（农产品加工及贮藏工程专业论文）鲟鱼硫酸软骨素制备工艺的研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：摄莓l i 论文使用授权的说明 只期：砷1 f 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文 指导教师亲笔签名 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 _ 7m 唧 福建农林人学硕士学位论史鲥鱼硗髓软骨紊制备 【艺的研究 中文摘要 硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，c s ) 多分布于软骨、鼻骨、喉骨、韧带、肌膜中，鱼 类软骨中含量很丰富。c s 临床上主要用于治疗神经痛、关节炎、耳呜以及促进溃疡愈合和防 止高血脂症等。随着生理功能及生化性质的深入研究，发现它具有凝血和防止血管硬化等功 效，对冠心病、黏膜细胞、肾细胞等具有保护作用；c s 还可与某些物质调制成化妆品用于保 护皮肤的健美。 本论文以鲟鱼软骨为原料，采用碱提取酶解醇沉法，以氨基【三檐含量和硫酸软骨素得 率为主要指标进行试验研究，选取硫酸软骨素的最佳生产工艺条件，为实际生产提供有价值 的参考数据。 c s 与蛋白质等成分结合在一起，碱提取有利于破坏硫酸软骨素与蛋白质之间的共价键使 硫酸软骨素释放出来，所以碱提取过程是提高硫酸软骨素得率的关键。酶水解过程是提高硫 酸软骨素产品纯度的关键，蛋白质是硫酸软骨素中最主要的杂质之一，通过酶解处理使溶液 中及硫酸软骨素长链上的蛋白质进一步得到水解破坏，形成为可溶性小分子肽、氨基酸等物 质。由于一次酶解，氮含量很难达到要求，所以采用双酶进行酶解。乙醇沉淀法是利用软骨 中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸软骨素与其它杂质相互分离。 试验结果显示：采用2 倍量6 n a o h 溶液作为浸提液，浸提温度为4 0 ，浸提时间4 h ； 酶解过程采用先胰酶作用后胃蛋白酶作用，酶量分别为0 5 和o 3 ，酶解温度分别为5 0 和4 0 ，p h 分别为8 6 和5 7 。酶解时间分别为3 h 和2 h ；醇沉体系的乙醇浓度为7 0 ，p h 为6 5 。按以上方法和条件得到的鲟鱼硫酸软骨索中，氨基己糖含量为2 7 1 3 ，得率为4 3 2 7 ， 含氮量为3 0 5 ，产品质量符合w s l c 3 0 0 3 0 - 2 0 0 0 ( 硫酸软骨素口服片) 标准要求 关键词：硫酸软骨素；正交试验；单因素优化试验；鲟鱼：软骨 祸建农林人学硕j 学位论立 鲥鱼砖艘软骨索制蔷1 = 岂的研究 s t u d i e so nt h ep r o d u c t i o no fc h o n d r o i t i ns u l f a t ef r o ms t u r g e o n a b s t r a c t 。 c h o n d r o i t i ns u l f a t ei st h eb a s i so fc o n n e c t i v et i s s u eo ft h em a m m a l i a n ，i tm o s t l yd i s t r i b u t e s c a r t i l a g e ，n o s e ，t h r o a t ，l i g a m e n ta n dm y o l e m m a ，e s p e c i a l yf i s hc a r t i l a g e c si sm o s t l yu s e dt o t r e a tn e u r a l g i a , a r t h r i t i s ，t i n n i t u s ，a l o n gw i t ha c c e l e r a t i n gc a n k e rc i c a t d s a t i o na n dp r e v e n t i n g h y p e r l i p e m i a w i t hl u c u b r a t i n gp h y s i o l o g i c a la c t i o na n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e ro fc s ，t h e e f f e c to f c u r o ra n dp r e v e n t i n gv e i nh a r d e ni sa l s of o u n d t h e r ei sp r e f e r a b l ec u r a t i v ee f f e c tf o rt h ep r e v e n t i n g o fc o r o n a r yh e a r td i s e a s ea n dm y o c a r d i a li n f a r c t i o n c sc a np r o t e c tn e r v ec e l l ，m u c o s a lc e l l ，k i n d e y c e l l c si sa l s oe x e c u t e dt o i l e t r ym i x e dw i t hs o m e t h i n gt op r o t e c tc u t a n e o u sb e a u t y am e t h o do fd i l u t ea l k a l i - e n z y m eh y d r o l y s i s e t h a n o lp r e c i p i t a t i o nt oe x t r a c tc h o n d r o i t i n s u l f a t ef r o mt h es t u r g e o nw a ss t u d i e d b ym a k i n gc h i e fi n d e xo nt h eg l u c o s a m i n ec o n t e n ta n dt h e y i e l do fc h o n d r o i t i ns u l f a t e ，t h eb e s tp i c k - u pt e c h n i c so fc sh a sb e e nf o u n dt oo f f e ri m p o r t a n t r e f e r e n c e so np r e p a r a t i o na n de f f e c t i v eu t i l i z a t i o nf o rp r a c t i c ep r o d u c t i o n a sc sb a n dw i t hp r o t e i n ，a l k a l ie x t r a c t i o ni sp r o p i t i o u st od e s t o t yc o v a l e n tb o n da m o n gc s a n dp r o t e i nt or e l e a s ec s t h ep r o c e s so fa l k a l ih y d r o l y s i si st h ek e yo fe x t r a c t i n gc s t h ep r o c e s s o fe m z y m eh y d r o l y z ei st h em a i nt e c h n o l o g yo fi m p r o v i n gp r o d u c t i o np u f t y p r o t e i ni so n eo ft h e m o s ti m p o t a n te x t r a n e o u sc o m p o n t e n t so fc s t h r o u g l le m z y m eh y d r o l y z e ，p r o t e i no ft h el o n g c h a i na m o n g l i q u o ra n dc si sm o r ed e s t o r e da n db e c o m e ss o l u b l es m a l lm o l e c u l e ，s u c h 豳p e p t i d e ， a m i n oa c i d a si ti sd i f f i c u l tt or e a c ht h es t a n d a r db yu s i n go n ek i n do fe m z y m e ，t h es t u d yu s e st w o k i n d so fe m z y m eh y d r o l y s i s e t h a n o lp r e c i p i t a t i o nd r a w su p o ns o l u b i l i t yd i f f e r e n c eo fc h e m i c a l c o n s t i t u e n t sf r o mc a r t i l a g et os e p a r a t ec sf r o mo t h e ri m p u r i t i e s t h er e s u l ti sa sf o l l o w s ：t h ee x t r a c t i o nw i t h2m u l t i p l ed o s a g eo f6 n a o hs o l u t i o na t4 0 w a sc h u r n e du pf o r4 h ；b o t hp a n c r e a t i na n dp e p s i nw e r eu s e dt oc a t a l y z et h eh y d r o l y s i so fp r o t e i n s i nt h ef i t r a t e ：t h ed o s a g eo fp a n c r e a t i nw a so 5 a tp h8 6a n d5 0 cf o r3 h a n dt h e nt h ed o s a g eo f p e p s i nw a s0 3 a tp h5 7a n d4 0 f o r2 h t h eo b t a i n e dh y d r o l y s a t ew a st h e nr e m o v e db y p r e c i p i t a t i o nw i t h7 0 e t h a n o ls o l u t i o na tp h6 5 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg l u c o s a m i n e c o n t e n t w a su pt o2 7 1 3 ，t h ey i e l do fc h o n d r o i t i ns u l f a t ew a g4 3 2 7 a n dn i t r o g e nc o n t e n tw a s3 0 5 t h eq u a l i t yo fp r o d u c t sa c c o r dw i t ht h es t a n d a r dr e q u i r e m e n to fw s l c 3 - 0 0 3 0 2 0 0 0 ( c h o n d r o i t i n s u l f a t et a b l e t s ) k e yw o r d s ：c b o n d r o i t i ns u l f a t e ；o r t h o g o n a lt e s t ；s i n 百ef a c t o ro p t i m i z i n gt e s t ；s t u r g e o n ；c a r t i l a g e 2 锅建农林人学坝j ：学位论文鲟鱼砖酸软骨索制需t 艺的研究 文献综述 硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，c s ) 广泛分稀于人和动物组织中，是动物的软骨、腱、 血管壁、皮觖等结缔组织的重要成分l “。硫酸软骨素属于糖胺聚糖( g l y c o s a mi n o g l y c a n s g a g s ) 类物质，是一种酸性粘多糖。作为一种天然活性成分，具有调节免疫和脂类代谢、预 防感染和心血管疾病等多种生理作用，在医药、食品、化妆品等领域应用前景广泛。为了进 一步认识和应用硫酸软骨素，本文拟就硫酸软骨素的研究概况、生产工艺和应用等方面做一 概括介绍。 l 硫酸软骨素研究概况 1 1 硫酸软骨素的来源 硫酸软骨素是一种天然酸性粘多塘，广泛存在于人和一些动物如猪、牛、羊和鱼等软骨 组织中，通常与蛋白质结合在一起以蛋白多糖的形式存在【2 引。不同动物体内所存在的硫酸软 骨素类型不同，猪、牛、羊的喉骨、鼻骨和关节骨中主要含有硫酸软骨素a ，鲨鱼，乌贼等 海洋动物的软骨中主要含有硫酸软骨素c 1 4 】。 1 2 硫酸软骨素的化学结构 硫酸软骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替连接而成的直链分子，通常含有5 0 7 0 个双糖 基本结构，分子量为1 0 0 0 0 5 0 0 0 0 d 1 量们。按其化学组成和结构不同，可分为c s a 、c 、d 、 e 、f 、h 等多种同分异构体。目前药用的主要是a 和c 异构体，它们均由d 氨基葡萄糖醛 酸和n 乙酰d 氨基半乳糖组成，只是硫酸基位黄不同，其分子式如图所示川。 c i m ah - c j 1 3 硫酸软骨素的物理性质 ， 硫酸软骨素为白色细微粉木1 8 j ，无臭无味，吸水性强，易溶于水而形成黏度大的溶液， 不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂1 9 1 0 1 ，其盐类对热较稳定，受热达8 0 c 办不被破坏。游 离硫酸软骨素水溶液遇较高温度不稳定，主要是乙酰基被水解，从其结构上脱落下来。在强 酸、强碱及高温条件下易降解为分子量较小的低聚语，导致溶液粘度下降。 3 福建农林人学硕l 二学位论文 鲟鱼硫艘软骨索制斋t 岂的研究 1 4 硫酸软骨素的化学性质 硫酸软骨素是一种聚阴离子的高分子化合物，多数含有s 0 3 h 和c o o h 等基团，易与 n a + 、k _ 、c a 2 + 、m 9 2 + 等阳离子结合1 1 2 + 1 3 1 。 1 4 1 降解反应 硫酸软骨素不仅在高温强酸条件下易发生降解反应，使其分子量降低【1 4 l ，同时在硫酸软 骨素裂解酶a b c 或硫酸软骨素裂解酶b 等的作用下也可发生降解【1 5 l 。 1 4 2 沉淀反应 硫酸软骨素含有的硫酸基可与b a “发生沉淀反应，沉淀物( b a s 0 4 ) 在盐酸或硝酸中均 不溶解1 1 酣。 1 4 3 还原反应 硫酸软骨素所含的半缩醛基具有还原性，可将碱性酒石酸铜溶液中的c u 2 + 还原成红色的 氧化亚铜i 切。 r ： ： u 一+ 2c o o u o m 一，v 、 n 4 一，_ ，矿 c o o k 1 4 4 显色反应 1 4 4 1a 一萘酚试验 将硫酸软骨素与a 一萘酚的混合溶液中加入浓硫酸，有紫色化合物生成。其反应机理是 硫酸软骨素先与浓硫酸反应生成糠醛或糠醛的衍生物，然后再与a 一萘酚缩合生成紫色的缩 合物【1 s l 。 1 4 4 2 问苯三酚试验 硫酸软骨素与盐酸的混合液于沸水浴中反应的生成物( 半乳糖醛酸) 与问苯三酚发生缩 聚反应，生成粉红色的多环二芳基甲烷1 1 9 】。 1 4 4 3 巴弗试验 硫酸软骨素与巴弗试剂( 醋酸与醋酸铜的缓冲溶液) 的混合液于沸水浴中反应，可析出 红色沉淀物l 期。 4 榀趾权林人学顾i ：学位论文 鲥鱼砬艘软骨老制蔷丁艺的研究 c i - i oc o o h r i c h o h - i - 2 c u a 叼+ 2h 2 0 _ ；c h 矗+ 2 q 1 2 0 + 4h a c 1 4 4 4 过碘酸试验 一定条件下，硫酸软骨素与过碘酸可发生氧化还原反应，硫酸软骨素的碳一碳键断裂并 生成羧酸，而过碘酸被还原成碘酸当反应溶液中加入硝酸银时可生成白色的碘酸银沉淀i 刎。 r c h 2 0 h r c l ，+ h 1 0 4 + h p _ r c h o 4 - 2r c o o h + 4 h 吼 h i o ，+ a g n o j a g l o j i + h n o j 1 4 4 5对甲苯胺醋酸赫试验 硫酸软骨素加热或与热磷酸反应后，生成的糠醛或糠醛衍生物可与对甲苯胺醋酸盐反应 生成红色化合物f 1 7 - 2 1 1 。 够n g 一坚c o 一5 器一。一 i a 5 糖脎试验 硫酸软骨素可与苯肼在一定条件下反应生成糠脎i 捌 i i + 3 扩一甲r c 。n n h 书- - op 臼一呷州州叫 1 5 硫酸软骨素的生物活性 硫酸软骨素具有调节机体免疫、抗氧化、抗纤维化、抗动脉粥样硬化和软骨保护作用等 生物活性。 1 5 1 免疫系统的作用 s a k a i 等1 2 1 1 在硫酸软骨素存在下以卵清蛋白( o v a l b u m i n ，o v a ) 刺激o v a 致敏的b a l b c 小鼠脾细胞，检测培养细胞的因子水平，并用流式细胞术检测辅助t 细胞，用实时定量r t - p c r 技术分析y 干扰素( i f n y ) m r n a 水平。结果显示硫酸软骨素可通过t h l 型细胞因子分泌 进i i 阻止产生抗原免疫球蛋白e ，因此可将硫睃软骨素用于防止免疫球蛋白e 参与的过敏反 应。 5 榀建农林人学颐。j ：学位论文 鲟鱼硗艘软骨岽制蔷t 岂的自0 d t 1 5 2 抗氧化和抗肝纤维化作用 文献i 冽指出包括透明质酸( h a ) 和c s a 在内的g a g s 均能与c u “、f c 2 + 等金属离子螯 合，减少氧化猝发( o x i d a t i v eb u r s t ) ，抑制脂类过氧化反应，从而起到抗氧化作用。c a m p o 等i a7 - 4 1 分别以c c h 诱导的急性肝损伤大鼠模型和亚慢性肝纤维化的大鼠模型研究了c s 和 h a 等g a g s 的抗氧化和抗肝纤维化作用。在对大鼠模型的转氨酶( a l t 和a s t ) 、金属蛋白 酶组织抑制因子( t i m p s ) 、过氧化歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化氢酶( g p x ) 等多个参 数的测评后，发现c s 与h a 单独使用时均无抗氧化保护作用j 只有c s 与h a 或其它g a g s 合用时才表现出抗氧化能力。并指出c s 和h a 共同使用时可降低a l t 和a s t ，部分恢复s o d 和g p x 的活性，并限制胶原蛋白在肝组织上的 ) c 积，从而限制肝损伤特别是肝纤维化。 1 5 3 软骨保护作用 体内外研究证明硫酸软骨素可通过刺激软骨细胞合成胶原蛋白、蛋白多糖和h a 控制新 软骨组织的形成【矧另外，硫酸软骨素也能抑制蛋白水解酶和溶酶体酶，如弹性酶、n - 7 酰 胺基葡萄糖苷酶等，这些酶均会损坏关节软骨m c a l i n d o n 指出，关节炎患者口服c s 后，与 空白对照组相比，可观测到关节处的h a 、蛋白多糖、i i 型胶原蛋白均显著增加，且n - 乙酰 胺基葡萄糖苷酶减少i 矧 1 5 4 抗动脉粥样硬化作用 m a k s i m c n k o 等【刎通过氯化亚铁诱导的动脉损伤大鼠模型研究了过氧化氢酶与c s 形成的 衍生物的抗血栓活性，指出该衍生物低剂量时即可改变已形成血栓的结构，促进血液持续流 动，能有效减缓和阻止动脉阻塞。 2 硫酸软骨素的生产工艺 硫酸软骨素的提取方法有碱法、碱盐法、酶法、超声波法和乙酸抽提法等；其分离纯化 有溶剂法、超滤膜法、离子交换色谱法、季铵盐沉淀法和电泳法等目前国内普遍采用稀碱 和浓碱的提取法，国外报道用稀碱稀赫综合提取法，这些制备工艺一般都要经过酶解和活性 碳或白陶土等处理。酶用高倍胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶等。 2 1 硫酸软骨素的提取 2 1 1 碱法 碱法提取硫酸软骨索的原理是基于硫酸软骨素与蛋白质结合的o - 糖苷键可在碱作用下发 生b 一消去反应，使糖一肽键断裂，硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来【2 8 l ，但在强碱作用下硫 酸软骨素易发生降解。碱法的提取通常与酶解棚结合，近年来的研究多利用二者相结合来捉 6 桶迎农林人学硕i ：学位论立鲟鱼硫髓软骨素制蔷丁艺的研究 取，可制得高质量的硫酸软骨素。邹开朗例等提出稀碱与酶解相结合生产硫酸软骨索。该 工艺每2 k g 原料可获得1 1 8 1 2 5 9 ( 最高可达1 3 0 9 ) 硫酸软骨素。葡萄糖醛酸含量达3 5 以 上( 2 4 以上即达部颁标准，可用于制药，3 0 以上可出口) 因此按该工艺制得的产品可达 优级纯与其他提取方法相比较，该工艺缩短了一半工艺流程，同时提高了纯度和得率，减 轻了碱法提取所带来的环境污染。罗曼等用稀碱和双酶解法生产硫酸软骨素，其方法操作 与邹开朗等的基本一致。根据该工艺生产，每l k g 原料可获硫酸软骨素1 1 8 1 2 5 9 ( 最高为 1 3 0 9 ) ，葡萄糖醛酸含量为2 7 7 还指出在酶解后，按5 体积比加入5 预冷的三氯醋酸， 静置后离心去沉淀，并立即对清液调节p h 为6 8 7 2 ，然后再用乙醇沉淀实验品可提高硫 酸软骨素的产量。高华川等应用浓碱一复合酶酶解提取法生产硫酸软骨素，该法与上述稀碱酶 解法基本一致，只是在碱提取时增大了碱的浓度该法制得的产品为白色粉术，纯度达到 9 5 2 ，得率为3 2 6 。此工艺提高了产品的纯度和得率，降低了生产成本。 2 1 2 碱盐提取法 碱盐法是利用碱性条件下，连接硫酸软骨素和蛋白质的糖肽键发生断裂，使硫酸软骨素 以游离态释放出来，并且通过控制一定的离子强度，使软骨中的某些蛋白质沉淀析出，便于 滤除1 3 2 1 。一定范围内，提取物中硫酸软骨素的含量和得率是随着碱液浓度的增加而提高【3 3 j 。 朱瑞芬1 7 1 等用n a o h 碱化的n a c i 溶液从动物气管中提取硫酸软骨素。该工艺的合适的操作条 件为碱盐两次浸提时间总和2 5 3 0 h ，水解时间2 0 4 0 h ，乙醇最终浓度为6 0 7 0 。 马叔涛等对文献报道的稀碱一浓盐法【i 】、稀碱稀盐法【i f 和稀碱法【】进行了改进，并将 此三种工艺与1 5 n a o h 提取工艺【】、2 0 n a o h 提取工艺i v ) 和酶解工艺 v i i 进行了对比， 结果显示，工艺l i 和产品质量较高，分子量大，但周期长，和v 提取时间短、分子量较 小，可通过控制好碱浓度、提取时间、温度的关系也可制得质量较高的产品【矧。 2 1 3 酶法 酶法是利用蛋白酶水解蛋白质的特异性，使胶原蛋白和粘蛋白等水解成氨基酸，再依据 氨基酸与硫酸软骨素在某些溶剂中的溶解性不同，实现硫酸软骨素与其它杂质的提取分离。 酶法作用条件温和，不会使硫酸软骨素发生降解。常用的酶制剂有胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋 白酶等。采用胰酶从新鲜猪喉骨中提取硫酸软骨素，可得到含氮量为3 6 2 的提取物i 。采 用胰酶与木瓜蛋白酶的复合酶可得到含氮量仅为3 5 0 的硫酸软骨素提取物1 1 3 i 。王凤琴【3 4 1 等 用复合酶解法提取硫酸软骨素。影响该工艺水解反应的因素为酶解温度、p h 值与加酶量，利 用j 下交试验得出优化条件为温度5 0 c 、p h 8 6 8 9 、加酶量0 3 9 9 l ，收率达1 7 8 4 。采用 全新的双酶酶解工艺和中空纤维超滤等现代技术生产硫酸软骨素，出于酶作用号性强的特 7 犏锉农林人学颂f ：学位论文鲟鱼硫艘软骨索制蔷t 艺的研究 点，所得产品质量稳定，收率高，颜色洁白，生产周期较短。华子义1 3 5 】也提出了双酶生产硫 酸软骨素的新工艺，该工艺所制产品质量稳定，与传统生产法相比，得率可提高1 2 ， 产品洁白，生产周期缩短1 3 ，生产成本降低5 2 1 4 超声波提取法 蒲志军i 圳等利用超声波法制备硫酸软骨素，其原理是在碱性条件下蛋白质易离解和超声 波的热学机制可促进蛋白质快速解离而达到去杂蛋白的目的，升温( 8 5 9 0 ) 均可使解离 的蛋白质变性吸附到白陶土上，从而使硫酸软骨素与蛋白质分离，提高产品质量。以猪喉骨 为原料，在对其进行预处理后，使用超声波手段进行稀碱抽提，浸出液再用超声波二次处理 使杂蛋白解离，经白陶土和活性炭去杂脱色，酒精沉淀后，干燥即得合格的硫酸软骨素，收 率为8 与传统的稀碱工艺提取相比，超声波提取工艺所制得的硫酸软骨素色泽雪白、颗粒 疏松，澄清度在0 0 5 以下，氮含量达标，其余各项指标均符合部颁标准。两种工艺所得产品 质量差别不大。超声波工艺法提取、除杂过程只需3 个多小时，稀碱酶解法则一般要2 0 多个 小时。前者大大缩短了生产周期，节约了生产成本( 不使用酶) ，而且提取和除杂过程无需加 热，操作起来比较简便。但是该工艺在抽提过程中，超声波处理时问不能太长，否则很多杂 质会跟着离解出来，从而增加去除杂质的难度，并使产品的色泽和质量达不到要求，且该工 艺收率偏低，限制其在生产上的广泛应用。 2 1 5 乙酸抽提法 n a k a n 0 1 3 7 1 等利用乙酸水溶液提取硫酸软骨素。先把鲜软骨上的脂肪、肉及其他软组织去 掉，在2 0 ( 2 冷冻，使用前在4 c 解冻。把软骨放在水中，用乙酸调节p h 为4 j ，在3 7 ( 2 下抽 提7 h 抽提液沸腾浓缩后，在9 0 下干燥即得硫酸软骨素粗品。通过此工艺，可以把牛鼻软 骨中7 0 以上的硫酸软骨素浸出影响硫酸软骨素浸出率主要影响因素是p h 值，若在抽提 硫酸软骨素时加入乙酸钠，在相同条件下，可使硫酸软骨素浸出率提高6 。该工艺流程简单， 成本较低，可以考虑商业化大规模生产。 2 2 分离制备 经碱或蛋白酶水解的组织消化液中，硫酸软骨素的多羧基及强电解质性质使这种高分子 以可溶的状态存在。残留蛋白质及各种小分子成分的去除为硫酸软骨素的进一步分级分离创 造了条件。常用的分级分离方法主要利用各种酸性粘多耱溶解度的不同和电荷密度的差异， 计有溶剂法、超滤膜法、季铵盐沉淀法、离子交换色谱法和电泳法等。 2 2 1 溶剂法 溶剂法是利用软骨中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸软骨素与其它杂质相互分离 8 榀逃农林人学硕f ：学位论文鲥鱼砬艘软骨素制蔷t 艺的研究 的纯化方法。硫酸软骨素含有的硫酸基、羧基和羟基等亲水性基团，使其易溶于水，不溶于 乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有机溶剂。马淑涛等调节硫酸软骨素溶液p h 为5 o 6 0 后加入 氰化钠至其浓度为1 5 ( m v ) ，再加入乙醇至其浓度为6 0 7 0 ，可得到纯度为7 0 7 8 的硫酸软骨素。n i c o l av 将硫酸软骨素溶于浓度为2 ( m v ) 的氯化钠溶液中，加入少量 乙醇于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到较 高纯度的硫酸软骨素。采用甲酵和丙醇也可得到同样的效剿矧。 2 2 2 超滤膜法 超滤膜法是利用滤膜孑l 径的不同使硫酸软骨素与其它非多糖类杂质分离，而得到分子量 分稚范围较窄且纯度较高的硫酸软骨素的方法。l i g n o tb 等采用管形的三氧化二铝膜纯化硫 酸软骨索，其滤膜的孔径分别为1 0 0 a m 、5 0 n m 、2 0 n m ，溶液的透过速度分别为9 0 i h m 2 、 6 0 l h m 2 、4 3 i h m 2 ，其硫酸软骨素的截流率均为1 0 0 ，杂质透过率分别为5 0 、6 5 、 7 0 h 0 1 电场强化超滤是利用硫酸软骨素在电场作用下发生电泳而不离开膜表面，从而有利于杂 质透过膜被除去。声场强化超滤是利用其具有的搅拌作用和产生的空化效应，使膜表面沉积 的硫酸软骨素浓度降低，从而提高杂质的透过率。陈健1 4 1 瞎采用声场和电场强化超滤对硫酸 软骨素的纯化研究表明，单独使用声场强化超滤，硫酸软骨素的平均截流率为7 7 5 6 ，较之 未加声场超滤提高了1 4 1 ；单独使用电场强化超滤，硫酸软骨素的平均截流滤为8 8 0 8 ， 较之未加电场超滤提高了1 5 1 7 ；同时使用声场和电场强化超滤，硫酸软骨素的平均截流率 可达9 3 1 6 ，较之单纯超滤提高了2 1 8 l 。 2 2 3 季铵盐沉淀法 硫酸软骨索在溶液中以聚阴离子形式存在，与季铵盐类化合物( 如溴化十六烷基三甲铵 或氯化十六烷基吡啶等) 形成水溶性很小的季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶 液中不溶解，但当其增大到临界离子强度时，可发生解离并溶解，利用该性质可使硫酸软骨 素得到分离纯化1 4 2 j 。该纯化法一般需要控制硫酸软骨素的浓度为0 1 1 o ( m v ) ，浓度过 高，会使季铵盐化合物与其中的杂质发生沉淀反应。k a z u a k ik 等采用浓度为5 m g m l 的氰化 十六烷基毗啶纯化1 0 pg m l 5 0 0 1 1g m l 的硫酸软骨素，当溶液中硫酸钠的浓度增加到 0 1 m o l f l _ , 时，硫酸软骨素的沉淀量达到最大。该法最低可沉淀浓度为5ug m l 的硫酸软骨索， 一般用来定量检测血清和尿液中的硫酸软骨素。 2 2 4 离子交换色谱法 离子交换色谱法是依靠库仑力的作h j 将物质吸附在交换剂上，然后选择合适的溶液进行 q 福i i ! 农林人学顾i j 学位论文 鲥鱼倒艘软骨崇制符t 岂的研究 沈脱，达到其纯化的目的。常用于硫酸软骨素纯化的阴离子交换剂有树脂、纤维素和葡聚糖 凝胶等。r a n h a k r i s h n a m u r t h yb 等采用d o w c x x 2 强碱型阴离子交换树脂，梯度洗脱体系为硼 酸和0 2 o m o i l 的氯化钠溶液，流速为2 0 m i m i n ，柱温5 5 ，压力为1 5 3 4 k g c m 2 。当 氯化钠溶液浓度为1 5 m o l l 时，可得到纯度较高的硫酸软骨素，回收率为8 5 i “n i c o l av 采用弱碱型e c t e o l a - - 纤维柱( 1 0 r a m x 8 0 r a m ) ，采用0 5 m o l l 的氯化钠溶液平衡柱子，上 样后依次用1 2 m l0 5 m o l l 和1 0 m l3 m o l l 的氯化钠溶液进行分级洗脱，可得到纯度较高的 硫酸软骨素例h i d e m i t s uu 等采用中强碱型d e a e 交联葡聚糖凝胶( a - 5 0 ) 柱纯化硫酸软 骨素，其梯度洗脱体系为0 5 1 0 m o l l 的氯化钠溶液与p h 为8 6 的t r i s h c l 的混合液，可 得到硫酸软骨素纯品1 4 4 】。b o h nr 等采用1 氯化十六烷基吡啶平衡纤维素枉后，用0 5 m o l l 的氯化镁沈脱，可得到回收率为7 8 的硫酸软骨素纯品1 4 5 1 r o g e rc m 等采用高效液相色谱 法( pb o n d a p a k c y a n o 柱，3 9 m m x 3 0 0 r a m ) 纯化硫酸软骨素，其流动相为甲醇四甲基氢氧 化铵( 0 0 2 m o l l , p h 3 o ) ( 3 ：2 ，v v ) ，流速为2 0 m 1 m i n ，上样量为3 0 2 5 0ug ，可得到纯 度为9 8 的硫酸软骨素，其回收率高达9 7 以上l 舶j 。f a l s h a wr 等将2 9 磺化的硫酸软骨素上 样于强酸型阴离子交换树脂( a m b e r l i t ci r1 2 0 h + ) 柱中，用水洗脱，收集液用1 0 m o l l 的 氢氧化钠溶液中和，可得到1 5 9 硫酸软骨素钠盐1 4 7 2 2 - 5 电泳法 根据化合物所带电荷类型和数量的不同，采用电泳法可将硫酸软骨素与其它杂质分开 电泳法具有分辨率、目标物纯度和回收率均较高的特点。采用双相电泳法纯化硫酸软骨索时， 第一相电泳条件为p h 6 0 的吡啶，醋酸水( 1 0 ：1 ：8 9 ，v v ) 缓冲液，电场强度7 5 v c m 2 ，电 泳6 0 r a i n ；第二相电泳条件为p h 7 7 醋酸钡缓冲液，电场强度为7 5 v c m 2 ，电泳1 3 0 r a i n ，可 得到纯度为8 2 ( w w ) 的硫酸软骨素【删。n i c o l av 采用琼脂糖凝胶电泳( 5 0 r a m x 7 0 r a m ，4 5 m m 厚) ，电泳条件为0 0 5 m o i l 的1 ，2 二氨基丙烷缓冲液( 醋酸调p h 至9 o ) ，电流强度为 5 0 m a ，电泳8 0 r a i n ，可得到纯度为9 0 的硫酸软骨素，但其回收率仅为4 5 1 4 9 1 。n i c o l av 采 用硝化纤维素电泳( 6 0 m m x l 0 0 m m ，孔径0 4 5 um ) ，加样量为1 o 1 0 0 i xg ，电泳条件为 0 1m o i l 的醋酸钡缓冲液，泳动度为5 7 5 1 0 3 c m a r a i n ，电泳4 0 r a i n ，可得到纯度为1 0 0 ( w w ) 的硫酸软骨素，回收率也为1 0 0 1 5 0 1 。 2 3 硫酸软骨素的分析方法 随着硫酸软骨素研究的广泛和深入，其检测方法和手段越来越多。对于硫酸软骨素，不 同的生产企业和不同的客商所采用和要求的含量测定方法不同，生物样品的检测也有不同的 方法因此，硫酸软骨素的含量测定方法有许多种，每种含量测定方法均钉其特点，但测定 1 0 福矬农林人学硕。f ：学位论文孝哥鱼硫艘软骨岽制需t 艺的研究 原理均是基于其组成的糖单位( d 葡糖醛酸和n 乙酰d 氨基半乳枯) 、硫酸基以及酸性粘多 糖的大分子性质。含量测定方法包括比色法、色谱法、电泳法、比浊法、原子吸收法、配位 滴定法及免疫法 2 3 1 比色法 2 3 1 1 氨基己糖的测定 该法又称e l s o n - m o r g a n 法，是硫酸软骨素部颁药品标准采用的方法。测定原理是基于硫 酸软骨素由d - 葡糖醛酸和n 乙酰d 氨基半乳塘组成，经盐酸水解可释放出氨基葡糖，在碱 性条件下与乙酰丙酮缩合，产物与对二甲氨基甲醛的酸醇溶液呈红色，于波长5 2 5 n m 处测定 吸收度，以氨基葡糖作对照品，计算氨基葡糖含量，再换算成硫酸软骨素含量。该方法搛作 繁琐，最棘手的是重现性差。谢继青等1 5 1 1 对此法进行了析囚实验设计，对比实验，发现影响 最终测定结果的关键步骤有乙酰化和显色两步，测定时按乙酰化同时计时、显色荆随加随计 时操作，所得结果精密度高、重现性好 2 3 1 2己糖醛酸的测定 该法又称咔唑法【5 2 】，测定原理是硫酸软骨素分子中的d 葡糖醛酸在硫酸作用下生成糠 醛，后者在咔唑的醇溶液中显红色，于波长5 3 0 n m 测定吸收度，制作标准曲线计算出d 葡糖 醛酸含量，再换算成硫酸软骨素含量。该法较测定氨基葡糖法简单一些，但由于在操作过程 中有浓硫酸，所以给实际操作带来诸多不便。 2 3 1 3 间苯三酚分光光度法 高华等【5 3 j 利用硫酸软骨素与含有白j 苯三酚的无机酸在l o o c 反应3 0 m i n ，生成的有色物 质在波长5 5 8 n m 处有最大吸收，通过比色测定硫酸软骨素的含量，线性范围o 1 1 o m g m l ， 具有较好重现性，操作简单。 2 3 1 4 染色法 原理是具有大分子聚阴离子的粘多糖与荷正电碱性燃料天青a 在一定p h 条件下结合产 生与原来燃料不同的颜色，并以粘多糖本身作对照，通过测定在波长5 0 5 n m 的吸收度定量。 由于天青a 对不同的粘多糖选择性不强，测定结果容易受其它粘多糖的影响。施文建i 列等以 乳化剂o p 作稳定剂，在p h 值为3 0 的磷酸磷酸二氢钾缓冲液中碱性艳蓝b o 与硫酸软骨素 反应形成离子对缔合物，水溶液颜色由绿色变成蓝色，在波长为5 7 5 n m 处测定l 殁收度。此方 法简便，快速、准确，可用于工业供试品的测定。 福建农林人学硕j ：学位论文 甜鱼硫艘软骨者制备t 艺的研究 2 3 2 色谱法 2 3 2 1 离子色谱法 茅力i 矧根据硫酸软骨素中的硫酸根与软骨素之间的关系，将硫酸软骨素水解生成等摩尔 的硫酸根，用a n i o nh c 色谱柱将硫酸根与其他干扰物质分离后，以硼酸钠葡萄糖酸钠淋沈 液为流动相，流速1 5 m l m i n ，电导检测器检测对照物：无水硫酸钠，采用外标法检测其含 量。这样使测定对象单一，准确度和回收率都较高，而且操作简便，符合药品分析的要求。 2 3 2 2 化学发光高效液相色谱法 a k i y a m a 等1 5 6 j 用化学发光高效液相色谱法，先将硫酸软骨素用硫酸软骨素酶a b c 或硫酸 软骨素酶a c i i 降解，然后用酰胺一8 0 - z 氧化硅色谱柱( 2 5 0 m i n x 4 0 r a m ) 反相色谱进行分离， 用l m m o l l 草酸盐和3 m m o l l 过氧化氢洗脱，电导检测器检测。该方法特别适用于临床生理 检测。 2 3 2 3 指纹色谱法 m i d u r a 等【期、l a u d e r 等同样将硫酸软骨素等粘多糖酶解，释放出寡糖，然后通过 c a r b o p a cp a l 色谱柱分离，分离组分用紫外分光光度法定量，在波长2 3 2 n m 处检测吸收度， 寡糖的检测范围5 0 7 5 0 0 n g 。该方法适用于细胞和体液中粘多糖的分析分离 2 3 2 4 其他色谱法 有反相离子对高效液相色谱法例、吸附高效液相色谱法【印l 等；另外，国内一些生化厂总 结多年工作经验，利用凝胶柱或c 1 8 柱测定，以1 4 2 、p h 6 8 的磷酸二氢钠为流动相，波长 2 0 6 r i m 紫外检测，并以对照品对照制作标准曲线，利用组分峰面积或峰高与对照品进行比较。 但分辨率较差，杂质容易产生干扰。 2 3 3 电泳法 2 3 3 1 醋酸纤维素薄膜电泳法 o a f f e n 等f 6 j 】把供试品先用硫酸软骨素酶a b c 消化，产物与钌【1 0 3 r u l 结合然后经醋酸纤 维素薄膜电泳分离，红斑印迹检测。该方法检测灵敏度可达2 n g ，还可以消除核酸和玻璃酸 的影响。 2 3 3 2 琼脂糖凝胶电泳法 v o l p i l 6 2 】利用粘多糖中的“快移动”片段和“慢移动”片段性质的不同，以及不同粘多糖 中二者比例不同首先用细菌酶降解，然后用琼脂糖凝胶电泳分离分析，标准曲线分光光度 法定量。该方法多用于实验室小量供试品中不同粘多糖的分析，定性及定量。 1 2 福建农林人学颂j j 学位论文鲥鱼硫艘软骨索制蔷t 岂的研究 2 3 3 3 毛细管区带电泳法 p a y a n 等俐建立了毛细管区带电泳测定硫酸软骨素含量的方法。测定时把供试品放在阴 极，应用离子对试剂四丁基铵磷酸盐和硼酸盐缓冲液，离子对试剂浓度的增加可导致z 电位 的降低此法尤其适用于临床上测定病人关节组织中的硫酸软骨素含量。 2 3 3 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 l y o n 等1 6 4 j 利用硫酸软骨素的粘多糖性质进行梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳，供试品可降解也 可不降解，用天青a 一银氨试剂染色进行定量，属半微量分析，检测灵敏度l 2 n g ，几乎可用 于所有粘多糖的分离分析。m o i l e r 等1 6 5 j 将该方法加以改进，首先采用高碘酸氧化，然后用天 青a 染色，最后用硝酸银滴定进行定量。该方法多用于实验室小量供试品的分析、定量。 2 3 4 比浊法 姬胜利等【删根据硫酸软骨素可与氧代十六烷基吡啶结合生成稳定乳浊液的聚阴离子性 质，建立了比浊测定法该法不需特殊设备，但受杂质影响较大，所以特别适用于精品软骨 素的含量测定国内一些生化厂根据以上原理，结合实际设备条件，建立了电位滴定法，其 过程就是用l m g m l 的氯代十六烷基毗啶p h 7 2 的供试品溶液，检测透光曲线以确定终点，本 法需要对照品作对照。 2 3 5 原子吸收法 茅力等1 6 7 1 利用间接原子吸收法测定鲨鱼软骨粉中硫酸软骨素的含量。利用硫酸软骨素完 全水解释放出等摩尔的硫酸根，钡离子过量定量，用原子吸收法直接测定过量的钡含量，求 算总硫酸根与游离硫酸根，得出有机硫酸根，间接换算出硫酸软骨素的含量。 2 3 6 配位滴定法 该法通过将硫酸软骨素水解，释放出硫酸根，氯化钡标准溶液配位滴定法测定，剩余钡 离子用7 - - 胺四乙酸( e d t a ) 滴定求算硫酸根含量，最后根据硫酸根与软骨素结构单位的 关系计算硫酸软骨素的含量【醴】。该法简单，但需严格控制温度。 2 3 7 免疫法 k a h n e r t 等【6 9 】利用抗原与抗体特异结合的性质，用6 c s 单克