（农产品加工及贮藏工程专业论文）猪血球蛋白粉的酶法脱色研究.pdf

摘要 猪血营养全面，蛋白质含量高达1 8 2 2 ，同时还含有八种人体必需的氨基酸，而且配比接 近人体的需要，是一种完全蛋白质，其中赖氨酸的含量接近9 ，是理想的蛋白质营养源。我国 猪血资源丰富，但是利用率还不到1 3 ，不仅造成了严重的浪费，而且污染了环境。其主要原因 是血液带有难以去除的色泽，不良的血腥味等。因此，研究猪血的脱色问题以更好的利用猪血资 源有很大意义。 本研究主要利用蛋向酶对猪血进行脱色，选择了几种蛋白酶进行实验。实验结果表明，在所 选择的几种蛋白酶中，碱性蛋白酶和中性蛋白酶有较好的脱色效果。碱性蛋白酶的脱色率达到了 9 0 以上，中性蛋白酶也达到了8 5 以上。同时利用超滤，提高脱色率。本实验对碱性蛋白酶进 行了酶解条件优化，确定了最适酶解条件：5 的猪血球蛋白粉溶液的浓度，温度为5 3 5 ，加酶 量为6 4 x 1 0 s u g ，时间为5 小时。对脱色产品进行喷雾干燥后的颜色为淡黄色，没有血腥味。 最后对脱色后的血红蛋白酶解液的抑菌性进行了初步研究，其酶解液分子量小于3 0 1 0 d 的部 分对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌及枯草杆菌有一定的抑菌效果。 关键词：猪血球蛋白粉，蛋向酶，超滤，脱色，抑菌 a b s t r a c t t h ep r o t e i no ft h ep o r c i n eb l o o dw h i c hh a sa b u n d a n tn u t r i t i o ni sa b o u t1 8 2 2 ，a n di t h a se i g h t a m i n oa c i d sw h i c ha r en e c e s s a r yf o rb o d y s ot h ep r o t e i no ft h ep o r c i n eb l o o di sc o m p l e t ep r o t e i n i n t h ep r o t e i no fp o r c i n eb l o o d ，t h el y s i n ei sa b o u t9 t h ep o r c i n em o o di sag o o df o u n d a t i o no fp r o t e i n - o u rc o u n t r yi sr i c hi np o r c i n em o o db u tt h ee f f i c i e n c yo fp o r c i n eb l o o du s ei sl e s st h a n1 3 m o s ti s w a s t e d t h ep a r tw a s t e di sn o to n l yw a s t e f u lb u ta l s oc o n t a m i n a t i v et oe n v i r o n m e n t t h er e a s o ni st h a t t h ep o r c i n eb l o o dh a ss a n g u i n ec o l o r , b l o o d ys m e l l ，a n di th a sab a dd i g e s t t h i sr e s e a r c hi sa b o u tt h ed e c o l o r i z a t i o no f p o r c i n eb l o o du s i n gp r o t e i ne n z y m ea n dc o m p a r e df i v e d i f f e r e n te n z y m e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ea i e a l a s ea n dn e u t r a lp r o t e i ne n z y m eh a st h eb e t t e re f f e c t t h ee f f i c i e n c yo ft h ed e c o l o u r i z a t i o ni sh i g ht o9 0 u s i n gt h ea l c a l a s ea n dt h en e u t r a lp r o t e i ne n z y m e i sa l s ot o8 s a tt h es a m et i m e t h i sr e s e a r c ha l s ou s e du l t r a f i l t r a t i o ns ot h a tt oi m p r o v et h ee f f i c i e n c y t h i sr e s e a r c hm a d et h eo p t i m i z i n gt h eh y d r o l y z i n gc o n d i t i o n ：b l o o dp o w d e rc o n c e n t r a t i o n 5 ，t e m p e r a t u r e5 3 5 c ，e n z y m ec o n c e n 擂a t i o n6 + 4 l 护堍h o u r s a f t e rd e c o l o r i z a t i n ，壤ep o w d e ri s n e a r l ys t r a wy e l l o w , d o e s n th a v et h eb l o o d ys m e l l t h ep e p t i d e sw h o s em o l e c u l a rw e i g h ta l e s s3 0 0 0 da r et h ea n t i b a c t e r i a la n t i v i t y t o s t a p y l o c o c c u sa u r e u sa n db a c i l l u ss u b t i l i sa n de s c h e r i c h i ac o l i k e y w o r d ：p r o t e i n i cp o w d e ro f p o r c i n ec o r p u s c l e ，p r o t e i ne n z y m e ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y u l t r a f l t r a t i o n ，d e c o l o r i z a t i o n ， u 独创性声明 y 9 3 8 7 6 本人声明所呈鬣的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 墨。尽鼗联知，除了文中饕鬈g 燕鞋拣注纛致谢缝遗方终，论文中不包含其稳人基经发 表溅撰写过的研究成果，也不包含为获得中阑农业大学或其惯教育机构的学位或证粥 露嫠惩过豹榜瓣。与浅一霹工佟静霹恋对零磷褒题擞酶拄籍嚣鼓均毯在论文审终了骥 确酌说明并旋示了谢意。 疆究生签名： 毒盘寐 时麓： 洳善年绢，玉醪 关于论文使用授权的说踺 本人完全了解中图农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校销权保鳃 送交论文夔复翠释窝磁盘，兔诲论文被套褥帮辔褥，霹臻采灞影窜、缩印或鞠摇等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中阑农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 簧搔学位论文盼垒帮或鼙分惑容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究镦签名：考宝案对闺；a 嘭军潮疡翻 导师签名 删时间；删年多局飞 1 1 研究目的和意义 1 1 1 猪血的营养价值 第一章绪论 猎血资源丰富，营养全面，素有“液态肉”之称。它的蛋白质含量高达1 8 2 2 ，同时还含有 八种人体必需的氨基酸，而且配比接近人体需要，符合联合国粮农组织、世界卫生组织( f a o w h o ) 专家组推荐模式，是一种完全蛋白质，其中赖氨酸的含量接近9 【1 】 是理想的蛋白质营 养源。其中的蛋白质含量比鸡蛋高6 2 ，比大米高1 2 7 。猪血中含有铜、铁、锌等多种微量元 素，猪血含铁量较高，而且以血红素铁的形式存在，容易被人体吸收利用。特别是含有的维生素 k 有促使血液凝周的作用，因此有i e 血功效。同时，猪血中含有微量元素钴，对恶性贫血有一定 的防治作用。猪血还有清除肠腔的陈渣浊垢的作用，可以清除尘埃和金属离子等有害物质。 猪血离心分成有形物和无形物两部分。无形物叫血浆，有形物叫血细胞，其比例约为2 ：1 。血 浆包括血清和血纤维蛋白原；血细胞包括红血球、白血球和血小板等，其中主要部分为红血球， 也就是血红蛋白。血浆中的蛋白质含量约为7 ，血细胞中蛋白质的含量约为3 8 4 2 ，占猪血 蛋白总量的7 5 以上。 1 1 2 国内外猪血的利用现状 国外对猪血的开发利用始于上世纪初，初期主要用于饲料工业。随着科技的发展，德国、 丹麦、瑞典、法国等国的食品专家用猪血分离出血浆蛋白、血球蛋白作为补品和添加剂，加入香 肠、布丁、糕点、面包、挂面中，不仅充分利用了猪血，而且也给机体补充了蛋白。再到后来猪 血还被用于家具的黏合剂，酿酒工业中的澄清剂，以猪血为原料还可提取许多有生理功能的制品， 如血红素【3 】、超氧化物歧化酶f s o d ) 等生化产品i 4 j 。猪血液回收利用比较先进的国家是欧洲各国， 丹麦、瑞典两国每年生产血可达1 0 , 0 0 0 1 5 , 0 0 0 吨，瑞典屠宰血液的利用率为1 0 0 ，欧洲其他国 家的利用率平均约为5 0 。日本对猪血也有较好的利用，该国有许多大型企业和研究机构对血液 深加工、生产高附加值产品的研究比较早( 如三菱食品公司、旭工业公司、伊藤肉食品公司等) ， 多以分离技术和酶解技术开发血液产品，主要包括生物制剂、医药、实验试剂、天然食品着色剂、 保健食品、农业饲料等。血液产品在保健品行业已经形成了一定的规模，产业化前景良好。 我国2 0 0 5 年生猪出栏头数约6 5 亿头，猪血约占猪体重的5 ，按每头猪宰后3 公斤计，总 量每年可达1 9 5 亿公斤，这是一个巨大的动物蛋白资源库。当前我国已经开发利用的猪血主要供 食用、饲用或制作生化药品。血浆蛋白、血球蛋白、凝血酶、超氧化物歧化酶( s o d ) 、血红素、 肽f e 等都是利用猪血开发的产品。我国猪血深度开发近来取得重要进展，采用生物酶技术、结 晶技术、压气蒸馏技术等高新技术开发出的血红素、水解球蛋白、水解血浆粉可作为食品原料、 食品添加剂、营养强化剂、医药原料等，又开发出功能食品，像血红素补铁口服片、水解血浆口 服液等，产品纯度高，提取率高，易于人体的吸收利用，是很好的营养强化剂和营养增补剂【5 ，6 7 】， 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 经卫生防疫部门的检测和毒理实验，表明产品无任何毒副作用，且蛋白质、微量元素等营养指标 高。 我国还利用猪血开发山保健食品，有易消化吸收的蛋白食品、抗衰老食品、增强免疫食品、 补血食品等等。利用猪血开发保健食品，为我国猪血的深度开发利用和保健食品功能因子资源的 开发提供了新的思路。 目前，我国猪血的实际利用率还不到1 3 ，大部分未被利用，有很多是直接倾倒在了环境当 中，猪血本身就是一个营养非常丰富的物质，很容易遭到微生物的侵蚀，因此很多有害的微生物 在此繁殖，给周围的环境造成破坏，因此解决猪血的综合利用问题还具有一定的社会意义。研究 猪血的综合利用问题已经势在必行。 1 1 3 阻碍猪血利用的因素 目前，我国生猪养殖、屠宰规模已跃居世界首位，然而由于屠宰技术水平较低，生产相对分 散，屠宰后的猪血资源一直没有得到很好利用，绝大部分以饲料或废弃物的形式进行处理，不仅 浪费了宝贵的猪血资源，而且造成了严重的环境污染。尽管国内一些厂家进行了多次尝试，终因 技术、资金等问题都没有取得突破性进展。 影响猪血综合利用的因素主要有以f 几个方面，首先是我国屠宰行业整体技术水平较低，生 产相对分散，非常不利于猪血的收集。我国生猪屠宰量的8 0 以上都由个体、私营企业来完成， 形成一定规模的生猪屠宰企业较少，对于这部分猪血的收集十分不易，火部分都是小规模的屠宰， 小容器的接收，因此对猪血的利用比较困难。第二个原因就是，猪血在从猪体内流出以后短时间 内发生凝聚在一定程度上也影响了猪血的深加工。因为猪血本身含有凝集因子，如果不妥善处理， 2 3 分钟就会发生凝聚现象，严重影响了猪血的加工利用。第三个原因是，猪血不易进行检疫。 由于猪血收集后，无法将患有疫病的病猪猪血分离出来，还有就是猪血本身就是一个很富有营养 的物质，流出体外以后很容易遭受病菌的侵蚀，使食品安全性存在极大隐患，也影响了猪血的进 一步加工利用。最后就是由于血细胞中血红素的颜色及腥味，在食品中加入少量也会使食品呈暗 棕色并有异味，影响感官质量，这在一定程度上也限制了猪血的应用，这个因素也是影响猪血利 用的关键因素。因此，解决猪血的脱色问题就成为解决猪血综合利用的主耍问题。 猪血的颜色主要是血球中血红蛋白的作用。血红蛋向由血红素和珠蛋白构成，而呈色部分是 血红素。脱色就是要把血红素除去，国内外有很多相关方面的研究，也取得了一定的成果。但仍 有一定的问题，主要是脱色率低，蛋白质损失大，工艺流程复杂，成本太高，不利于工业化生产， 因此并没有解决猪血的综合利用问题。 1 1 4 研究猪血脱色的目的和意义 随着社会的进步和经济的发展，人们的生活水平日益提高，对健康的关注程度越来越高。在 饮食方面也已经认识到，蛋白质对身体的重要作用。猪血有很高的营养价值而且资源丰富，因此， 开发廉价的猪血蛋白资源意义深远。 国内外专家学者都从多方面研究开发猪血资源，不仅应用于食品领域，还应用于医药，工业， 2 保健品等各种不黼的领域。受猪斑颜色的影响，猪血应用于食黼领域受到校天静限翻。 国内外也有猪血脱色方面的研究，识是由于工芑流程复杂，成本高等原嘲，并没有真正应用 予王造建生产。溪鼹，迸一多研巍猪盎鹃魏色翊蘑鼗曼褥缀肖慧必。 1 2 盘筮爨蠢凝脱色枧瑕 l 。幺1 盘甄鳖爨 舰红蛋囱是一种结台蛋自，分子量6 4 ，0 0 0 ，由珠蛋白和皿红索构成。撒缴綮由原卟啉与强铁 瓣子缀残，鹰个稼蟹垒分予谢= 对熬链 8 1 ，一对是a 毽，是一队整t 3 链。数强基续会模式如蹿 1 - 1 ，1 - 2 ，蘧颤素乎蕊结擒摇潮1 - 3 。 强1 - 1 血红强魁鞋基结台横巍翻 t i tl 盆筑疆鑫平面示鬻誉 f 嘧】- 2 p a t t e r no f c o r p u s c l e 3 譬如 e 琏 。牲 槲h ， 匿l 略盘缸素举稿结祷臻 f i g ，1 - 3 p a t t e r n o f h c r n a c h r o m e 瘫红素帮臻簧鑫遥避霆毽掇菇含，其中嚣枣穗照盎蕴囊土静两个蠢酸基与撩蛋鑫结合，另两 个是髓过铁与珠蛋白中蛆氨咪唑环的氮彤成配位键。此配位键中的一个当血红綮与氧躺台时被氯 敷我。臻蛋鑫鑫嚣萋3 链穗嚣条8 链梅戒，8 琏蠡绕残7 争螺凌狃、嚣、c 、d 、e 、f 、g ) ，b 键 盘绕成8 个螺旋( a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、m 。珠谶自的每个亚基部与一个弧铁血红紊相连。豫 铁血毁素位于e 、f 殛个螺旋节段之闽。此处有一个出琉水氨基酸残熬构成的警问称为疏水口袋， 亦称为盎红素霜袋( h o r a eb a g ) 。盎红素分子中鹣“在蠹蕤素平磊懿一裰与靛链孛魏一个翅甄 酸残基以配位键相连。f d + 与砚相连在平面的另侧。 甄铁盎蠹索努子豫鼹羲褰予菠馨，雯帮努势藤h 羲窀是一釉整要嚣# 琳鬻生耪，在蓝铁巍 红素中存在的是原卟啉。原卟啉上的两个n 原子与铁以共价键结合，另两个则是以配能键结合， 整个分子整予莛摄捩态。 1 2 2 脱色机理 从血红蛋白分子结构来看，它易与氧结合。当m 红素中的铁为= 价时，熟颇色的变化取决于 氧豹存在。当与氧缝台舞裂盛为裁套盎数餐自，赣琶为鳝甄色，程燕氧台盘魏袋壹鬃不稳定，在 氧和强氧化剂存在下渗遴压被破坏，亚锾被氧化戚高铁，配位的氧原予变成h 藏价键连梭的羟基， 或为邂铁血红媾角，壤煎为褐题。 曝诧，盘缝蛋白静脱色，实际上是簧蠢摔其登龟纯台秭集团e p 斑红素或将其呈色纯台翱血赶 素包裹起来，币为外观所见。 趣红蛋是脱色，就楚采震一定翦方法捷盘茳素上翡嚣酸基与臻爨黩结台的活中纯学键爱蠢簸 素中的铁与组氮酸咪唑环的氮形成的两个配位键断裂，从而使珠蛋白和血红索分离。血红素位予 e 帮f 漂囊瑟穗痿麴巯拳空定串。鞫嚣，在正零条件下，强铁盎蒸素窝蛋垂紧紧结含在起，缎 难把他们拆分歼来，但是由于变性因素如加热、p h 值变化、胍等变性剂的存在，导致廊红蛋自 戆空耀缕棱发生变往嚣燮蛙，在这静壤况下热入撵分割，硪使璩蛋囟拳嵫红索分离。 1 3 国内外猪血脱色的研究历史和现状 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 猪血的红色主要是血球中的血红蛋白造成的。血红蛋白主要是由4 分子的血红素和1 分子的 珠蛋白构成【”。血红素是呈色物质，它是由一个二价铁离子镶嵌在一个原卟啉环中而构成的称为 铁卟啉的化合物。猪血脱色主要就是脱掉血红素，而使猪血的颜色脱去。其方法主要有化学方法， 物理方法以及现在研究的比较多的酶法等。 1 3 1 国外猪血脱色的研究历史和现状 对猪血脱色的研究，国外研究的比较早。刚开始主要是化学方法，最早使用该方法的是j 0 p e i l w 和t v b o 一1 1 , 1 2 。1 9 4 9 年j o p e 利用酸性丙酮把血红素结晶出来，剩下的就是没有颜色的珠蛋白。d l o o r 等人1 9 7 5 年用酸性丙酮连续抽提法脱色，滤液中加入4 5 倍体积的丙酮( 丙酮中加入3 的盐酸， 调节p h 值为3 0 左右) ，搅拌抽捉l o m i n ，过滤，滤出物即为珠蛋白。连续式抽提方法使猪血的脱 色更加彻底，也使丙酮得到了充分的利用。酸性丙酮脱色的基本原理是：血液中的血红素有游离 态和结合态两种，游离态和结合态之间存在一种平衡，酸性条件下可使平衡向分解的方向移动。 1 9 7 7 年l i n d r o o s b 3 用乙醇提取方法，其原理是利用血红素侧链上的两个丙酸基与乙醇进行酯 化反应，生成血红素二乙酯达到脱色目的。s a t o ：采用c m c 层析柱进行珠蛋白和血红素的分离【1 4 1 ， 但是l g c m c 只得至u 7 0 m g 的脱色球蛋白。a u t i o 使用可溶性c m c ：来拆分牛血红蛋白其成本大大低于 层析柱【1 ”，但是仍然有2 0 血红素铁没有被拆分。 w i s m e r p e d e r s o n 利用高压均质机做成乳化物，降低血红蛋白的颜色；z a y a s 等( 1 9 7 5 ) 采用 超声波处理的乳化刹达到隐色；s m i m i t s k a y a 等( 1 9 7 3 ) 利用凝固的乳蛋白来隐藏血红素；在丹 麦，血在压力下通过均质脱色；在美国，制作溶化脂肪、蛋白质、水、血混合液，通过急剧降压 包埋血红蛋白而脱色1 1 6 j 。d r o s t e 等采用过氧化氢作为氧化剂氧化脱色 ( d r o s t e ，1 9 1 5 ；b o r e h e r s ，1 9 4 2 ；b i n g o l d ，1 9 4 9 ；m i t s y k 等，1 9 7 5 ；o o r d & w e s d o r p ，1 9 7 9 ) 。 g o m e z - j u a r e z 等人采用术瓜蛋白酶水解红细胞，水解液通过多聚砜超滤，然后用5 的次氯 酸钠盐脱色，浓缩得球蛋白【l7 1 。 1 3 2 国内猪血脱色的研究历史和现状 张炜煜等用氯仿为溶剂，猪血粉与乙醇进行酯化反应，得血红素二乙酯，过滤分离【。 施跃峰，李卫华等用沉降脱色法把猪血制成无色蛋白粉。利用的猪全血，抗凝，用6 n 的盐 酸调节p h 值为3 0 ，使血红蛋白中的珠蛋白与辅基色素分离。再用n a o h 调节口h 值回到6 5 ，加入 酒精和3 0 h 2 0 2 溶液，利用泰切曼反应打断了亚铁血红素分子中的四个氮原子与一个铁原子之间 的两个共价键和两个配位键脱至无色，同时利用蛋白质的变性使蛋白质沉降下来。 杨严俊、王荣民等回用拆分剂c m s ( 羧甲基淀粉) ，使高铁血红素和拆分剂发生共沉淀而达到 脱色目的a 姜鹭等采用a a s 型吸附树脂代替传统的活性炭，对猪血粉水溶液进行脱色m 1 。阳离 子交换剂对猪血血红蛋白进行脱色也有过报道。马美湖等利用酸性丙酮和过氧化氢结合起来进行 脱色处理脚j 还有利用表面活性剂进行脱色的口”。 王彩云，常学东，汤风霞口2 】等利用酶法进行脱色，先把猪血进行离心分离，得到血细胞后 把血细胞溶血，然后调节至合适的酶解条件进行酶解，反应一定的时间灭酶终止反应，然后进行 5 中国农业大学硕上学位论文 第一章绪论 离心后把上清液进行浓缩喷舞干燥，得到无色的粉状蛋白质成品。 赖小玲【”增利用酶法结合吸附剂的方法进行了脱色。比较了a s 1 3 9 8 中性蛋白酶，胰酶，木瓜 蛋白酶几种酶的脱色效果，最终得出中性蛋白酶的脱色效果较好的结论。还对c m c ，活性炭，二 氧化锰等三种吸附剂的吸附效果进行比较，并从经济角度进行了权衡比较，活性炭是最优选择。 陈文辉 2 4 】，楚杰等 2 5 1 2 ”也利用酶法对猪血进行了脱色研究。利用了碱性蛋白酶，中性蛋i 气酶这 两种酶进行的，最终干燥成了粉状，并对产品的性质进行了简单的分析。张华山【2 7 等利用胰蛋白 酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶对猪血的脱色进行了研究。并用活性炭作为吸附剂。他还研究了影 响蛋白水解液脱色效果的几个因素，温度、d h 值、时间和活性炭用量。 从国内外的研究来看，利用化学方法进行猪血脱色，成本太高，不适合于工业化生产。而物 理方法脱色又不是很彻底，因此使用酶米进行脱色是大势所趋。国内也对酶法脱色进行了一定的 研究大多数研究都是和活性炭共同使用进行脱色的，这样由于活性炭的吸附作用，能很好的起 到脱色作用，但同时蛋白质的损失也很严重，有的损失5 0 左右，因此，有必要对酶法脱色做进 一步研究。 1 4 本课题的主要研究内容 1 4 1 利用蛋白酶酶解的方法进行脱色 猪血脱色主要包括物理法，化学法，酶水解法，表面活性剂法和综合脱色法。这些方法都不 同程度的达到了一定的脱色效果，但是都存在一定的问题。物理方法主要是利用脂肪掩埋法改变 组织状态达到脱色目的，因此脂肪用量大，而且制品仍然有一定的颜色，产品容易被氧化而发生 颜色变化。化学方法最大的问题是有机溶剂使用量过大，蛋白质中的溶剂残留也是问题，而表面 活性剂法的条件要求苛刻。采用酶法有很多优点，用量少，成本低，副产物少，易于进行工业化 生产。目前的酶水解脱色都配合使用活性炭，蛋白质有很大损失。 本实验不使用活性炭，单独使用酶，考察了脱色率和蛋白质得率两个指标。选择几种常见的 蛋白质水解酶，进行水解。首先确定最适合猪血脱色的酶的种类。然后，再进行酶解条件的优化， 并对影响猪血脱色的几种网素，进行分析。这几种因素主要是指血粉溶液的浓度，加入酶的浓度， 温度，p h 值这四个因素。最后通过正交实验进行酶解条件优化。实验指标主要有脱色率，蛋白 质回收率以及蛋自质水解度等等。 有关猪血脱色的理论研究己很多，但是真正应用于生产的还很少，其主要问题是实验室的研 究和实际工业化生产有一定的距离。在实验室研究的基础上，寻找适合工业化生产的脱色方法， 才能从根本上解决猪血的综合利用问题。本课题就是选择几种常见的酶进行猪血的脱色实验，没 有使用活性炭等吸附剂，使蛋白质的得率提高，也为丁业化生产中缩短了工艺。同时还进行了较 大规模的实验，进一步为工业化生产创造条件。 1 4 2 超滤在猪血球蛋白粉溶液脱色中的应用 蛋白酶把猪血球蛋白水解成小肽，破坏了血红蛋白的空间结构，使血红素和珠蛋白分开。在 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 适合的温度和p h 值条件下，血红素由于疏水作用而聚集在一起，但是仍然会有一部分的血红素和 珠蛋白不能分开而以较大分子状态存在着，冈此我们采用超滤的方法使含有血红素部分的小肽分 离以进一步提高脱色效果。 1 4 3 血红蛋白酶解液抑菌性初步研究 本课题利用酶法，酶在将血红蛋白分解为珠蛋白和血红素的同时，也把珠蛋白酶解成具有生 物活性的肽类物质。据资料报道，小分子猪血肽不仅具有很好的溶解性【”, 2 9 , 3 0 、低粘度、抗凝胶 形成性，而且还有抗菌、抗高血压等生理活性，同时小肽在体内消化吸收快。 采用琼脂扩散法分析血红蛋白酶解液的抑菌特性。初步研究影响抑菌特性的几个因素，摸索 适宜的抑菌条件。 7 2 1 前言 第二章蛋白酶的筛选及酶解条件的优化 我国生猪产量世界第一，猪血资源非常丰富，而且猪血营养价值非常高，是一座真正的营养 宝库。但是，我国在猪血资源的开发利用上却远远落后于世界上其它发达国家，不仅造成了资源 的浪费而且还给环境造成了严重的污染。猪血的血红色及其腥味是影响其综合利用的一个因素。 因此，国内外都有猪血脱色的相关研究。国外研究的比较早，主要是使用的化学方法。它的脱色 效果比较明显，但是同时也存在着化学试剂使用量太大，成本太高的缺点，因此使猪血的综合利 用问题没有得到根本的解决。为此，研究猪血的脱色问题，特别是产业化仍然非常重要。 随着科技的发展，生物酶法在科学研究中的应用越来越广泛。同样，利用蛋白酶也可以对猪 血进行脱色，该方法的优点是酶用量少，成本低，副产物少，易于进行大规模生产，无二次污染。 在猪血酶法脱色的研究中，酶解工艺大体相同，不同酶的作用条件及作用时间不同。酶解前先对 猪血进行的处理，由于猪血本身凝血酶的作用，使得猪血非常容易凝固，因此在采血时要有抗凝 措施，一般都是加入适量的柠檬酸三钠作为抗凝剂。猪血中的颜色主要是因为红血球的缘故，因 此还要对猪血进行离心，取下半部分的红血球进行脱色研究。蛋白水解酶有其自身的特点，针对 不同的蛋白质其作用位点是不同的，所以不同的蛋f i 酶对猪血的脱色效果也有很大的不同，选择 合适的蛋白水解酶显的非常重要。在以往的研究中，a s 1 3 9 8 中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白 酶、菠萝蛋白酶等都被使用过，都有一定的脱色效果，这说明蛋白酶在猪血的脱色中是可以使用 的。在酶法脱色的过程中，常常要活性炭作为吸附剂进行辅助脱色，但活性炭同时也带走了大量 的蛋白质，使蛋白质的得率明显下降，因此研究一种既有较高的脱色率又有较高的蛋白质得率的 脱色方法就显得非常有意义。血红蛋白中的血红素和珠蛋白在p h 值为3 0 时的结合最疏松【3 “， 因此在酶解结束时调节p h 值到3 0 左右，再进行离心处理，这样就可以不用活性炭而可以得到 较高的脱色率，同时也保证了较高的蛋白质得率。本实验就是在这个理论的指导下进行的。这样 还可以减少工艺流程，更适合工业化生产。 本实验分别选取中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶几种常见的蛋 白酶进行实验。在它们各自最适合的酶解条件下进行反应，初步选择适合猪血脱色的酶的种类。 选择猪血脱色率和蛋白质的回收率作为评价指标。然后又进行了酶解条件的优化实验，并分析了 酶解脱色的影响因素，包括加酶量、温度、d h 值等对脱色率的影响。最终确定了最适合猪血脱 色的酶的种类及酶解条件。 本实验选择的实验材料是猪血球蛋白粉，目的是为了实验的方便和准确性。最后证明用猪血 球蛋白粉代替猪血进行实验是完全可以的，利用猪血球蛋白粉实验得出的实验条件应用于猪血同 样达到了很好的脱色效果。 2 2 材料和方法 2 2 1 材料 8 中国农业大学颂士学位论文 第二章蛋白酶的筛选及酶解条件的优化 ；悉镀，牌瓶球蛋自糖，赡予天津愚镣蛋鑫震鬯隈公蔼，2 5 警g 麓，鼹滚于漂楚豫存。 成份分析；粗蛋白 9 0 0 水分】0 0 月镕肪 蝣l 挺辩髓色攀的嚣镌 皿球蛋白粉溶液的浓度选择为5 ，碱性蛋白酶的加入鬣为6 4 x 1 0 5 u g ，5 5 c ，反成时间为4 个 枣辩；孛鹱爨蛊酶热入鼙凳7 0 x l o s u g ，5 5 0 c ，菠应对润为5 个枣黠。舞定不趣蹲蓥f 舱虢惫攀， 其结果如下： 1 0 。! 尊o 翼 暴 9 一一= ”、 j + 碱性蛋白酶j 卜女“中性蛋骞簿； ，撼。酬眷避避眠科 一蒯鸯：5 。2 6 48 4 - 4 1 、匿8 5 州 ”黩帮 j 一菇崩 789 p h 蘧 蓉2 - 4 麟髂捧毽对凝壹效暴熬嚣稿 f i g 2 - 4 e f f e c t o f p h v a l u eo i lr a t i o o f d e e o l o u r i z a t l o n 每个酶都骞最逮p h 僮，捷鲍p 酲缀条俘下缳他反应的速度最趣。最适p 兰壬值的徽，j 、偏离，砑 以便酶活陡部位的纂溺离子发生交豫丽降低酶酶活力。当p h 氆靛空较丈偏离对，维护酶三缭结 构的许多共价键受到干扰，导致酶蛋白自身变性硒降低活性。如图2 - 4 所示t 对于碱性蛋向酶来 说，p 毛燕京1 0 , 0 霹艇篷率最糍，毽是献鋈上可以善凄，p h 蓬对碱性蛋自酶戆雾璃不大。两对于 中性蛋白酶求说，p h 值影响比较大，p h 值在8 0 时脱色举最低，而在7 5 时有最高的脱色效聚。 6 ) 离心速度秘对麓蘑麓色羧莱熬影壤 把酶解之后的溶液的p h 假调节到3 , 0 进行离心时，离心速廉和离心时间都会对脱色率潦成 影蟪。把猪救球蛋巍羚溶渡用翅下条传进萼亍脱色处理，猪盘豫蛋嶷粉溶液浓度为5 ，碱蛀缀自 酶进行处褒，加入酶瓣量为蠢4 x i 扩t 滤，温度潞5 5 * 0 ，p h 值夯1 0 0 ，反应瓣闻为4 个，j 、黠。谲 节潞液p h 值为3 0 ，5 5 c 条 牛f 放置半个小时，然后进行冷却至蜜温。等待离心，其结果如下： 囊2 一1 0 鬻心蘧裹辩麟色搴薛豁端( 2 0 m l u ) t a b 。2 - 1 0e f f e c to f c e n t r i f u g a ls p e e do i lr a t i oo f d e c o l o u r i z a t i o u ( 2 0 r a i n ) 浪：表率车霹字母霞表奔箍著茬差异 1 9 ，百_)瓣籀鏊 中困农业人学坝l 学位论义 第一币监自酶的筛选发酶解条件的优化 表2 一i1 离心时间对脱色率的影响 l a b2 - ii e