，【2 0 】。中外科学家赞誉蜂胶为“血管的清道夫”、c c 健康的保护 神”等。蜂胶广泛地应用于医药和保健食品工业中，特别是在日本和巴西。现已证明 蜂胶的作用如下： 1 3 1 抗肿瘤【2 1 - 2 3 1 。具有预防结肠腺肿瘤和改善癌变期间的生化指标、抗黑性胶 质瘤、黑色紊瘤以及皮肤肿瘤的作用。 1 3 2 抗病原微生物【1 2 4 - - 2 9 。蜂胶对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏 菌、上呼吸道感染菌等2 0 余种致病性细菌具有较强抑制作用；可增加试验动物血清 总蛋白的合成，改善机体的成分，增强巨噬细胞的吞噬功能，显著提高机体抵抗病菌 侵袭的能力。蜂胶中的黄酮类化合物和3 甲基丁烯- 2 咖啡酸酯对单纯型疱疹病毒 ( h s v 1 ) 、腺病毒5 、流感病毒、轮状病毒、口腔炎病毒等均有灭活作用，尤其对h s v 1 作用明显 3 0 1 。3 甲基丁烯2 咖啡酸酯能使h s v 1 病毒效价降低，病毒d n a 的合成 能力为原来的1 3 2 。 1 3 3 保肝护肝功能。蜂胶提取物对四氯化碳致肝脏损伤、d 半乳糖胺诱导肝损 伤、酒精致肝损伤均有保护作用，这种保护作用是蜂胶中多种活性成分协调作用的结 果【3 1 1 。 1 3 4 调节免疫力。蜂胶能有效地增强人体的免疫能力，促进吞噬细胞的作用， 刺激体内产生抗体，抵抗多种疾病【3 2 1 。 1 3 5 抗氧化防衰老。蜂胶的水提取物、甲醇提取物和氯仿提取物均能够有效地 清除l ，1 - c i p h e n y l - 2 p i c r y h y d a z y l 自由基和0 2 自由基的作用3 3 捌】。从水提取物中分离 出的苯基丙烯酸衍生物，其抗氧化作用强于v c 和v e ，具有防止机体功能衰老的功 2 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 效【3 5 1 。 1 3 6 改善心血管系统。蜂胶中含有大量的黄酮( 每1 0 0g 中含总黄酮3 2g ) 、 黄酮醇等物质，对心血管系统有一定的调节改善作用【3 6 - 3 s 1 。 1 3 7 抗溃疡。蜂胶具有促进组织修复的功能，能使胃溃疡模型大鼠胃酸降低， 抗幽门结扎型溃疡的形成，抗应激型、酒精型和消炎病型溃疡的形成。 1 3 8 预防骨质疏松的作用0 9 1 。尉辉杰等用去卵巢引起骨质疏松的大鼠为模型研 究蜂胶黄酮类提取物对骨代谢的影响，将雌性s d 大鼠2 1 只随机分为3 组，每组7 只。对照组实施假手术，模型组和蜂胶组均切除双侧卵巢。对照组、模型组灌胃均给 蒸馏水5m l ( k g d ) ，蜂胶组灌胃给蜂胶提取物1 0 0m g ( k g ，d ) 。1 0 周后，称量体重、 测定骨密度( ( b m d ) 、骨矿物含量( b m c ) 、血清碱性磷酸酶( a l p ) 、尿钙及尿经脯氨酸 ( h o p ) 含量。结果显示，与对照组相比，模型组骨b m d 和b m c 下降( 尸 o 0 5 ) ，血清 a l p 增加( 尸 0 0 1 ) 。尿钙、尿h o p 增 j l l ( p 0 0 5 ) ：与模型组比，蜂胶组b m d 和b m c 均显著升高妒 o 0 5 ) ，血清a l p 、尿钙减少( p 0 0 5 ) h o 。表明蜂胶黄酮类提取物可 增加骨密度，减少去卵巢大鼠骨钙丢失，预防骨质疏松。 1 4 蜂胶的临床应用 从2 0 世纪5 0 年代以来，国内外许多学者对蜂胶进行了全面的研究，主要包括蜂 胶的来源、化学成分、性质、药理作用、安全性临床应用等。 l 、口腔疾病蜂胶用于治疗口腔疾病在西方国家有着悠久的历史。近年来的药理 研究表明，蜂胶对唾液细菌和链球菌齿斑均有不同程度的抑制作用。治疗口腔溃疡， 止痛效果为1 0 0 ；溃疡面越小，愈合越快。最快为2 4 小时上皮愈合【4 1 1 。 2 、心血管疾病对1 6 0 例典型高黏滞血症患者给予饭前口服3 0 蜂胶酊5 0 滴，每 日3 次，同时服用蜂胶片，服用前、后分别测定全血黏度、血浆比黏度、血沉及红细 胞压积等指标，血浆中上述指标均有显著差异。患者服药后血液黏度降低，自觉头脑 清晰。反应灵活，肢麻消失，体力增加【4 2 】。 3 、呼吸系统疾病临床试验表明：蜂胶可明显降低儿童急性和慢性鼻炎症的发病 率。对上呼吸道的病毒、病菌也有抵抗作用；另外，蜂胶还能够镇咳祛痰，治疗感冒 发烧、头昏鼻塞、咽喉干燥肿痛等，对支气管哮喘有平喘功效，并有解毒消炎等作用 【4 3 】 o 1 5 我国蜂胶资源及存在问题 在国外，蜂胶研究和应用的历史都较长，许多研究人员对蜂胶自然来源、化学组 3 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 分、生物学作用、保健功能部分都进行了深入的研究。目前，我们国家早已成为世界 上蜂胶生产量最多、出口量最大的国家。但国内蜂胶市场的开发刚刚起步，虽有少量 蜂胶产品在国内上市，但由于宣传力度不够，蜂胶制品在国内还没有形成气候掉4 6 l 。 蜂胶是近年最畅销的蜂产品，随着国内外对蜂胶的需求增大，而蜂胶产量低，导 致价格上扬。我国是养蜂大国，蜂胶来源极其丰富，蜂胶本是养蜂副产品，本身不需 要另加经济投入，所以开发蜂胶让蜂胶更好地造福人类，具有十分重要的意义。 因此，如何利用国内的蜂胶资源，增强国民体质、摆脱各种疾病的困扰、提高人 民生活的质量已是众望所归。如何开发蜂胶资源，使其产品多样化，满足不同人群的 需求已是急需解决的重要课题。本项目拟采用乳化剂制成水溶性蜂胶口腔喷雾，为酒 精及其他溶剂过敏和不适的人群带来了福音，丰富蜂胶市场，增加蜂农收入和出口创 汇。 2 蜂胶的产品 2 1 蜂胶产品的发展阶段 日本东京科学技术研究所所长、东京医科大学医学博士川村贤司【4 7 1 先生等在日 本汉方医药新闻中，提出了蜂胶的生产工艺演变图。川村博士是以生产工艺为主线， 划分蜂胶健康食品的发展阶段： 第一代蜂胶产品为粉体法。是用机械方法将蜂胶原胶除杂后，粉碎成粉末状制成 蜂胶产品。 第二代蜂胶产品统称为溶剂法。在日本经历有水提取法、活性提取法、酒精提取 法。 第三代蜂胶产品为气体法。也就是超临界c 0 2 提取法，在日本也经历有两个过 程的发展。 最初以佐藤利夫教授为主开发的超临界c 0 2 提取法，在生产的安全性和卫生的 管理方面非常有利，脂溶性成分得到很好的提出，但水溶性的成分较少，其制成量也 还小高。 川村教授在日本汉方医药新闻指出，吴晓闻博士开发的新方法，新超临界c 0 2 提取法，蜂胶中脂溶性和水溶性的成分均得到了提取，制成量也有提高，是超临界 c 0 2 提取法的改进。 目前，国内外专家们对确认第三代蜂胶产品是超临界c 0 2 流体苯取的蜂胶制各 产品，观点是统一的，但对第一代和第一代蜂胶产品定位尚待探究。 超临界c 0 2 萃取的蜂胶制成的蜂胶健康食品，由于其独特的先进工艺，其整个 4 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 苯取过程在无氧低温的状态下进行，保证了整个生产过程无污染，可排除众多杂质， 有效地脱除重金属，极大地保留了蜂胶中活性成分。实践证明它被越来越多的消费者 接受和喜爱，在国际上开始形成超临界蜂胶产品一就是“第三代蜂胶产品”，是当前理 想、先进的蜂胶产品【4 引。 我国著名的蜂疗专家房柱【4 9 】教授，在他的蜂胶新书中，将蜂胶食品发展分成 三个阶段：第一代产品以醇提法酿制蜂胶原液，第二代产品以蜂胶醇类提取物制各保 健食品，第三代产品以蜂胶超临界“提取物制备保健食品”。 如何看待蜂胶产品的发展阶段，一些中国学者们认为，应从蜂农将蜂胶原料磨成 “粉末状”的原始使用阶段开始，蜂胶成为人类健康食品，不断取得令人惊喜的效果， 推动蜂胶迅速进入工业化生产阶段。 2 2 蜂胶产品的应用 蜂胶的主要产品：l 、内服型蜂胶酊剂、口服液、片剂、胶囊( 软、硬) 、乳剂 以及口香糖、蜂胶酒、蜂胶蜜。2 、洁口型用于口腔卫生和保健、有蜂胶牙膏、洁口 剂、气雾剂、喷剂、洗液和漱口液。3 、外用型蜂胶乳膏、搽剂、栓剂、霜剂、洗液 及痤疮液。4 、化妆品、蜂胶肥皂、护肤膏、香水、生长水、喷雾发膏。 已见报道的蜂胶应用例子有：1 、抗胃溃疡病药物，试验证明可显著抑制利血平 溃疡的形成，对醋酸烧灼型溃疡的愈合有明显的促进作用。2 、蜂胶牙泰用来杀灭口 腔细菌，治疗口腔炎、牙龈炎。3 、慢性咽炎雾化剂，蜂胶中的球松素和咖啡酸苯乙 醋的混合物有较强的局部麻醉作用，能有效减轻患者咽喉部异物感，与相应的中药制 成雾化剂可起到清咽利喉的功效【5 0 1 。4 、烧伤和皮肤溃疡愈合剂，蜂胶涂覆剂在伤1 3 可形成一层黏性膜，即可避免体液外流，又可防止细菌侵袭和感染，并能吸收脓液， 促进愈合。5 、医用植皮保存剂。6 、人参保鲜剂。7 、作为畜禽饲料添加剂，具有促 进动物生长、增加动物抵抗力的功效。8 、畜禽药物制剂。通过互联网搜索，查到的 蜂胶产品有蜂胶片、蜂胶浓缩液( 水溶性、醇溶性) 、蜂胶口服液、蜂胶滋养霜、蜂 胶喉安喷剂、蜂胶香皂、蜂胶可乐、蜂胶口香糖、蜂胶胶囊等等许多产品，国外己有 蜂胶针剂用于l 临庆治疗。还有食品上使用蜂胶做为保鲜剂，食品和药品的添加剂等等 【4 6 】 o 2 3 蜂胶的加工技术 国外用于药品和食品的蜂胶，提取方法基本上可分为醇溶和水溶两种。醇溶包 括蜂胶的乙醇提取液、乙醇提取物的快速提取、甘醇提取法、油提取法、蜂胶软膏、 干提取物、水溶性蜂胶的干粉状蜂胶提取物、自由流动和不吸湿的蜂胶粉、水溶性的 5 福建农林大学硕士学位论文 蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 衍生物【5 l 】。 y o n g k u np a r k 采用紫外分光光度计法比较了水溶蜂胶液和乙醇溶解蜂胶液的吸 收光谱，二者虽然在2 9 0n l t l 处均为最高峰，但水溶蜂胶液的吸收水平却很低。6 0 的乙醇液提取的蜂胶液中所含异樱花素、榭皮素、山奈酚的量最高；7 0 乙醇液提取 的乔松素、樱花素量最多；8 0 的乙醇液提取的山奈甲黄素、刺槐素、异鼠李素较多； 6 0 和8 0 乙醇提取液对微生物的抑制作用最强；7 0 和8 0 的乙醇提取液的抗氧化 作用最强；8 0 的乙醇提取液对透明质酸酶的抑制作用强，而蜂胶水溶液不能抑制微 生物生长和透明质酸酶活动，抗氧化性能较弱【5 l 】。 日本采用硼高分子电解质法提取蜂胶。将阴离子型离分子化合物硼高分子电解 物的稀释精制水溶液与含有蜂胶物的纤维素充分混溶，高分子电解物的稀释精制水溶 液可不断分解蜂胶，然后加入乙醇和以海藻为原料的纤维素，从而可提取出含有有效 成分的亲水性凝胶体，经提炼后的结晶具有很强的除菌力，用这种方法得到的提取物 具有很好的活性【5 2 1 。 3 乳化技术的研究现状 3 1 乳化技术概述 乳化作用是有一类物质能够使油水较变成相对稳定难以分层的乳状液的过程【5 3 1 ， 能够等油水变成乳液的物质叫乳化剂。乳化的三个关键因素是：1 、乳化体系；2 、搅 拌叶片的形式和搅拌速度；3 、加水的过程。 现在乳化技术主要有单一乳化，工艺简单，易于掌握，应用也非常广泛；复合乳 化，需要确定最佳复合剂型与比例，其乳化效果较单一乳化剂好；微乳化技术更是近 些年来的备受关注的乳化技术，广泛的用于化工、食品、医药领域；还有超声乳化和 纳米乳化也得到了很大的关注和应用。 3 2 乳化技术的研究进展 单- - $ l 化技术【5 4 1 能够改善乳化体中各种构成相之间的表面张力，形成均匀分散的 乳浊液。可以是两种以上不相溶的溶液形成混合物。 乳化剂复合【5 5 1 使用更有利于降低界面张力，界面张力越低，界面吸附增强，分子 定向排列更加紧密，界面膜增强。防止液滴的聚集倾向，有利于乳浊液的稳定性。复 合乳剂要比单一乳剂具有更好的表面活性。由此可见，使用复合乳剂是提高乳化效果、 增强乳浊液稳定性的有效方法。 超声乳化【5 6 】是利用超声的空化效应把两种或多种互不相溶的液体互相分散乳浊 液或微乳的过程。它可用于石油、化工过程中的油水或其它物料的乳化、微乳化，也 6 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 可用于轻工、食品和药品等部门的液体处理。在食品工业中的软饮料、番茄酱和蛋黄 酱等的食品生产均可应用超声乳化技术。主要过程是使工作物质通过预混器，泵送至 超声乳化器内破碎、混合、乳化。可进行连续或间歇操作。乳化粒径可小于2u n l 。 微乳是由油相、水相、乳化剂及助乳化剂在适当比例自发形成的一种透明或半透 明、低黏度、各向同性且热力学稳定的油水混合系统，其作为药物载体的主要优点是 可同时增溶不同溶解性能的成分，分散性好，利于吸收，提高生物利用度【5 7 1 。 3 3 微乳技术的应用 现从微乳作为给药载体时不同类型配方、质量评价方法、各种微乳给药系统的优 势，以及微乳在药学领域的其他应用情况等方面，对近年来国内进展状况进行综述， 并对微乳在中药方面的应用提出建议。 一般情况下，我们将两种互不相溶液体在表面活性剂作用下形成的热力学稳定 的、各向同性、外观透明或半透明、粒径1 1 0 0n l n 的分散体系称为微乳液【锄。相应 地把制备微乳液的技术称之为微乳化技术( m e t ) 。自从8 0 年代以来，微乳的理论和 应用研究获得了迅速的发展，尤其是9 0 年代以来，微乳应用研究发展更快，在许多 技术领域：如三次采油，污水治理，萃取分离，催化，食品，生物医药，化妆品，材 料制备，化学反应介质，涂料等领域均具有潜在的应用前景。我国的微乳技术研究始 于8 0 年代初期，在理论和应用研究方面也取得了相当的成果。 1 9 8 2 年，b o u t o n m t l 5 9 首先报道了应用微乳液制备出了纳米颗粒：用水合胼或者氢 气还原在w o 型微乳液水核中的贵金属盐，得到了单分散的p t ，p d ，r u ，i r 金属颗 粒( 3 1 0n m ) 。从此以后，不断有文献报道用微乳液合成各种纳米粒子，纳米粒子制备 的角度出发，论述了微乳反应器的原理、形成与结构，并对微乳液在纳米材料制备领 域中的应用状况进行了阐述。 3 4 蜂胶乳化的研究状况 蜂胶提取物高度亲脂，几乎不溶于水，目前通常采用有机溶剂和乳化剂来制备蜂 胶溶液，国内很多人研究蜂胶水提工艺，如浙江省中医研究所的杨锋【6 0 】就介绍了一种 醇溶水提法制备蜂胶水溶液的工艺；江西农业大学动物科学技术学院的张娟1 6 1 】也介绍 了蜂胶的水溶工艺。然而有很多研究表明，水溶的蜂胶药理作用远不如有机溶剂的蜂 胶溶液。 陈崇羔 6 2 】等人采用t w e e n - 2 0 、t w e e n 一6 0 、t w e e n 一8 0 和s p a n 8 0 等4 种表面活性 ，剂，按一定浓度梯度配置的水溶液作为蜂胶的增溶剂。结果表明：2 0 t w e e n 2 0 水 溶液与8 0 t w e e n 一6 0 水溶液以及6 0 t w e e n - 2 0 水溶液与4 0 t w e e n 一6 0 水溶液的组 7 福建农林大学硕士学位论文 蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 配液，对蜂胶水溶的增容效果最好。并确定当上述增溶剂用量不小于蜂胶用量的7 2 倍和8 4 倍时，蜂胶可任意加水稀释均保持澄清。 王嘉军【6 3 】博士选择具有天然、广谱抗微生物活性的蜂胶醇溶液为油相，硝酸银水 溶液为水相，表面活性剂吐温一8 0 为乳化剂，按照纳米乳剂形成的新理论，以适当的 比例混合后，室温下温和搅拌制备成水包油型( o w ) 蜂胶一银离子复合纳米乳剂。并 对复合乳剂的理化性质和抗菌活性物质总黄酮的含量进行测定，透射电镜观察乳剂的 纳米结构体系；比较复合乳剂与单独使用相同浓度蜂胶和银离子的抑菌效果：检测复 合乳剂的杀灭细菌、真菌、病毒和芽抱的效果和稳定性；研究复合乳剂杀灭革兰氏阴 性和阳性菌的杀菌机理；评价复合乳剂的毒性和安全性。 4 本项目研究的目的及意义 蜂产品是蜜蜂为了其种族的生存和繁衍向自然界索取精华物质并进行加工的产 品，它包括蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉、蜂胶和蜂蜡等。它是大自然赋予人类的天然食品 和保健品，具有很强的营养保健和防病治病的神奇功能，是营养全面的食疗保健佳品， 被人们称为“新的长寿因子”。基于对蜂胶化学成分和药理学研究，它不仅对于治疗糖 尿病、高血脂、高血压、病菌感染发炎、各种疼痛等疾病具有重要作用，而且具有抗 氧化、抗衰老、预防各种疾病、保持机体健康等作用，为人类健康长寿带来福音1 5 】。 从蜂胶生产发展潜力来看，中国在国际上有无法取代的作用。蜂胶高产蜂种的培 育和推广、无污染蜂胶高产采集的研制和使用、蜂胶生产操作技术规程的实施，将把 我国蜂胶生产推向一个新水平。从国内外市场潜力看我国蜂胶产业的发展，蜂胶将会 成为食品、保健品、药品、日用化工的重要原料，在未来世界有广阔的市场前景。目 前，我国每年蜂胶产量的一大半用于出口( 包括原料及加工成品) ，其中，国内蜂产 品消费水平目前还很低，每人每年蜂胶的消费几乎为零。这些丰富的蜂胶资源转化为 产品，年产值可达几十亿元，纯利润至少也有几亿元。因此如何开发国内市场蜂胶市 场，开发多元化蜂胶产品，增加国民收入，提高蜂胶经济效益，已成为国内蜂胶研究 的重点。 为丰富蜂胶产品多样化、增加蜂胶的在医药食品行业的应用，本研究从蜂胶乳化 工艺着手，系统的研究乳化剂筛选、优化乳化工艺，以期寻找到蜂胶水溶液的最佳工 艺，填补此项空白。 本研究以蜂胶为原料，优化提取工艺，通过乳化剂对蜂胶乳化效果研究，优选出适合 蜂胶乳化的乳化剂；分别通过对单一乳化工艺、复合乳化工艺参数的优化，比较了不 8 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 同乳化剂工艺对蜂胶乳化，探讨如何通过控制乳化条件，从而有效的控制蜂胶乳化的 工艺条件；采用二次正交旋转组合试验方案，建立复合乳化工艺中透光率和乳化黄酮 含量与乳化工艺各参数的两个动态数学模型，实现生产中进行动态控制和预测产品质 量的目的，具有重要的实践意义。 5 研究内容 5 1 研究蜂胶提取工艺参数，即乙醇浓度、提取温度、提取时间、超声时间四因 素三个水平的正交试验，以蜂胶黄酮含量、浸膏得率、总提出物得率为标准，优选出 蜂胶的最佳提取工艺。 5 2 采用吐、温- 2 0 、吐n - 4 0 、l r l , 吐i 品- 6 0 、吐温- 8 0 、曲拉薄1 0 0 五种乳化剂及其组合，使用乳 化约束条件乳化温度5 0 ，乳化剂用量2 ( 体积百分比) ，搅拌时间2 h ，分别对蜂 胶进行乳化，以乳化液的透光率、乳化黄酮含量为指标，选取适合蜂胶的乳化剂。 5 3 使用选取出来适合蜂胶乳化的乳化剂，通过正交试验分别探讨单一乳化剂乳 化蜂胶的的乳化温度、乳化剂用量、超声时间、搅拌时间对乳化效果的影响规律，并 以透光率和乳化黄酮含量为指标确定单一乳化剂各自较优乳化工艺。 5 4 通过单因素试验确定复合乳化剂的较佳组合，并采用二次正交旋转组合试验 设计方案，建立蜂胶乳化工艺中乳剂透光率y l 、乳化黄酮含量y 2 与乳化温度x l 、超 声时间x 2 、搅拌时间x 3 的数学回归模型。 5 5 用吐温4 0 、吐温6 0 及吐温4 0 与吐温一6 0 组合制成的蜂胶聚乙二醇一4 0 0 乳剂， 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌进行的抑菌研究。 9 福建农林大学硕士学位论文蜂胶乳化工艺及抑菌性研究 第二章蜂胶提取工艺的研究 目前，提取蜂胶的方法很多，但都有其各自的弊端。蜂胶中黄酮类化合物的提取 主要根据溶解性及酸性进行，黄酮苷及游离的黄酮均能溶于醇，通过醇的多次浸泡， 可以较充分的把蜂胶中的黄酮类物质提取出来删。为此，国内外用于药品和食品的蜂 胶，大部分还是采用乙醇作提取溶剂。用乙醇提取蜂胶目前仍是一种方便安全且经济 有效的方法。但国内外研究表明：用乙醇提取，提取时间长，导致在一定温度下黄酮 类醇溶功能物质受到不同程度的破坏【6 5 】。因此本研究采用短时，辅助超声波的方法对 蜂胶提取工艺进行研究。 l 材料与方法 1 1 原料与试剂 蜂胶 芦丁 亚硝酸钠n a n 0 2 硝酸铝( a 1 ( n 0 3 ) 3 ) 9 5 乙醇( c h 3 c h 2 0 h ) 无水乙醇( c h 3 c h 2 0 h ) 氢氧化钠( n a o h ) 1 2 仪器与设备 c h a s 恒温振荡器 s z c l 一型数显智能控温磁力搅拌器 s z 一9 7 自动三重水蒸馏器 a l 2 0 4 型电子天平 u v 9 1 0 0 紫外分光光度计 d h g 9 1 4 0 鼓风干燥箱 s h b i l l 循环水式多用真空泵 超声细胞粉碎机( 功率为4 0 0 w )