（农产品加工及贮藏工程专业论文）菜籽植物甾醇的提取、纯化及抗氧化活性研究.pdf

华中农业人学2 0 0 9 届硕l ：学位论文 摘要 植物甾醇是一种类似于环状醇结构的物质，广泛分布于自然界，代表了植物代 谢的一个终产物。天然植物甾醇种类繁多，主要包括p 谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇 和菜油甾醇4 种无甲基甾醇，另外还有燕麦甾醇、菠菜甾醇、麦角甾醇等。近年来 随着科学研究特别是生命科学、油脂科学与工程技术的迅猛发展，植物甾醇在医药、 食品、化工、饲料、植物基因工程等领域被高度重视与关注。 目前，提取植物甾醇的原料主要为植物油脱臭馏出物。本课题从多种菜籽油原 料中提取菜籽植物甾醇，首先对植物甾醇提取工艺进行了研究，接着对粗甾醇进行 纯化，其次对植物甾醇结构进行分析鉴定，最后通过对植物油和动物油的抗氧化实 验，以及通过化学发光法来评价植物甾醇的抗氧化效果。 主要研究结果如下： 1 通过对菜籽毛油、菜籽油脚及菜籽脱臭馏出物中主要成分分析，得到菜籽毛 油的水分o 1 ；，脂肪酸9 6 7 ；酸价2 9 4 m g k o h g ；不皂化物o 8 。菜籽油脚的 水分3 2 5 ；酸价8 7 2 3m g k o h g ；不皂化物1 8 ；脂肪酸5 9 5 ：磷脂0 1 5 。 菜籽脱臭馏出物的水分0 9 ；酸价9 7 1m g k o h g ；不皂化物2 6 1 ；脂肪酸5 5 4 ； 菜籽植物甾醇1 2 5 。实验选择了菜籽脱臭馏出物为主要的提取原料并进行了提取 工艺的优化，实验结果表明：料液比w v 为l ：1 6 ，酯化时间为7 1 h ，酯化温度为 6 0 5 ，搅拌速度为4 2 0r m i n ，催化剂量为1 5 2 m l ，甾醇得率可达7 7 6 8 m g g 。将 实验提取的粗甾醇用无水乙醇、正己烷和丙酮三种有机溶剂进行重结晶精制，实验 结果表明：无水乙醇精制效果最好，得率可达6 5 4 ，纯度可达9 3 。 2 通过化学试剂特征显色法、紫外扫描、红外扫描、电镜扫描对菜籽甾醇进行 了结构鉴定和表征。提取的植物甾醇中主要含有：d 谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇。 3 植物甾醇对植物油和动物油的抗氧化实验，采用了不同浓度的植物甾醇和不 同增效剂对其进行抗氧化研究。实验结果表明：植物甾醇对葵花籽油、菜籽油、大 豆油及猪油都有一定得抗氧化效果，且抗氧化效果随着剂量的增大而增强。通过不 同增效剂的比较，得出其在植物油和动物油中的抗氧化能力为甾醇 维生素c 维生 素e e d t a 。 4 通过化学发光法进行植物甾醇抗氧化实验研究，实验表明：通过四个发光体 系的发光图谱分析得出，菜籽植物甾醇可以清除羟基自由基、超氧阴离子及双氧水， 对d n a 损伤的保护作用，表现出了一定的抗氧化能力。 关键词：菜籽毛油；菜籽油脚；菜籽脱臭馏出物；植物甾醇；溶剂结晶；抗氧化 菜籽植物；醇的提取、纯化及抗饥化活傩研究 a b s t r a c t t h es t r u c t u r eo fp h y t o s t e r o li ss i m i l a rt ot h ec r i c o i da l c o h o l s ，i ti sw i d e l yd i s t r i b u t e d i nn a t u r e ，a n dr e p r e s e n tam e t a b o l i ce n dp r o d u c t so fp l a n t s t h e r ea r em a n yk i n d so f p h y t o s t e r o l s i n n a t u r e ，m a i n l yi n c l u d i n gi b - s i t o s t e r o l ，s i t g m a s t e r o l ，b r a s s i c a s t e r o l a n d c a m p e s t e r 0 1 i t sa l s oi n c l u d ea v e n a s t e r o l ，s p i n a s t e r o la n de r g o s t e r o le t c i nr e c e n ty e a r s ， w i t hs c i e n t i f i cr e s e a r c hi np a r t i c u l a r ，l i f es c i e n c e ，s c i e n c ea n de n g i n e e r i n gg r e a s et h e r a p i dd e v e l o p m e n to ft e c h n o l o g y ，p h y t o s t e r o l si nm e d i c i n e ，f o o d ，c h e m i c a l ，f e e d ，p l a n t g e n e t i ce n g i n e e r i n ga n do t h e rf e l d sh a sb e e na t t a c h e dg r e a ti m p o r t a n c ec o n c e m a tp r e s e n t ，t h em a i nr a wm a t e r i a lf o re x t r a c t i o no fp h y t o s t e r o l sf o rt h ev e g e t a b l eo i l d e o d o r i z e rd i s t i l l a t e t h es u b j e c to f r a wm a t e r i a l sf r o mav a r i e t yo f r a p e s e e do i le x t r a c t e d r a p e s e e dp h y t o s t e r o l s ，f i r s t ，e x t r a c t i o no fp h y t o s t e r o l sh a v eb e e ns t u d i e d ，t h e np u n f yt h e c r u d ep h y t o s t e r o l s f o l l o w e db ya l la n a l y s i so ft h es t m c t l eo ft h ei d e n t i f i c a t i o no f p h y t o s t e r o l s ，f i n a l l y ，v e g e t a b l eo i l sa n da n i m a lo i lo nt h ea n t i o x i d a n te x p e r i m e n t s ，a s w e l la st h r o u g ht h ec h e m i l u m i n e s c e n c et oe v a l u a t et h ea n t i o x i d a n te f f e c to f p h y t o s t e r o l s t h e f o l l o w i n gi st h em a i n l yc o n c l u s i o n s ： 1 b ya n a l y s i st h em a i nc o m p o n e n to fr a p e s e e dc r u d eo i l ，r a p e s e e do i lr e s i d u ea n d r a p e s e e dd e o d o r i z e rd i s t i l l a t e ，r a p e s e e dc r u d eo i lt ob e0 1 o ft h ew a t e r ；f a t t ya c i d 9 6 7 ；a c i dv a l u e2 9 4 m g k o h g ；u n s a p o n i f i a b l em a t t e r0 8 r a p e s e e do i lr e s i d u eo f w a t e r3 2 5 ；a c i dv a l u e8 7 2 3m g k o h g ；u n s a p o n i f i a b l em a t t e r1 8 ；f a t t ya c i d s5 9 5 ； p h o s p h o l i p i d o 15 r a p e s e e dd e o d o r i z e rd i s t i l l a t eo fw a t e ro 9 ：a c i dv a l u e 9 7 1m g k o h g ；u n s a p o n i f i a b l em a t t e r2 6 1 ；f a t t ya c i d s5 5 4 ；r a p e s e e dp h y t o s t e r o l s 1 2 5 t h ee x p e r i m e n tc h o s e nr a p e s e e dd e o d o r i z e rd i s t i l l a t ea st h em a i nr a wm a t e r i a l e x t r a c t i o na n do p t i m i z a t i o no ft h ee x t r a c t i o np r o c e s s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w t h a t ：l i q u i d r a t i o w vt o1 1 6 ，t h ee s t e r i f i c a t i o nt i m ew a s7 1 h ，e s t e r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r eo f 6 0 5 c ，s t i r r i n gs p e e d o f4 2 0r m i n , t h e c a t a l y s tw a s1 5 2 m l ，p h y s t o s t e r o ly i e l d 7 7 6 8 m g g b yp u r i f i e dp h y s t o s t e r o lw i t hr e e r y s t a l l i z a t i o nm e t h o d b yc o m p a r i n gt h e a b s o l u t ee t h y la l c o h o l ，n h e x a n ea n da c e t o n e ，t h eb e s to fr e f i n e da b s o l u t ee t h y la l c o h o l ， 6 5 4 y i e l d , p u r i t yu pt o9 3 2 t h er a p e s e e dp h y s t o s t e r o ls 仃u c t l 盯a li d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o nt h r o u g h t h es p e c i a ls o l v e n t st od i s p l a yc o l o u r , u v s p e c t r u m ，i rs p e c t r u m ，s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p y e x t r a c t i o no fp h y s t o s t e r o lm a i n l yi n c l u d i n gi b - s i t o s t e r o l ，b r a s s i c a s t e r o la n d c a m p e s t e r 0 1 华中水业人学2 0 0 9 届硕1 ：学位论文 3 p h y t o s t e r o lf o rv e g e t a b l eo i la n da n i m a le x p e r i m e n to ft h ea n t i - o x i d a t i o n ，u s eo f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp h y s t o s t e r o l sa n dt h e i ra n t i o x i d a n ts y n e r g i s ts t u d i e s t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w ：p h y t o s t e r o l sh a v ea n t i o x i d a n te f f e c t s o ns u n f l o w e ro i l ， r a p e s e e do i l ，s o y b e a no i l a n dl a r da n da n t i o x i d a n te f f e c ti n c r e a s e sw i t ht h ed o s e e n h a n c e m e n t c o m p a r i s o no fd i f f e r e n ts y n e r g i s tc o m ei nv e g e t a b l eo i la n da n i m a lo i lf o r a n t i o x i d a n tc a p a c i t yo fp h y s t o s t e r o l v i t a m i nc 5 0 。使用环己酮为溶剂，3 次分级结晶混合植物甾醇，得到谷甾醇含量为8 7 ，以环己酮或正戊醇为溶剂，过5 次重结晶后，豆甾醇含量达到9 2 。中南林学 院的韩军采用结晶方法从葵花籽油中回收植物甾醇，他用乙醇将原料酯化，使用正 己烷作溶剂，加入适量水和乙醇作为助溶剂，通过使用4 倍与酯化物的溶剂进行一 次结晶，得到甾醇的提取为8 4 ，纯度为3 6 。 h a m u n e n 等使用烃和酮的混合物提取中性物质中的甾醇后，使用分子蒸馏， 将甾醇含量从2 5 - - - 3 0 提高到4 0 - - 6 0 ，再使用烃和水的混合物或烃、水和 低碳醇( 甲醇) 的混合物进行重结晶比例为( 1 5 - 3 5 ：0 0 3 - - 0 0 3 5 ：0 1 ) ，甾醇 的纯度可以提高9 7 5 以上。 。 溶剂结晶法具有操作简单，便捷等优点，适合实验室采用。但是由于混合植物 甾醇各组分结构非常相似，所以在分离单体时也很困难，重结晶法分离单体有限， 且纯度不高，在大规模工业化生产中，存在主要缺点是操作多，成本高( 彭莺，2 0 0 2 ； 张丽霞，2 0 0 6 ) 。目前很多研究利用先进设备，如高速逆流色谱和自制备色谱分离 出了高纯度的甾醇成分，但还是不能满足工业化大量生产的需要。 络合法 络合法工艺流程：脱臭馏出物一皂化一酸分解一萃取一络合反应一分离一络合 物一分解一甾醇粗制品一脱色一结晶一精制甾醇 此法所用的络合形成剂主要包括：有机酸、卤素、尿素和卤素碱土金属盐。一 般用卤盐络合，卤盐有氯化钙、溴化钙、氯化锌、氯化镁、溴化镁、氯化亚铁等等。 络合反应溶剂有用石油醚的，有用异辛烷的，反应温度亦各异。在不严重影响收率 的情况下，用水相皂化代替醇相皂化，减轻溶剂回收麻烦，可适当降低成本。 浙江大学傅小峰研究了络合法提取植物甾醇的工艺条件，脱臭馏出物经提取 菜籽植物甾醇的提取、纯化及抗钒化活悱研究 v e 后，进行转酯化反应，得到转酯化产物，再用氯化钙络合提取。得到优化的操 作条件为：乙酸乙酯为非质子性溶剂，其用量与转酯化产物质量比为1 ：1 ；氯化钙 转酯化产物质量比为1 ：8 ；甲醇为质子性溶剂，甲醇与氯化钙质量比为1 ：2 2 ：2 ；反 应温度4 0 ：反应时间l h 。在此条件下，甾醇的纯度达到9 8 以上，收率达到 7 5 以上。 皂化法 皂化法工艺流程：脱臭馏出物一加碱皂化一萃取去钙皂一浓缩一甾醇粗制品 一洗涤去杂一脱水一甾醇精制品 白求恩医科大学的杨锦竹等使用皂化法，对从麦胚油中提取药用植物甾醇进行 了研究，他们将麦胚油在氢氧化钾乙醇溶液中皂化后，用石油醚萃取三次，回收溶 剂后的枯黄色甾醇固体，纯度为5 7 2 9 。 广东省食品工业研究所的李春荣、王三永通过在植物油沥青中加入氢氧化钙和 水皂化后，用有机溶剂提取植物甾醇。他们从植物油沥青、菜籽油沥青及塔尔油沥 青中提取植物甾醇的回收率分别为9 0 、8 4 、8 8 。此工艺也是一种较传统的 方法，被广泛使用近年来也有人使用干式皂化工艺，即使用熟石灰或生石灰在6 0 一- - 9 0 c 皂化后，直接用机器粉碎膏状物，避免了一些麻烦的干燥程序。此外，采 用乙醇作为抽提剂进行低温浸出，一方面可节省大量乙醇，另一方面生产工艺安全 无毒。 蒸馏法 简单蒸馏法：h u i b e r s 等使用刮膜式蒸发器分离妥尔油中的甾醇，收集2 9 0 以下的残余物当在l m m h g 的压力下，2 2 0 c 蒸发，留在底部的残余物为总量的1 0 ，这其中含有5 的松脂酸，1 7 的总谷甾醇。谷甾醇的产量为7 0 ，3 0 的 谷甾醇挥发，受热分解的较少，几乎没有豆甾醇。当在2 5 0 。c ，常压下反应，甾醇 的酯化程度从4 0 9 0 l m m h g ，2 2 0 残余物，残余物在底部的为总油量的1 2 ，含有5 的松脂酸，1 9 总甾醇，甾醇总收率为9 5 。 分子蒸馏法：在1 3 3 p a 0 1 3 p a 下蒸馏可反复进行，以便更好地分离出v 和 脂肪酸酯类，便于甾醇的萃取。工艺流程：脱臭馏出物一酯化一蒸出低碳醇一蒸馏 除脂肪酸酯一残渣一分子蒸馏脱除v 一残渣一皂化一丙酮提取一甾醇粗制品一脱 色一结晶一精制甾醇 浙江省粮食科学研究所的许仁溥使用分子蒸馏蒸出米糠油皂脚酸化油中的脂 肪酸后，蒸馏浓缩物进一步用n a o h 的乙醇溶液处理，静置2 h ，母液在5 0 c 力n 入 6 华中农业人学2 0 0 9 届顾 ：学位论文 磷酸一氢钠，调p h 到6 5 ，析出谷维素过滤，用含水乙醇精制，得到谷维素纯度 为9 9 5 ，提取率为原油的4 0 ；沉淀用石油醚提取，回收石油醚后用乙醇精制， 得到黄色糠甾醇，总甾醇含量为6 5 。 吸附法 柱吸附法：工艺流程：脱臭馏出物一吸附柱除非甾醇杂质一溶剂洗脱一甾醇 粗制品一乙醇重结晶一甾醇精制品 原料为动物或植物油脂的皂化物和重酯化物，色谱柱填充物为硅酸铝、硅酸 镁或硅胶。柱色谱可分离出至少一种甾醇，溶剂和洗脱剂组成相同，主要是芳香烃 或脂肪烃的混合物对于胆甾醇，原料为羊毛脂皂化后的醇混合物或用碳数更低的醇 重酯化后的酯混合物，原料量是填充剂的4 0 ，填充剂为硅胶，室温下色谱分离后 重结晶前纯度可达6 7 以上，洗脱剂为c 8 c 9 脂肪烃和碳原子更少的脂肪酮或 酯，其中烃类占总体积的8 0 - 9 8 ，如9 5 的庚烷和5 的丙酮，最后对洗脱 物进行重结晶，可使甾醇达到药物纯度。 v a nd a m 等用柱色谱分离法从大规模的含甾醇的原料中进行商业化生产，提取 甾醇。 清华大学的周玉杰和戴玲妹等利用高速逆流色谱法，并选用v 庚烷：v 乙 腈：v 乙酸乙酯= 5 ：5 ：1 溶剂体系，成功地分离了混合植物甾醇标1 3 谷甾醇和 菜油甾醇。经过h p l c 检测准品中的1 3 谷甾醇和质量分数为9 1 的菜油甾醇产 品，收率分别可达5 6 和5 0 。该方法简便、重现性好，可作为高纯度的 1 3 谷甾醇和菜油甾醇标准品的制备分离方法。 高压流体吸附法：工艺流程：脱臭馏出物一高压流体混合物一吸附柱一甾 醇粗制品一重结晶一精制甾醇 高压液体、亚临界气体或超临界气体5 0 - - 4 0 0 b a r ，3 0 - - 6 0 与原料形成的高 压流体混合物通过吸附，使无脂甾醇离开高压流体，选择性的被留在吸附剂上，其 中吸附剂主要为氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙、碳酸镁或氢氧化镁，甾醇的脱附则需 通过另一种高压流体或有机溶剂，而从吸附后的高压流体中回收脂类则可提高温度 或者降低流体压力，得到的甾醇纯度很高( 姚专，2 0 0 3 ) 。 酶法：工艺流程：脱臭馏出物一酶催化酯化一脱溶一真空蒸馏一甾醇和v e 一 分离 加拿大s u r e s h r a m a m u r t h i 和a l a nr m c c u r d y 采用丹麦哥本哈根 n o v o i n d u s t r i a s 生产的一种固定化非特异性脂肪酶对脱臭馏出物的酯化过程进行 7 菜籽植物甾醇的提取、纯化及抗饥化活性研究 催化，使脂肪酸甲酯的转化率达到9 6 5 ，脱臭馏出物中的v e 和甾醇分别浓缩为 原来的1 7 倍与1 5 倍，即v e 由原来的1 2 7 4 提高到2 1 4 8 ，甾醇由原来的 1 1 3 9 提高到1 7 5 6 。g h o s h 和b h a t t a c h a r y y a 采用c a n d i d ac y l i n d r a c e a 酶将葵花 籽油脱臭馏出物水解，再用m u e o rm i e h e i 酶酯化、蒸馏，在l m m h g 压力下收集 2 3 0 2 6 0 的馏分，可得到纯度为3 0 的v e 和纯度为3 6 的甾醇。原料中含有 4 8 的v e 和9 7 的甾醇。整个过程v e 和甾醇的总回收率分别为7 0 和4 2 。 超临界c 0 2 萃取法：超临界c 0 2 萃取是一种全新的化工分离技术，具有无 易燃性、无化学反应、无毒、无污染、安全性高、操作简单等优点，在天然产物提 取中越来越受到重视( 石军，2 0 0 2 ) 。无锡轻工的赵亚平、丁萧霖用此方法做了工 艺条件的研究，他们采取间歇式操作，萃取温度为4 0 6 0 ，压力为1 5 m p a - - 一 3 0 m p a ，提取的植物甾醇纯度达到5 0 - 9 5 ，回收率达到8 5 - - 4 1 。 6 植物甾醇的主要功能 植物甾醇是一种重要的天然甾体，具有许多重要生理功能，最引人注目的是降 低胆固醇功效( 李月，2 0 0 4 ) 。p 谷甾醇具有类似于氢化可的松和羟基保泰松功能， 有较强抗炎作用( 刘荣华，2 0 0 7 ) 。另外一些研究表明，其在抑制肿瘤、防治心脏 病、抗癌、防治前列腺疾病和调节免疫功能等方面都有重要作用( 王稳航，2 0 0 2 ) 。 降低胆固醇：许多文献资料显示，剂量分别为0 5 9 。6 9 d 或o 6 9 l g m 植物甾 醇或饱和性植物甾醇平均可降低1 0 左右胆固醇( b o u i c ，1 9 9 9 ) 。关于植物甾醇 降低血中胆固醇机理尚未完全阐明，目前有几种主要理论( p i i r o n e nv ，2 0 0 0 ) 。( 1 ) 低吸收机制：植物甾醇和植物甾醇烷醇可将小肠中胆固醇沉淀下来，使其呈不溶解 状态，因此不能被吸收。( 2 ) 阻碍胆固醇溶于胆汁酸机制：胆固醇能溶于小肠内腔 胆汁酸微胶束，是被吸收的必要条件；而植物甾醇存在可将胆固醇替换出来，使之 不能经过胆汁酸微胶束运送到达小肠绒毛吸收部位，p 谷甾醇阻碍胆固醇吸收作用 主要发生这一种情况。( 3 ) 竞争结合位点机制：在小肠微绒毛膜吸收胆固醇时植物 甾醇将与胆固醇相互竞争，阻碍对胆固醇吸收。 调节血脂：医学界关于甾醇对血脂的作用开展了二十多项的临床研究，研究表 明，甾醇酯可以降低1 4 的低密度蛋白胆固醇( l d l c ) ，对于胆固醇水平过高的儿 童也有同样的功效。对人体健康有益的高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 和甘油三酯的 水平却并没有受到影响( 贾代汉，2 0 0 5 ) 。最近的一项研究证实，服用药物的患者 在服用添加了甾醇酯的食品后，l d l c 的水平可以再降低l o 。还有许多研究正 在进行之中。 8 华中农业人学2 0 0 9 届硕f j 学位论文 降低心脏病发生率：w e s t s t r a t e 和m e i j e r 指出，日服3 9 甾醇或饱和性甾醇可使 心脏发生率下降1 5 4 0 ( m e l l a n e np ，1 9 9 6 ) 。 抗癌：研究证明，植物甾醇对机体某些癌症如乳腺癌，肠癌，胃癌等发生和发 展有一定抑制作用( a w a d ，2 0 0 2 ；m e n d i l a h a r g um ，1 9 8 8 ) 。 类激素功能：由于植物甾醇在化学结构上类似于胆甾醇，对防治前列腺疾病和 乳腺疾病有较好作用。许多研究者认为它在体内表现出一定激素活性，且无激素副 作用( m i e t t i l l e l lt ，2 0 0 1 ；唐传核，2 0 0 1 ) 。 其他一些研究表明植物甾醇还具有一定得抗炎和免疫调节作用( d es t e f a n i ， 2 0 0 0 ；李劲松，2 0 0 4 ) 。 7 植物甾醇在国内的研究概况 我国对植物甾醇的研究大多只停留在对植物甾醇的提取和分析方面，对植物甾 醇的活性应用研究报道较少，对植物甾醇类单体研究，国内基本空白( 吴谋成， 2 0 0 1 ) 。 8 植物甾醇在国外的研究概况 美国、欧洲和日本等国家对植物甾醇在医药中的应用理论和技术的研究较多， 也有一定得突破。目前国外英勇最多的是在医药方面，如作为甾体激素药物的原料、 降低胆固醇的药物，抗炎退热及抗肠癌、宫颈癌、皮肤癌、肺癌、前列腺癌等。在 食品领域应用方面主要趋向于作为预防心血管疾病的功能性活性成分( 杨振强， 2 0 0 6 ) 。在欧美市场见得最多的是人造奶油、黄油等涂抹油脂中的应用( 齐继成， 2 0 0 4 ) 。近年来，由于植物甾醇的热稳定性及其抗氧化、抗聚合能力的发现，煎炸 油工业中引入植物甾醇的日子已不远( 吴时敏，2 0 0 2 ) 。如现在利用液晶技术、脂 质体制备技术、微胶囊技术等将植物甾醇及其产品粒子化后，成为适合某特定用途 形式，如在精密光学、医学、生命科学领域的产品拓展。 9 立题背景及课题意义 我国是油脂生产大国，油料作物也主要集中在长江中下游一带，我国油脂生产 中，仅脱臭馏出物中就蕴藏着几千吨植物甾醇。而大量厂家都没有充分利用起来， 造成资源的浪费。在当今能源如此紧张的时代，如何充分合理利用资源是待解决的 重要问题之一。所以摆在我们面前的任务就是要寻找一条操作简单，既经济又合理 的工艺路线来充分利用这些资源来提取其活性物质，达到资源最大利用的目的。 9 菜籽植物甾醇的提取，纯化发抗瓴化活悱研究 本课题以菜籽油及其副产物为原料，通过对提取工艺的优化及纯化得到纯度较 高的植物甾醇。为菜籽油脚、菜籽脱臭馏出物提取植物甾醇的工业化生产提供依据。 同时，本实验还对菜籽植物甾醇的抗氧化活性进行了初步研究，也为植物甾醇的活 性研究提供参考。 1 0 华中农业人学2 0 0 9 届硕i ：学位论文 第二章菜籽植物甾醇的提取与分离 从植物油及其脱臭馏出物中提取植物甾醇，主要是利用原料组成的化学性质、 物理性质方面的差异来达到分离与提纯的目的，由于植物油及其脱臭馏出物中脂肪 酸含量较高，所以一般都先通过酯化除去游离脂肪酸，酯化后，主要含有甾醇、脂 肪酸甲酯、甘油等其他物质，最后再利用植物甾醇容易结晶的特性来分离提纯植物 甾醇。相关文献表明无论使用哪种方法提取植物甾醇之后，都是采用溶剂萃取结晶 法来提纯粗甾醇，利用溶剂重结晶法可以迸一步获得更高纯度的植物甾醇。本实验 通过几种有机溶剂的比较考察了重结晶工艺精制甾醇的效果。曾哲灵研究了混合植 物甾醇在多种有机溶剂中的溶解度情况，为本实验关于甾醇结晶溶剂的选择提供了 很高的参考价值。 1 材料、仪器与方法 1 1 实验材料 菜籽毛油：华中农业大学生物柴油制备中心 菜籽油脚：湖北省麻城市 菜籽脱臭馏出物：湖北省油料所 1 2 主要试剂 乙醚 乙醇 浓硫酸 盐酸 氢氧化钾 酚酞 三氯甲烷 氧化锌 冰乙酸 己烷 碘化钾 硫代硫酸钠 可溶性淀粉 甲基橙 a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r 天津市德思化学试剂有限公司 天津市德思化学试剂有限公司 信阳市化学试剂厂 成都科龙化工试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 菜籽植物淆时的提取、纯化及抗钒化活讹研究 1 3 主要仪器 分析天平 烘箱 紫外分光光度计 恒温水浴锅 s h z c 旋转蒸发器 搅拌器 c e n t r i f u g e 冷冻离心机5 4 1 5 r 赛多利斯科学仪器( 北京) 有限公司 上海精宏实验设备有限公司 上海欣茂仪器有限公司 江苏金坛市中大仪器厂 河南巩县英峪仪器厂 金坛市杰瑞尔电器有限公司 e p p e n d o r f 1 4 菜籽毛油、菜籽油脚和菜籽脱臭馏出物成分分析 1 4 1 水分含量的测定：g b 5 5 2 8 1 9 8 5 1 4 2 酸价的测定：g b t5 5 3 0 1 9 9 8 1 4 3 不皂化物的测定：g b t5 5 3 5 2 1 9 9 8 1 4 4 游离脂肪酸的测定： 准确称取3 至5 9 样品，置于锥形瓶中，然后加入3 0 m l 中性石油醚一乙醇混 合溶液( 体积比为2 ：1 ) ，待样品完全溶解后，加入几滴酚酞指示剂，用浓度为0 1 m o l l 的k o h 标准溶液滴定至微红色，且半小时内不退色。 游离脂肪酸( ，w t ) = n x v x l 0 一w x 2 8 2 5 x 1 0 0 式中：n - - n a o h 浓度( m o l l ) ； v - n a o h 体积( m 1 ) ； w 一样品重量( g ) ； 1 4 5 总脂肪酸含量的测定 ( 1 ) 脂肪酸与甘油分离 称中性油脂约2 0 9 于2 5 0 m l 三角瓶中，加1 5 m l 5 0 氢氧化钠溶液及4 0 m l 9 5 乙醇，连接回流冷凝器，水浴加热皂化3 0 m i n 。皂液移入1 0 0 0 m l 烧杯中，三角瓶 内残留物用5 m l 热乙醇沈，转入烧杯内，烧杯置于水浴上蒸发去除乙醇 乙醇蒸去后，肥皂内加入热蒸馏水2 0 0 m l ，加热搅拌，肥皂溶化后，加数滴甲 1 2 华中农业人学2 0 0 9 届硕l ? 学位论文 基橙指示剂，使皂液显黄色。慢慢加入过量稀硫酸，使杯内溶液分为明显两层，上 层为透明脂肪酸，下层为红色酸性甘油液，加热数分钟后冷却。 将烧杯内的溶液全部转移到5 0 0 m l 分液漏斗内，静置后，将下层酸性甘油液转 移到另一只5 0 0 m l 分液漏斗内。在此漏斗内加入3 0 m l 乙醚，充分摇匀混合后，静 置，分去甘油，同时再用2 5 m l 乙醚提取两次，弃去甘油层。将乙醚层( 上层) 合 并于脂肪酸液中，加入约1 0 0 m l 蒸馏水来清洗脂肪酸，如此清洗数次，直到放出 的水溶液遇甲基橙指示剂不再显红色( 酸性) 为止。 ( 2 ) 总脂肪酸的测定 将上述分液漏斗内的乙醚层溶液，加入无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液转移到 已知质量的浸取瓶中，连接浸取器，回收乙醚。将所得脂肪酸置于压力为1 0 0 m m h g ， 7 5 真空烘箱内烘至恒重，冷却，称重。 1 4 6 过氧化值的测定 脂肪酸含量=堕堕墼壁量幸 油样质量 l o o 准确称取试样2 0 0 3 0 0 9 于2 5 0 m l 碘量瓶中，加入3 0 m l 三氯甲烷冰乙酸 ( 2 + 3 ) 使试样完全溶解，再加入1 0 0 m l k i 饱和溶液迅速盖好瓶塞，轻振摇o 5 m i n ， 然后在1 5 2 5 避光放置5 m i n 。取出，加入1 0 0 m l 蒸馏水，立即用硫代硫酸钠标 液滴定至浅黄色，加l m l 淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点( 如过氧化值 很小，则可直接加入淀粉指示液，用硫代硫酸钠标液滴定至终点即可) 。 不加试样，用溶剂和试剂进行空白试验。如空白试验超过0 1 m l 的0 0 1 m o l l 硫代硫酸钠标液，应更换不纯的试剂。 测定次数：同一试样进行两次测定。 p v =c * ( z , - v 0 ) 1 0 0 0 m 式中c - 所用硫代硫酸钠标准溶液的准确浓度，m o l l ； v l 样品滴定所用硫代硫酸钠标准溶液的体积，r l l l ； v r 空白滴定所用硫代硫酸钠标准溶液的体积，m e g m 试样的质量，g ； p v ：过氧化值，m m o l k g 菜籽植物甾酵的提取、纯化及抗饥化活f t - ：o f 究 1 4 7 磷脂含量的测定 ( 1 ) 绘制标准曲线 取5 只5 0 m l 比色管，编成1 ，2 ，4 ，6 ，8 五个号码，按号码顺序分别注入磷 标准2 号液1 ，2 ，4 ，6 ，8 m l ，再按顺序分别加水9 ，8 ，6 ，4 ，2 m l 。接着向5 只管内各加0 0 1 5 硫酸联氨溶液8 o r a l ；各加钼酸钠稀硫酸溶液2 o r a l ，加塞、摇 匀。去塞，将5 只管置于正在沸腾的水浴中加热l o m i n ，取出冷却至窒温，用水稀 释至5 0 m l ，充分摇匀，经1 0m i n 后，用分光光度计在波长6 5 0 n t o 下，用3 c m 液 槽，用水调整零点，分别测定消光值。以消光值为纵坐标，以磷量( o o l 、0 0 2 、o 0 4 、 o 0 6 、o 0 8 m g ) 为横坐标，绘制标准曲线。 ( 2 ) 制备被测液 用坩埚称取试样约l o g ( 准确至o 0 0 1 9 ) ，加氧化锌0 5 9 ，先在电炉上加热炭化， 然后送入5 5 0 - - , - , 6 0 0 。c 的高温炉中灼烧至灰化( 白色) ，灼烧时间约2 h ，取出坩埚冷却 至室温，用热盐酸( 1 ：1 ) l o m l 溶解灰分，并加热微沸5 m i n ，将溶解液过滤注入 l o o m l 容量瓶中，用热水冲洗后坩埚和滤纸，待滤液冷却至室温后，用5 0 氢氧 化钾溶液中和至出现混浊，缓慢滴加盐酸使氧化锌沉淀全部溶解后，再滴2 滴，最后 用水稀释至刻度，摇匀。 ( 3 ) 比色 用移液管吸取被测液l o m l 注入5 0 m l 比色管中，加入0 0 1 5 硫酸联氨8 0 m l ， 加2 o r a l 钼酸钠稀硫酸溶液，加塞，摇匀。去塞，将比色管置于正在沸腾的水浴中 加热1 0 m i n ，取出冷却至室温，用水稀释至5 0 m l ，充分摇匀，经l o m i n 后，用分 光光度计在波长6 5 0 h m 下，用3 c m 液槽，用水调整零点，测定消光值。 根据被测液的消光值，从标准曲线查得磷量( p ) ，按公式计算磷脂含量： 磷瞰) = 尸搴鲁 2 6 3 1 而1 0 0 式中 p 标准曲线查得的磷量，m g ： v ：群品灰化后稀释的体积，m l ； v ，比色时所取的被测液体积，m l ； 2 6 3 1 每毫克磷相当于磷脂的毫克数； w 一式样重量，g 。 1 4 华中农业人学2 0 0 9 届硕i ：学位论文 1 4 8 甾醇含量的测定： 采用可见光比色法( 高瑜萤等，2 0 0 1 ) 测定粗甾醇中甾醇的含量。 标准曲线的制作：准确称取甾醇标准样品，配成l m l 系列标准样品。溶剂为乙 酸酐，浓度为0 0 1 ，0 0 3 ，0 0 5 ，0 1 ，0 1 5 ，0 2 ，0 2 5 x 2 x 3 ，并且每个因素对提取率的影响都极显著。 如表2 1 0 ，从关键值表中可以看出不同因素的编码值和未编码值一致，表明在 ( 0 0 8 9 7 7 7 ，0 2 8 6 9 1 0 ，0 0 5 4 6 0 2 ) 关键点处有极大值。 如表2 。1 1 表，从特征分析表中可以看出，特征值全为负，因此稳定点( 0 0 8 9 7 7 7 ， 0 2 8 6 9 1 0 ，0 0 5 4 6 0 2 ) 为最大值点( 编码) ，预测最大值为0 8 0 5 5 8 9 。 通过计算得出最佳条件为，菜籽毛油用量4 4 8 m l ，皂化时间6 5 m i n ，萃取剂用 量为1 5 8 m l 。 $ 中收业，、学2 0 0 9 月恸i 学位论i 一0 0 7 3 9 2 6 一o l l 5 6 0 7 01 7 6 8 4 2 0 2 6 7 8 7 4 03 3 1 9 7 7 09 0 4 4 5 3 08 9 9 8 1 0 - 02 4 9 3 3 3 0 3 5 8 0 1 6 03 4 4 3 6 3 09 0 9 7 3 9 02 3 1 9 2 7 从回归方程做响应面，进行响应回归后得回归方程如下： y i = 07 9 5 6 6 7 - 0 0 4 5 3 7 5 x t + 00 5 4 8 7 5 x 2 - 01 6 2 7 0 8 x t 0 0 0 8 9 7 0 8 x 2 z 一00 5 9 7 5 0 x 2 x i y 2 ；07 9 5 6 6 7 + 00 5 4 8 7 5 x 2 + 0 0 0 0 5 0 0 x 3 0 0 8 9 7 0 8 x 2 2 0l1 3 9 5 8 x 3 2 + 00 3 6 0 0 0 x 3 x 2 y 3 = o7 9 5 6 6 7 00 4 5 3 7 5 x t + 0 0 0 0 5 0 0 x 3 01 6 2 7 0 8 x t z - o1 1 3 9 5 8 x 3 。+ o0 1 8 0 0 0 x 3 x 1 三个因素之间的交互作用曲面图如下： 圈i t x 1 与的交互作用 f i ga r e l a t i o n s h i po f x ta n dx 2 图b x - 与) b 的交互作用 f i gb r e l a t i o n s h i po f x la n dx 3 菜籽植物甾酵攫取纯化抗礼化* 性日 a 2 7 2 从菜籽油脚中提取植物甾醇旋转正交实验结果 表2 1 2b o x b e h n k e n 设计方案及响应值结果 t a b l e 2 - 1 2 b o x - b e h n k e n d e s i g n r e s u l t so f r e s p o n s e v a l u e 华中农业人学2 0 0 9 届硕。l ：学位论文 根据以上实验结果，通过s a s 软件进行二次响应面回归分析，得到如下关于料 液比、酯化温度和酯化时间的多元二次响应面回归模型： y - - - 4 7 6 0 0 0 0 0 0 6 3 7 5 0 x 1 + 0 2 8 1 2 5 0 x 2 + 0 0 4 0 0 0 0 x 3 0 5 8 1 2 5 0 x i z - o 2 8 1 2 5 0 x 2 z 一0 4 8 8 7 5 0 x 3 2 - 0 0 6 2 5 0 0 x 2 x i + 0 0 1 8 0 0 0 x 3 x l + 0 0 2 9 0 0 0 x 3 x 2 表2 1 3 方程中各参数的回归系数 t a b l e 2 - 1 3r e g r e s s i v ec o e f n c i e n to ft h ep a r a m e t e r si ne q u a t i o n 通过对回归方程的检验，由t a b l e 2 1 4 可以看出影响提取率的三个因素的f 值 分别为4 8 1 ，4 3 1 和4 5 9 。由此可见，影响最大的因素是料液比，并且影响较其他 两个因素尤其明显，其次是酯化时间，酯化温度的影响最小，即影响显著性的顺序 是x l x 3 x 2 ，并且每个因素对提取率的影响都显著。 如表2 1 5 ，从关键值表中可以看出不同因素的编码值和未编码值一致，表明在 ( - 0 0 5 4 8 9 1 ，0 6 1 6 2 4 0 ，0 2 1 3 6 3 6 ) 关键点处有极大值。 菜耔植物甾阱的挺耻、9 e 化抗轧化活t e f 究 如表2 1 6 表，从特征分析表中可以看出，特征值全为负，因此稳定点( 一o0 5 4 8 9 1 ， 0 6 1 6 2 4 0 ，02 1 3 6 3 6 ) 为最大值点( 编码) ，预测最大值为48 5 2 6 8 1 。 通过计算得出最佳工艺条件为：料液比1 ：1 2 ，酯化温度6 2 c ，酯化时间57 h 。 表2 - 1 5 关键值表 t a b l e 2 - 1 5k e y v a l u et a b l e 从回归方程做响应面，进行响应回归后得回归方程如下： y 叫7 6 0 0 0 0 00 6 3 7 5 0 x i + 02 8 1 2 5 0 x 2 0 5 8 1 2 5 0 x 1 2 02 8 1 2 5 0 x 2 2 - 00 6 2 5 0 0 x 2 x 1 y 2 = 47 6 0 0 0 0 00 6 3 7 5