（农产品加工及贮藏工程专业论文）脂肪酶水解鸡油及酶解物热裂解产物组成的研究.pdf

摘要 本文以1 3 种商业酶为酶源，研究各种脂肪酶水解鸡油能力和水解产物的差异性，为获得特 定脂肪酸和进一步加工提供数据基础，结果表明：催化鸡油水解能力最强的脂肪酶是 l i p o m o d - 3 4 p 各种脂肪酶催化鸡油水解主要产物为棕榈酸、油酸和亚油酸，但水解产生脂肪 酸种类不同，从3 0 种至“种不等。对饱和、单不饱和和多不饱和脂肪酸表现出强特异性的脂 肪酶分别是l i p o m o d - 1 6 6 p ，l _ i p o m o d - 3 4 p 和l i p o m o d - 3 3 8 p 。各种脂肪酶主要水解出c 1 6 和c 1 8 的脂肪酸。并研究l i p o m o d 一3 4 p 的水解工艺条件，确定该脂肪酶水解鸡油的最佳工艺条件为： 酶量1 0 0 u g 反应液，4 0 c ，p h 7 0 ，底物浓度7 0 ( w w ) 采用p y r o l y s i s - c f _ 搠s 技术研究鸡油和鸡油酶解物的热裂解性质。探讨热裂解温度和水解 作用对热裂解产物的影响。结果显示：鸡油和鸡油酶解物的热裂解产物总量和种类随着温度的 升高而增加；此外，温度越高，越容易生成短碳链的产物。鸡油与鸡油酶解物热裂解产物对比 结果显示：在各实验温度，酶解物熟裂解产物种类多于鸡油热裂解产物；鸡油酶解物易生成短 碳链物质；在2 5 0 - 4 0 0 c 时，鸡油和酶解物热裂解产物中，醇、醛、酮三类物质差异较大，酶 解物更易形成醇和酮类物质；5 0 0 和6 0 0 c 时，鸡油和鸡油酶解物均增加了烯类物质生成量， 酶解物更易生成大量烯类物质。鸡油和鸡油酶解物热裂解均生成一定量体现肉类风味的醛和脂 肪酸。 关键词：脂肪酶，鸡油，脂肪酸，水解，酶解物，热裂解 a b s t r a c t t h i r t e e nl i p a s e sw o r ei n v e s t i g a t e dt oc e t a l y s ec h i c k e nf a th y d r o l y s i s ，s ot h a tw ec o u l do b t a i nt h e d i f f e r e n c eo ft h ec a p a c i t yo fc a t a l y s i sa n dp r o d u c t sb e t w e e nt h el i p a s e s ，w h i c hc o u l db et h eg u i d ef o r p r o d u c i n gs p e c i a lf a t t ya c i d sa n d u l l h e rp r o c e s s i n g t h er e s u l t ss h o w nt h a tt h el i p o m o d - 3 4 p e x h t h i t e dt h eh i g hc a p a c i t yo fc a t a l y s i s ；v a r i o u sl i p a s e sp r o d u c e dd i f f e r e n ts p e c i e so ff a t t ya d d s ， w h i c hn u m b e rr a n gf r o mt h i r t yt of i f t y - f o u r , b u tt h em a i nf a t t ya d d sw e r ep a l m i t i ca c i d o l e i ca c i da n d l i n o h ca c i d i na d d i t i o n , t h es p e c i f i c i t yo fh p a s e sf o rp r o d u c i n gt h es a t u r a t i o n ，m o n o u n s a t u r a t i u na n d p o l y u n s a t u r a t i o nf a t t ya c i d sw e r el i p o m o d - 1 6 6 p , h p o m o d - 3 4 pa n dl i p o m o d - 3 3 8 pr e s p e c t i v e l y a l l l i p a s e sm a i n l yp r o d u c e dc t 6a n dc i sp r o d u c t s t h eh y d r o l y s i sc h a r a c t e ro fl i p o m o d - 3 4 pw a ss t u d i e d ， a n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so ft h eh y d r o l y s i st e c h n o l o g yf o rl i p o m o d - 3 4 pa r et h eq u a n t i t yo fl i p a s e 1 0 0 u gr e a c t a n t ，t e m p e r a t u r e4 0 ，p h 7 0a n dt h es u b s t r a t ec o n c e n t x a t i o n7 0 ( w w ) p y r o l y s i s - g c m st e c h n o l o g yw a sp e r f o r m e dt or e s e a r c ht h ep y r o l y s i sc h a r a c t e ro ft h ec h i c k e n f a ta n di t s h y d r o l y s a t e , w h i c hc o u l ds h o wt h ed i f f e r e n c eo ft h er e a c t a n ta tv a r i o u sp y r o l y s i s t e m p e r a t u r e sa n dt h ee f f e c to fh y d r o l y s i so i lt h ep y r o l y s i s t h er e s u l t ss h o w nt h a tt h ea m o u n t ，l i p e c i e a a n ds h o r tc a r b o nc h a i no fp r o d u c t sf r o mc h i c k e nf a ta n dh y d r o l y s a t ep y r o l y s i sw e r ei n c r e a s i n gw i t h i n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e t oc o m p a r i s o nt h ep r o d u c t sc o u l db er e s u l ti nt h a ts p e c i e so ft h eh y d r o l y s a t e w e r em o r et h a nt h ec h i c k e nf a ta tt h ee v e r ys a m et e m p e r a t u r e t h es h o r tc a r b o nc h a i np r o d u c t sc o u l d b eo b t a i n e df i o mh y d r o l y s a t ee a s i l y a t2 5 0 枷t h e r ew a sm u c hd i f f e r e n c e 妯t h ea m o u n to f a l c o h o l s ，a d e h y d e sa n dk e t o n e sa n dt h eh y d r o l y s a t ep r o d u c e dm o r eq u a l i t yo f a l c o h o l sa n dk e t o n e s a l a r g en u m b e ro f o l e f m s w e r ep r o d u c e da t5 0 0a n d6 0 0 c ，t h eh y d r o l y s a t ep r o d u c e dm o r et h a nc h i c k e n f a t s o m em e a tf l a v o rp r o d u c t sc o u l db eo b t a i n e df r o mc h i c k e nf a ta n di t sh y d r o l y s a t ep y r o l y s i s , s u c h a sa d e h y d e sa n df a t t ya c i d s k e yw o r d s ：l i p a s e ，c h i c k e nf a t ，f a t t y a c i d ，h y d r o l y s i s ，h y d m l y s a t e ，p y r o l y s i s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 于恶，低 时间：办 年b 月玎日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名奇萼，侮 1 导师签名： 时间：问年z 月矿日 时阍：棚年) 只ts f 中国农业大学硕十学位论文第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) 是将油脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油的酶，具有对油 水界面的亲和力，并能在油水界面上以高催化速率水解不溶于水的油脂。脂肪酶的天然底物是 油脂，它必需与底物结合才能起到催化作用。但是，这种酶底物复合体中是不会存在亲脂结合 的，因为酶是水溶性的，而底物( 油脂) 不溶于水。因此，脂肪酶水解反应只能发生在油水界 面上【l l 。为了使脂肪酶充分作用，需要利用搅拌或振荡来产生足够大的界面，有时甚至需要加 入乳化剂，以利于两相的分散。 作为油脂重要组成部分的动物脂肪，由于人们健康意识的增强，动物脂肪因含有相对长碳 链的饱和脂肪酸而成为副产品。因此，通过酶解、热裂解等方法生产特殊脂肪酸、风味物质， 从而提高动物脂肪的附加值具有重要意义。 油脂可通过熟裂解反应转化为燃料和化合物。p y - c , c m s 技术在反应的同时对裂解产物进 行分离检测可通过控制热裂解温度和其他反应条件，来控制产物的形成。并且p y - g c m s 技 术是快速有效的研究反应条件对产物影响和阐明产物形成机理的方法。 1 2 脂肪酶的结构与性质 脂肪酶( 1 i p a s ebc 3 1 1 3 ) 亦称酰基甘油水解酶( a c y l g l y c e r o lh y d r o l a s c s ) 。脂肪酶的 来源非常广泛，在许多动植物及微生物中存在1 2 】。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子， 动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等，微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重 要来源，它包括细菌、酵母和霉菌产生的脂肪酶【3 1 。脂肪酶的天然底物是甘油酯类，然而研究 表明，脂肪酶能够催化甘油酯类化合物的水解n5 j 等反应，尤其是利用某些脂肪酶的专一性睁 ”成为酶工程领域研究的热点。因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、油脂 化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等许多 领域得到广泛应用。 1 2 1 脂肪酶的结构特征和催化机制 1 2 1 1 脂肪酶活性中心结构及油水界面催化 脂肪酶是一种蛋白质，其氨基酸残基数为2 7 0 - 6 4 1 ，其分子量为2 90 0 0 1 0 00 0 0 。各种来 源的脂肪酶都具有相似的三维结构。迄今为止，人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达，并利 用x - e 射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构，等电点等参数，确定了 组成脂肪酶活性中心的三元组( t r i a d ) 结构 s l 。袭1 - 1 列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参 数。 中国农业大学硕学位论文 第一章绪论 裹i - i 部分脂肪酶的结构特征参数 t a b l e1 - it h es t m c t u rc h a 阳啦fp a r a m e t c r so f s o m el i p a s c s 脂肪酶名称氪基酸残基数 分子量( 道尔顿)尺度( 1 0 1 0 m )三元催化中心 c c l ( c r l ) 5 3 45 7 2 2 3 ( 5 7 7 4 4 )融! 翟乙5 h i s ( 4 4 9 ) - s e r ( 2 0 9 ) - 6 1 u ( 3 4 1 ) 6 5 6 0 x 4 5 6 0 0 0 0 ( 5 9 4 x 8 4 x h i s ( 4 8 3 ) - s 8 1 ( 2 1 7 ) - g l u ( 3 6 4 ) 2凹29472 4 4 9 7 1 6 x 7 5 5 5 s e r ( 1 4 4 ) - h i s ( 2 6 7 ) - a s p ( 2 0 3 ) 4 8 3 l x 2 2 9 3 1 9 s e r ( 1 5 2 ) 堋i s ( 2 6 3 ) - s p ( 1 7 6 ) 洼lc n ( c a a d i m c y l i n d x a c c a l j p a s c ) ；c r l ( o a d i d a r u g m a l i m “) ；o c l ( g a m i c h u m q 嘣蛔l i l m ) ：r m l ( r h i z o m u c h m i 幽d l i l l e ) ；m m l ( m u a x m i k i i j p 越e ) ；h p l ( h m 柚 聃瑚血c u p 船e ) 尽管不同脂肪酶的氨基酸序列会有所不同，但它们以相似的方式折叠，具有类似的催化部 位。绝大多数脂肪酶的活性中心都由s e r 和h i s 参与组成【9 】，h i s 、s e t 与另一种氨基酸残基 一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组( t r i a d ) 。构成脂肪酶活性中心的三元组之间，丝氨酸残 基通过氢键与组氨酸相连，另一种氨基酸( 谷氨酸或天冬氨酸) 也通过羧基形成的氢键与组氨 酸相连。在反应过程中，三者通过与底物形成四面体中间体复合物完成催化过程。活性中心是 丝氨酸残基，在正常情况下该残基受一个o 螺旋盖的保护，当脂肪酶与界面相接触时，此盖打 开，逶过亲电子域的创造导致脂肪酶的构象改变，此亲电子域在丝氨酸残基周围，由疏水残基 的暴露和亲水残基的包埋来完成。这种结构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以 及活性中间体的稳定，所以界面激活现象通常与“d - i 旋盖”的重新定向排列( 构象改变) 有 关【1 0 】。 1 2 1 2 脂肪酶底物特异性 脂肪酶活性中心结构差异使它们对不同底物特异性也出现不同，脂肪酶底物特异性包括脂 肪酸特异性、位置特异性和立体特异性 ( 1 ) 脂肪酸特异性 脂肪酶对不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，不同来源脂肪酶水解不同甘油 酯所表现出脂肪酸特异性极大。圆弧青霉( p e n i c i l l i u mc y c l o p i a m ) 脂肪酶对短链脂肪酸，黑曲 霉( d 昨嚼玩g 嘲妒) 和根霉( 尉d 砌) 对中等长链脂肪酸，表现出强特异性i “i , a c h r o m o b a t e r i u m l i p o t y a c u m 对饱和脂肪酸表现出特异性【1 2 1 。而s t a p h y l o c o c c u aa s r e u s 2 2 6 脂肪酶对不饱和脂肪酸 具有特异性；白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u m ) 对油酸甘油酯表现出强特异性“1 。 脂肪酶对底物中不饱和脂肪酸双键位置也表现出不同专一性。白地霉脂肪酶对e i s - 9 - c 1 8 ：l 和e i s - 9 - c 1 8 ：2 、e i s - 1 2 - c 1 8 ：2 不饱和脂肪酸表现出特异水解活性i ( 2 ) 位置特异性 脂肪酶对底物甘油三酯中s n 1 ( 或s n - 3 ) 和s n 之位置键识别和水解能力不同。大多数脂 2 觚等 咖 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 肪酶作用于s n - 1 和s n - 3 位。如解腊假丝酵母等脂肪酶：还有一部分脂肪酶可水解所有位置脂 肪酸，如白地霉等脂肪酶嗍。 ( 3 ) 立体特异性 脂肪酶对脂肪酸中立体对映结构1 位和3 位具有选择性水解能力 1 2 2 脂肪酶催化反应的主要影响因素【1 61 9 1 脂肪酶通常溶于水。大多数动物脂肪酶最适p h 值偏碱性( p h = 8 - 9 ) 受底物和乳化剂的影 响也可能偏酸性。大多数脂肪酶的最适温度在3 0 c - 4 0 c 。脂肪酶的稳定性因酶的来源不同而 有所不同。微生物脂肪酶的热稳定性通常高于动植物中的脂肪酶。脂肪酶的稳定性还与底物有 很大关系，可能是因为底物从酶附近带走水分，限制了酶结构上的变化。 1 2 2 1 温度 温度是影响酶催化反应的重要因素之一，其对酶催化反应的影响表现在以下两个方面：一 是对酶蛋白稳定性的影响；二是对酶催化反应体系本身的影响。酶热变性失活的活化能为 5 0 0 0 0 - 1 5 0 0 0 0c a l m o l ，约是一般酶催化反应的活化能( 5 0 0 0 1 5 0 0 0c a l m 0 1 ) 的十倍。当温度低 于3 0 c 时，由于体系提供的能量远低于酶热变性失活的活化能，因此酶的热失活作用很慢，此 时温度对酶催化反应无明显影响。但是由于酶的热失活作用温度系数远大于酶催化反应的温度 系数，因此随着温度升高，酶变性失活对反应的负面影响远大于温度升高本身对反应速度的促 进作用。 以酶催化反应速度对温度作图可得到一条钟罩形曲线。反应速度在某一温度出现最大值， 通常称这个温度为酶催化反应的最适温度。另外，酶在高温下失活往往和体系中的水分子有关， m 卸o v 给出了解释【” 1 2 2 2o h 由于酶分子结构的复杂性，因此p h 变化对酶催化反应的影响也较复杂。在酶分子结构中 存在许多酸性、碱性氨基酸侧链基团。上述基团随p h 值的变化可以处于不同的解离状态。侧 链基团的不同解离状态可能直接影响酶与底物的结合；也可能改变酶的空间结构，从而影响酶 的催化活性。研究表明，p h 值对酶活的影响主要有以下几个主要方面： ( 1 ) 酸或碱可以破坏酶的空间结构，导致酶可逆失活或不可逆失活； ( 2 ) 酸或碱影响酶活性部位结合基团的解离状态，导致底物不能和它结合； ( 3 ) 酸或碱影响酶活性部位催化基团的解离状态，导致底物不能分解为产物； 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 ( 4 ) 酸或碱影响底物的解离状态，导致其不能与酶结合或者结合后不能转化为产物。 酶催化的最适p h 值范围是上述几种因素共同作用的结果，因此酶催化活性有一个最适p h 值范围，以酶活力对p h 值作图，也可得到一条钟罩形曲线。 1 2 2 3 水量 水分含量以复杂的方式影响酶的活性和稳定性一定量的水对于酶维持其活性构象而发挥 作用是必需的。通常认为，酶分子有“开启”和“紧锁”两种存在状态。当体系中仅舍少量水 或没有水时，酶分子处于“紧锁”状态，酶的催化活性部位被包裹在分子内部，不能与底物分 子接触，此时酶不具有催化活性当体系中的含水量增加到某一程度后，酶分子的结构便由“紧 锁”状态转变为“开启”状态，酶具有了催化活性。但如果体系中含水量过高，酶分子的活性 中心附近将聚积大量的水分子，使不溶或难溶于水的底物与酶催化活性部位的接触几率变小， 导致酶催化活性降低。此外，使酶的结构出现“紧锁”状态转变为“开启”状态所需的最小含 水量随酶的种类及反应条件而异i l q 。 1 2 3 脂肪酶催化特点 酶具有一般催化剂的共性，如少量存在即可大大加快反应速度；能使反应迅速达平衡而不 改变化学反应平衡点位置；反应前后本身无变化并可重复使用。但是，作为一类特殊的高效催 化荆，酶催化具有以下几个方面的特点【1 9 】： ( 1 ) 催化效率高。 与普通催化剂相比，酶可更大程度的降低化学反应所需的活化能，使反应更易于进行。酶 催化是多种催化因素的协同作用，如酶与底物的邻近效应和定向效应、酶与底物相互诱导的扭 曲变形和构象变化的催化效应等均可在一定程度上提高酶的催化活性。 ( 2 ) 专性高。 酶的专一性主要包括酶与底物结合的专一性和酶催化的专一性。酶是由数以百万计的氨基 酸组成的活性大分子，但其分子结构中只有- - 4 部分基团具有催化作用，被称为催化活性位 酶的催化活性位具有一定大小和几何形状，当底物的大小不当或几何形状不合适时，均不能与 酶的活性部位结合，这是酶与底物的结合专一性；另外，酶催化活性位的基团和底物分子上的 基团要有必要的相互作用力，通过这种作用力，酶才能和底物结合，这是酶对底物催化专一性。 在解释酶对底物的专一性方面有两个较合理的假说，即锁钥学说和诱导楔合假说。 ( 3 ) 反应条件温和。 酶催化反应无需高温、高压操作，在温度低于1 0 0 * c ，正常大气压，中性p h 环境下即可进 4 中国农业大学硕十学位论文 第一章绪论 行。与之相比，一般化学催化反应或无催化剂反应往往要在较高的温度、压力下才能进行。 ( 4 ) 催化活性可调 作为一种催化剂，它的催化机理与化学催化剂一样，是通过降低反应体系的活化能，而在 反应结束之后，其将被释放出来，进而催化下一个反应脂肪酶具有催化专一性的特点。在某 些情况下，它们只催化底物中的特殊基团。如多数脂肪酶只对甘油三酯的1 ，3 位具有活性，在 工业生产中，利用这种专一性可生产出具有特定结构的产品并且使副产物最少。 1 3 脂质与风味的形成 肉类风味的形成是十分复杂的过程，其中脂质氧化是肉风味形成的一个重要途径，并且， 脂肪酸的不饱和程度越高，肉的风味越佳刚。脂肪酸氧化降解所产生的许多挥发性物质都是肉 香味的重要成分，不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸、亚麻酸、和花生四烯酸中的双键，在加热过程 中发生氧化作用，生成过氧化物，继而进一步分解生成具有很低阈值的酮、醛、酸等挥发性香味 化合物，如鸡肉中的重要香味化合物2 ，4 - 癸二烯醛被认为是来源于亚油酸。不饱和脂肪酸的含量 影响到风味的形成。鸡油中含有约6 0 的不饱和脂肪酸，而其中主要不饱和脂肪酸为油酸、亚 油酸等 1 3 1 脂质氧化途径 腊质氧化主要包括脂质的自动氧化降解和热氧化裂解两个反应途径【2 l j 。 1 3 1 1 脂质的自动氧化及其氧化降解产物 脂质产生的香味物质可通过自动氧化生成，脂质自动氧化的机理是自由基链式反应。它受 热、光等许多因素的影响。脂质的主要成分是甘油脂肪酸酯，这些脂肪酸中的烯丙基对自由基 链反应很敏感，在氧的存在下可以导致脂肪酸分子的断裂不饱和脂肪酸很容易通过非酶反应 而降解成大量的挥发性物质 ( 1 ) 脂肪酸或酯的氢过氧化物生成机理 不饱和脂质与氧反应形成氢过氧化物，通常是自由基过程，分为链引发、链传递、链终止 3 个基本步骤阎。氢过氧化物是脂质自动氧化的主要产物，每种脂肪酸氧化可以产生几种氢过 氧化物，但是氢过氧化物没有任何气味。氢过氧化物形成的自由基机理涉及到脂质中双键的a 位亚甲基上氢原子的离去，这样就形成了很稳定的烯丙基自由基。烯丙基自由基上的电子可以 离域在3 个碳原子上自动氧化形成异构型的氢过氧化物的机理也有文献论述嘲。 ( 2 ) 氢过氧化物的降解产物 5 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 氢过氧化物的降解产物与温度、压力和氧气浓度有关。不饱和脂肪酸形成的氢过氧化物很 不稳定。氢过氧化物断裂生成各种挥发性的香味物质和非挥发性的物质。氢过氧化物的降解涉 及到- o o h 的均裂，生成烷氧基自由基和羟基自由基洲。烷氧基自由基在c c 键上进行裂 解，形成醛和乙烯基自由基或不饱和醛和烷基自由基，进而形成挥发性的醛、烯、醇等有机化 合物。 1 3 1 2 脂质的热降解产物 脂质受热可产生大量的香味物质。当温度高于6 0 时，脂质的自动氧化降低。脂质受热 时，饱和和不饱和的酰基酯上所有的碳氢链的位置都可能受到自由基的进攻，从而形成复杂的 挥发性的物质。加热脂肪超过1 5 0 ，可改变自动氧化的途径【蕊硐在无氧存在时，脂质通过 脱氢、脱羧、水解和碳碳键的断裂进行熟降解。 由脂质产生的挥发性成分的芳香阈值比其他水溶性前躯物质发生m a i l l a r d 反应所产生的含 硫、氮杂环化合物阈值要高，因此脂类所产生的挥发性成分对香味的作用如浓度相对较低的杂 环化合物要小。但是由其产生的含c 6 - c l o 的饱和和不饱和醛类却是所有烧肉中挥发性成分的重 要组成，对肉香中的脂肪味和油腻味有很大的作用。不同肉类其脂类含量和成分不同，所产生 的特征的香气也不同，但醛类是其主要降解产物 2 7 1 。 有关研究表明。脂肪经过控制氧化以后，可以产生大量的c6 - c l o 的脂肪族醛、酮、羧酸， 氧化产物作为前体物直接用于热反应香精或热反应原料，对于提高肉味香精的特征性香味效果 显著 2 8 , 2 9 1 。 1 4 热裂解技术 熟裂解技术是转化油脂为燃料和化合物的一种代表方法。热裂解可分为直接热裂解和使用 催化剂的热裂解。其中催化剂存在的热裂解较直接热裂解研究多，应用到的主要催化剂包含四 种：分子筛催化剂，活性氧化铝催化剂、过渡金属催化剂和碳酸钠。 热裂解研究结果表明产物的形成非常复杂。影响产物的主要因素有反应器类型、反应时间， 温度、收集方法和检测技术。反应条件对最终产物的影响需进一步研究，以便更好的得到目标 产物，了解热裂解化学和综合评价最终反应产物性质【划。有很多关于甘油三酯的热裂解研究， 可分为两个方面：一方面是燃料应用，另一方面是食品科学研究。热裂解工艺可分为慢速、快速、 反应性热裂解三种类型。 1 4 1 甘油三酯的热裂解机理 c h a n g 等p 1 】研究饱和甘油三酯热裂解机理认为包含1 6 类反应。他们认为大部分的酸、烯醛 和烯由等式( 1 ) ( 3 ) 途径形成。烃的形成主要是( 6 ) 和( 1 1 ) 途径。如下： 6 中国农业大学硕十学位论文第一章绪论 ( 1 ) 甘油酯的分解 c h 2 0 c o r c d 2 li c h o c o c h 2 r ”一c h + r c 0 0 h + r ”c o o h + r ”c h f c o ll c h 2 0 c o r c h o ( 2 ) 脂肪酸的分解( 8 ) 异构化 ( 3 ) 烯和醛的分解 2 r ”1 0 h = - 2 c o + r h cc h r c h 2 = c h c h o c o + c 2 h 4 2 r c o c h 2 r 一2 r 2 + c o + c 2 h , , ( 4 ) 单元分解 c n h 2 m 2 - - n c + ( n + 1 ) h 2 ( 5 ) 脱氢 g l b 一g h 2 。+ h 2 ( 6 ) 裂解 g j b 件2 一o 。i k 2 + g m h ( 7 ) 烷基化 gm h a 口+ c 胡b g l 2 叶2 n q 一异构一c 9 i h , 2 ( 9 ) 芳香环化 c 6 ) h ( m 1 ) 一g l k l + 4 h 2 ( 1 0 ) 烯烃的聚合 2 c 疆k q 矗k c ；h 知+ g 朋知一c ( * _ ) h 2 - 惯 ( 1 1 ) 烯烃的降解 c ( m ) h 2 m ，一吼口+ q k ( 1 2 ) 烯烃降解为二烯烃 、 ( 1 3 ) 烯烃降解为炔烃 ( 1 4 ) 烯烃的芳构化和环化 ( 1 5 ) 烯烃的氢化 c 廿b “1 2 一c 。 b ( 1 6 ) 烯烃的异构化 n ( 讯。一异构体 c n h 2 a a l e n c a r 等嘲研究饱和甘油三酯的热裂解机理指出：热裂解甘油三酯生成自由基( a ) r c o o 和( b ) r c h 2 0 a 自由基脱羧后经歧化作用和消除作用形成奇数烷和单烯烃。偶数烷和烯烃是 b 自由基经上述途径形成。 s c h w a b 等1 3 ，l 研究不饱和甘油三酯的热裂解机理，解释不饱和甘油三酯热裂解形成烷、烯、 二烯、芳香物质和羧酸的机理。烷和烯的形成源于甘油三酯脱羧产物r c 0 0 自由基。不饱和键 增加了c - c 双键的断裂，并且裂解反应是主要反应。 i d e m 等p 4 】研究了菜籽油的热裂解，结合前人研究给出了含饱和和不饱和组分甘油三酯的热 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 裂解模型( 图1 - 1 ) 。模型解释了酮、醛、酯、醇、烃等的形成机理。同时指出，甘油三酯的不 饱和度对其热裂解行为具有重要影响。比如。残基中间体可通过不同途径由氧化化合物降解最 终形成c l - c 5 烃。脱羧和脱羰基化作用可发生在c - c 断裂之前或之后。不饱和甘油三酯，断裂 易发生在之前。 围1 - 1 饱和和不饱和甘油三酯热裂解反应机理 f i g 1 - l r c c t i o n m e c h a n i s m f o r t h e p y r o l y s i s o f s a t u r a t e da n du n s a t u r a t e d t r i g l y c e r i d e s 8 此外，一些关于催化反应机理的研究，主要介绍了两种类型的催化剂的催化机理。 ( 1 ) 活性氧化铝催化剂 v o n g h i a 等m j 研究了活性氧化铝催化甘油三酯脱氧生成脂肪烃的催化机理。与沸石类催化 剂相比，活性氧化铝决定转化途径简单，它使反应物脱氧生成无环链烯和烷烃，因此活性氧化 铝适合用于研究一级降解途径。研究结果表明：甘油三酯降解始于两个机理。不是b - 消除产生 羧酸就是 氢转移生成链烯。两种机理都是羰基氧和铝氧催化剂路易斯酸部位键合。由此可假 设，羧酸形成对称酮，该酮可通过另一个t 氢转移生成单链烯和甲基酮。甲基酮经过脱氢或丫- 氢重排后的一个不确知的途径最终生成单链烯。甲基酮也可以通过异构化作用形成醛而后氧化 形成羧酸。 ( 2 ) 分子筛催化剂 k a t i k a n e n i 等p q 研究指出含催化剂的甘油三酯热裂解主要反应阶段生成酮和醛等氧化产 物这些氧化产物脱氧进而生成石蜡和烯烃物质。部分烯类物质经环化等作用形成芳香和脂肪 族物质。 1 4 2 油脂热裂解研究现状 f o r t c s i ”l 等采用p y 母a m s 技术研究了m a c a u b a 植物油在无氧( i e ) 和有氧( o z n 2 - - - - 1 ：1 ) 条 件下的热裂解产物，结果表明：裂解主要产物为羧酸、醛、醇、烯和二烯。在无氧条件下，主要 产物相对百分含量随热裂解温度升高而降低。在有氧条件下，主要产物的生成量几乎不变。胡桃 油在较高温度下热裂解产物( 醇和醛) 增加，而其他类产物下降，但是羧酸量几乎不变。热裂解 时间影响产物的形成。 i d e m i 叫等研究了菜子油的热裂解行为，阐述了温度、气流量、蒸汽对产物的影响，并阐述了 不同物质的形成机理。菜籽油的转化率随温度升高而增加，而随转化率随气流量和蒸汽，油比增加 而降低。产物主要是c 4 和c 5 烃、芳香物质和q + 脂肪烃，还有( 4 的烯类物质。长碳链物质随气 流量和蒸汽油比增加而增加，但随温度升高而降低。c 2 - c 4 的烯类物质均随蒸汽，油和温度升高而 增加。在高温时，易形成芳香烃物质。 c h e n gz h e n g y i 【勰l 等进行了植物油热裂解的热动力学计算研究。 a l e n c a r 【矧等研究了棕榈油等的热裂解产物和油酸的热裂解行为。结果表明：含有油酸为主要 组成成分的甘油三酯热裂解形成环烃可能与油酸的9 1 0 位的双键环化作用有关。 9 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 5 本研究的目的、意义、内容和技术路线 1 5 1 研究目的和意义 由于人们健康意识的增强，动物脂肪因含有相对长碳链的饱和脂肪酸而成为副产品，为农 产品的精深加工及环保带来挑战。因此，采用高新技术，综合利用动物脂肪具有经济和现实意 义。 此实验使用不同脂肪酶水解鸡油，分析其水解产物，并研究得出脂肪酶水解鸡油的最佳水 解工艺；进而采用热裂解气质分析技术获得鸡油和鸡油酶解物热裂解产物特性和差异，反应生 成可进一步加工和利用的化合物。 1 5 2 研究内容 1 5 2 1 研究不同脂肪酶催化鸡油水解的产物类别及碳链长度的差异，并对水解鸡油效率高腊肪 酶进行水解工艺研究； 1 5 2 2 采用热裂解一气质分析技术研究鸡油和鸡油酶解物热裂解产物类别和碳链长度差异，探讨 水解作用对热裂解的影响。 1 5 3 研究技术路线 1 5 3 1 脂肪酶催化鸡油水解性质研究 不同来源脂肪酶一测定酶活力一水解鸡油一比较各种酶的水解能力一分析不同酶水解鸡油 产物一对比分析结果得出各脂肪酶水解鸡油产物种类及碳链长度差异一对i _ p o m o d - 3 4 p 脂肪酶 进行水解因素研究得出该脂肪酶水解晟佳工艺参数 1 5 3 2 鸡油和鸡油酶缮物的热裂解性质研究 鸡油和l p o m o d - 3 4 p 脂肪酶催化鸡油水解产物一不同温度分别进行热裂解一产物分析一得 出鸡油和酶解物热裂解性质一对比得出鸡油和酶解物热裂解产物特性一分析水解对熟裂解作用 中国农业大学硕 学位论文第二章脂肪酶水解鸡油产物及t 艺研究 2 1 引言 第二章脂肪酶水解鸡油产物及工艺研究 水解甘油三酯生成脂肪酸和甘油是油脂工业中相当重要的一部分。水解产物脂肪酸和甘油 广泛用于食品、化妆品和药品等工业。酶催化水解与化学水解相比具有专一性的优点，适于生 产特殊不饱和脂肪酸。而作为油脂重要组成部分的动物脂肪，由于人们健康意识的增强，动物 脂肪因含有相对长碳链的饱和脂肪酸而成为副产品。因此，通过酶催化水解加工以提高动物脂 肪的附加值具有重要意义。国内外关于动物脂肪水解的报道较少，盛梅、曹国民【柏。1 l 研究了脂 肪酶催化猪油和牛油水解的工艺，a d a m c z a k 等啤j 研究r h i z o m u c o r m i e h e i 和y a r r o w 如l 驴o l y t i c a 脂肪酶的性质间接研究了其水解牛油的性质。鸡油含有约6 0 的不饱和脂肪酸一j ，可作为生产 不饱和脂肪酸的来源。 本章对1 3 种商业脂肪酶的水解鸡油能力和水解产物进行分析，得出它们的产物差异，为进 一步加工提供指导，并对其中水解能力最强的酶进行水解工艺条件研究，得出其最佳水解工艺 条件。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验用酶 一 表2 1 实验酶制剂 ! 垫坦z ：! ! ! ! 暨e ! i ! 堡! 皇! 监竺罂 编号名称来源公司 2 2 2 主要实验试剂和材料 1 1 中国农业大学硕十学位论文第二章脂肪酶水解鸡油产物及t 艺研究 表2 - 2 主要实验试剂和材料 ! 塑! ! 丝! 塑竺盥! 些! 型塑g ! 坐翌! ! 型! ! 坐 试剂名称等级生产厂家 洼：其他试剂均为国产分析纯试剂 2 2 3 主要仪器设备 表2 - 3 主要仪器设备 ! 型：2 ：i 墼巴也婴型坚! g 罂! 名称及型号生产厂家 f a 2 5f l u k oh o m o g 幽f l u k o d s 盼3 多用途水褡恒温振荡器 3 2 0 型口h 计 s e n c or 系列旋转蒸发仪 循环水式多用真空泵s l y - i l l a l 2 0 4 型电子天平 普通层析柱 6 8 9 0 n - 5 9 7 3 n 气相色谱质谱联用仪 缸苏太仓市实验设备厂 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 上海申生科技有限公司 河南省太康教材仪器厂 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 内径2 6 e r a 长度5 0 c m 美国a l i g c n t 公司 2 2 4 脂肪酶活力测定m ( 1 ) 乳化液制各；n a c l 4 5 9 ，k h 2 p 0 4 0 1 9 ，甘油1 3 5 m l ，阿拉伯胶2 5 9 ，蒸馏水1 2 5 m l ， 加热溶解混匀。 ( 2 ) 底物制备：9 0 r a l 橄榄油和2 1 0 r a l 乳化液，1 0 0 0 0 r m i n 间隔均质9 r a i n ，每3 m i n 一次， 共三次。 ( 3 ) 反应条件：用移液管分别取5 m l 底物和4 m l 0 2 m ( p h 7 o ) 磷酸钠缓冲液于1 0 0 m l 锥形瓶中，添加酶0 0 1 9 ，3 7 反应3 0 m i n ( 转速1 8 0 f r a i n ) ，用1 5 m l 乙醇中止反应，以l 酚 酞为指示剂，用o 0 5 mn a o h 滴定。 ( 4 ) 酶活定义：l g 酶在3 7 c p h 7 0 条件下，脂肪酶水解脂肪，每分钟产生1 微克分子脂 肪酸的酶量是1 个脂肪酶国际单位。 2 2 5 鸡油皂化值测定f 4 5 j ( 1 ) 称取l g ，准确到0 0 0 5 9 的试验样品于锥形瓶中。用移液管将2 5 0 m l 氢氧化钾一乙醇 中国农业大学硕十学位论文第二章脂肪酶水解鸡油产物及1 = 艺研究 溶液加到试样中，并加入一些玻璃珠，连接回流冷凝管与锥形瓶，水浴加热( 9 0 ) ，煮沸( 煮 沸后开始计时) ，维持沸腾状态6 0 m i n 加0 5 m l 酚酞指示剂于热溶液中，并用标准体积盐酸溶 液滴定到指示剂的粉色刚消失。空白试验：按照以上的步骤说明，不加试样，用2 5 0 m l 的氢 氧化钾乙醇溶液进行空白试验。结果取三次测定的平均值。 t o 化僻( z ，) 一! ! 二：! ：i ! = ! 兰至垒：! 式中：厂空白试验所消耗的盐酸的盐酸标准滴定溶液的体积，m l v 广试样所消耗的盐酸标准滴定溶液的体积，m l ： c 一盐酸标准滴定溶液的实际浓度，m o l l ； l i r 试样的质量，g 。 ( 2 ) 盐酸的标定：准确称量基准试剂n a 2 c 0 3 r e ( g ) ( 分子量1 0 5 9 9 ) ( 2 8 0 c 烘2 b ) 0 1 3 9 左右，各用5 0 0 0 m l 蒸馏水溶解，滴加2 滴1 甲基橙指示剂，用h c i 溶液滴定溶液由黄色一橙 色( 终点) c x - a ( 2 1 一号产- 吉- ，0 0 0 ( t o o l l ) 2 2 6 鸡油脂肪酸组成分析【撕l 称取l g 鸡油加入1 5 m i7mk o h - 9 5 z , 醇溶液，在9 5 c 下冷凝回流反应4 h 加入1 5 m i 蒸馏水，用3 0 m l 正己烷分三次萃取出未皂化油脂，弃掉用6 mh a 将水溶液的p h 调为2 0 ， 然后用每次1 0 m l 无水乙醚萃出游离脂肪酸，共三次。在加下抽真空浓缩除去乙醚。向游离 脂肪酸中加入3 5 m l 5 1 2 s o 栅o h 溶液，在9 5 下冷凝固流反应1h 。随后用每次1 0 m l 正 己烷萃取3 遍，用无水n a 2 s o 除去痕量水，将萃取溶液在4 0 c 下蒸发浓缩至i m l ，待g c - m s 检测。 2 2 7 脂肪酶水解鸡油能力测定 称取鸡油加入质量相当的磷酸钠缓冲液( p h 7 0 ，0 0 5 m ) 经加热融化，加入对于鸡油含 量1 吐温一乳化剂，l c 0 0 0 r m i n 高速剪切2 0 m i n ，制备成1 ；1 乳化液。每个样品取1 0 9 上 述乳化液于2 5 0 m l 锥形瓶中，加入( 1 - 1 3 号) 酶粉含对映酶活力2 0 0 u 1 0 9 底物乳化液，空白 对照试验不加入酶粉。温度3 7 1 2 恒温水浴振荡器中( 1 8 0 i m i n ) 反应2 4 h 。反应结束后，取适 量反应液( 0 0 0 0 l g ) ，1 5 m l 9 5 乙醇中止反应，用0 0 5 mn a o h 溶液滴定，酚酞为指示剂水 解率= 酸价皂化值1 0 0 。 1 3 中国农业大学硕士学位论文 第二章脂肪酶水解鸡油产物及丁艺研究 2 2 8 脂肪酶水解鸡油产物分离检测i 辄4 7 1 取适量反应液经硅胶柱层析将酯和游离脂肪酸分离，经薄层层析分析按r f 确定含脂肪酸部 分，按所述脂肪酸甲酯化方法甲酯化，样品用于g c m s 检测。详细方法如下： ( 1 ) 硅胶柱层析 9 0 9 硅胶( 2 0 03 0 0 目) ，2 5 0 m l 石油醚( 6 0 - 9