（制浆造纸工程专业论文）纤维素酶降解蔗髓及发酵制取燃料乙醇的研究.pdf

广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成 果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经 发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研 究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： z ) 研 i 学位论文使用授权说明 7 d 加年6 月7 日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布 ( 保密论文需要注明， 0 解密后发布 并在解密后遵守此规定) 论文作者獬。了哥 刷磁轹 莎叶日 纤维素酶降解蔗髓及发酵制取燃料乙醇的研究 摘要 本论文立足于广西农业与工业发展现状，针对当前燃料乙醇产业发展， 分析和讨论了利用制糖工业的副产品一一蔗髓为原料，采用2 氢氧化钠、 2 硫酸以及5 0 乙酸过氧化氢的预处理方法，综合分析还原糖得率、傅立 叶红外光谱和x 衍射，优选出最佳的预处理方法；然后结合傅立叶红外光 谱、x - 衍射、液相色谱、扫描电镜分析蔗髓酶解前后的变化，进行纤维素 酶水解工艺条件的研究；最后摸索酶水解液的分步糖化发酵和固定化酵母 发酵的工艺条件。本论文为发展非粮食乙醇，提高蔗髓的利用率提供新途 径。研究主要结果如下： 1 通过比较三种不同的预处理方法，结果显示：2 氢氧化钠预处理蔗 髓，在改善原料化学组成、提高原料的酶解还原糖得率等方面较2 硫酸和 5 0 乙酸过氧化氢预处理效果要好。2 氢氧化钠预处理后，蔗髓的酶解还 原糖得率达3 6 3 6 ，比未预处理的提高15 7 9 ，同时预处理后蔗髓在微观 形态上出现许多裂缝、裂孔，结晶度明显下降，从5 2 3 2 降至4 8 0 6 ，降 幅达到8 1 4 。 2 蔗髓纤维素酶水解工艺优化。通过单因素实验和正交试验得出纤维 素酶水解蔗髓的最佳工艺条件为：酶用量o 0 5g g ( 绝干原料) ，底物浓度 3 0 9 t , ，反应温度5 0 。c ，p h 值5 0 ，反应时间6 0 h 。 3 单酶与双酶比较研究。蔗髓酶解液还原糖得率比较发现单一纤维素 酶水解蔗髓还原糖得率为3 7 0 1 ，而双酶( 纤维素酶与木聚糖酶) 水解还 i 原糖得率为5 0 2 4 ，还原糖得率提高3 5 7 4 。进而对酶解液进行液相色谱 定量分析，测定双酶水解液中葡萄糖与木糖的浓度分别为4 5 6m g m l 和 2 0 1m g m l ，较纤维素酶水解液中葡萄糖和木糖分别提高8 0 5 和7 4 7 8 。 4 蔗髓酶解前后的x 一衍射分析：酶解前蔗髓的结晶度为4 8 0 6 ，酶解 后蔗髓的结晶度提高到5 2 3 7 ，酶解导致蔗髓的结晶度升高8 9 7 。 5 蔗髓纤维素酶水解液发酵生产乙醇工艺优化。单因素实验和正交试 验结果显示酶水解液分步发酵生产乙醇最佳工艺条件为：氮源为硫酸铵， 酵母接种量1 2 5 ，反应时间3 d ，反应温度3 6 。c ，体系初始p h 值5 0 。 6 固定化发酵：通过比较固定化酵母发酵与游离酵母发酵方法，结果 显示：固定化酵母发酵乙醇产量是o 1 4 4 9 g ( 绝干原料) ，而游离酵母发酵 是o 1 3 5 9 g ( 绝干原料) ，固定化酵母发酵与游离酵母发酵相比较，乙醇产 量增加提高6 6 6 。 关键词：蔗髓纤维素酶发酵酶解乙醇固定化发酵 c e l l u l o s ed e g r a d a t i o na n df e r m e n t a t i o no f b a g a s s ep i t hf o rf u e le t h a n o l a b s t r a c t t h er e s e a r c hs t u d i e dt h ep r o d u c t i o no ft h ef u e le t h a n o lf r o mt h eb a g a s s e p i t h m a i n c o n t e n t si n c l u d e dt h r e ea s p e c t s f i r s t l y , w er e s e a r c h e dt h e p r e t r e a t m e n t o fb a g a s s e p i t h ；s e c o n d l y , w e r e s e a r c h e dt h e e n z y m a t i c s a c c h a r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo fb a g a s s ep i t h ；f i n a l l y , w es t u d i e de t h a n o l f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s t h em a i nr e s e a r c h e sr e s u l t s w e r ea sf o l l o w i n g ： 1 2 n a o hp r e t r e a t m e n th a dm o r ea d v a n t a g e st h a nt h e2 s u l f u r i ca c i d p r e t r e a t m e n t ，5 0 a c e t i ca c i d h y d r o g e np e r o x i d ep r e t r e a t m e n ti ni m p r o v i n g t h e s u g a ry i e l d r e d u c i n gs u g a ry i e l dr e a c h e d3 6 3 6 a f t e r2 n a o hp r e t r e a t e d ， w h i c hr a i s e d b y 15 7 9 c o m p a r e dw i t h y i e l d o f b a g a s s ep i t h w i t h n o n p r e t r e a t m e n t t h e r ew e r ean u m b e ro fc r a c k sa n dh o l e sa p p e a r e di nt h e s u r f a c eo fb a g a s s ep i t h t h ec r y s t a l l i n i t yo fb a g a s s ep i t hw a sd e c r e a s e df r o m 5 2 3 2 t o4 8 0 6 ，d o w n8 14 2 b ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m u m c o n d i t i o n s f o rt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fb a g a s s ep i t hw e r ea sf o l l o w i n g ：t h ed o s a g e so f e n z y m eo o s g g ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n3 5 9 l ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r e5 0 ( 2 ， i n i t i a lp h5 0 ，h y d r o l y s i sr e a c t i o nt i m e6 0 h i l l - 3 w ec o m p a r e dt h er e d u c i n gs u g a ry i e l db yc e l l u l a s ea n dd o u b l ee n z y m e ( c e l l u l a s ea n dx y l a n a s e ) h y d r o l y s i st h eb a g a s s ep i t h t h er e s e a r c hs h o w e dt h a t t h e r e d u c i n gs u g a ry i e l db y c e l l u l a s ea n d x y l a n a e sh y d r o l y s i s w a s 5 0 2 4 ，w h i c hr a i s e db y3 5 7 4 c o m p a r e dw i t ht h ey i e l dr e d u c i n gs u g a rb y c e l l u l o s eh y d r o l y s i s t h ed o u b l e e n z y m eh y d r o l y s i so fg l u c o s ea n dx y l o s e c o n c e n t r a t i o n sw e r e4 5 6 m g m la n d2 01 m g m l ，c o m p a r e dw i t he n z y m a t i c h y d r o l y s i so fg l u c o s ea n dx y l o s ew e r ei n c r e a s e d8 0 5 a n d7 4 7 8 4 t h ex - r a yd i f f r a c t i o ns p e c t r u ma n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ed e g r e eo f c r y s t a l l i n i t yo fb a g a s s ep i t hw a s4 8 0 6 b e f o r eh y d r o l y s i s ，t h ed e g r e eo f c r y s t a l l i n i t yo fb a g a s s ep i t hw a s5 2 3 7 a f t e rh y d r o l y s i s ，w h i c hw a si n c r e a s e d 8 9 7 5 e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fb a g a s s ep i t ht op r o d u c ee t h a n o lb yf e r m e n t a t i o n p r o c e s so p t i m i z a t i o n ，t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ：n i t r o g e ns o u r c e w a sa m m o n i u ms u l f a t e ，y e a s ti n o c u l u m1 2 5 ，r e a c t i o nt i m e3 d ，r e a c t i o n t e m p e r a t u r e3 6 c ，i n i t i a lp h 5 0 6 i m m o b i l i z e df e r m e n t a t i o nw e r es h o w e dt h a tt h ee t h a n o lp r o d u c t i o no f i m m o b i l i z e dy e a s tf e r m e n t a t i o nw a so 14 4 9 g ，w h i c hr a i s e d6 6 6 ，c o m p a r e d w i t hp r o d u c t i o no ft h ef r e ey e a s tf e r m e n t a t i o n k e yw o r d s ：b a g a s s ep i t h ；c e l l u l o s e ；f e r m e n t a t i o n ；e n z y m a t i c ；h y d r o l y s i s ； e t h n o l ；i m m o b i l i z e df e r m e n t a t i o n i v - 目录 摘要i a b s t r a ( 了r 。i i i 第一章绪论l 1 1 研究背景l 1 2 蔗髓的综合利用3 1 2 1 燃烧3 1 2 2 饲料3 1 2 3 木糖、糠醛、糠氯酸：3 1 3 纤维素的预处理4 1 3 1 物理法5 1 3 2 化学法6 1 3 3 生物法7 1 4 纤维素的酶水解研究7 1 4 1 纤维素酶7 1 4 2 纤维素酶水解机理7 1 4 3 纤维素酶水解影响因素8 1 5 纤维素的发酵9 1 5 1 乙醇发酵机理9 1 5 2 纤维素发酵的方法10 1 6 研究意义和内容1l 第二章蔗髓预处理方法的研究1 2 2 1 材料与方法1 2 2 1 1 实验材料。12 2 1 2 实验方法1 3 2 2 结果与讨论。1 6 2 2 1 蔗髓组分分析。1 6 2 2 2 蔗髓不同预处理还原糖得率分析1 6 2 2 3 蔗髓不同预处理前后红外光谱分析1 7 2 2 4 蔗髓不同预处理前后结晶结构分析1 8 2 2 5 蔗髓不同预处理前后扫描电镜分析2 l 2 3 本章小结2 2 第三章蔗髓的酶解糖化工艺研究2 4 3 1 材料与方法。2 4 3 1 1 实验材料2 4 3 1 2 实验方法2 5 3 2 实验结果与讨论2 5 3 2 1 葡萄糖标准曲线2 5 3 2 2 不同纤维素酶对蔗髓纤维素酶水解的影响2 6 3 2 3 酶用量对蔗髓纤维素酶水解的影响2 7 3 2 4 底物浓度对蔗髓纤维素酶水解的影响2 8 3 2 5 体系p h 值对蔗髓纤维素酶水解的影响2 9 3 2 6 反应时间对蔗髓纤维素酶水解的影响3 0 3 2 7 反应温度对蔗髓纤维素酶水解的影响3 1 3 2 8 纤维素酶与木聚糖协同酶解蔗髓3 2 3 2 9 纤维素酶水解的正交分析3 3 3 2 1 0 液相色谱测定酶水解液中葡萄糖、木糖含量3 5 3 2 1 1 蔗髓酶解前后红外光谱分析3 6 3 2 1 2 蔗髓酶解前后纤维结晶度的变化3 7 3 2 1 3 蔗髓酶解前后扫描电镜分析3 8 3 3 本章小结3 9 第四章酶水解液发酵生产乙醇的研究4 l 4 1 材料与方法4 l 4 1 1 实验材料4 l 4 1 2 实验方法4 2 4 2 实验结果与讨论4 3 4 2 1 紫外吸光法乙醇标准曲线4 3 4 2 2 气相色谱法测定发酵液中乙醇含量4 4 4 2 3 氮源对活性干酵母产乙醇的影响4 5 4 2 4 酵母接种景对活性干酵母产乙醇的影响4 6 4 2 5 体系初始p h 值对乙醇产量的影响4 7 4 2 6 反应时间对乙醇产量的影响。4 8 4 2 7 反应温度对乙醇产量的影响4 8 4 2 8 酶水解液发酵产乙醇影响因素的正交分析4 9 4 2 9 固定化酵母发酵5l 4 3 本章小结。5 2 第五章结论5 4 参考文献5 6 致谢6 0 攻读硕士学位期间发表论文情况6 1 广西大掌硕士掌位截咒 纤维素酶降解蔗髓及冀二醇制取燃事0 乙i i g 的a g i - 究 1 1 研究背景 第一章绪论 能源是人类文明的先决条件，是经济增长和社会发展的重要物质基础。能源技术的 每一次重大突破，都将给生产力的发展和人类社会的进步带来巨大的飞跃。 地球上能源种类很多，大体分为可再生能源和不可再生能源，可再生能源包括太阳 能，风能、生物质能、水能及由其衍生出来的生物燃料等；不可再生能源包括石油、天 然气、煤炭、核能等，其中石油、天然气、煤炭又叫化石燃料。目前在人类所消耗的能 源中，8 5 以上是石油、煤炭和天然气等不可再生能源【l 】。石油、天然气、煤炭等化石 燃料在地球上的储量是有限的，1 9 9 1 年世界石油总储量约3 0 0 0 亿吨，其中探明储量1 3 3 0 亿吨，按每年3 0 亿吨消费计算，全球石油仅能维持到2 0 5 0 年【2 卜。同时，随着化石燃料 的减少、能源需求的不断增加、以及化石燃料燃烧产物( c 0 2 、s 0 2 和氮氧化物等) 造 成的环境污染( 温室效应和酸雨等) 日趋严重，使人们对化石燃料储量的有限性和使用 的局限性有了更为深刻的认识。能源问题作为当今世界各国面对的关系国家安全和经济 社会可持续发展的中心议题，日益成为全球关注的焦点【2 1 。 目前，世界能源结构1 3 j 正在经历以化石能源消耗为主过渡到以可再生能源为主的变 革。国际能源机构( i e a ) 预测，在未来的能源结构中，石油和煤炭所占比例将逐渐下 降，天然气、核能和可再生能源将逐渐上升。预计到2 0 5 0 年，世界能源的结构：煤炭 占2 1 、石油占2 0 、天然气占2 3 、核能占1 4 、可再生能源占2 2 。 2 0 世纪中期以来，世界上许多科技人员致力于可再生能源研究，以代替不可再生能 源，燃料乙醇作为生物质能源的重要组成部分成为其中的研究热点。早在1 9 世纪科学 家就已提出利用纤维素制造酒精的技术，并在美国和前苏联建有工厂，后因石油的大规 模、低成本开发以及其经济性较差而被淘汰。1 9 7 3 年石油危机后，很多国家重新投入了 大量人力、物力来研究开发石油替代燃料( 主要是甲醇和乙醇) ，并在乙醇生产方面取 得很大进展。以美国国家可再生能源实验室( n r e l ) 为代表的研究者开展了大量的纤 维素制酒精的研究工作。 燃料乙醇是一种无色透明、易挥发、易燃烧的液体，具有良好的互溶性，燃烧性能 与矿物燃料相似，可直接用作液体燃料或与其他液体燃料混合使用。虽然燃料乙醇燃烧 时产生的热能比汽油低( 酒精2 2 1 m j l 、汽油为3 4 3 m 肌) ，但酒精的法辛烷值( r o n ) 广西大粤页士掌位谶譬纤舞u 繁酶降解蔗髓技墩醇制取燃牵i 乙醇的研究 达到1 1 l ，马达辛烷值( m o n ) 9 1 1 4 1 ，比汽油高许多，因此添加乙醇可有效地提高汽油 的抗爆性。有关研究结果显示【5 l ，国内典型催化裂化汽油中添加体积分数为1 0 的乙醇 后，其辛烷值( r o n ) 提高3 4 个单位，辛烷值( m o n ) 增加1 4 个单位。同时，乙醇 又是抗爆剂和助燃剂，因此不用添加四乙基铅或m t b e ，减少空气污染。更重要的是， 乙醇是太阳能的一种表现形式，在自然系统中，燃料乙醇可形成无污染的闭路循环，是 一种新型绿色环保型燃料。通过添加乙醇改变汽油组成，可有效降低汽车尾气排放。国 内研究【6 】结果表明，燃用e 1 5 和e 2 5 ( 乙醇体积分数为2 5 与汽油体积分数为7 5 的混 合燃料) 时，碳氢化合物含量含量比燃用汽油分别下降1 6 2 和3 0 ，c 0 2 排放分别减 少3 0 和4 7 。 目前燃料乙醇主要是利用糖类和粮食为原料，因生产工艺简单，成本较高，其产量 受到一定的限制。以美国为例，用于乙醇生产的玉米每增加2 5 0 万吨，玉米价格就会上 涨1 2 0 2 0 0 美元l ( g ，而在中国，可用于生产燃料乙醇的粮食更加有限。 农作物秸秆、蔗渣等废弃物，因其富含纤维素、半纤维素等生物质纤维的特性且价 格低廉因而成为各国研究的重点。据资料表明【7 】，植物每年通过光合作用，产生高达 1 5 5 1 0 1 0 吨植物纤维素，而用于工业或燃烧的纤维素仅占2 左右，还有很大一部分未 被利用。其中纤维素、半纤维素的总量为8 5 1 0 m 吨，因此研究开发纤维素的转化技术， 将秸秆、蔗渣、废纸等纤维物质高效地转化为燃料乙醇，对于新能源开发，环境保护具 有非常重要的现实意义。b o h l i n 锄【8 】认为全球植物纤维素每年可生产3 5 3 6 亿吨生物乙 醇。硒m t 9 认为利用全球残余农作物生产燃料乙醇的潜在生产能力可以达到3 9 2 8 亿吨燃 料乙醇年，比目前全球燃料乙醇年产量高1 6 倍。研究表明纤维素乙醇中能量的9 0 以 上为净能量，c 0 2 减排效应同样可达9 0 。美国已经决定从2 0 1 6 年停止玉米生产燃料乙 醇，大力发展纤维素依赖型燃料乙醇和其它非玉米依赖型生物能源【1 0 1 。利用植物纤维原 料生产燃料乙醇已成为新能源的发展趋势。 发展植物纤维原料生产燃料乙醇有显著的经济意义和社会效益：( 1 ) 植物纤维原料 比化石燃料分布得更均匀，具有安全保障。( 2 ) 发展植物纤维原料生产燃料乙醇可以有 效缓和粮食、饲料生产对土地的需求与燃料生产对土地的需求之间的潜在矛盾。( 3 ) 生 产植物纤维原料在肥料、农药和能量方面的投入较低。( 4 ) 生产燃料乙醇时所造成的净 温室气体排放较少，对环境影响较小。( 5 ) 生产燃料乙醇可为农村劳动力提供就业机会 丝1 1 1 1 可。 植物纤维原料数量巨大且价格低廉，随着物理学、化学及生物学等技术的飞速发展， 广西大掌硕士d q 叟论文 纤维素酶降解囊 髓及发酵制取崧：稗乙醇的研究 植物纤维原料的能源化转化和合理利用将对世界能源危机的有效缓解，实现人类、资源 与环境的和谐、有序、发展具有重要意义。 一 1 2 蔗髓的综合利用 蔗渣是目前造纸生产中的主要原料之一，在广西每年大约有1 0 0 0 万吨蔗渣是用于造 纸，而其中有2 0 - 3 0 是蔗髓，蔗髓作为蔗渣的副产品现在的利用率很低，主要是用 于燃烧、生产饲料酵母、制取木糖、糠醛、糠氯酸等。 1 2 1 燃烧 通过燃烧来提供热量已被证实为是一种不经济的利用方法，从热值上看，含水分 5 0 的蔗髓，其热值约为9 2 1 1 - - 9 8 3 9 k j k g ，按糖厂习惯计算，蔗髓与标煤比为( 3 0 - - 3 2 ) ： l ，即3 吨多蔗髓才相当1 吨标煤。目前广西的标煤每吨价格为3 0 0 , - 一4 2 0 元之间，则蔗髓 用作燃料的价值为1 0 0 - - - 1 4 0 元吨。可见，用作锅炉燃料烧掉是不经济的，没有做到物尽 所用。 1 2 2 饲料 利用蔗髓生产动物饲料是一种新兴的综合利用技术【1 2 , 1 3 】，蔗髓在纤维素酶的作用 下，纤维素水解成还原糖，进行酵母发酵生产饲料酵母( 单细胞蛋白) ，酵母蛋白质含 量达4 3 。蔗髓经碱性液蒸煮后质地变软，纤维润胀，易于消化吸收和提高适口性，再 加上糖蜜、尿素等碳源和氮源，更有利于牛中的纤维素酶杆菌把它转化为菌体蛋白。19 9 3 年江西省玉山追目集团( 前玉山糖厂) 利用造纸黑液碱化蔗髓制牛饲料，与氨化饲料相 比，牛增重提高2 2 7 4 。产品经江西省饲料质量监督检验测定，按绝干饲料计，粗蛋白 质1 7 ，, , 热1 6 2 9 k j l o o g ，成本较氨化饲料降低2 5 【1 4 1 。上世纪7 0 年代，轻工业部甘蔗 糖业科学研究所用造纸筛出的蔗髓通过稀酸蒸煮后，通气发酵增殖菌体，制成含蛋白质 约2 0 的供鱼及牛食用饲料【1 5 】。 1 2 3 木糖、糠醛、糠氯酸 木糖【1 6 , 1 7 是一种白色粉状晶，无毒，味甜，广泛用于食品、化工和国防等工业。 木糖发热量仅为蔗糖的1 3 ，可作为肥胖病人食用的低热量甜味剂，不增加血脂；可防治 龋齿，还可供忌吃蔗糖的病人如糖尿病人作为代糖品，不影响血糖值。木糖是制造木糖 醇和饲料酵母的主要原料，国内外市场需求较大。传统的化学法木糖醇生产过程如下： 半乡f 维素一z i 反应温度 底物浓度 酶用量，由极差表中 k 值可得对酶解液的最佳工艺条件组合为a 2 8 2 c 2 d 3 。即确定纤维素酶水解蔗髓最优化 方案为：p h 值5 o ，酶用量0 0 5 9 g 绝干原料，底物浓度3 0 9 l ，反应温度5 0 2 ，反应 时间6 0 h 为最优实验方案。在最佳实验条件下进行验证实验，还原糖得率达到3 7 6 9 ， 与正交实验中最高还原糖得率3 7 1 7 接近。因此，通过实验验证，说明工艺选择合理。 广西大国昀黄士掌位论文 纤维素酶降解蔗髓殁墩醇制取燃牵- 乙醇的研究 3 2 1 0 液相色谱测定酶水解液中葡萄糖、木糖含量 传统的测糖方法主要是d n s 法，其原理是利用糖的还原性，得到的是总还原糖的含 量，不利于对酶解做出准确的评价。因此，利用液相测定纤维素酶单独水解后葡萄糖、 木糖的含量以及纤维素酶与木聚糖酶共同水解后葡萄糖、木糖的含量。如图3 9 、图3 1 0 、 表3 - 4 所示。 图3 - 9 双酶( 纤维素酶与木聚糖酶) 水解蔗髓的液相色谱图 f i g3 - 9t h el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yo fe e l l u l a s ea n dx y l a n a s eo ne n z y m a t i ch y d r o l y s i so fb a g a s s ep i t h 图3 1 0 单酶( 纤维素酶) 水解蔗髓的液相色谱图 f i g3 - 1 0t h el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yo f c e l l u l a s eo ne n z y m a t i ch y d r o l y s i so f b a g a s s ep i t h - 3 5 - 广西大掌硕士掌位论文纤维素酶降解蔗髓及发酵制取燃料乙醇的研究 利用公式3 1 计算酶水解中的葡萄糖、木糖含量，其结果如表3 4 所示。 表3 _ 4 酶水解液中葡萄糖、木糖的含量 t a b l e3 - 4t h ec o n t e n t i o no f g l u c o s ea n dx y l o s ei nt h ee n z y m o l y s i sf l u i d 由图3 - 9 、图3 1 0 和表3 _ 4 可知，单酶水解液中葡萄糖的浓度为4 2 2m g m l ，木糖 的浓度为1 1 5 m g m l ，双酶( 纤维素酶与木聚糖酶) 水解液中葡萄糖的浓度为4 5 6 m g m l ，木糖的浓度为2 0 1m g m l ，这与前面d n s 法测得还原糖得率的数据相一致。 酶水解液中木糖的浓度1 1 5 m g m l 提高到2 0 1 m g m l ，葡萄糖的浓度4 2 2m g m l 提高 到4 5 6m g m l ，说明木聚糖酶主要水解蔗髓中的半纤维素，半纤维素水解可能会产生一 定量的木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、纤维二糖。 3 2 11 蔗髓酶解前后红外光谱分析 对于纤维原料而言，红外光谱法主要用于对纤维素、半纤维素和木素作定性分析， 着重是结构分析，也可用于定量分析。本节以酶解前后蔗髓为研究对象，参考有关文献 6 1 , 6 2 , 6 3 1 ，借助傅立叶红外光谱图对各种功能团出现的特征吸收峰来鉴定酶水解前后蔗髓 官能团的变化情况，了解纤维素酶水解对蔗髓结构的影响。 表3 5 红外光谱的吸收峰及其相应的结构归属 t a b l e3 5t h ea b s o r p t i o np e a l ( o fl rs p e c t r u ma n dc o r r e s p o n d i n g 波数c m j光谱归属和基团解释 3 4 0 0 3 2 0 0 2 9 1 7 1 6 6 0 1 6 3 9 8 9 5 2 9 0 0 、1 4 2 5 、1 3 7 4 1 7 4 2 分子内羟基键o - h 伸展振动 - c h 2 一，- c h 2 - c o - c = o 共轭羰基振动 p 一糖苷键振动 纤维素 半纤维素木聚糖 j r - - 西大掌硕士学位论文纤匀啊 酶降解蔗：嘲【及发酵制取燃料乙醇的研究 图3 1 1 蔗髓酶解前后傅里叶变换红外光谱图 f i g3 1 1t h ei rs p e c t r ao fb a g a s s ep i t h o np r ea n dp o s te n z y m a t i ch y d r o l y s i s a 爿；髓酶解前红外光谱图b 蔗髓酶解后红外光谱图 由表3 5 和图3 1 1 可知，蔗髓酶水解前后红外光谱图相似，只是部分吸收峰的强度 发生变化，证明没有新的化学结构和功能性基团生成，表明蔗髓在酶解前后结构变化不 明显。 3 3 7 4c m 1 是表征纤维素分子内氢键连接的羟基吸收峰，在纤维素酶水解过程中，此 吸收峰强度降低，说明分子内氢键发生断裂。这是因为内切酶和p 葡萄糖苷酶能使纤维 素被分散，纤维素结晶结构被打乱，使得纤维素酶能深入纤维素分子界面，导致纤维素 分子内氢键的破裂。2 9 2 5c m 。1 处是表征纤维素中c h 2 _ c o 一伸缩振动的吸收峰，酶解前 后，此吸收峰吸收强度几乎无变化。木聚糖的特征峰1 7 3 5 c m 1 消失，从而说明蔗髓酶解， 使得一部分的木聚糖水解成木糖，也有可能发生脱乙酰化作用，形成有机酸。此外， 1 6 5 4 c m 1 处有明显的特征吸收峰，其为醛或者羰基所引起的吸收峰，但酶水解后蔗髓在 此处的吸收峰强度减弱，说明酶水解后，表明有相当数量的c = o 共轭羰键断裂。体现p d 葡萄糖基特性8 9 8c r n 1 吸收峰的吸收强度减弱，说明酶水解导致部分p d 葡萄糖基断裂。 此键的断裂还表明酶解对蔗髓分子内氢键具有一定的破坏作用，从而使得纤维素对厌氧 菌的反应能力加强。 3 2 1 2 蔗髓酶解前后纤维结晶度的变化 p a r a l i k a r 等观察到纤维素酶水解过程中，纤维素的结晶度稍有增加。因为纤维素酶 水解作用并非局限于无定形区，而是对结晶区表面和无定形区都有作用。于是，本文采 纤维素酶降解蔗髓及发酵制取崧料乙醇的研究 用x 衍射法对蔗髓酶水解前后纤维结晶结构的变化进行了分析。 图3 1 2 蔗髓纤维素酶解前后的x 谢线衍射图 f i g3 1 2x r a yd i f f r a c t i o ns p e c t r u mo f p r ea n dp o s te n z y m a t i ch y d r o l y s i s 利用式2 2 计算结晶度，其结果如表3 - 6 所示。 表3 6 蔗髓酶解前后的结晶度 t a b l e3 - 6t h ed e g r e eo fc r y s t a l l i n i t yo fb a g a s s ep i t ho np r ea n dp o s tt r e a t m e n t s 样品结晶度 酶解前 酶解后 4 8 0 6 5 2 3 7 由图3 1 2 和表3 6 可知，纤维素酶解前蔗髓的结晶度为4 8 0 6 ，纤维素酶酶解后蔗 髓的结晶度为5 2 3 7 ，酶解导致蔗髓的结晶度提高8 9 7 ，这与管斌晔】等研究结果相同。 因为纤维素酶水解蔗髓主要发生在纤维素的无定形区和半纤维素存在区域以及纤维素 结晶区的表面，几乎很难作用于纤维素的结晶区，随着无定形区的纤维素大分子的降解， 纤维素的结晶度相应有所提高【6 5 】。 3 2 1 3 蔗髓酶解前后扫描电镜分析 利用s e m 观察蔗髓酶解前后纤维表面形态的变化，结果如图3 1 3 、图3 。1 4 所示。 由图3 1 3 、图3 1 4 可知，蔗髓酶水解前后的微观形态上存在一定的差异。酶水解 前的蔗髓，纤维结构表面平整、光滑，且结构较为致密。酶水解后，纤维结构上裂缝、 裂孔及结构层断面的表面粗糙，这可能是由于在纤维素酶与半纤维素酶的作用下，裂缝 裂孔及结构层断面的纤维素与半纤维素大量水解溶出的缘故。 3 8 纤维素酶降解蔗髓及发酵制取燃料乙醇的研究 图3 1 3 蔗髓的电镜扫描图x 1 0 0 0 ( 酶水解前) f i g 3 13s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p h so fb a g a s s ep i t h ( b e f o r ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s ) 图3 1 4 蔗髓的电镜扫描图1 0 0 0 ( 酶水解后) f i g3 1 4s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p h so f b a g a s s ep i t h ( a f t e re n z y m a t i ch y d r o l y s i s ) 3 3 本章小结 本章主要进行了蔗髓2 氢氧化钠预处理产物的纤维素酶水解条件优化，比较了蔗 髓纤维素酶水解与纤维素和木聚糖酶双酶水解的还原糖得率，并对酶解产物的结晶度和 糖类型进行了测定，主要结论如下： 1 、通过比较市场上的4 种有代表性的纤维素酶的水解还原糖得率，认为日肇雪花 牌酶对蔗髓2 氢氧化钠预处理产物的酶解效果最佳。 2 、通过单因素分析和正交优化实验，认为在一定范围内影响纤维素酶水解效果的 四个重要因子酶用量、底物浓度、反应温度、反应时间的作用大小顺序为：反应时 间 反应温度 底物浓度 酶用量，同时确定了蔗髓2 氢氧化钠预处理产物纤维素酶水解 最优化条件为：p h 值5 0 ，酶用量o 0 5g 佗绝干原料，底物浓度3 0 9 l ，反应温度5 0 ( 2 ， 反应时间6 0 h 。并测定最佳发酵条件下还原糖得率达到3 7 6 9 ，与正交实验中最高酶水 广西大掌硕士掌位论文纤维素酶降解蔗髓及发醇制取燃料乙醇的研究 解还原糖得率3 7 1 7 接近。这进一步验证了工艺选择的合理性。 3 、单酶与双酶比较研究。蔗髓酶解液还原糖得率比较发现单一纤维素酶水解蔗髓 还原糖得率为3 7 0 1 ，而双酶( 纤维素酶与木聚糖酶) 水解还原糖得率为5 0 2 4 ，还 原糖得率提高3 5 0 。进而对酶解产物进行液相色谱定量分析，测定双酶水解液中葡萄 糖与木糖的浓度分别为4 5 6m g m l 和2 0 1m g m l ，较纤维素酶水解液中葡萄糖和木糖 分别提高8 0 5 和7 4 7 8 。因此，双酶水解蔗髓能够显著增加木糖含量以提高水解还原 糖得率，水解效果比单一纤维素酶要好。 4 、蔗髓酶解前后的x 衍射分析：酶解前蔗髓的结晶度为4 8 0 6 ，酶解后蔗髓的结 晶度提高5 2 3 7 ，酶解导致蔗髓的结晶度升高8 9 7 。分析认为纤维素酶水解蔗髓主要 发生在纤维素的无定形区和半纤维素存在区域以及纤维素结晶区的表面，几乎很难作用 于纤维素的结晶区，随着无定形区的纤维素大分子的降解，纤维素的结晶度有所提高。 广西大学硕士学位论文纤维素酶降解蔗髓及发醇制取崧料乙醇的研究 第四章酶水解液发酵生产乙醇的研究 随着化石燃料的减少及化石燃料燃烧造成的环境污染日趋严重，各国都致力于可再 生能源的研究，以便最终取代化石燃料。乙醇作为一种洁净和可再生的能源，已经受到 各国政府和众多研究者的广泛重视【鲫。乙醇是来自可再生资源的最有发展前景的液态燃 料，具有清洁、安全和支持汽油充分燃烧的特点。目前国际上主要以粮食为原料生产燃 料乙醇，但是由于我国人口的众多和粮食的短缺，用粮食生产乙醇的发展规模必将受到 限制。近年来以农作物秸秆为代表的植物纤维生产燃料乙醇技术，被认为是解决未来能 源问题的重要途径，具有良好的发展前景【6 刀。我国拥有丰富且廉价的植物纤维资源，尤 其是农林废弃物，采用纤维素酶将纤维原料降解成可发酵的葡萄糖，然后用酵母发酵生 产燃料乙醇，对于开发新能源和环境保护具有重要意义【6 8 1 。 蔗髓中的纤维素和半纤维素的质量分数在6 0 以上，其基本组成单元为葡萄糖、木 糖等还原糖类，此类还原糖经酵母发酵可以转化为燃料乙醇【6 9 】。于是本文利用蔗髓酶水 解液为原料，采取分步糖化发酵的方法，着重研究酵母接种量、反应温度、p h 值、反 应时间、氮源等因素对发酵产乙醇的影响，并优化发酵工艺条件，最后通过进行固定化 酵母发酵，达到提高乙醇产量的目的。 4 1 材料与方法 4 1 1 实验材料 ( 1 ) 原料 取第二章双酶水解糖液适当浓缩作为发酵液，还原糖浓度为5 , - - - , 6 。 ( 2 ) 主要试剂 活性干酵母：湖北省安琪有限公司提供。 4 重铬酸钾溶液：按质量分数配得，摇匀，静置，备用。 无水乙醇( 色谱纯) 。 ( 3 ) 主要设备 紫外可见分光光度计：恒温水浴振荡器；a g i l e n t ( 6 8 9 0 n 气相色谱仪配a g i l e n t 7 6 8 3 自动进样器) ；电子天平；微量取样器。 广西大掌硕士掌位论文纤维素酶降解蔗胃t 及发葛莹制取燃料乙醇的研究 4 1 2 实验方法 4 1 2 1 培养基 一 种子培养基( g l 葡萄糖5 0 9 ，蛋白胨5 9 ，酵母膏5 9 ，k h z p 0 4 1 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 3 9 ，n h 4 c l l g ，p h = 7 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 发酵培养基( g l 蔗糖5 0 9 ，蛋白