（农产品加工及贮藏工程专业论文）黑大豆皮中色素的提取纯化、结构鉴定及其性质的研究.pdf

摘要 摘要 黑大豆在我国北方山区分布广泛，具有绝对的资源优势，而且栽培面积还在不断的扩大。 黑大豆皮在化妆、保健食品加工方面有着广泛的用途。有研究表明：黑大豆皮中的花色苷具 有抗氧化和清除自由基功能。本试验以东北农业大学大豆研究中心提供的黑大豆为原料，探 索黑大豆皮中的花色苷的提取、分离工艺，并对其进行结构分析研究，为黑大豆皮进一步广 泛开发利用提供科学依据，以促进黑大豆皮的利用价值。 本试验以黑大豆皮作为研究对象，对其花色苷化合物进行了提取工艺研究。采用溶剂法 与超声波相对比的方法对提取各因素进行了单因素条件试验和正交试验。 在溶剂法中，对p h 值，料液比进行单因素试验，通过控制提取温度、提取时间、溶剂 浓度，以吸光值为指标，采用三因素三水平正交试验确定最佳的提取条件，确定了试验最优 提取条件为：最佳p h 值为4 - 6 ，料液比为l ：4 0 ，溶剂浓度为6 0 ，提取时间为l 小时，提 取温度为6 0 ，得到的提取液稀释到2 0 0 m l ，其吸光值为0 8 6 5 。 在超声波法中，通过控制超声功率，超声时间、溶剂浓度，料液比，以吸光值为指标， 采用四因素三水平正交试验确定最佳的提取条件，确定了试验最优提取条件为：溶剂浓度 4 0 ，超声功率6 0 0 w ，料液比l ：3 0 ，超声时间4 0 r a i n 。得到的提取液稀释到2 0 0 m l ，其吸 光值为0 7 9 5 ，可知，溶剂法提取的效果比超声波法要好。 在提取物分离工艺中，引入了大孔吸附树脂、s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶柱色谱技术。 通过对树脂种类的筛选、影响吸附和解吸因素的研究，建立了大孔树脂纯化黑大豆皮提 取物的工艺：选用a b 8 大孔吸附树脂为吸附剂，分离黑大豆皮中的花色苷较适宜的吸附条 件为：流速2 m l m i n 、浓度0 0 7 4 m g m l 、p h 为6 左右；较适宜的解吸条件为：洗脱剂为 6 0 0 6 乙醇溶液，流速为2 m l m i n 。以此工艺绘制的洗脱曲线结果表明，采用此纯化工艺取得 较理想效果，洗脱峰集中，对称性好，无明显拖尾现象，其吸附率为8 0 0 , 6 ，解析率为8 0 。 聚酰胺纯化黑大豆皮色素，浓度为0 0 8 6 m g m l ，5 0 0 , 6 乙醇水溶液，流速为2 m l r a i n ，p h 为6 左右，洗脱效果较好。其吸附率为6 0 0 , 6 ，解析率为7 0 0 , 4 。 综上所述，本实验采用大孔树脂法对黑大豆皮中的花色苷进行纯化。 用s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶柱色谱对花色苷进行分离，用6 0 甲醇溶液进行洗脱，洗脱流速 为l m l m i n ，通过t l c 、h p l c 检测，合并相同组分，得到化合物；t l c 和h p l c 检测， 检验了该物质的纯度；运用紫外、核磁共振波谱学，结合化学定性鉴别的方法，对化合物进 行了结构鉴定，确定该物质为3 半乳糖矢车菊色素。 对得到的花色苷进行酸法和酶法水解进行比较，在酸法水解中水解温度为9 0 ，水解时 间3 0 m i n ，料液比l ：3 0 ，盐酸乙醇溶液浓度1 5m o i l ，水解率为8 0 3 2 。在酶法水解中， 最佳组合为水解时间6 0 m i n ，加酶液浓度3 0 t j e d m l ，p h 4 5 ，温度6 0 ，水解率为9 3 2 3 得 到的结论是酶法水解的效果好。 i 东北农业大学工学硕士学位论文 。i l i i !p m , , 量量曼曼曼鼍暑鼍量置量皇量舅皇葛舅詈量量量皇墨 而且对苷元进行了纯化的研究，大孔树脂纯化苷元，上样液的浓度为o 1 l m g m l ，吸附 流速为2 m l m i n , 解析流速为2 m l m i n ，6 0 的乙醇进行解析，径高比为l ：2 ，其吸附率为8 0 ， 解析率为7 2 。聚酰胺纯化苷元上样液的浓度为o 0 6 5 m g m l 。吸附流速为2 m l m i n , 解析流 速为2 m l m i n ，6 0 的乙醇进行解析，径高比为l ：2 ，其吸附率为6 8 ，解析率为7 1 。所 以选择大孔树脂对苷元进行纯化。 根据以上的纯化条件，得到苷元样品用h p l c 和标准品比对，该物质为矢车菊苷元。 同时还研究了金属离子对黑大豆皮色素的影响，采用不用浓度的c a 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 、f 矿 对色素进行试验，c a 2 + 对色素的有一定的影响，z d + 、c u2 + 对色素的影响不大，f e 3 + 对色素有 影响在食品加工时应避免f e 3 + 与接触。 还对其黑大豆皮中的色素进行了抗氧化行的研究和其他几种大豆皮进行比较，其抗氧化 行很好。 关键词：黑大豆；花色苷；分离；结构鉴定 i i a b s t r a c t t h e e x t r a c t i o n ，r e f i n d m e n t , s t r u c t u r a l i d e n t i f i c a t i o na n dp r o p e r t yo f a n t h o c y 久n i n sc o 巾o u n di nt h ec o a to f b l a c ks o y b e a n a b s t r a c t t h eb l a c ks o y b e a n , w h i c hi sp l a n t e dm o r ea n dm o r en o w , i sa ni m p o r t a n tp l a n tr e 默) l l r c ea n d c x i s t l 甜i nm o u n t a i n o u sa 陀ai nn o r t ho fo u r c o u n t r y i ti sw i d e l yu s e df o rt h ep l d 0 0 5 5o fc o s m e t i c a n dh e a l t hc a r ef o o d , i ti sr e p o r t e dt h a tt h ea n t h o e y a n i n si nt h ec o a to f b l a c ks o y b e a nh a st h ea b i l i t y o f a r a i o x i d a n ta n ds c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a l s t h i se x p e r i m c n tu s e dt h ec o a to f b l a c ks o y b e a na s m a t e r i a l ，i no r d e rt oe x p l o r e dt h ep r o c e s so fe x t r a c t i o n , p u r i f i c a t i o na n d 咖蛐l 髓ji d e n t i f i c a t i o no f t h ea a t h o c y a n i m a l lt h i sd o n ei sa i m e df o rp r o v i d i n gt h e o r e t i c a lb a s i sa n ds o m es c i e n t i f i cm e s s a g e f o rd e v e l o p i n ga n du t i l i z i n gb l a c ks o y b e a nn 塔0 堋略e t h em e t h o d st h a tt h ed u a lw a v e l e n g t hs p e c t r o p h o t o m e t r ya n dh p l c 。w e 旭e s t a b l i s h e df o rt h e q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no ft h ea n t h o c y a n i n si nt h ec o a to f b l a c ks o y b e a r li ti sm a d ec e r t a i nb y s p e c t r u ms c a n n i n gt h a tt h ee x p e r i m e n t a le o n d i t i o mo f d u a lw a v e l e n g t hs p e c l r o p h o t o m e t r yw e q ea s f o l l o w , d e t e c t i o nw a v e l e n g t h5 2 5 n m i ti sp l 州t h a tt h i sm e t h o dw a sa b l et oo v e r c o m ef i l e d i s m r b a n c eo f t h es m m ga b s o r b a n c eo fs o l v e n tj _ l p l cw a sa p p l i e dt oq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f t r i g o n e l l i n ei np u m p k i nf l e s l lt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e l ea sf o l l o w s , t h ea g i l e n t - 11 0 0c 1 8 c o l u m n , m o b i l ep h a s em e t h a n o l ：o 4 p h o s p h o r i ca c i d ( 5 5 ：4 5 ) , f l o wr a t e1 0 m l m i n , a n dd e t t c c t i o n a g i l e n t - g 1 31 4 au vd e 抚圮! t i d n i nt h i se x p e r i m e n tt h ep r o c e s so fa n t h o c y a n i n se x t r a g t i o ni se x p l o r e d n 虻a n t h o c y 蕊n si n c o a to f b l a c ks o y b e a nw a se x t r a c t e db yu l t r as o n i cw 绷a n da l c o h o le x 乜a c t i o i lt h eb e s tm e t h o do f a l c o h o le x t r a c t i o nw 啪o b t a i n e d , n a m e l ye x t t a c r f o rl hb yu s i n g6 0 e t h a n o ls o l u t i o na t6 0 。c w i t ht h em a t e r i a lr a t i oo f1 ：4 0 ( g m 1 ) s t i l ls t u d i e dt h ei n f l u e n c eo ft h em e t a l si o nu t m nt h eb l a c k s o y b e a as k i n i nt h i se x p e r i m e n t , t h em a c m p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i na n dc h r o m a l o g r a p i d cm c t l l c ) d sw c r c a p p l i e dt o t h ep r o g e s $ o fp u r i f i c a t i o n t h et e c h n o l o g i e sw e r ee s t a b l i s h e db yt l l ec h o o s eo f m a c r o p o r o u sa d s o l - p t i o nr e s i n , t h er e s e a r c ho f e f f e c t s0 1 1a d s o r p t i o na n de l u t i o r lt h ea p p r o p r i a t e m d i s s e r t a t i o nf o rt h em a s t e r sd e g r e ei ne n g i n e e r i n g c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ，a b - 8m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n ，p h = 6 ，e l u t i o ns o l v e n t6 0 a l c o h o ls o l u t i o n , e l u t i o nf l o wr a t e2 5 m l m i n n e p u r i f i e de x 仃a c f i o nw a se x w a c t e db ye t h y la c e t a t e t h ee t h y la c e t a t ee x t r a c t i o nw a sm i x e d w i t hs i l i c ag e l 。d r i e di nv a c u u ma n de n c a s e di nc o l u m n 1 1 1 ee l u t i o ns o l u t i o nw a se x a m i n e db y p a p e rc h r o m a t o g r a p h y t h eh y d r o l y s i sp a r to ft h ee l u t i o np u r i f i e db ys i l i c ag e lw a sd e t e c t e db y h p l c t h es e p h a d e xl h - 2 0c o l u m nw a su s e df o rp u r i f i c a t i o no ft h eh y d r o l y s i sp a r t ，6 0 a l c o h o l w a sc h o s ea se l u t i o ns o l v e n t ，a n de l u t i o nf l o wr a t ew a s1 0 m l m i n 。l a s t l y , w ed e t e r m i n e dt h ep u r i t y o ft h ec o m p o u n d sb ym e l t i n gp o 破t e s t , t l ca n dh p l c ，n l ec o m p o u n d sw e 佗i d e n t i f i e db yu v a n dn m rm e t h o d s i ti sm a d ec e r t a i nt h a ti ti st h ec y a n i d i n e 一3 - g a l a c t o s i d e 1 1 1 ec o n c l u s i o nc a r r i e do nt h es o u l m e t h o da n dt h ee 1 1 z y m em e t h o dw a t e rs o l u t i o nt oc a l t y0 1 1a c o m p a r i s o nt ot h ea n t h o e y a n i n sf o rg e t , g e ti st h ee n z y m em e t h o dw a t e rt os o l v ew e l l ，a n dt ot h e c y a n i d i n et h er e s e a r c ht h a tc a r r i e do nm i n i n gp u r e l y ，g e tt ot 哪p u r e l yo fc o n d i t i o n , i $ et h e 玎? l c a n ds t a n d a r da r t i c l er a t i ot o ，t h a tm a t e r i a li sc y a n i d i n e i t ss t i l l d y ei nt h ec o a to fb l a c ks o y b e a nc a r r i e do na l la n t i - t oo x i d i z et og oo ft h er e s e a r c h a n do t h e raf e ws o y b e a ns k i n sc a r r yo nac o m p a r i s o n , i t sa n t i - o x i d i z e st og ov e r yg o o d k e y w o r d s ：t h eb l a c ks o y b e a n ；a n t h o c y a n i n s ；p u r i f i c a t i o n ；i d e n t i f i c a i t i o n c a n d i d a t e ：t e n gx u e f e n g m a j o r ：a g r i c u l t u r a lp r o d u c tp r o c e s s i n g s u p e r v i s o r ：p r o f x uy a q i n 研究生学位论文独创声明使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 翅遗直墓丝噩要挂型直蛆数：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：万孽毫群 日期：2 彩年月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：滕学霹 日期：如罗年加幻日 导师 签名：稻i 浆秀 日期：伽罗年月弘日 引言 1 引言 随着科学技术的发展和人类对自身健康和重视，人们发现许多合成色素对人体极有害，甚至 致癌，因此合成色素作为食品添加剂的用量越来越少，甚至禁止使用，天然色素使用安全，且具 有一定的营养和药理保健作用倍受人们的亲睐，开发天然食用色素对保障人们的健康及食品工 业的发展具有重要意义。但目前我国色素的生产和研究与国外相比存在很大差距，成本较高、 效率低等现象，因此我们应该寻找出简单、方便的工艺、方法来提高效率节约成本，实行更大 的经济效益。 花色苷是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，属于花色苷化合物，也是植物的主要呈色物 质。自然条件下游离的花色苷极少见，而常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿 拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷如图1 1 ，花色苷中的糖苷基和羟基还可以与一个或几个分子的 香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸等芳香酸和脂肪酸通过酯键形成酰基化的花色苷，己 知天然存在的花色苷有2 5 0 多种，存在于2 7 个科 7 3 个属的植物中( a n n a m a r y j u , de t c1 9 9 7 ) 。 黑大豆系豆科植物大豆的黑色种子，黑大豆是我省的特产，蛋白质含量居其它豆类之首，不仅富 含人体所需的1 8 种氨基酸、维生素和微量元素等，其有滋补强身、消炎解毒等功效。此外黑大 豆皮中含有丰富的花色苷类，其主要成分为飞燕草瑚萄糖苷、矢车菊素3 葡萄糖苷和 矢车菊素3 半乳糖苷( m y o u n g - g u nc h o t m ge t c ，2 0 0 1 ) 。 r i ri 和b ：是h o b 或者o c h ，凡是糖 基或1 1 r | 是糖基或o h 图1 1 花色苷的结构 f i g 1 - ls t u c t u r eo f t h ea n t h o c y a n i n s 东北农业大学工学硕卜学位论文 1 1 花色苷的提取 花色苷的提取是一件耗时、耗能又费溶剂的工作。目前传统的提取方法有溶剂提取法和 水蒸气蒸馏法，常用的溶剂提取法有索氏提取法和目流提取法等，他们均存在被提成分损失大， 周期长，工序多，提取率不高等缺点，已不适应时代发展的需要。随着科学技术的发展，一批新技 术、新设备应运而生。如酶法提取、超声波萃取( s e ) 、超临界流体萃取( s f e ) 等。较常用的提 取方法是溶剂浸取法，通常采用酸性溶液进行提取，此外还有微生物破壁法、c 0 2 超临界萃取、 及酶工程技术等。超声波萃取仍较多用于实验室，s f e f l j 于设备复杂，运行成本高，提取范围有限 等问题应用受到限制，所以在实验室里很少有里很少有利用超临界流体萃取( s f e ) 进行提取。 1 9 8 6 年，g a n z l e r 等人首先报道了微波用于天然产物成分的提取( kg a n z l e r ，1 9 8 6 ) 。张秀成等 人利用乙醇对越桔色素进行提取( 张秀成等，2 0 0 0 ) 。向道丽利用酶法提取越桔果渣花色苷( 向 道丽，2 0 0 6 ) 。 1 2 花色苷的分离纯化 花色苷的粗提物往往有较多的杂质，难于对其进行鉴定，只有将各组分进行分离提纯为单 体花色苷后，才能进行鉴定，确定其化学结构。分离纯化的方法主要是层折法 包括纸层析( p c ) 薄层层析( t l c ) 柱层析( c c ) 高效液相色谱法( h p l c ) 以及高速逆流色普法( h s c c c ) 等。花色苷 的分离有着不同的方法，其原理和方法都各不相同，s e p h a d e xg 或l h 系列是利用排阻色谱 的原理进行分离的，而大孔树脂是根据分子问的作用力如范德华力和氢键等不同进行分离的。 例如经常用的s e p h a d e xg 或l h 系列进行分离，型号不同，分离的程度也不同。l t l i s ，c a b r i t a , t o r g i l sf o s s e n , a n d e rs e n 成功地利用s e p h a d e x l h 2 0 柱分离六种不同种类的花色苷( l u i s e t c ，2 0 0 0 ) 。早期b a t e 2 s m i t h 曲d 用纸层析法分离花色苷元；p a r t r i d g e 和w e s t a l l 用此方法来鉴别糖 的种类；h a r b o m e 在1 9 5 8 年提出了花色苷的光谱鉴( kg a n z l e re t c ，1 9 8 6 ) 。 1 。2 。1 大孔树脂纯化花色苷 大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙烯酸酯为单体，加入二乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯为 致孔剂，它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。它的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机 溶剂，不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。树脂吸附作用的根本因素是吸附剂与吸 附质之间的作用力，即范德华力。通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作的，使有机化合 物根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱而分开达到分离、纯化、除杂、浓缩等不 同目的。 树脂吸附性能的优劣是由其化学和物理结构决定的，同一型号大孔吸附树脂上的吸附能 力有差异，不同树脂结构对不同物质吸附效果不同。大孔吸附树脂吸附符合以下规律：非极 2 引言 1 性物质在极性介质( 水) 内被非极性吸附剂吸附，极性物质在非极性介质中被极型吸附剂吸附， 带强极性基团的吸附剂在非极性溶剂里能很好的吸附极性化合物。聚苯乙烯型树脂一般适用 于非极性和弱极性物质的化合物如皂苷类和黄酮类：聚丙烯酸类树脂带有酯基或酰氨基，对 中极性和极性化合物如黄酮甾醇和酚类的吸附较好。 吸附条件和解吸附条件的选择直接影响着大孔吸附树脂吸附工艺的好坏，在整个工艺过 程中应综合考虑各种因素。影响树脂吸附的因素很多，主要有被分离成分的性质( 极性和分子 大小等) 、上样液中溶剂的性质( 溶剂对成分的溶解性、盐浓度和p h i ) 、上样液浓度及吸附 流速等。通常，极性较大分子适用中极性树脂上分离，极性小的分子适用非极性树脂上分离； 体积较大化合物选择较大孔径树脂；上样液中加入适量无机盐可以增大树脂吸附量；酸性化 合物在酸性溶液中易于吸附，碱性化合物在碱性液中易于吸附，中性化合物在中性液中吸附， 对于滴速的选择，则应保证树脂可以与上样液充分接触吸附为佳。 影响解吸条件的因素有洗脱剂的种类、浓度、p h 值、流速等。洗脱剂可用甲醇、乙醇、 丙酮、乙酸乙酯等，应根据不同物质在树脂上吸附力的强弱选择不同的洗脱剂和不同的洗脱 剂浓度进行洗脱：通过改变洗脱剂的p h 值可使吸附物改变分子形态，易于洗脱下来；洗脱流 速一般控制在0 5 - - - 5 m l m i n 。 进样之前样品一般要经过预处理，预处理不好则会使大孔树脂吸附的杂质过多，从而降 低其对有效成分的吸附。树脂的粒径、树脂柱的高度也会产生一些影响，通常较高的洗脱液 流速、较小的树脂粒径和较低的树脂高度有利于增大吸附速度。但同时也使单柱的吸附量有 所降低。树脂柱的粗细也会影响分离效果，若柱太细。洗脱时，树脂易结块。壁上易产生气 泡流速会逐渐降为零。 如果大量生产纯化花色苷，利用吸附树脂纯化比较经济实惠，国内许多学者和专家利用大 孔吸附树脂对花色苷的纯化进行了研究。赵泊涛等人利用大孔树脂a b 遗对黑莓中花色素的纯 化。为分析目的纯化花色苷时，花色苷纯化的传统方法是纸色谱，薄板色谱和柱色谱也用于花色 苷的纯化。z a p s a l i s 锄d f r a n c i s 曾用乙酸铅沉淀法和离子交换树脂法纯化花色 苷，。f r a n c i s a n d a n d e r s e n 用微滴逆流色谱( d c c c ) 纯化花色苷。孟凡丽，苏晓田，李亚东在2 0 0 4 年对红豆越橘果实中3 一半乳糖一矢车菊色素的提取、分离及结构鉴定给出结论。在2 0 0 6 年 z h a o c h a n g l i n g ，g u o w e i m i n g ，c h e n j u n y u 从梅花南京红须中的花色素得出2 种主要花色苷。 1 2 2 葡聚糖凝胶柱色谱 对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：s e p h a d e x - g 型及s e p h a d e x l h - 2 0 型。 用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附，凝胶对黄酮类化 合物的吸附程度取决于游离酚经基的数目；分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。葡 聚糖凝胶在溶剂中膨胀成球形颗粒，具有三维空间的网状结构。由于凝胶网孔半径的限制， 大分子将不能渗入凝胶颗粒内部( 即被排阻在凝胶粒子外部) ，故在颗粒间隙移动，并随溶剂 一起从柱底先行流出；小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱阻力增大、， 3 东北农业大学t 学硕十学位论文 流速较缓，将较晚流出。样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程 度也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡后，即按分子由大到小顺序先后流出 并得到分离。 s e p h a d e x lh - 2 0 为s e p h a d e xg 经羟丙基化处理后得到的产物。其分子中的葡萄糖部分与 羟丙基以醚键形式结合。与s e p h a d e xg 比较，s 印h a d e xl h 2 0 分子中- o h 基总数虽无改变， 但碳原子所占比例却相对增加。因此与s e p h a d e xg 仅具亲水性不同，不仅可在水中应用，也 可在极性有机溶剂或与水组成的混合溶剂中使用。s e p h a d e xl h 2 0 除保留有s e p h a d e xg - 2 5 原有的分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中 常常起到反相分配色谱的效果，适用于不同类型有机化合物的分离。 杨晓红等利用s e p h a d e xl h - 2 0 柱色谱对分蘖葱头进行分离纯化，分得4 个黄酮苷类化合 物，其中一个为新的黄酮苷类化合物。戴胜军等利用s e p h a d e xl h 2 0 从烈香杜鹃中分得8 个黄 酮单体。 目前国外许多学者利用s e p p a d g e c l 8 柱，反相高效液相色谱( r p h p l c ) 和半制备高 效液相色谱对花色苷成功的进行了纯化。为得到纯度较高的花青素色素，应将粗提液进一步处 理去除杂质一般采用树脂纯化的方法，如阳离子交换树脂，大孔吸附树脂h p - 2 0 吸附树脂 x a d - 2 0 0 0 树脂等此外，还可采用醋酸铅沉淀法去除杂质，但考虑到试剂毒性和操作简便程度，以 树脂处理法较好，有时也可与重结晶等方法一起使用。 1 3 花色苷的结构鉴定 2 0 世纪8 0 年代后期发展起来的分离与鉴定联用技术为活性成分的研究和鉴定提供了有利 条件。其中主要的有纸层析法、花色苷的水解分析法、光谱分析法液相色谱大气压离子化质 谱联用( l c - a p i - m s ) 、高速逆流色谱与质谱联用( h s c c c m s ) 及生物分子相互作用分析与质谱 联用( b 认l 订s ) 等，这类联用技术及其应用进展( 徐渊金等，2 0 0 6 ) 。结构的鉴定对于色素的研 究和应用有着很大的作用，有些色素的化学结构研究在国内尚未见报到。目前结构的鉴定，根 据物质的不同的理化性质采用不同的方法，大多数是用树脂和色谱以及光谱等连用，根据理化 性质进行结构鉴定，也有利用显色反应进行结构鉴定。赵昶灵、郭维明、陈俊愉，利用显色反 应来鉴定梅花花色素的种类。刘小玲，许时婴，王璋利用采用液质联用( h p l c m s ) 的方法对火 龙果色素的基本性质及结构鉴定。 1 4 国内外研究动态和趋势 自2 0 世纪中叶以来，天然色素的研究与开发又重新受到各个国家的重视，并已取得了 可喜的进展。围绕植物天然色素展开的研究涉及到提取提纯技术研究、植物天然色素的性质 4 引言 及应用研究、植物天然色素的化学成分的研究、生理活性功能研究等各方面。 r e v i l l a 在1 9 9 8 年用多种方法提取葡萄花青素，通过实验比较证明当溶剂中的h c i 达到 0 1 2 m o l l 时能使酰基化的花色苷部分水解。g a r c i a 用丙酮提取花青素，与酸性甲醇相比，丙 酮提取由于消除了果胶的影响，效果更好。国内技术工作者对植物色素的研究也取得了进展。 吕丽爽等从脱脂葡萄籽中提取低聚原花色素。葡萄籽粉竞石油醚脱脂，乙醇提取，浓缩，用 乙酸乙酯萃取，真空浓缩，加石油醚沉淀，沉淀即为原花色素粗品。对葡萄皮色素的提取也 受到关注。王战勇等8 0 乙醇溶液很o 5 柠檬酸溶液的混合液做提取液，同时调整溶液的 p h 值为2 - 4 ，过滤、减压浓缩、干燥，得到有较高提取率的葡萄皮色素。 近年来，有人尝试将超临界流体技术及微波技术用于植物色素的提取。惠伯隶等用超临 界二氧化碳流体萃取取代传统有机试剂萃取番茄果皮中番茄红素，使萃取物中总类胡萝卜的 含量比丙酮乙醚萃取物的高3 1 ，其中番茄红素占9 0 。李守君研究了枸杞子红色素的超 临界流体萃取方法，确定了最佳萃取工艺条件。李雄辉采用乙醇溶剂浸取栀子黄色素，再由 超临界二氧化碳萃取分离，使提取率、纯度、色价较传统工艺明显提高。但目前普遍认为超 临界流体萃取较适用于脂溶性色素的萃取，而对于水溶性的花色苷色素，超临界流体萃取方 面的报道尚不多见。 花色苷分离纯化的方法很多，有纸层析、柱层析、薄层层析、溶剂萃取、高效液相色谱、 高速逆流色谱法等。 苏红等人采用三次纸层析法得到甘蓝红色素的主要花色苷：矢车菊素- 3 双芥予酰槐二糖 5 葡萄糖营，三次的展开剂分别为b a w ( 正丁醇：乙酸：水= 4 ：l ：5 v 柑) ，b h ( 正丁醇： 2 m o f l 盐酸= l ：l v v ) 。1 5 x 3 0 c m 新华n o 3 纸层析，上行法。s u l y o k 和b a i n t 等人将除去乙 酸乙酯的提取液上a m b e r l i t e xa d 叼柱，用蒸馏水洗脱至流出液在4 0 减压浓缩。残余物溶 于含5 乙酸的甲醇中，再能过一根s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶柱。将只含紫色的流出液再在4 0 减压浓缩，残余物反复在上述凝胶柱上分离2 次以上，从甲醇中重结晶，得到暗紫色的飞燕 草色素3 ；香糖苷5 葡萄糖晶体。m a u f i z i o h p l c 技术从草莓分离出矢车菊色素3 葡萄糖苷、 天竺葵色素- 3 葡萄糖苷和天竺葵色素3 阿拉伯糖苷。d e g e n h a r d t 等人用装有3 个螺旋管柱的 c c c 1 0 0 0 高速逆流色谱仪分离用x a d - 7 柱纯化过的黑加仑提取物，得到4 个峰，它们依次是 飞燕草色素- 3 芸香糖苷、矢车菊色素- 3 芸香糖苷、飞燕草色素3 葡糖苷和矢车菊色素- 3 葡 糖苷。 花色苷的提取分离鉴定方法在国外发展已日渐成熟，但在国内对这方面的研究比较少。 黑大豆皮中含有丰富的花色苷，很有开发研究价值，但品种多，结构复杂，有待长期进行。 1 5 立题意义及研究内容 黑大豆适应能力较强，具有易种易管，极少病虫害，栽培当年少量结果的优点。我国北 方大部分地区均适合黑大豆生长。目前，我国部分地区先后从国外引进优良黑大豆品种，经 5 东北农业大学t 学硕十学位论文 过栽培试验，己取得了良好的效果。在国际市场上，黑大豆产品很畅销，年需求量远远大于 它的供应量。这些种植优势和市场情况使黑大豆栽培面积急剧扩大。 目前国内外对黑大豆皮中的色素的研究报道还较少。本课题以我省特产黑大豆皮为原 料，探索从其中提取、纯化分离及结构鉴定化合物的工艺条件，目前一般花色苷中的种类很 多，纯品的价格很高，不易购买到，而本试验采用黑大豆为原料，因为黑大豆皮中的花色苷 的种类较少，从而为得到纯品降低成本，探索出一种简单、方便、经济的方法。 6 材料与方法 2 材料与方法 2 1 试验材料与仪器 2 1 1 原材料 黑大豆( 东北农业大学大豆研究中心提供) 2 1 2 试剂 无水乙醇 乙酸乙酯 冰醋酸 正丁醇 甲酸 盐酸 三氯甲烷 氢氧化钠 冰醋酸 三氯化铝 甲醇( 色谱纯) 磷酸( 色谱纯) 无水醋酸钠 硼酸 柱层析用硅胶 硅胶g f 2 5 4 s e p h a d e xl h - 2 0 苷元的标准品 以上试剂除特殊说明外均为分析纯 2 - 1 3 大孔树脂 n k a 9 大孔树脂( 南开大学化工厂) d 4 0 0 6 大孔树脂( 南开大学化工厂) 孓8 大孔树脂( 南开大学化工厂) 7 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市耀华化学试剂有限公司 天津市福晨化学试剂厂 天津市光复精密化学试剂所 哈尔滨市新达化工厂 天津市永大化学试剂开发中心 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市耀华化学试剂有限责任公司 天津市双船化学试剂厂 m a d ei nu s ad i m at e c h n o i 0 g yi n c 天津科密欧试剂开发中心 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市凯通化学试剂有限公司 青岛海洋化工厂 青岛海洋化工厂 北京金欧亚科技发展有限公司 s i g m a 公司 a b 8 大孔树脂( 南开大学化工厂) d i3 0 大孔树脂( 成都晨光化工研究所) 。d 1 4 0 大孔树脂( 成都晨光化工研究所) - 东北农业大学工学硕七学位论文 x 5 大孔树脂( 南开大学化上厂) 2 。1 4 试验仪器 电热恒温水浴锅 旋转蒸发器 7 5 5 p c 紫外可见分光光度计 t 6 新悦型可见分光光度计 p h s 2 5 型酸度计 a l l 0 4 电子分析天平 8 0 - 2 b 低速台式离心机 s m b - 2 0 型超滤器 z t 6 0 - 6 0 0 型蠕动泵 r s z 1 0 0 自动部分收集器 高效液相色谱仪 c x - 5 0 0 型超声波清洗杌 t h - 3 0 0 a 梯度混合器 质谱仪 u v 2 0 0i i 紫外可见分光光度计 w r x - l s 显微热分析仪 2 2 试验方法 2 2 1 黑大豆皮中的花色苷的提取 上海医疗器械五厂 上海申胜生物技术有限公司 上海光谱仪器有限公司 北京普析通用仪器有限公司 上海伟业仪器厂 瑞士梅特勒托利多公司 上海安亭科学仪器厂 中国科学院上海原子核研究所 保定兰格恒流泵有限公司 上海金达生化仪器有限公司 a g i l c n t 公司 北京医疗设备二厂 上海沪西分析仪器厂 瑞士b r u k e r 公司 大连依利特分析仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 2 2 1 1 乙醇提取法 提取工艺：黑大豆皮粉碎溶剂提取过滤将滤渣再次提p 过滤 合并滤液 1 租提液的制备：取黑大豆2 克左右，料液比为l ：3 0 ，提取时间为1 5 小时，p h 为4 7 ， 重复操作2 次，得到黑大豆皮的粗提液。 2 利用波长扫描来确定该花色苷的最大吸收波长：将黑大豆皮的粗提液稀释若干倍后， 在t i _ 一1 9 0 l 双光束紫外可见分光光度计上进行全波长扫描，得出黑大豆皮花色苷的最大吸 收的扫描谱图。 3 不同的p h 值对黑大豆皮中的花色苷的影响：将黑大豆的粗提液利用p h s - 2 5 型酸度 计，用l m o f l 的h c i 和n a o h 调成不同的p h 值，观察其颜色的变化，得出结论。 4 ，不同的料液比对黑大豆皮中的花色苷的影响： r 材料与方法 采用单因素的试验方法，对料液比进行试验，料液比为l ：3 0 ，l ：4 0 ，l ：5 0 ，l ：6 0 ( g m e ) 精取l g 左右黑大豆皮，根据上述p h 值得出的结论，按照不同的料液比在7 0 c 下 提取l h ，过滤，按照上述的条件重复一次，将两次的滤液合并，在4 0 时旋转蒸发，除 去乙醇，将得到的液体定容到1 0 0 m l ，摇匀，在最大吸收波长出测其吸光值，从而来确定最 佳的料液比。 5 不同的提取时间对黑大豆皮中的花色苷的影响 准确称取l g 左右的黑大豆皮，料液比为l ：4 0 ，提取时间为0 5 ，l ，1 5 ，2 ，2 5 h ，p h 为6 ，溶剂浓度为5 0 进行提取，以吸光值为指标，确定最佳的提取时间。+ 6 不同的提取温度对黑大豆皮中的花色苷的影响 准确称取l g 左右的黑大豆皮，料液比为1 ：4 0 ，提取温度为2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 ， 提取时间为l h ，p h 为6 ，溶剂浓度为5 0 0 , 6 进行提取，以吸光值为指标，确定最佳的提取温 度。 7 不同的溶剂浓度对黑大豆皮中的花色苷的影响 准确称取l g 左右的黑大豆皮，料液比为1 ：4 0 ，提取温度为6 0 1 2 ，提取时间为l h ，p h 为6 ，溶剂浓度为2 0 0 , 6 ，4 0 0 , 6 ，6 0 ，8 0 进行提取，以吸光值为指标，确定最佳的溶剂浓度。 8 通过控制提取温度、提取时间、溶剂浓度，以吸光值为指标，采用三因素三水平正交 试验确定最佳的提取条件； 表2 q 正交试验因素水平表 t a b l e 2 - 1t h et a b l eo f f a c t o r sa n dl e v e lo f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 从而确定乙醇提取法的最佳条件。 2 2 1 2 超声波法 提取工艺：黑大豆皮粉碎超声波提取过滤将滤渣再次提取过滤 合并滤液 1 不周的超声功率对黑大豆皮中的花色苷的影响 准确称取l g 左右的黑大豆皮，超声功率为3 0 0 w ，4 0 0 w ，5 0 0 w ，6 0 0 w ，7 0 0 w ，料液比 为l ：4 0 ，超声时间为2 0 m i n ，p n 为6 ，溶剂浓度为4 0 进行提取，以吸光值为指标，确定 最佳的超声功率。 2 不同的超声时间对黑大豆皮中的花色营的影响 准确称取1 9 左右的黑大豆皮，超声时间为1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 r a i n ，料液比为1 - 4 0 、， 9 东北农业大学1 二学硕f = 学位论文 l i p i , i 鲁鼍詈暑置| 置量置鲁量一 超卢功率为5 0 0 w ，p h 为6 ，溶剂浓度为4 0 进行提取，以吸光值为指标，确定最佳的超卢 时间。 3 不同的溶剂浓度对黑大豆皮中的花色苷的影响 准确称取l g 左右的黑大豆皮，超声功率为5 0 0 w ，料液比为l ：4 0 ，超声时间为2 0 m i n ， p h 为6 ，溶剂浓度为2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 进行提取，以吸光值为指标，确定最佳 的溶剂浓度。 4 不同的料液比对黑大豆皮