（农产品加工及贮藏工程专业论文）苦瓜植物胰岛素的分离纯化及降血糖活性研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 苦瓜( m o m o r d i c ac h a r a n t i a 三) 为葫芦科苦瓜属一年生草本植物苦瓜的果实， 我国各地都有种植。近年来，国内外学者从苦瓜果实、种仁中分离纯化出多种 蛋白和多肽，发现具有明显的降血糖生物活性，具有很高的保健作用和药用价 值。 本论文从苦瓜果实中提取、纯化降血糖活性蛋白，并研究了其对四氧嘧啶 诱导糖尿病模型小鼠的降血糖效果。主要研究内容和结论如下： 1 苦瓜植物胰岛素的提取、纯化。选择台湾种新鲜山苦瓜，去籽、破碎、 匀浆，酸乙醇浸泡，有机溶剂沉淀，得粗蛋白。粗蛋白经s e p h e r d e xg 1 0 0 凝胶 柱层析反复纯化得到两个组分p l 、p 2 。其中p 2 经反相高效液相色谱方法纯化制 备，得到苦瓜植物胰岛素组分p a 。相对文献报道的薄层层析制备方法，凝胶柱 层析结合反相高效液相色谱法便于大量制备苦瓜植物胰岛素。 2 苦瓜植物胰岛素p a 组分的初步鉴定。s d s p a g e 分析p a 为单一蛋白着 色带，分子量为2 4 k d 左右。经测定，p a 等电点为5 3 左右。p a 组分与胰岛素药品 经反相高效液相色谱和高效毛细管电泳分析对照。 3 苦瓜植物胰岛素粗蛋白凝胶分离组分p l 、p 2 对四氧嘧啶诱导糖尿病模型 小鼠的降糖效果研究。p 2 按5 0 m g k g 体重的剂量腹腔注射给药，连续给药5 天，断 尾取血，测定空腹血糖。与模型对照组比较有非常显著的降糖作用，并且明显提 高小鼠肝糖元含量，其降糖作用优于阳性对照药品格列苯脲；p 2 按5 0 m g k g 体重 剂量灌胃有一定的降糖作用，但效果不明显，没有达到统计学差异。p i 采用腹腔 注射和灌胃两种给药方式，对糖尿病模型小鼠皆无降糖作用。 关键词：苦瓜，蛋白，凝胶层析，高效液相色谱，降血糖 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t m o m o r d i c ac h a r a n t i al ，a l lh e r b a c e o u sp l a n to fg e n u s ，l a g e n a r i as i c e r a r i a , i s w i d e s p r e a di nc h i n a , f r o mw h o s e f r u i t sa n ds e e d ss c i e n t i s t si na n da b r o a di nt h e r e c e n ty e a r sh a v ei s o l a t e da n dp u r i f i e dm a n yt y p e so fp r o t e i n sa n dp o l y p e p t i d e ， w h i c ha r ef o u n dt ob co fh y p o g l y c e m i cb i o a c t i v i t y , h e n c ea r eo fh ig hm e d i c i n a l v a l u e t h i st h e s i sa i m st od e s c r i b et h ep r o c e s so fi s o l a t ea n dp u r i f yt h eh y p o g l y c e m i c a c t i v ep r o t e i na n ds t u d yi t sp h y s i o l o g i c a la c t i o n t h em a i nc o n t e n ta n dc o n c l u s i o n a r ep r e s e n t e da sf o l l o w s ： t h ef r u i t so ft a i w a nb r e dm o m o r d i c ac h a r a n t i aa r ef r e s h l yc o l l e c t e di nt h e f i e l d s ，t a k e na w a yt h es e e d s ，c r u s h e da n dh o m o g e n i z e di na c i de t h a n 0 1 t ot h i s m i x t u r eo r g a n i cs o l v e n ti sa d d e d ，h e n c ep r e c i p i t a t ei so b t a i n e d t h e nt h es o l v e n t d r i e d ，c r u d ep r o t e i ni so b t a i n e d ，w h i c hw a sp u r i f i e db yg e lf i l t r a t i o n ，a n dt w o c o m p o u n d sp 1a n dp 2a r eo b t a i n e d p 2i s p u r i f i e db yr e v e r s e d p h a s e c h r o m a t o g r a p h ya n di n s u l i np ai so b t a i n e d i n s u l i np r e p a r a t i o nb yg e lf i l t r a t i o na n d b yr e v e r s e d - p h a s el i q u i dp h a s ec h r o m a t o g r a p h ya les u p e r i o rt ot h a tb yk a h a n n at h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , a n dc o n v e n i e n tf o rp r e p a r a t i o ni nl a r g ea m o u n t a n ya m o u n t o fi n s u l i nc a nb eo b t a i n e d b ys d s p a g e ，p ai ss i n g l es t a i n i n gs t r i p ，m o l e c u l a rw e i g h ta b o u t2 4 0 0 0 0 ， i s o e l e c t r i cp o i n ta b o u t5 3 ，w h i c hw a sp r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e da sg l y c o p r o t e i n b y r e v e r s e d p h a s el i q u i dc h r o m a t o g m p h y ，c a p i l l a r yc a t a p h o r e s i s ，p ai sc o m p a r e dw i t h i n s u l i nm e d i c i n e ( w a n b a n g ，x u z h o u ) ，a n di sf o u n dt ob ei d e n t i c a lw i t hi n s u l i ni n s t r u c t u r e l i q u i dp h a s ec h r o m a t o g r a p h ya n dc a p i l l a r yc a t a p h o r e s i sa r em o r ea c c u r a t e t h a nt h et h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y s t u d yo ft h eh y p o g l y c e m i ca c t i v i t yi ni n s u l i np 2r e v e a l st h a tw h e np 2i si n j e c t e d i n t r a m u s c u l a r l yt ot h et e s tm i c es u f f e r i n ga l l o x a ni n d u c e dd i a b e t e sm e l l i t u si n 5 0 m g k gd o s e ，t h e f a l li nt h el e v e lo fb l o o ds u g a ri sm o r ec o n s p i c u o u sw h e n 江苏大学硕士学位论文 c o m p a r e dw i t ht h a to ft h er e f e r e n t i a lt e s tm i c e p 2i ss u p e r i o rt op o s i t i v er e f e r e n t i a l m e d i c i n eg l i b e n c l a m i d ei nh y p o g l y c e m i cf u n c t i o n w h e nt a k e no r a l l y ，p 2s h o w sl e s s h y p o g l y c e m i ca c t i v i t y ，q u i t eb e l o wt h es t a t i s t i c a ld i a c r e p a n c y pis h o w sn oh y p o g l y c e m i ca c t i v i t ye i t h e rw h e nt a k e no r a l l yo rw h e ni n j e c t e d i n t r a m u s c u l a r l yt ot h et e s tm i c es u f f e r i n ga l l o x a ni n d u c e d d i a b e t e sm e l l i t u s k e yw o r d s ： m o m o r d i c ac h a r a n t i al ，g e lf i l t r a t i o n ，r p h p l c ，h p c e ， 1 1 1 江苏大学硕士学位论文 r p h p l c s d s - p a g e s t z t c t g p k c n a d ( p ) h p i t n f n k 1 1 1 h i v p b s 缩略表 反相高效液相色谱 十二烷基磺酸钠凝胶电泳 链脲霉素 总胆固醇 甘油三酯 蛋白激酶c 烟酰胺酰嘌呤二核苷酸( 磷酸) 等电点 肿瘤坏死细胞 自然杀伤细胞 t 淋巴细胞亚群 人免疫缺陷病毒( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，h i v ) 磷酸盐缓冲溶液 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 查青 日期：0 , , 0 5 年多月f 啦日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文 的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论 ，在三年解密后适用本授权书。 学位论文作者签名：爿 鼋指导教师签名：镞 学位论文作者签名：席壤指导教师签名：锹 i 、j 一 3 口口f 年6 月1 毕日加r 年多月，够日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 苦瓜( m o m o r d i c ac h a r a n t i al ) ，为葫芦科苦瓜属一年生草本植物，在全球共 有4 0 余种，主要分布于热带、亚热带地区。在国外苦瓜又名b i t t e rm e l o n 、b i t e r g o u r d 、p a p a i l l a 、k a r e l a 等，在我国也有锦荔枝、赖葡萄、红姑娘等多种称谓。据 记载苦瓜大约在南宋时传入我国，现在全国各地都有种植，已知有5 个品种，包 括苦瓜( m c h a r a n t i al ) 、木鳖( m c o c h i n c h i n e n s i ss p r e n g ) 、云南木鳖( m d i o c i a r o x b e x w i l l d ) 、喷瓜( me l a t e r i u ml ) 和臭苦瓜( m f o e t i d as c h u m a c h ) 。 对于苦瓜属植物的药用价值，人们早有认识，在民间广为应用。苦瓜具有消 暑清热、明目解毒之功效，我国用于热病烦渴、中暑、痢疾、赤眼疼痛、痈肿丹 毒、恶疮等症的治疗，在印度还用于治疗糖尿病。木鳖的种子木鳖子作为一种中 药材载入我国药典，它具有散结消肿，攻毒疗疮的功能用于疮疡肿毒、乳痈、 痔漏、干癣、秃疮等。云南木鳖可活血化瘀、清热解毒，在印度用于抗阿米巴原 虫及治疗毒蛇咬伤。苦瓜的口服煎剂在希腊民间用于治疗各种癌症。臭苦瓜在南 尼日利亚用于治疗多种疾病【l j 。 近年来，人们对苦瓜食用价值认识提高，苦瓜资源的开发利用呈不断扩大 之势。随着该属植物降糖、抗肿瘤及抗病毒等活性功能的发现，对其药理作用及 活性成分的研究日益加深，其中尤以苦瓜的研究最为深入【2 】。 1 1苦瓜的营养功能与药用价值 现代营养学研究表明，苦瓜果实营养丰富。每1 0 0 9 苦瓜果实中约含有蛋白质 0 9 9 、脂肪0 2 9 、碳水化合物3 2 9 、灰分0 6 9 、钙18 m g 、铁0 6 m g 、磷2 9 m g 、钾2 6 0 m g 、 硫胺素0 0 7 m g 、核黄素0 0 4 m g 、尼克酸0 3 m g 、粗纤维1 1 m g 、抗坏血酸8 4 m g 、 维生素e 0 8 5 m g 、维生素a 5 4 mg 、维生素b 1 0 0 0 3 m g 、维生素b 2 0 0 3 m g 、胡萝卜 素0 6 m g 。此外苦瓜中还含有苦瓜苷、腺嘌呤及多种氨基酸，抗坏血酸含量是大 多数果蔬所不及的【3 _ 5 】。随着营养知识的普及，苦瓜开始受到人们的青睐，成为 餐桌上的美味佳肴。 以苦瓜为食品原料，国内开发出多种食品。张斌等将苦瓜处理后，榨汁粗滤， 用水调配，过滤，生产出独具特色的苦瓜汁饮料【6 】。刘仁智等将青瓜、苦瓜、白 江苏大学硕士学位论文 砂糖配制而成，研制出混合性蔬菜饮料，该产品具有明显的青瓜和苦瓜的混合风 味，味甜略苦，饮后具明显的清凉感，具有清暑解毒作用。目前开发出的产品还 有罗汉决明子茶、果蔬营养片、苦瓜银杏保健饮料、苦瓜酒、苦瓜啤酒、苦瓜茶、 苦瓜冻干超微粉全果制品、苦瓜素奶粉、苦瓜膳食纤维百乐饼干等。 苦瓜作为药用在我国历史悠久。我国最早见记载于滇南本草。称其“苦、 寒、平，入心、脾、胃三经、泻六经实火，清暑、益气、止渴”。本草纲目苦 瓜条谓“苦寒、无毒、除邪热、解劳乏，清心明目”。医药学界认为苦瓜的根、 茎、叶、花、果实、种子均可供药用。瓜肉性寒，可清暑解热、明目、解毒、养 血滋肝、润脾补肾；籽有壮阳益气作用；根可清热解毒、清心明目、益气壮阳： 叶可用于敷药治湿疹皮炎、热毒疖肿、毒蛇咬伤。苦瓜内含的苦瓜素可抑制肿瘤 细胞分泌的蛋白酶，防止癌细胞的生长和扩散：它还含有苦瓜皂苷、植物胰岛素 等，具有降血糖作用。现代医学表明苦瓜的药理活性主要体现在降糖、抗艾滋病、 抗肿瘤、抗生育、抗菌、抗病毒等方面。由此可见，苦瓜不仅是人们日常佐餐瓜 果，而且还具有很高的药用价值。 1 2 苦瓜的主要化学成分 苦瓜资源丰富，药理作用显著，因此自上个世纪中叶以来人们对其化学成 分进行了研究。近年来，科研人员从苦瓜中已分离得到的化学成分包括三萜、 甾类、蛋白质、有机酸、生物碱及多糖类等化合物。 1 2 1蛋白、多肽类 1 2 1 1 类胰岛素多肽( i n s u l i n 1 i k ep e p t i d e ) 国外，1 9 7 4 年k h a n n a 首次发现苦瓜中存在类胰岛素多肽p i n s u l i n t 7 1 。接下来， n gt b 等人对苦瓜中类胰岛素做了深入研究，发现苦瓜中存在多种类胰岛素的物 质【8 1 8 。1 9 8 6 年，他们从苦瓜种子中纯化得到一种与半乳糖结合的植物凝集素【9 】， 相对分子量为1 2 4 0 0 ，由3 个亚基组成f l o l 。1 9 8 7 年，n gt b 等又纯化得到两个分子 量均为8 0 0 0 的多肽，两个多肽有类似的氨基酸组成，但它们在阳离子交换柱上色 谱行为及其聚丙烯酰胺凝胶电泳行为有着较大的差异f j j 】。 国内张世荣【1 2 】等从苦瓜中分离出分子量分别为8 0 0 0 6 0 0 0 ，2 5 0 0 , 2 0 0 0 ， 江苏大学硕士学位论文 1 2 0 0 8 0 0 的3 种组分，均能降低高血糖模型小鼠和正常小鼠的血糖水平，其中分 子量2 5 0 0 - - - - 2 0 0 0 的组分在纳克级即有明显效果。 1 2 1 2 苦瓜凝集素( m o m o r d i c ac h a r a n t i al e c t i n ) 1 9 7 2 年，m t o mi t t l 3 】等人首先报道了通过琼脂糖凝胶亲和层析，从苦瓜中分 离得到具有凝集人o 型血红细胞，并为d 半乳糖所抑制的凝集素，并且认为此凝 集素不能凝集y o s h i d a 瘤细胞。随后，由于分离纯化方法的不同以及检测手段的 差异，出现了多种不同理化性质的苦瓜凝集素。 j y l i n 1 4 1 通过c m c e l l u l o s e 阳离子交换柱层析，从苦瓜种仁中分离得到有毒 和无毒的苦瓜凝集素，分别命名为m o m o r d i n 和m o m o r d i c aa g g l u t i n i n 。经 s d s p a g e 测得它们的分子量分别为2 3 6 7 8 和3 1 7 6 2 ，都是由一条多肽链组成的。 s s l i 【1 5 l 通过d e a e a 5 0 阴离子交换层析、s e p h a d e x g 1 5 0 凝胶过滤层析和 c m 5 2 阳离子交换柱层析，分离得到两种不同的苦瓜凝集素，称为凝集素i 和i i 。 经s d s p a g e 和s e p h a d e x 和g 1 5 0 凝胶过滤层析柱检测可知二者都是由2 6 0 0 0 d 的 亚基所组成的，但它们的氨基酸组成却不相同，从而导致了凝血活性的差异【1 6 】。 v h o r e j s i t l 7 】则通过o 0 【d 半乳糖丙烯酰胺凝胶亲和柱层析法而得到苦瓜凝 集素的。其分子量为1 2 9 0 0 0 d ，由分子量分别为2 9 0 0 0 ，3 2 0 0 0 和3 6 0 0 0 的三个亚基 通过二硫键相连而成的。含有4 1 的中性糖和0 5 的葡萄糖胺，并存在a s n 和v a l 两个n 末端氨基酸残基。 l u i g ib a r b i e r i l l 8 】提纯的凝集素是采用s e p h a r o s e 4 b g lu 酸处理的s e p h a r o s e 6 b 亲和柱层析而得到的。它的分子量是l1 5 0 0 0 ，经s d s p a g e 检测含四个亚基，分 子量分别为3 0 5 0 0 ，2 9 0 0 0 ，2 8 5 0 0 和2 7 0 0 0 t 19 1 。 1 2 1 3 0 【一苦瓜素( c x m o m o r c h a r i n ) 和b 一苦瓜素( p - m o m o r c h a r i n ) h w y e u n g t 2 0 1 等人采用丙酮分级沉淀、c m s e p h a r o s e 离子交换和 s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶过滤柱层析后得到的两种组分糖蛋白，分子量分别为2 9 0 0 0 和2 8 0 0 0 ，各含有1 6 和1 3 的中性糖，n 末端都含a s p 残基，而富含a s p a s n 和 g l u g l n 残基，二种蛋白质均无c y s 残基。此外，甜苦瓜素含有较少量的m e t 残基 而1 3 苦瓜素则没有。 江苏大学硕士学位论文 1 2 1 4 苦瓜抑制剂( m o m o r d i c ac h a r a n t i ai n h i b i t o r ，m c i ) m y u j u l 2 1 l 从苦瓜种子中分离出两种核糖体失活蛋白，分别称为m o m o r d i na 和b ，并对它们的氨基酸组成和其它一些特性进行了检测。随后的一些报道中对 二者的全部氨基酸顺序和寡糖链的结构进行了测定【2 2 1 ，结果显示二种糖蛋白的寡 糖差别仅限于一个果糖分支的不剧2 3 1 。 1 2 ，1 5 免疫缺陷病毒型苦瓜抑制剂( i n h i b i t o ro f h i v - 1 ) 1 9 9 0 年，l e e h u a n g t 2 4 1 从苦瓜种子和果实中分离出一个新的碱性蛋白质，被 称之为m a p 3 0 ，分子量约为3 0 k d 。2 0 0 1 年j i r a t c h a r i y a k u l 通过硫酸铵沉淀，凝胶 柱层析，从苦瓜种子和果实中分离出一个新的蛋白质，称为m r k 2 9 ，等电点1 9 分子量2 8 6k d 2 s l 。 1 2 2 三萜类成分 苦瓜属植物中的三萜类成分，主要为葫芦烷型四环三萜及少量齐墩果酸型 五环三萜。 1 9 8 0 年日本学者o k a b eh 等对苦瓜子采用下列的提取分离方法：甲醇渗滤， 丁醇提取，硅胶柱层析，以氯仿甲醇水( 7 0 ：2 5 ：3 ) 洗脱，分得m o m o r d i c o s i d e a 和b ：苦瓜子的甲醇：水( 1 ：1 ) 渗滤液，经浓缩放置析出无色嘧啶苷结晶 v i c i n e l 2 6 1 。1 9 8 1 年他们又从苦瓜子丁醇提取部分，分离出三个三萜皂苷 m o m o r d i c o s i d ec ，m o m o r d i c o s i d ed ，m o m o r d i c o s i d ee f 2 7 j 。19 8 2 年o k a b eh 等 用甲醇提取未成熟苦瓜果实，提取液浓缩干后，用氯仿和正丁醇提取，正丁醇 部分用硅胶柱层析，甲醇：氯仿：水( 5 一1 5 ) 醋酸乙酯：甲醇：水( 5 0 ：2 ： 0 5 ：4 0 ：2 ：o 5 ) 洗脱，分出m o m o r d i c o s i d eg ，f l ，f 2 ，i 【2 8 】，k ，l f 2 9 1 。1 9 8 4 年m a y u m iy a s u d a 对苦瓜茎、叶用甲醇提取，提取物浸膏用氯仿和水分配，水 层用正丁醇萃取。氯仿部分经硅胶柱层析，分出m o m o r d i c i n ei ，丁醇部分分出 m o r n d r d i c i n ei i 、i i i 3 0 1 。 2 0 0 1 年日本学者t o s h i y u l dm 等对苦瓜采用下列的提取分离方法：全苦瓜 甲醇提取，减压浓缩，乙酸乙酯脱脂，水层用正丁醇萃取。正丁醇部分正相硅 胶柱层析，以氯仿甲醇水梯度洗脱，再经反相硅胶柱层析，高效液相制备柱 纯化，分得g o y a g l y c o s i d ea ，b ，c ，d ，e ，f ，g ，h 和g o y a s a p o n i n i 、i i 、i i i l 3 l 】 4 江苏大学硕士学位论文 等2 4 个三萜类和甾体类单体化合物。 1 2 3 甾体类成分 1 9 6 5 年s u c r o w 从苦瓜果实中分离出一种甾体皂苷和一种新的豆甾醇皂苷 t 3 2 l ；第二年他又从干的苦瓜果实中分离 a i s 2 5 】豆甾二烯醇及它的3 p 葡萄糖 苷【3 3 1 ，并分出两种【7 】- 甾醇【3 4 1 。 1 9 6 6 年，c o t l i k a rmm 从苦瓜果实中获得具有显著降血糖活性的植物甾醇 ( p 一谷甾醇一p d 一葡萄糖苷和1 5 缁】豆甾二烯醇一3 p d 葡萄糖苷的等分子混 合物) 3 5 l 。1 9 9 6 年，r a l l l a l l 再次报道了该成分c h a r a n t i n f o e t i d i n 即“苦瓜亭 【3 6 1 。 1 9 9 0 年，朱照静从苦瓜籽中分得2 4 p 一乙基一5 a 一胆甾7 ，反式- - 2 2 e 。 2 5 ( 2 7 ) 一三烯- 3 1 3 - 羟基一3 一o p d 一吡哺葡萄糖苷。同年g u e v a r a 用乙 醇浸提石油醚脱脂，氯仿部位经过反复硅胶柱层析，得到具有抗诱变活性成分 3 - 0 6 - 0 p a l m i t o y l b e t a d g l u c o s y l s t i g m a s t a - 5 ，2 5 ( 2 7 ) d i e n t 3 7 j 。 1 2 4 生物碱类 i y e r ，r i 等人从未成熟的苦瓜果中，采用9 0 的冷甲醇提取，经阳离子交换 树脂d o w e x s 0 、纸层析s e p h d a xl h 2 0 柱层析，分离得到两种内源性细胞分裂素， 即玉米素核糖苷( z e a t i nr i b o s i d e ) 和玉米素( z e a t i n ) f 3 钔。埃及学者e l g e n g a i h i s 从苦瓜中分得一种生物碱，它含有5 羟色胺及2 种具有嘧啶结构的苷类：蚕豆嘧 啶葡糖苷( v i c i n e ) 和阿拉伯糖苷嘧啶( c h a r i n e ) 3 9 】。 1 。2 5 有机酸 y u w a ik e 从苦瓜果实中分得多种有机酸：c t 桐酸( e l a e o s t e a r i ca c i d ，a l p h a ) 、 丁酸( b u t y r i ca c i d ) 、棕榈酸( p a l m i t i ca c i d ) 、棕桐油酸( p a l m i t o l e i ca c i d ) 、硬脂 酸( s t e a r i ca c i d ) 、油酸( o l e i ea c i d ) 、月桂酸( l a u r i ca c i d ) 、肉豆蔻酸( m y r i s t i c a c i d ) 、亚油酸( l i n o l e i ea c i d ) 、亚麻酸( l i n o l e n i ca c i d ) 等h 叭。此外还含有羊蜡 酸，胆固醇等。 半个世纪以来世界各国的科学工作者，陆续从苦瓜果实及种籽中分离到 2 5 0 多种单体化合物，它们主要是一些皂苷类和蛋白多肽类。其中三萜化合物 江苏大学硕士学位论文 已报道6 5 种，甾体类有2 0 种，蛋白类有7 0 种左右。此外还有番茄红素等多种 类胡罗卜素、糖类化合物、单萜化合物及钙，铁等无机物。 1 3 苦瓜的生物活性 1 3 1 降血糖作用研究 在苦瓜的生理活性作用研究中，苦瓜降糖活性的研究最为广泛和深入。由 于提取方法、降糖成分及实验对象的不同，苦瓜的降糖效果结果不一。 1 3 1 1 苦瓜不同部位的的降糖活性的研究 大量的实验研究表明，苦瓜的果汁、种子和叶子对正常老鼠【4 h 3 1 、四氧嘧 啶诱导糖尿病老鼠【* 舶】、链脲菌素诱导糖尿病老鼠【4 7 4 8 】及基因诱变糖尿病老鼠 【4 9 】都具有显著的降糖活性。 1 3 1 2 不同提取方法导致降糖效果差异性的研究 d a y 5 0 】等研究显示，苦瓜的水提物和碱性氯仿提取后的剩余物在l h 可降低 糖尿病小鼠的血糖，而经碱性水冲洗的氯仿提取物再用酸性水恢复后，其降糖 作用与前二者相比显著推迟。 1 9 9 3 年，a l i f 4 1 1 将苦瓜果汁和不含皂甙的果汁提取物的降糖效果进行了比 较研究，结果对于非胰岛素依赖型糖尿病老鼠，空腹血糖和餐后血糖都能明显 降低，而不含皂甙的果汁提取物的降糖效果更加显著。 2 0 0 1 年范玉玲【5 l 】筛选出苦瓜对化学性四氧嘧啶糖尿病模型有降糖作用的 较有效的部位，即用未加热方法直接冻干的果汁降糖效果最好。推断其降血糖 成分为水溶性受热易分解的成分。 2 0 0 2 年，r a t h i t 5 2 1 等每天给糖尿病老鼠口服苦瓜水提物2 0 0 m g k g ，进行了 为期四个月观察。结果链脲菌素诱导糖尿病大鼠在l 、2 、3 、4 个月后血糖水平 分别显著下降了6 4 3 3 ，6 6 9 6 ，6 9 7 和7 0 5 3 ；同样方法，四氧嘧啶诱 导糖尿病大鼠在4 0 、5 0 、6 0 天时血糖水平分别显著下降了1 5 3 7 0 a 。1 8 6 8 和 2 2 8 6 。 2 0 0 3 年j a s p r e e tv i r d i l 5 3 1 等人采用不同极性溶剂提取降糖成分，发现新鲜未 成熟苦瓜的水提物对糖尿病小鼠的降糖效果最佳，其效果与“g l i b e n c l a m i d e ( 优 6 江苏大学硕士学位论文 降糖) ”相当；乙醇提取物降糖效果不佳。然而，最近由a j i t l 【a r 进行的一项研 究结果表明：糖尿病小鼠在持续两周，每天注射苦瓜果实乙醇提取物 ( 2 5 0 m g k g ) ，其降糖效果与“e u g l y c e m i e ( 降糖灵) 相当。 1 3 1 3 苦瓜中降糖功效成分的研究 1 9 6 6 年，l o t l i k a r l 5 4 l 等发现，苦瓜果实中的中性成分臭苦瓜素( c h a r a n t i n ) 在 动物实验( 家免和猫) 中可显著降低血糖水平，其作用方式与甲苯磺丁脲相似， 其降糖活性强于1 丁基3 对甲苯磺酰脲( t 0 1 b u t a m i d e ) 。1 9 7 7 年，m a r q u i s t 5 5 】等发 现臭苦瓜素对空腹大鼠的降糖作用与胰岛素相当，但对四氧嘧啶型大鼠的效果 不佳。他将这一现象解释为苦瓜降糖需要臭苦瓜素与苦瓜中的其它成分的协同 作用。 19 81 年，a k h t a r 5 6 1 等通过观察苦瓜提取物不同极性成分对正常及四氧嘧啶 型家兔的降糖作用，推测苦瓜的降糖成分可能包括生物碱和类胰岛素两种类型 的物质。 1 9 8 1 年，k h a n n a 等从苦瓜中分得一种具有降糖活性的多肽，并证明它具有 口服降糖活性，因该肽提取方式和薄层层析相对迁移率与牛胰岛素一致，故该 肽又称植物胰岛素( p l a n t - - i n s u l i n ) ，该肽有1 6 6 个氨基酸残基，1 7 种氨基酸， 分子量大约为ll k d 7 1 。接下来，n gt b 等人对苦瓜中类胰岛素做了深入研究， 发现苦瓜中存在多种类胰岛素的物质【5 7 6 0 1 ，能降低高血糖模型兔和正常兔的血 糖水平。1 9 8 0 年，张世荣i 佗l 等从苦瓜中分离出分子量分别为8 0 0 0 - - - 6 0 0 0 ，2 5 0 0 - - - - 2 0 0 0 ，1 2 0 0 - 8 0 0 的3 种组分，均能降低高血糖模型小鼠和正常小鼠的血糖水 平( 下降范围2 5 - - - 4 0 ) ，而且能抑制1 2 5 胰岛素与肝细胞膜受体和胰岛素抗 血清的结合，其中分子量2 5 0 0 2 0 0 0 0 的组分在纳克级即有明显效果。3 种组 分经蛋白酶处理后，其生物活性立即消失。1 9 9 1 年，权建新等也从苦瓜果实 中分得一种白色“植物胰岛素 ，口服有效。1 9 9 3 年，陈随军报道了从苦瓜果 实中分出的降血糖蛋白p a 6 2 1 ，其等电点为5 4 - 5 6 ，分子量在3 8 0 0 0 左右。 1 9 9 8 年，王勇庆对苦瓜降血糖有效成分进行提取分离，从苦瓜中分离到两个 白色粉末状结晶：苦瓜a 素和苦瓜b 素，结果苦瓜a 素和苦瓜b 素对实验性糖 尿病小鼠和正常小鼠的血糖都有明显的降低作用【6 3 1 。经薄层层析分析可见二者 不为同一化合物，初步鉴定不是皂甙、黄酮和生物碱，说明苦瓜中降糖成分除皂 7 江苏大学硕士学位论文 甙和植物蛋白外，还有其他更强的降糖活性化合物。 目前，一般认为苦瓜的降糖成分包括：三萜类物质，如苦瓜甙：甾体类物 质，如臭苦瓜素( c h a r a n t i n ：为b 谷甾醇葡萄糖甙和5 ，2 5 豆甾二烯醇3 1 3 葡萄糖甙的等分子化合物) 等：多肽类物质，如类胰岛素多肽等：还有少量生 物碱类物质。 1 3 1 4 苦瓜降糖机理研究 长期以来，人们一直在探讨苦瓜降糖机理，但至今仍未形成定论。目前一 般认为包括以下几方面的作用。 ( 1 ) 类胰岛素作用：a k h t a r 等研究了苦瓜对正常及四氧嘧啶( s t z ) 糖尿 病兔血糖影响，结果对动物的血糖有显著降低作用：k h a n n a 等从苦瓜中分得一 种具有降糖活性的多肽，并证明它具有口服降糖活性。以上实验提示苦瓜具有 类胰岛素作用。 ( 2 ) 刺激胰岛素分泌：h i g a s h i n ot 6 4 j 通过观察苦瓜甙对糖尿病模型大鼠的 降血糖作用，推测苦瓜甙不仅有直接的类胰岛素作用，而且还有刺激胰岛素释 放的功能。a l i 4 2 】等研究显示，苦瓜果实浆汁、苦瓜种子和全株植物的醇提物对 正常及2 型糖尿病大鼠具有显著降糖作用，对l 型糖尿病大鼠模型却无降糖作 用。结果提示，苦瓜提取物可不依赖于类胰岛素作用及抑制肠道葡萄糖吸收作 用而通过直接促进胰岛素分泌( 即通过类似磺酰脲类药物作用) 降低血糖。 ( 3 ) 抗1 3 细胞凋亡、促进1 3 细胞更新或受损1 3 细胞恢复的作用：a h m e d l 6 5 j 研究了苦瓜汁对s t z 致糖尿病鼠胰腺a 、1 3 和6 细胞的作用，结果显示，苦瓜 汁治疗组大鼠1 3 细胞数量虽然明显低于正常对照组，但显著高于未治疗的糖尿 病组；而a 和6 细胞数量不受苦瓜汁的影响，提示苦瓜汁在s t z 致糖尿病鼠b 细胞更新或促进部分受损1 3 细胞恢复方面具有一定作用。 ( 4 ) 附加胰腺的作用：还有许多学者将苦瓜的降糖活性理解为一种附加胰 腺的作用【6 6 1 ，它包括：增强了肝脏和机体的葡萄糖利用率【6 7 】；增加了机体中葡 萄糖转运因子4 ( g l u t 4 ) 的输送蛋白的数量【6 8 】：抑制了葡萄糖在小肠壁的吸收【6 9 l ； 降低了肝脏中糖激酶的活力( 对照组相比糖尿病大鼠肝脏中己糖激酶，葡糖激 酶，磷酸果糖激酶，6 磷酸葡糖激酶活力分别减少了7 4 8 ，2 9 6 ，1 2 0 5 和9 0 5 5 ) 1 7 0 。 8 江苏大学硕士学位论文 1 3 1 。5 临床应用研究 在一项临床试验中，9 位非胰岛素依赖型糖尿病患者在服用苦瓜水提物后， 病人血糖水平显著降低；以煎炸的苦瓜果实，作为每天的膳食补充，结果血糖下 降不明显，然而在没有增加胰岛素水平的情况下，患者的糖耐量却显著提剐7 1 1 。 另一项临床研究显示，1 0 0 位非胰岛素依赖型糖尿病患者服用苦瓜果肉浆汁后， 8 6 的患者餐后血糖显著下降，5 的患者空腹血糖显著下降( p 血糖值 1 i 1m m o l l 者认定为小鼠糖尿病模型，小鼠标记，供模型动物用。 3 2 2 试验动物分组及给药 3 2 2 1动物分组 小鼠随机取1 0 只作为空白对照组，其余造成四氧嘧啶糖尿病模型，糖尿病模 型小鼠按血糖值分为6 组，每组1 0 只，分别为：空白组；阳性对照组：药物对照 组：组分p i 腹腔注射组；组分p i 灌胃组：组分p 2 腹腔注射组；组分p 2 灌胃组。 3 2 2 2 给药剂量和给药方法 格列苯脲按5 0 m g k g 剂量给药；苦瓜提取物p 1 p 2 按照5 0 m g l ( g 剂量给药。动 物分组后，分别按剂量和不同给药方式( 腹腔注射、灌胃) 给药，连续5 天，每天 1 次。 3 2 3 血糖f l , 3 n 定 第5 天给药前禁食1 2 h ，给药后分别于1 h 、5 h 断尾取血，测定小鼠空腹血糖值。 采用t o u c h l i 血糖试纸测定，参照t o u c h l i 血糖监测仪说明书。 3 2 4 肝糖元的测定 小鼠颈椎脱臼处死立刻取肝脏测肝糖元。 采用葸酮法测定肝糖元原的含量。 3 2 4 1 原理 提取后的糖原经酸解后与葸酮反应，在6 2 0 n m 处有最大吸收 3 2 4 2 试剂 ( 1 ) 葡萄糖标准液：l m g m l ； ( 2 ) 葸酮试剂：葸酮5 0 m g ，硫脲1 9 ，溶于1 0 0 m l 的7 2 ( v ：v ) h 。s 0 ，中， 当天配制； ( 3 ) 磷酸缓冲液( p b s ) ：0 1 m o l l ，p h 7 4 ： ( 4 ) 1 磺基水杨酸； 江苏大学硕士学位论文 3 2 4 3 肝糖元的提取 处死小鼠，取肝脏，尽量冲掉血液，称重，按重量：体积= l g ：5 0 m l ，用 p b s 制备匀浆。取匀浆0 5 m l ，加4 磺基水杨酸0 5 m l ，混匀，离心( 1 0 0 0 r p m ) 。 表3 - 1 试剂配制表 t a b 3 - 1 r e a g e n tc o n f e e t 3 2 4 4 计算 肝矧m g g 心= 绦s 。 3 2 5 试验数据处理 所有数据均用牙+ s d 表示，采用t 检验进行统计学分析，将试验组与对照组 数据进行统计处理，p 1 1 1 m m o l l ) ， 成模率为7 0 。 3 3 2 观察糖尿病小鼠生活情况 成模糖尿病小鼠有明显的三多一少糖尿病症状( 多尿，多饮水，多食，体 重减轻) ，p 2 腹腔注射组小鼠症状明显减轻。 江苏大学硕士学位论文 3 3 3 苦瓜提取物对实验性小鼠血糖值的影响 3 3 3 1 给药1 小时后小鼠血糖值 给药1 小时后小鼠血糖值结果如表3 2 所示 表3 2 给药后1 小时的血糖值 t a b 3 - 2t h ev a l u eo f b l o o ds u g a ri o ha f t e rt r e a t m e n t ( # # 表示与模型对照组相比较差异非常显著，p 0 0 1 ) 由上表可以看出，给药1 小时后，p 2 注射组有显著的降血糖效果，p 2 灌胃 组、p l 注射和灌胃组都没有降糖效果。 3 3 3 2 给药5 小时后小鼠血糖值 给药5 小时后小鼠血糖值结果如表3 3 所示： 表3 - 3 给药后5 小时的血糖值 t a b 3 3t h ev a l u eo fb l o o ds u g a r5 o ha f t e rt r e a t m e n t 给药前血糖值给约后血糖值 差值 组别小鼠只数 ， - ) ， 1 l i , m m o l l g m m o- ) l ，, r n m 0 1 l ) ， l ) 上lj 空白对照 阳性对照 格列本脲 p 。灌胃 p 。注射 p ：注射 1 0 1 0 1 0 l o 1 0 8 4 2 2 0 9 95 8 5 1 2 8 1 3 7 0 3 0 41 8 6 2 3 4 2 1 8 6 2 3 4 21 5 1 7 4 3 4 1 5 6 7 3 3 61 8 4 3 4 4 2 1 6 8 3 6 0 01 5 6 1 6 6 6 1 8 2 3 7 5 5 39 1 5 6 1 0 5 8 2 2 5 3 3 4 6 4 2 6 ” 一4 6 7 4 4 7 1 _ 0 2 4 4 3 9 0 9 7 4 6 。 p ：灌胃 81 6 0 3 3 7 31 5 4 4 5 8 60 5 9 5 0 4 ( 木木表示与模型对照组相比较差异显著，p 0 0 5 ：# # 表示与模掣对照组相比较差异1 卜常显 江苏大学硕士学位论文 著，p 0 0 1 ) 由上表3 3 可以看出，给药5 小时后，格列本脲片、p 2 注射组有显著的降 血糖效果，其中p 2 的降糖效果优于格列本脲片。p l 注射和灌胃组都没有统计学 意义，但p l 注射组血糖有所下降。 3 3 4 苦瓜提取物对实验性小鼠肝糖元影响 3 3 4 1 苦瓜提取物对实验性小鼠肝糖元影响 结果如表3 - 4 ( 牙士s d ) 表3 - 4 肝糖元测定值 t a b 3 4t h ev a l u eo f g l y c o g e n5 o ha f t e rt r e a t m e n t ( # # 表示与模型对照组相比较差异非常l 显著，p 0 0 d 从表3 4 中可以看出，p 2 、格列本脲片给药后，小鼠肝糖元比模型对照组 肝糖元显著升高，p 2 效果尤其显著。其它给药组无统计学意义。 3 3 4 2 苦瓜植物胰岛素对糖尿病小鼠肝脏的影响的观