（农产品加工及贮藏工程专业论文）脂肪酶水解鱼油富集DHA和EPA甘油酯的研究.pdf

脂肪酶水解鱼油富集d h a 和e p a 甘油酯的研究 摘要 天然鱼油中d h a 和e p a 一般是以甘油酯的形式存在，含量相对较低，保健 和医疗效果比较差。而d h a 和e p a 的甘油酯型易被人体消化吸收，性质稳定， 是保健品和药品的最佳产品型式。为增强d h a 和e p a 的保健和医疗效果，就须 提高d h a 和e p a 在甘油酯中的含量。 脂肪酶催化鱼油水解法是提高d h a 、e p a 在甘油酯中含量的一种很有效的 方法。本研究通过采用单因素和响应面试验设计，得到脂肪酶o f 水解鱼油的较 好的工艺参数：在油水比为1 ：4 、缓冲溶液p h 值6 5 、酶浓度2 0 m g g 油、反应 温度为3 5 的情况下水解2 4 h 后，产物中的d h a 和e p a 总含量可达6 1 4 8 ， 其中d h a 和e p a 含量分别为5 6 2 2 和5 2 6 。d h a 和e p a 甘油酯的理化性质 符合鱼油的一级标准。d h a 和e p a 甘油酯经硅胶柱层析分离和傅立叶近红外光 谱检测，结果表明产物中以甘油二酯为主，含量为6 4 3 2 ；其次是甘油三酯和 甘油一酯，含量分别为3 5 2 3 和0 4 5 。 通过对脂肪酶催化鱼油水解反应动力学的研究，发现该反应在动力学控制条 件下，基本符合m i c h a e l i s - m e n t e n 的单底物酶促反应动力学。通过对试验数据的 回归分析，求得了酶促鱼油水解的动力学参数，米氏常数：o 4 5 m o l l ，最大 反应速。= 0 1 5m o l s 。 差示扫描量热( d s c ) 分析表明，d h a 和e p a 甘油酯的热氧化过程与甘油 酯组成及脂肪酸组成都密切相关：微商热重( d t g ) 分析表明，d h a 和e p a 甘 油酯的热氧化过程主要发生在3 0 0 5 0 0 ，因此应当采取适当措旌避免d h a 和e p a 甘油酯热氧化的发生。利用f l y n n w a l l o z a w a 法和k i s s i g e r 法分别计算 出了d h a 和e p a 甘油酯的热氧化动力学参数，两种方法具有一致性。这都为预 测d h a 和e p a 甘油酯产品的货架期提供了可靠的理论依据。 关键词：黄鳍金枪鱼鱼油，d h a 和e p a 甘油酯，脂肪酶，水解 s t u d y 0 1 1c o n c e n t r a t i o no fd h aa n de p a g l y c e r i d e s b yl i p a s eh y d r o l y s i so f f i s ho i l a b s t r a c t d h aa n de p ae x i s ti nt h ef o r mo fg l y c e r i d ei nt h en a t u r a lf i s ho i l 。t h ec o n t e n to f d h aa n de p ai s r e l a t i v e l yl o w e r , s o h e a l t hc a r ea n dm e d i c a le f f e c t sa r e c o m p a r a t i v e l yb a d ，s i n c ed h aa n de p ag l y c e r i d e sw i t l ls t a b l en a t u r ea r ee a s i l y d i g e s t e da n da s s i m i l a t e db yt h eh u m a nb o d y ，t h e ya r et h eb e s tp r o d u c t so fh e a l t ha n d m e d i c i n e s i no r d e rt os t r e n g t h e nt h eh e a l t hc a r ea n dm e d i c a le f f e c t so f d h aa n de p a ， s o m em e a s u r e sm u s tb et a k e nt oi m p r o v ed h aa n de p ac o n t e n ti nt h eg l y c e r i d e s i ti sak i n do fv e r ye f f e c t i v em e t h o db yc o n c e n t r a t i n gd h aa n de p ai nn a t u r a l f i s ho i lb yl i p a s eh y d r o l y s i s t h eb e t t e rh y d r o l y s i sp a r a m e t e r sh a db e e no b t a i n e db y t h er e s p o n s es u r f a c ee x p e r i m e n td e s i g n a t i o n ，w h i c hw e r et h a tt h er a t i oo fw a t e rt oo i l i s4 ，b u f f e rs o l u t i o np h6 5 ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n2 0 m g go i l ，t h eh y d r o l y s i s t e m p e r a t u r ei s3 5 ，h y d r o l y s i st i m e2 4h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h et o t a lc o n t e n t o f d h aa n de p ai nt h er e a c t i v ep r o d u c tw a s6 1 4 8 ，d h aa n de p aw a s5 6 2 2 a n d 5 2 6 r e s p e c t i v e l y p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sm e a s u r e du pt o t h ef i r s t s t a n d a r do ff i s ho i l d h aa n de p a g l y c e r i d e sw e r es e p a r a t e db ys i l i c ag e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p ha n dw e r ed e t e c t e db yf o u r i e ri n f r a r e ds p e c t r a d i g l y c e r i d ew e r et h e m a i nc o m p o n e n t ，t h ec o n t e n to fw h i c hw a s6 4 3 2 t h ec o n t e n to ft r i a c y l g l y c e r o l s a n dm o n o a c y l g l y c e r o l sw a s3 5 2 3 a n d0 4 5 r e s p e c t i v e l y t h r o u g hs t u d yo nr e a c t i o nd y n a m i c so fh y d r o l y s i s ，t h er e a c t i o nb a s i c a l l y a c c o r d e dw i t ht h er e a c t i o nk i n e t i c so fe n z y m a t i cr e a c t i o no fo n l yo n es u b s t r a t e t h r o u g hr e g r e s s i o na n a l y s i s o fe x p e r i m e n t a l d a t a ，t h ek i n e t i cp a r a m e t e r so f l i p a s e c a t a l y z e dh y d r o l y s i so ft u n ao i lw e r eo b t a i n e d ，j r ( m = o 4 5 m o l l ，g m “= 0 1 5 m o l s t h ea n a l y s i so ft h ed i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) s h o w e dt h a tt h e r m a l o x i d a t i o np r o c e s so fd h aa n de p a g l y c e r i d e sw a sc l o s e l yr e l a t e dt ot h ec o m p o n e n t o fg l y c e r i d e sa n df a t t ya c i d s t h ea n a l y s i so ft h ed e r i v a t i v et h e r m o g r a v i m e t r y ( d t g ) s h o w e dt h a tt h et h e r m a lo x i d a t i o no f d h aa n de p a g l y c e r i d e sw 够h a p p e n e db e t w e e n 3 0 0 - 5 0 0 t h ec o r r e s p o n d i n gm e a s u r e ss h o u l db et a k e nt oa v o i dt h et h e r m a l o x i d a t i v ee m e r g e n c eo fd h aa n de p ag l y c e r i d e s t h ek i n e t i cp a r a m e t e r sw e r e c a l c u l a t e d u s i n gf l y n n - w a l l o z a w aa n dk i s s i g e re q u a t i o n sr e s p e c t i v e l y , w h o s e r e s u l t sw e r ec o h e r e n t t h e s ek i n e t i cp a r a m e t e r sw o u l dp r o v i d et h er e f e r e n c ef o r p r e d i c t i n gt h es h e l f l i f eo f t h ed h a a n de p a g l y e e r i d e s k e yw o r d s ：y e l l o w f mt u n ao i l ，d h aa n de p ag l y c e r i d e s ，l i p a s e ，h y d r o l y s i s l l 缩写 d g d h a d s c d t g e p a f t - i r g c m g p u f a r s m t a t g 论文中的缩写名词及其含义 全 称 d i g l y c e r i d e d o c o s a h e x a e n o i ca c i d d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y d i f f e r e n t i a lt h e r m o g r a v i m e t r y e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y g a s c h r o m a t o g r a p h y m o n o g l y c e r i d e p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y t h e r m a la n a l y s i s t r i g l y c e r i d e 中文 甘油二酯 二十二碳六烯酸 差示扫描量热法 微商热重法 二十碳五烯酸 傅立叶变换红外光谱 气相色谱 甘油一酯 多不饱和脂肪酸 响应面法 热分析 甘油三酯 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 本学位论文成果归广东海洋大学所有。 研究生签名：列鹂辫 劫口6 年5 日喀b j ，霜孙膨 臌加撒枷 指护 广东海洋大学硕士学位论文 第一章绪论 二p 碳五烯酸( e p a ，e i c o s a h e x a e n o i c a c i d ) 和二r 二碳六烯酸( d h a ，d o c o s a h e x a e n o i c a c i d ) 是水产生物中两种特有的n _ 3 型多不饱和脂肪酸( n - 3 p u f a ，n - 3p o l y u n s a t u r a t e df a t t y a c i d ) 。e p a 、d h a 的分子结构式如图1 1 。 e m e i 嘲a p 酬始咖l c a c 呻c 舱5 ，= 、，兰、曙= 、一，= 鬻、冒 c o 。h 僻w 咖| i i 霸哺f 雠恕两c 翌：s 篁2 ，2 气。，：。、，= 气。= = 、盏絮、 。 ) o h 图1 一l d h a 和e p a 的结构式 f i g1 - 1s t r u c t u r e f o r m u l a o f d h a a n d e p a 有关d h a 和e p a 的提取、富集、生理活眭及临床应用，很多科研工作者都进行 了大量的探索工作。目前对d h a 和e p a 的生理活性已经明确，它们不仅具有降血压、 消除疲劳、预防动脉粥样硬化和脑血栓、抗癌等生理活性，而且能显著地促进婴儿的 智力发育，改善大脑机能，提高记忆力，是生产预防心血管疾病和婴儿益智食品的良 好基料。 1 1d h a 和e p a 的生理功能和保健作用 1 1 1d h a 和e p a 对视力和大脑发育的促进作用【l 。1 d h a 是视网膜的主要组成部分。约占4 0 - - 5 0 。d n 和e p a 能提供视觉神经所 需营养及机能成分，故可防止视力下降，多数中老年患者服用后视力明显改善，补充 足够的d h a 对活化衰弱的视网膜细胞有帮助，对用眼过度引起的疲倦、老年性眼花、 视力模糊、青光眼、白内障等疾病有治疗作用。d h a 是大脑细胞形成发育及运作不 可缺少的物质基础。人的记忆力、思维功能都有赖于d h a 来维持和提高。大脑脂肪 中大约1 0 左右是由d h a 组成，缺少d h a 不仅感观功能衰退，还会影响记忆力与 思维能力，d h a 摄入量增加可提高人们的阅读能力和记忆的效果。补充d h a 可促进 脑细胞充分发育，防止智力下降、健忘、老年痴呆等。 d h a 对提高儿童智力有好处。联合国粮农组织和世界卫生组织早在1 9 9 5 年推荐 的膳食指南中明确规定【4 ，婴儿配方奶粉中必须含有d h a ，美、f 1 等发达国家己立 1 脂肪酶水解鱼油富集d h a 、e p a 甘油酯的研究 法规定必须将d h a 添加于各类婴幼儿食品中。 据中华预防医学会负责人介绍，研究表明【5 】，我国居民摄入的n 3 系列脂肪酸主 要是m 亚麻酸，d h a 和e p a 的摄入量非常有限，很多内陆地区居民膳食中几乎检测 不出d h a 和e p a 。因此，积极改善食物结构，增加含有d h a 、e p a 的海鱼产品的 摄入量十分必要。当然，对于那些食用海产品困难，又十分需要增加d h a 、e p a 的 人群，如早产儿，血甘油三酯高的成年人等，可以选择d h a 、e p a 补充荆。 1 1 2d h a 和e p a 与心血管疾病 根据国外最新的流行病学和临床实验提供的数据【6 】，d h a 和e p a 等n 3 型多不 饱和脂肪酸的摄取量和冠心病的发病率呈负相关，4 0 - - 8 0 岁的男性病例摄取较多鱼 肉可降低心脏猝死的危险。f r a n k 等1 7 1 对1 5 1 3 例冠心病患者进行了1 6 年跟踪研究， 比较摄取鱼类或d h a 和e p a 等1 1 3 型多不饱和脂肪酸较少的人群和较多的人群发生 冠心病和非致命性的心肌梗死的危险性。结果发现每周摄取的鱼类越多，相对危险度 越低。在英国对2 0 3 3 名恢复期心肌梗塞的患者研究发现，吃富含d h a 和e p a 等n - 3 型多不饱和脂肪酸的海鱼组死亡率明显低于不吃海鱼组【8 】。 l 。1 3d h a 和e p a 抑制血栓的形成 大量的人体和动物实验表明【9 0 1 ，d h a 和e p a 等n 一3 型多不饱和脂肪酸在体内经 过转化，可产生多种衍生物，具有抑制血小板凝集、增加血小板细胞膜流动性和改变 细胞信号作用，从而抑制血栓的形成。 1 1 4d h a 和e p a 降低甘油三酯和胆固醇 动物实验和临床研究表明，d h a 和e p a 等n 3 型多不饱和脂肪酸可有效地降低 血液中甘油三酯和胆固醇水平。d h a 和e p a 等n 3 型多不饱和脂肪酸不仅有效降低 严重高甘油三酯血症患者的甘油三酯；而且可降低餐后高甘油三酯血症，并可以有效 治疗混合型高脂血症【”】。 1 1 5d h a 和e p a 影响血浆脂蛋白胆固醇水平 高密度脂蛋白( h i g h d e n s i t yl i p o p r o t e i n ，h d l ) 可逆向转运胆固醇，因而具有抗动脉 粥样硬化的作用，而低密度脂蛋i ! i ( 1 0 wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，l d l ) 转运内源性胆固醇， 被认为是动脉粥样硬化独立的危险因子。研究表明，d h a 和e p a 等n - 3 型多不饱和 脂肪酸具有降低l d l 胆固醇和v l d l ( 极低密度脂蛋白) 胆固醇，增加h d l 胆固醇 的作用【1 2 1 。 1 1 6d h a 和e p a 的降压作用 降压实验表明，增加脂肪组织中的亚油酸不影响正常人的血压，而每增加1 的 a 亚麻酸则使平均动脉压下降0 6 7 k p a 。用含不同脂肪酸的饲料喂食自发性高血压的 幼鼠发现富含a 亚麻酸的饲料可使幼鼠舒张压比其它幼鼠低2 8k p a 【1 3 】。2 4 小时动 态血压监测显示，每天摄入3 6 5 9 d h a 和e p a 等n - 3 型多不饱和脂肪酸1 6 周，可使 收缩压下降0 9k p a ，舒张压下降0 6 8k p a 。d h a 和e p a 等n 3 型多不饱和脂肪酸 2 广东海洋大学硕士学位论文 的降压作用可能是降低内源性血管活性物质( 如去甲肾上腺素) 对血管的反应，也可能 是前列腺素的直接作用。 1 1 7d h a 和e p a 与动脉粥样硬化 多数实验研究显示，d h a 和e p a 等n 3 型多不饱和脂肪酸可以延缓动脉粥样硬 化的进程。日本一项流行病学研究结果表明，农村居民动脉粥样斑块数是渔村居民的 5 8 倍，且d h a 和e p a 等n 3 型多不饱和脂肪酸与颈动脉斑块数呈负相判1 4 1 ，n - 6 型多不饱和脂肪酸斑块数呈弱的正相关。一项尸检研究显示，爱斯基摩人血管内膜脂 质条纹和呈现的损害更少，且在低龄时期脂质条纹与内陆居民的区别更大【1 5 。脂肪组 织中的脂肪酸组成，可以客观的反映从食物中摄取的脂肪类型。a n g e r e r 等研究发现 冠状动脉病变的程度和脂肪组织中d h a 浓度和体重呈负相关。2 2 3 例经冠状照影证 实为冠心病的患者，每天摄入1 6 5 9 的d h a 和e p a 等n 3 型多不饱和脂肪酸，2 年 后结果表明n _ 3 型多不饱和脂肪酸的摄入减缓了冠状动脉粥样硬化的进程m 1 。 1 2 脂肪酶法富集d h a 和e p a 甘油酯的研究进展 d h a 和e p a 等n - 3 p u f a 在人体生物学中的重要功能己得到世人的共识。目前， 国际市场上的鱼油保健品，d h a 和e p a 的存在形式有三种：游离型，甲、乙酯型和 甘油酯型。在天然鱼油中，d h a 和e p a 是以甘油酯的形式存在，其相对含量比较低， 保健和医疗效果比较差，难以满足消费者的需要。为了提高d h a 和e p a 的保健和医 疗效果，众多研究者将甘油酯中的d h a 和e p a 转酯化或者水解转化为相应的乙酯或 者游离形式，然后再通过各种物理或者化学方法提高d h a 和e p a 的含量，以此来增 强d h a 和e p a 的保健和医疗效果。1 9 9 0 年美国f d a 的研究人员通过大量实验后， 发现d h a 和e p a 的甘油酯型、乙酯型和游离脂肪酸型在人体内消化吸收有差异。 i k u o 1 7 - 1 9 1 等研究的结果也表明，d h a 和e p a 乙酯型在人体中不仅消化和吸收比较困 难，而且可能存在安全隐患；游离型的d h a 和e p a 虽然易于被人体消化和吸收，但 是容易氧化生成对人体有害的物质，而且有酸味、口感不好，直接作为食用难以被人 们接受；d h a 和e p a 的甘油酯型不仅性质稳定、不易氧化、口感好、易被人体消化 吸收，而且是d h a 和e p a 的天然存在形式，因此d h a 和e p a 的甘油酯型是保健品 和药品的最佳产品型式。再者，随着人们生活水平的提高，消费者对天然鱼油甘油酯 型保健品中d h a 和e p a 含量低不再满足，期望提供安全性好，d h a 和e p a 含量高 的甘油酯型保健品。 海产鱼类中d h a 和e p a 的总含量在3 一3 0 之间。大型洄游性鱼类如金枪鱼、 鲣鱼等的d h a 和e p a 含量在3 0 左右，而一些中上层低值鱼类如鲐鱼、蓝圆黪等的 d h a 和e p a 含量在3 也o 。从海产鱼类中提取的天然鱼油，d h a 和e p a 基本都 以甘油酯的形成存在，其含量相对较低，如不进行浓缩富集，其医疗和保健效果并不 理想。目前，如何提高天然鱼油中d h a 和e p a 的含量是一个亟待解决的技术问题。 脂肪酶水解鱼油富集d h a 、e p a 甘油酯的研究 因此，为了增强鱼油产品的竞争力和满足人们的物质文化生活需要，加强保健鱼油的 技术丌发力度，扩大保健鱼油的生产就显得十分必要。 d h a 和e p a 甘油酯是未来鱼油保健品及药品的主要发展方向。d h a 和e p a 甘 油酯主要从海洋生物( 如金枪鱼、沙丁鱼、鳕鱼等鱼油) 中提取获得，但是鱼油中 d h a 、e p a 含量较低，采用化学或物理方法很难将其中的d h a 、e p a 含量大大提高。 近年来，利用微生物酶富集d h a 和e p a 的方法逐渐受到人们的重视。与物理和化学 方法相比，酶法有一系列的优点，首先，酶催化效率高，在大规模的生产中用量很少， 且固定化酶能多次的重复利用；再则，酶催化反应在温和的p h 、温度和压力下进行， 这对不稳定的长链d h a 和e p a 来说尤为重要。在通常的理化反应条件下长链d h a 和e p a 中顺式结构双键被氧化、顺反异构、双键的移位和聚合反应都易发生；最后， 酶催化反应能降低能量的消耗，这在能源短缺的时代是非常必要的。进一步说，出于 酶催化反应能在无溶剂条件下进行，可以避免庞大的设备和繁杂的工艺流程，而操作 人员也能在安全的条件下工作。因此，利用酶工程技术将d h a 和e p a 富集在甘油酯 上是种非常有效的方法。脂肪酶法富集d h a 和e p a 甘油酯又分为脂肪酶选择性水 解、脂肪酶选择性酯交换和脂肪酶选择性酯化等【2 0 】。 1 2 1 脂肪酶选择性水解法 通常认为鱼油的甘油三酯中2 位上连接着d h a 和e p a 等n 3p u f a ，l 、3 位上 连接着饱和的和低度不饱和脂肪酸，这样其分子由上而下的三个酯键( 1 、2 、3 ) 有 空间差异。有的脂肪酶具有1 、3 位置选择性，利用酶的位置选择性水解掉l 、3 位上 的饱和的或单不饱和的脂肪酸，从而使n 3p u f a 富集在甘油酯的2 位上。有的脂肪 酶虽然对甘油酯无位置选择性，但对酰基碳链有选择性，就可水解掉任何位置的非 n - 3p u f a 脂肪酸，得到富含n - 3p u f a 的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物。 b o t t i n o 等1 2 l j 人认为脂肪酶对酰基碳链的选择性与鱼油中n - 3 p u f a 对脂肪酶水解的抵 抗作用有关。不饱和脂肪酸分子中存在碳碳双键和全顺式构型，引起整个链的弯曲， 因此在甘油酯分子上不饱和脂肪酰中靠近酯键的最末端甲基对脂肪酶的进攻形成空 间阻碍。d h a 和e p a 分子中分别有六个和五个双键，导致全顺式构型的整个链高度 弯曲，加强了这种空间阻碍作用，使得脂肪酶难以接触到d h a 和e p a 与甘油形成的 酯键，故脂肪酶对甘油酯上的d h a 和e p a 酰基作用较弱。但饱和的和单不饱和的脂 肪酰在空间上对酶分子不存在这样的空问阻碍，因而很容易被水解掉。机理见图l - 2 。 一0 h 屿2 e 伽p u f a + r i c o o h + r ：c o o h 图l - 2 脂肪酶选择性水解的机理 f i g1 - 2m e c h a n i s mo f l i p a s e - c a t a l y z e ds e l e c t i v eh y d r o l y s i s 4 l 薹一 厂 广东海洋大学硕士学位论文 利用脂肪酶水解法富集d h a 和e p a 甘油酯，国外已在2 0 世纪9 0 年代开展了大 量的研究工作，我国是在2 0 0 0 年后才有资料报道这方面的研究。但是到目前为止， 还没有高含量的d h a 和e p a 甘油酯产品上市。 通过脂肪酶的选择性水解来富集d h a 和e p a 甘油酯，关键是要筛选出具有良好 选择性的脂肪酶和控制好水解过程参数，以防止甘油酯的完全水解。w a n a t m d a r a 等i 丑j 人对多种商业化的脂肪酶进行筛选，发现柱形假丝酵母脂肪酶( c a n d i d ac y l i n d r a c e a l i p a s e ) 水解富集d h a 和e p a 的效果最好，可使海豹油中d h a 和e p a 含量提高至 4 3 5 ，使鲱鱼油中d h a 和e p a 含量提高至4 4 1 。t a n k a l 2 3 + 2 4 等人在筛选六种脂肪 酶的选择性水解金枪鱼油的能力中发现也是柱形假丝酵母脂肪酶水解富集d h a 和 e p a 的效果最好，甘油酯中d h a 含量增加了3 倍，而其它五种酶，并没有使d h a 含量明显增加。s h i m a d a 等 2 5 - 2 7 1 用四种脂肪酶选择性水解富集e p a ，发现通过高度水 解来富集鱼油中的e p a 是困难的。h l l r l 2 8 1 等人在研究中阐述了脂肪酶对s n 一1 、3 位的 特殊选择性的重要性。为了增加选择性水解富集d h a 和e p a 的效率，研究者采用了 各种办法，s h i m a d a t 2 9 3 0 等采用逐步酶水解法，第一步水解后，用物理的方法除去游 离脂肪酸，剩余的甘油酯进一步用脂肪酶在同样的条件下再水解，甘油酯中d h a 和 e p a 含量可增加至5 7 5 ，得率为1 6 3 。s u n 等川人以从鲑鱼内脏中提取的鱼油为 原料，用6 种脂肪酶催化水解富集d h a 和e p a 甘油酯，结果发现来自洋葱假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sc e p a c i a ) 和假丝酵母( c a n d i d ar u g o s a ) 脂肪酶的富集效果比较好， 可使原料鱼油中d h a 和e p a 含量增加两倍。o k a d a 等1 32 1 人用假丝酵母( c a n d i d a r u g o s a ) 脂肪酶选择性水解沙丁鱼油6 h ，e p a 和d h a 在甘油酯中含量分别由2 6 8 6 和1 3 6 2 增加至3 4 ，4 5 和2 8 0 2 。k o 等【3 3 】人利用表面活性包裹的假丝酵母( c a n d i d a r u g o s a ) 脂肪酶在水油两相中对金枪鱼油进行选择性水解，结果甘油酯中的n - 3 p u f a 含量由原来的2 6 4 增加到4 9 。8 ，d h a 含量由原来的1 9 1 增加到3 8 9 0 o 。 在我国，石红旗等1 3 4 j 人研究了以国产解脂假丝酵母( c a n d i d ar u g o s a ) 脂肪酶在 适宜的条件下水解鱼油，制备了的富含d h a 和e p a 的甘油酯产品，d h a 和e p a 含 量分别为3 4 0 和1 3 9 ，总含量为4 7 9 ，d h a 甘油酯产品经高效液相色谱分离、 红夕 光谱分析确证为甘油酯混合物，包括单甘油一酯( m g ) ，甘油二酯( d g ) 和甘油 三酯( t g ) 3 种形态。吴可克等【3 5 j 人以鳕鱼油为原料，研究了国产假丝酵母( c a n d i d a r u g o s a ) 脂肪酶的选择性水解条件，结果表明在适宜条件下鱼油中的d h a 和e p a 含 量由原来的7 9 7 5 和1 2 0 1 6 增加至2 9 3 7 和2 3 2 6 。吴可克等【3 6 】人还以深海鱼油 为原料，脂肪酶为催化剂，尝试了搅拌式反应器、渗透膜反应器、中空纤维式反应器 对鱼油的选择性水解反应的影响，结果表明带有固定化酶的搅拌式反应器对酶促鱼油 部分水解反应为最适反应器。王运吉等【3 7 】人以聚氨酯泡沫为载体，采用固态培养的方 法固定化r h i z o p u s c h i n e n s i s w z h - 8 细胞，研究了固态培养条件和固定化胞内脂肪酶的 性质及其在选择性水解鱼油富集n - 3 多不饱和脂肪酸( n - 3 p u f a ) 的应用，结果表明： 脂肪酶水解鱼油富集d h a 、e p a 甘油酯的研究 在最佳条件下，固定胞内脂肪酶与非固定化的自由菌丝胞内脂肪酶相比，前者水解活 力提高了2 5 以上；p h 和热稳定性也显著提高；半衰期为8 3 6 h ；酶法选择性水解鱼 油，n 一3 p u f a 由2 7 提高到5 3 9 上。郑毅等3 列人通过对5 种不同来源脂肪酶的筛 选，以来源于米曲霉脂肪酶为最佳酶种，在该酶的最佳水解鱼油的条件下，鱼油中 e p a 和d h a 分别由3 0 和4 3 提高到9 o 和1 6 5 。 1 2 2 脂肪酶选择性酯交换法 脂肪酶选择性酯交换法是通过选择不同活力的脂肪酶，使鱼油中的甘油酯与游离 的r t - 3p u f a 、醇或另酯发生的酰基交换反应，结果使鱼油中的n - 3p u f a 较多的分 布在甘油酯中，达到富集的目的 3 9 , 4 0 。酯交换可分为三个过程：酸解、醇解、酯酯交 换，反应的机理见图1 3 。 广一o c o r lr p u f a 卜一p u f a + n - 3p u f a i * - 一p u f a + r 1 c o o h 十r j c o o h l o c o r 2 l p u f a 广o c o r l 广一o h t - p u f a+ r o h ；= 2 卜_ p u f a + r l c o o r + r 2 c o o r l o c o r 2 l o h 厂o c or l 广一p u f a 卜_ p u f a十r ，c o o r ；二二! 卜一p u f a + r i c o o r ，+ r 2 c o o r l o c o r 2l p u f a 图1 - 3 日目肪酶选择性醑交换机理( r 为p u f a ) f i g1 - 3m e c h a n i s mo f l i p a s e - c a t a l y z e ds e l e c t i v ee s t e r e x c h a n g e 酸解富集是利用脂肪酶的选择性将连接在1 、3 位的饱和脂肪酰基和单不饱和脂 肪酰基与高浓度的n - 3p u f a 发生酰基交换作用，从而将n 3p u f a 富集在甘油酯上。 t a k a s h i 等【4 l l 在底物比6 ：1 ( n - 3p u f a ：鱼油) 、固定化脂肪酶3 0w t 、水分含量5w t 的条件下，经酸解富集甘油酯中小3 p u f a 含量增至6 2 。n 粕e 【4 2 1 等在利用d h a 酸解反应中发现鱼油中e p a 含量在前5 h 是下降的，而d h a 含量在正常酸解反应中 是增加的，可能是由于鱼油中e p a 被d h a 所取代而达到一个新的平衡。为增加反应 的效率，y a m a n e 等 4 a l 采用两步酸解法，首先在超临界c 0 2 中进行3 h ，然后在真空下 进行5 - 2 4 h ，这样可使甘油二酯的含量减少；通过一套由水套式填充柱和底物混合器 ( 温度保持在1 0 c 或2 00 c ) 中间由管道连接组成的循环装置可从反应混合物中除去 结晶的饱和和单不饱和的脂肪酸，从而提高n 3p u f a 的含量。n o z o m i 等m 】还研究 了将酶水解和酸解联合应用富集n - 3p u f a 中，认为将n - 3 p u f a 可以富集到一些有价 值的植物油中，生产出具有更高利用价值的构造脂质。在酸解反应中，水分含量和酶 活性是影响反应效率的两个重要参数。如果底物中水分含量太高，酸解会向水解的副 反应方向进行：另一方面如果水分太低，它又会影响酶活性。这种双重效应使得酸解 6 广东海洋大学硕士学位论文 反应将n 3p u f a 富集在甘油酯中的效率比较低，这是酸解反应的一个最大缺点。虽 然酸解富集可以将甘油酯中n 3 p u f a 的含量提高到5 0 左右，但是需要较高浓度的 n - 3p u f a 为前提。因此醇解富集为提高甘油酯中n 一3 p u f a 的含量提供了另外一个技 术途径。 醇解富集n 3 p u f a 的机理和水解一样，利用脂肪酶的1 、3 位置选择性，使连接 在1 、3 位的饱和脂肪酰基和单不饱和脂肪酰基与一些短链的脂肪醇发生酯化作用， 从而将n 3 p u f a 富集在甘油酯上。h a r a l d s s o n 等【4 5 】在1 0 脂肪酶、一定量的乙醇、 2 0 和反应2 4 h 的条件下，甘油酯中n 3 p u f a 的含量增至5 0 左右，e p a 和d h a 的回收率分别是9 0 ：f f l8 0 。w a t a n a b e 等【4 6 】认为脂肪酶在定量的乙醇中可能会失 活，为了避免这种情况发生，采用逐步加入乙醇的方法，第一步醇解在4 0 、1 3 量 的乙醇、4 固定化脂肪酶的条件下反应l o h ，乙醇被消耗，3 3 的金枪鱼油被转化为 相应的酯；第二步，加入剩余的乙醇，反应3 6 h ，经过逐步醇解9 5 的金枪鱼油被转 化为相应的酯。在醇解反应中，水分含量和脂肪醇的类型是影响醇解效率的两个关键 因素。l i 等【4 7 】人对十种醇进行醇解筛选，发现异丙醇和乙醇用于醇解最合适，也有 研究者认为月桂醇最合适。 酯酯交换反应是利用脂肪酶选择性催化甘油酯中1 、3 位的酰基与n 一3 p u f a 的乙 酯发生酰基交换反应，得到n 一3 p u f a 含量更高的甘油三酯。目前关于这方面的报道 还很少。 1 2 3 脂肪酶选择性酯化法 乩n - 3 p u f a 和l i p a s e ，h - - o c h o r l2 2 2 = 2 = 2 2 2 2 = 卜- u h l o c o r 2 u 油 l - 甘油一酯 1 、3 h 油二酯 醚位怯o r ，罢篓肇o c o r o c 1 ：ll1 2 酯 峭，；二详墙 广_ 一o c 0 r 2 l o c o r l i 一o c o r 3 图1 4n 3 p u f a 和甘油的脂肪酶催化酯化机理 f i g1 - 4m e c h a n i s mo f l i p a s e - c a t a l y z e de s t e r i f i e a t i o no f n - 3 p u f aa n dg l y c e r o l 脂肪酶选择性水解法和脂肪酶选择性酯交换法由于受天然鱼油中n 一3 p u f a 含量 脂肪酶水解鱼油富集d h a 、e p a 甘油酯的研究 低的限制，使得n 3 p u f a 在甘油酯中的含量仍然得不到较大提高，因此脂肪选择性 酯化就成为提高n 3 p u f a 在甘油酯中含量的一个新的重要技术途径。脂肪酶选择性 酯化是指脂肪酶选择性的催化游离脂肪酸中n - 3 p u f a 与甘油反应生成甘油酯，而 n 一3 p u f a 富集在甘油酯分子上，从而达到富集的目的。这种方法一般先使鱼油完全水 解，浓缩富集制得高纯度的n 3 p u f a ，再在脂肪酶的催化下与甘油发生酯化反应【4 s j 。 利用此法可得到n - 3 p u f a 含量达7 0 以上的甘油酯。酯化反应机理见图1 4 。y h 等1 4 9 - 5 q 研究在酶催化酯化反应中强调使用有机溶剂的重要性，选择合适的有机溶剂体系可为 底物提供均一的系统，改变酶分予对底物的选择性和亲和力，产生各种各样的物理化 学效应。“等”2 j 对甘油和n 一3 p u f a 在有机溶剂体系中的酯化反应进行了深入研究， 脂肪酶i m 6 0 的酯化度达到了9 2 4 ，由于该酶具有l 、3 位置选择性，产物主要以 甘油二酯为主，而甘油三酯含量较少。c e r d a n 等 5 3 , 5 4 在对脂肪酶p s 、i m 和4 3 5 进行 催化合成研究中发现，脂肪酶4 3 5 的酯化度达到了9 5 以上，该酶具有宽广的专一性， 产物中甘油三酯的含量达到9 3 5 ，g c 分析n - 3 p u f a 的含量达到7 0 以上。h e 等 s 5 1 对多种脂肪酶进行酯化反应筛选，发现来源于染色粘性菌( c h r o m o b a c t e r i u m l l s c o s u r l l ) 的脂肪酶酯化富集的效果最好，在异辛烷体系和最佳工艺5 水( g 甘油) 、 底物比l o ：1 ( g g ) 、酶4 0 m g 、5 0 反应4 8 h 条件下酯化率为9 4 3 。h a r a d s s o n 等1 5 6 】 在无溶剂系统中进行酯化反应富集，添加1 0 的c a n d i d aa n t a r c t i c an o n r e g i o s p e c i f i c 脂肪酶，在真空、6 5 下反应2 4 h ，n - 3 p u f a 的酯化率为9 7 ，若反应时间延长为 7 2 h ，酯化率可达1 0 0 。r o s u 等i ”j 认为p s e u d o m o n a s 脂肪酶对d h a 有较好的选择 性，将该酶固定在碳酸钙粉上，在真空条件下反应5 h ，d h a 的酯化率为9 0 。体系 中水分含量影响着反应的平衡和酶的活性，因为水是反应的产物，大量水的生成又会 导致已富集了n 3 p u f a 的甘油酯重新发生水解，分子筛的加入可以有效除去多余水 分提高酯化率。影响酯化反应的因素较多，为更好的控制反应过程参数，l i n d e r 等 s s l 利用响应面优化方法对酶法合成的过程参数进行了优化，在最佳的因素水平组合下， 酯化度达到了9 7 。以上的研究都表明酶促合成法很容易将1 1 3 p u f a 富集到甘油酯 中，酯化度可达9 0 以上，甘油酯中n - 3 p u f a 的总含量可达7 0 以上。 1 2 。4 小结 脂肪酶选择性酯交换和脂肪酶选择性酯化，这两种方法反应的前提是需要高浓度 的d h a 、e p a 做底物，而高浓度的d h a 、e p a 需要通过其它物理或者化学方法富集 得到，生产工序繁多，操作复杂，生产成本较高，而且容易有有机溶剂残留。脂肪酶 选择性水解法可以克服以上两种方法的缺点，其操作简单，投入设备少，只需要脂肪 酶的一步水解就可以使甘油酯中的d h a 和e p a 达5 0 以上，能够满足保健鱼油的要 求，而且生产成本较低。因此脂肪酶选择性水解富集d h a 和e p a 甘油酯是一种既实 用又有效的方法。