（遗传学专业论文）红细菌发酵辅酶q10的研究.pdf

摘要 辅酶q l o 是人体中必需的一种醌类物质，它定位在细胞呼吸链上的黄素蛋白与细胞 色素b 之间，在细胞呼吸链上起重要的作用。辅酶q l o 是细胞中天然的抗氧化物质，具有 消除自由基、提高机体免疫力、抗衰老等功能，业已广泛应用于心脏病、糖尿病、癌症、 急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗中。 微生物是辅酶q l o 生产的重要来源。本文对红细菌( r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s ) 发酵 制备辅酶q l o 进行了研究，通过优化发酵条件及诱变筛选菌种来提高发酵的产量，为最 终投入工业生产打下基础。主要研究内容和结果如下： 通过红细菌的生长曲线的研究，确定了辅酶q i o 的发酵条件：培养温度3 0 c ，初始p h 值7 0 ，转速2 2 5 r m i n ，发酵时间7 2 h 。 采用正交分析的方法，优化了培养基中的碳源和氮源比例，得到了合适的培养基成 分：2 葡萄糖，1 蛋白胨，2 酵母粉，1 蛋白胨0 9 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，0 0 1 对羟基苯甲 酸，0 0 5 k ：h p 0 4 ，0 0 5 k h 2 p 0 4 ，0 0 2 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ，胡萝卜汁添加量为2 0 m l l 。 以红细菌为原始菌株，经紫外线诱变处理，采用抗性筛选法，直接在平板上挑取抗 对羟基苯甲酸菌株，获得一株高产量的突变株，其辅酶q 1 0 产量为4 9 3 3 m g l ，较原始菌 株提高3 0 3 。 本实验为进一步辅酶q 1 0 规模生产提供了一定的参考和操作指南，下一阶段将从基 因改造角度来提高菌种的产量。 关键词：辅酶q l o ：发酵；优化培养基；诱变；红细菌 a b s t r a c t c o e n z y m eq ioi sa l ln e c e s s a r yq u i n i n eh o m o l o gi nh u m a no r g a n s ，w h i c hi sl o c a t e d b e t w e e nf l a v o p r o t e i na n dc y t o d 咖eb ，p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h er e s p i r a t o r yc h a i no f c e l l c o e n z y m eq 10i sa na n t i o x i d a n tp r o d u c e dn a t u r a l l yi nt h ec e l l s ，w h i c hc a nf u n c t i o ni n s c a v e n g i n gf r e er a d i c a l s ，i m p r o v i n gt h ei m m u n i t yo fo r g a n i s ma n da n t i - a g i n g c o e n z y m eq 1 0 h a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nt h ec u r eo fv a r i o u sd i s e a s e ss u c ha sh e a r td i s e a s e s ，d i a b e t e s ， c a n c c r , h e p a t i t i s ，p a r k i n s o na n ds oo n m i c r o o r g a n i s m sa r ei m p o r t a n ts o u r c eo fc o qh o m o l o g s i nt h i sp a p e r ，t h es t r a i n r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u sw a ss t u d i e di no r d e rt oi n c r e a s ec o q10p r o d u c t i v i t yb yo p t i m i z i n g t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n dm u t a t i n gs t r a i n ，w h i c hl a y st h ef o u n d a t i o nf o ri n d u s t i a l p r o d u c t i o n t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n d r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： t h eg r o w t hc u r v eo fr h o d o b a c t e rc a p s u l a t u sh a sb e e ns t u d i e d ，a n dt h es u i t a b l e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fr h o d o b a c t e rc a p s u l a t u sa r ea c q u i r e d ：c u l t u r et e m p e r a t u r e ：3 0 ，i n i t i a lp h ：7 0 ，r o t a t i o n a ls p e e d ：2 2 5 r r a i n ，f e r m e n t a t i o nt i m e ：7 2 h o u r s t h ec u l t u r em e d i u mw a sa n a l y s e db yo r t h o g o n a lt e s t ，t h er a t i o no fc a r b o na n dn i t r o g e n i nm e d i u mw a s o p t i m i z e d ，a n dt h eo p t i m u m c u l t u r em e d i u mw a so b t a i n e da sf o l l o w s ： 3 g l u c o s e ，2 y e a s te x t r a c t ，0 9 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，p e p t o n e l ，p h b 0 0 1 ，0 0 5 k 2 h p 0 4 ， o 0 5 k h 2 p 0 4 ，o 0 2 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 5 n a c l ，c a r r o t2 0 m l l r h o d o b a c m rc a p s u l a t u sh a sb e e nu s e da so r i g i n a ls t r a i n ，m u t a g e n i z e dw i t hu vs c r e e n e d b ys e l e c t i n gm u t a n t sr e s i s t i n gp h b ，t h em u t a n ts t r a i nt h a tc a no v e r p r o d u c ec o e n z y m eq 10 w a so b t a i n e d ，w h i c hh a sm u c hh i g h e rp r o d u c t i v eq u a l i t i e st h a ni t sp a r e n t a ls t r a i n t h e c o e n z y m eq 10p r o d u c t i v i t yo ft h em u t a n tr e a c h e d4 9 3 3 m g lt h a tw a s3 0 3 h i g h e rt h a nt h e o r i g i n a ls t r a i n t h ee x p e r i m e n to ff e r m e n t a t i o no fc o e n z y m eq 10f r o mr h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s p r o v i d e sr e f e r e n c ea n de x p e r i m e n t a lg u i d ef o rf u r t h e re x t e n d i n gp r o d u c t i o no fc o e n z y m eq 10 i nf u r t h e re x p e r i m e n t s ，t h eg e n em o d i f i e dw i l lb eu s e dt oi n c r e a s et h ep r o d u c t i o no fc o e n z y m e q 1 0 k e y w o r d s ：c o e n z y m eq 1 0 ；f e r m e n t a t i o n ；m u t a t i o n ；o p t i m u mo f c u l t u r ec o n d i t i o n s ； r h o d o b a c t e r c a p s u l a t u 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月 日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关部门或机 构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影 印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文：在不以赢利为目的的前提下，学 校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 第一章文献综述 第一章文献综述 辅酶q 1 0 ( c o e n z y m eq l o ，c o q l 0 ) 是重要的辅酶q 类之一，是一种脂溶性化合物。 根据其在人体器官中的生理功能又称为维生素q 或维生素辅酶q i o 。 辅酶q 1 0 在自然界中分布广泛，主要存在于微生物、植物叶子、种子以及动物的心 脏、肝脏中，它是呼吸链中n a d h 脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和6 c 复合物之间的一个脂溶 性电子载体，起递氢体的作用。辅酶q i o 通过其氧化还原作用形成跨膜质子梯度，使生 物体产生重要的能量物质a t p ( c g o m e z d i a ze t a l 2 0 0 0 ) 。此外，辅酶q l o 在细胞核、质 膜、高尔基泡和溶酶体中也有发现( r l l e s t e re ta 1 1 9 5 9 ) ，可能与细胞的抗氧化和转质 膜电子运输有关。 辅酶q 1 0 最早发现于2 0 世纪4 0 年代；1 9 5 7 年美国的f r e d e r i c kc r a n e 和其合作者( f l c r a n e e t a l 1 9 5 7 ) 从牛心、老鼠肝脏中提取出该物质；同年英国的m o r t o n 教授( m o r t o n r a e ta 1 1 9 5 7 ) 从维生素a 缺陷的小鼠肝脏中也得到了这种化合物，命名为泛醌，意即广泛 存在的醌；1 9 5 8 年，f o l k e r s 等( f o l k e r sk e ta 1 1 9 7 7 ) 阐明了其化学结构并首次通过发酵 手段获得了该化合物；6 0 年代后，辅酶q 1 0 就作为心脏病的一种辅助治疗药物用于临 床( l a n g s j o e np h 19 9 9 a n df o l k e r sk 19 7 4 ) ；19 7 2 年，意大利l i t t a r r u 等发表了心脏病患 者缺乏辅酶q 1 0 的研究报告( l i t t a r r ug p e t 口正1 9 7 2 ) ；7 0 年代中期，苏格兰爱丁堡大学的 m i t c h e l l 运用化学渗透假说理论( m i t c h e l lp e ta 1 1 9 7 6 ) ，揭示了生物体内能量的转换以及 辅酶q l o 在能量转换体系中重要的质子传递作用而荣获了1 9 7 8 年的诺贝尔化学奖；8 0 年代初，随着瑞典e m s t e r 揭示出辅酶q l o 的抗氧化和自由基清除作用，特别是日本实 现了批量生产纯品辅酶q l o 的工业技术，极大地满足了临床试验对大量辅酶q 1 0 的需 求，有力地促进了辅酶q l o 临床研究的进展。同时由于色谱分析手段的应用，实现了高 效液相色谱仪对血液和组织中辅酶q i o 含量的直接检测，使得辅酶q 1 0 的临床试验在 数量和规模上都得到了迅猛发展。 1 1 辅酶q l o 的分子结构和理化性质 1 1 1 分子结构 辅酶q i o 化学名称为2 ，3 - 二甲氧基- 5 一甲基- 6 - 癸异戊烯基- 1 ，4 - 苯醌 ( 2 ，3 一d i m e t h o x y - 5 - m e t h y l 一6 - p o l y p r e n y l 一1 ，4 - b e n z o q u i n o n e ) ，结构与维生素k 类似，分子式 湖北大学硕十学位论文 为c 5 9 h 9 0 0 4 ，分子量为8 6 3 3 6 ，其分子结构为： 1 1 2 理化性质 c h 3 广- o c h 3 _ 一o 3 罕h 、 c h 2 一c h = c c h 2jn o 州啪帕ei 啊咖蝴 图卜1 辅酶q 1 0 的化学结构式 辅酶q l o 为黄色或淡黄色结晶，不含结晶水，无臭无味，熔点4 9 ，其纯度可达 9 9 以上。见光易分解成微红色物质，对温度和湿度较稳定，易溶于氯仿、二氯甲烷、 乙醚、石油醚、甲苯等溶剂，不溶于水。辅酶q 1 0 的生化性质主要来自于其分子结构中 醌环的氧化还原性和侧链的疏水性，如类异戊烯基侧链使辅酶q 1 0 具有高度的非极性， 可在线粒体内膜的磷脂双分子层的疏水区自由扩散。醌分子中虽然存在碳碳双键与碳氢 双键间的丌氕共轭体系，但x 射线分析证明，醌环不是芳香烃，不属于芳香族化合物， 它具有典型的烯烃和羰基化合物的反应性能，可以进行多种形式的加成反应和氧化还原 反应( 王宗德等1 9 9 9 ) 。研究表明( 杨学义等1 9 9 4 ) ，细胞中的辅酶q 1 0 有三种氧化还原 状态，即氧化型醌( q ) ，还原型醌( q h 2 ) 和自由基半醌( q h ) ，它的氧化还原电势量为 o 5 4 2 v ，氧化型较还原型稳定，还原态的辅酶q 1 0 比氧化态的辅酶q 1 0 具有更高的生 物活性和药理作用。辅酶q 1 0 可参与氧化还原反应、乙酰化反应和磷酸化反应以及醌 醇的结构互变等。 1 2 辅酶q 1 0 生理功能及应用 1 2 1 辅酶q l o 的生理功能 1 2 1 1 抗氧化作用 辅酶q 1 0 有氧化型( c o q l o ) 和还原型( c o q l o h 2 ) 两种存在形式，但在细胞膜内基本 上都是以还原态形式存在，从而保证了其作为抗氧化剂的有效性。在用辅酶q 1 0 防治大 鼠内毒素休克及防治离体大鼠心肌细胞缺氧试验中( 冯乐平等1 9 9 4 ) 发现，辅酶q l o 能显著提高动物或细胞存活率，显著减少组织细胞的脂质过氧化物的含量。 2 第一章文献综述 1 2 1 2 自由基清除作用 辅酶q 1 0 的氧化型和还原型均具有强大的自由基清除作用，其还原型( q h 2 ) 比氧 化型( q ) 作用强3 倍。内、外源性辅酶q 1 0 均可通过其还原型( q h ) 传递h 给自由 基，中断其连锁反应，抑制自由基对生物膜的损伤( 孙晓芳等2 0 0 4 ) 。辅酶q 1 0 在体内 可以清除多种氧化诱导剂( 如高亚氯酸盐、脂质氧化酶、过渡金属等) 诱导产生的自由 基，如氧中心自由基、碳中心自由基、单线态氧等。 1 2 1 3 稳定生物膜功能 辅酶q 1 0 可防止因过量维生素a 所产生的红细胞膜及溶酶体膜的不稳定，有助于 维持细胞膜通道的完整性。同时，辅酶q 1 0 可以抑制磷酸酶活性，加强a t p 的再合成， 防止细胞膜破裂及肌纤维结构的破坏，保护生物膜结构完整性( f o l k e r sk e ta l l 9 9 7 ) 。 1 2 1 4 对呼吸链系统的作用 生物氧化过程中的电子传递必须有辅酶q 1 0 参与，它是电子传递过程中限速反应的 关键酶。辅酶q 1 0 存在于线粒体内膜上，底物给出的电子传递到含有辅酶q 1 0 的呼吸 链上，同时递氢体将质子传递到膜外，这样就导致了膜两侧的质子梯度，从而产生a t p 。 另外p a p u c e i 等( p a p u c c il e t a 2 0 0 3 ) i a ：明了辅酶q 1 0 可以阻止细胞凋亡的传导信号，从 而减少a t p 合成代谢的所需物质。 1 2 2 辅酶q 1 0 的应用 1 2 2 1 辅酶q 1 0 在临床医学中的应用 辅酶q 1 0 在医学上的应用主要有：( 1 ) 用于急慢性病毒性肝炎、亚急性肝坏死的治 疗，对其他肝病也有一定的疗效( 周桂林等2 0 0 5 ) ；( 2 ) 用于心血管疾病( s i n g a lpk e t a 1 1 9 9 9 ) ，如缺血性心脏病、风湿性心脏病、缩窄性心包炎、心肌炎、心绞痛、心律失 常及高血压等的治疗，也用于充血性心力衰竭的辅助治疗；( 3 ) 用于癌症的综合治疗 ( f o l k e rk e ta 1 1 9 9 3 ) ，减轻放、化疗引起的某些副反应，l 临床上对于医治晚期急性癌 症患者也有一定疗效；( 4 ) 用于原发性和继发性胆固醇增多症、颈部外伤后遗症、脑血管 疾病、出血性休克等治疗( 钱雪等2 0 0 6 ) ；( 5 ) 用于治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙 周炎等，对促进胰腺功能和分泌方面也有显著作用( h e l e nf r a n k i s h 2 0 0 2 ) ；( 6 ) 用于帕金 森症的辅助治疗( 王淑英等1 9 9 4 ) 。目前，辅酶q 1 0 临床的应用范围继续扩大，其片剂已 有效地用于治疗圆形脱发症、肺气肿，其注射液对治疗支气管哮喘也有显著作用。此外， 3 湖北人学硕士学位论文 每天摄取一定剂量的辅酶q l o ，能明显增加红细胞数量( 王根华等2 0 0 2 ) ，对先天性、 再生性贫血的治疗有较好的效果。 1 2 2 2 辅酶q 1 0 在功能食品方面的应用 辅酶q l o 的发现被誉为“营养研究的里程碑”，它能大幅度改善人体细胞的用氧、 营养和免疫增强功能。当人体内辅酶q 1 0 的含量减少2 5 以后，各种疾病就可能发生。 但补充足够的辅酶q 1 0 可使人体各项功能得以保持、恢复和延缓衰老。辅酶q 1 0 还具 有提高人体免疫力、增强抗氧化性、保持青春等功效( 齐继成2 0 0 2 ) 。如今，欧美等发 达国家已将人体内辅酶q 1 0 含量的高低作为衡量人体健康与否的重要指标。 1 2 2 3 辅酶q l o 在化妆品方面的应用 辅酶q 1 0 能有效地深入皮肤，激发细胞活性，改善肤质，滋润肌肤。它具有促进皮 肤新陈代谢，加速面、手部上皮细胞呼吸链传递和a t p 产生，同时抑制皮肤脂质过氧化、 帮助修复皮肤皱纹，减少色素沉着，恢复皮肤弹性等方面的功效，有利于皮肤抗衰老、 除皱、美白和滋润。此外，辅酶q 1 0 对粉刺、褥疮等皮肤炎症也有治疗作用。对人体安 全、无刺激( 叶青等1 9 9 9 ) 。辅酶q l o 也可用于1 ：3 腔卫生制品，在牙膏中与扁柏粉、甘草 酸、维生素e 、维生素b 6 或溶菌酶配伍，可预防牙病和牙龈炎。 1 3 辅酶q 1 0 的生产方法及研究现状 辅酶q l o 的生产方法主要有3 种：动植物组织提取法、化学合成法、微生物发酵法。 其中化学合成法又可分为全合成法和半合成法。由于全合成法的路线太长，中间处理困 难，收率低没有工业生产价值，因此，目前研究较多的是半合成法。近几年发酵法的发 展也比较快，工业生产也迅速发展。下面分别对它们进行介绍： 1 3 1 动植物组织提取法 生物提取法是人们最原始的生产辅酶q l o 的方法，主要是从动物的脏器( 猪心、 牛心) 及植物( 烟草、大豆) 中提取辅酶q l o ，但由于动植物组织中辅酶q l o 含量低、 各种化学成分复杂、原料来源受限制，从而制约了辅酶q l o 的规模化生产。因此用这种 方法生产辅酶q 1 0 成本高，产品的价格昂贵。根据生物提取工艺的不同，动植物组织提 取法制备辅酶q 1 0 又可以细分为：纯碱皂化法、碱皂化法、溶剂萃取法、吸附层析法。 ( 1 ) 纯碱皂化法 4 第一章文献综述 纯碱皂化法，就是将含有辅酶q 1 0 的组织或细胞称重后加入7 ( w w ) 的焦性没食子 酸，搅拌。缓慢加入1 3 1 5 倍量1 0 的氢氧化钠一乙醇溶液搅拌，置水浴加热回流 3 0 m i n 。然后迅速冷却至室温，加入体积1 1 0 量的石油醚，将石油醚提取液用无水硫酸 钠脱水浓缩，经硅胶吸附柱层析、石油醚洗脱、除杂。再以5 ( v v ) 乙醚一石油醚洗脱， 分段收集，减压蒸馏除尽溶剂，得黄色油状物。再以无水乙醇结晶，即得橙黄色结晶体。 此法是经典的提取脂溶性物质的方法，方法简单，但成本较高，现代工业生产上有被淘 汰的趋势。 ( 2 ) 碱皂化法 在酸性水溶液中将含有辅酶q 1 0 的原料细胞破碎，l o o 加热3 h 后，加入氢氧化钠， 1 0 0 下皂化m 。皂化液用乙烷加异丙醇的混合溶剂萃取，浓缩萃取液，冷却，析除沉 淀胆固醇，上硅胶层析柱，收集含辅酶q 1 0 的溶液，浓缩，采用无水乙醇结晶，得辅酶 q 1 0 。此法省去了焦性没食子酸、乙醇溶剂。而是用酸破碎细胞直接皂化，使辅酶q 1 0 的生产成本大幅下降。 ( 3 ) 溶剂萃取法 将原料与1 5 倍的丙酮、乙醇、或乙醇7 , 醚( 3 ：1 ) 的混合溶剂回流1 5 2 0 m i n ，冷却至 室温，过滤。滤渣再反复提取两次，提取液用石油醚萃取，浓缩萃取液，得油状物。用 丙酮在低温下析除杂质后，硅胶层析纯化，无水乙醇结晶，得辅酶q 1 0 结晶粉末。此法 操作相对比较简单，但是纯化工作较困难，总体消耗较大，工业上难于推广。 ( 4 ) 吸附层析法 在7 3 0 用低浓度乙醇溶液提取含有辅酶q 1 0 的原料3 h 。提取液通过大孔树脂吸附， 低浓度乙醇洗涤，正己烷洗脱、浓缩、去除乙醇，得含有辅酶q 1 0 的油状物。用柱层析， 再经过层析柱，用9 ：1 的丙酮水溶液洗脱、浓缩，乙醇结晶，可得纯度为9 9 4 的辅酶 q 1 0 总之生物组织提取法原料来源受到限制，从而难以实现规模化生产。 1 3 2 化学合成法 辅酶q 1 0 的分子结构被发现以来，科研工作者对其化学合成的方法进行了不断地研 究和改进。1 9 5 9 年r u e g g 等人报道了利用茄尼醇为原料的合成途径，由茄尼醇转化得 到辅酶q 1 0 是顺、反异构体的混合物( 詹豪强1 9 9 9 ) ，需要进行分离，且产率只有2 0 。 1 9 7 2 年，k s a t o 对醌进行溴化，并对氢醌进行基团保护，采用n i 催化取代，使产率提 5 湖北大学硕士学位论文 高到2 8 ( 廖满媛等2 0 0 2 ) 。1 9 7 9 年，yn a r u l a l 将茄尼醇制成异戊烯锡烷，利用其较 强的亲核性，在低温条件下获得了几何构型较为满意的产品，使转化率达到5 1 ( 陈炳 志等1 9 9 9 ) 。总体而言，辅酶q 1 0 的化学合成需要3 个关键步骤：首先是合成母核化合 物( 2 ，3 二甲基5 甲基1 ，4 苯酮或氢酮) ，其次，合成出具有立体选择性的多戊烯醇或 其卤化物( 一般采用茄尼醇为出发原料) ，最后是进行两者高产率的缩合。 但是总体上，半化学合成法产率较低，且合成路线也很复杂，使得半化学合成法合 成辅酶q 1 0 的研究进展非常缓慢。1 9 8 8 年e t o nd 等人报道了利用香叶醇为原料的辅酶 q 1 0 全合成路线( e t o nd e t a l 1 9 8 8 ) 。这条路线具有步骤相对简单、原料较易得、中间 体易制备以及产率相对较高等优势。而逐步采用以香叶醇代替茄尼醇的全合成路线合成 辅酶q 1 0 ，而且这条路线也是目前惟一成功的全化学法技术。但是由于使用该技术生产 辅酶q 1 0 的合成条件苛刻，且线性不饱和侧链的合成存在一定难度，与大规模工业化生 产尚有一定的距离。 目前，辅酶q 1 0 半合成法在技术上己经比较成熟，并逐步实现了工业化。但是从烟 叶中提取茄尼醇的工艺比较复杂，且合成法中茄尼醇的纯度要求很高，一般都在9 5 以 上，这些使得化学法合成辅酶q 1 0 的成本仍然比较高( 郑奎玲2 0 0 3 ) 。另一方面，在使用 上，半化学合成法与生物提取法所得到的产品在活性上有较大的差距。原因在于生物提 取法得到的是天然的产品，其侧链为全反式，易于被人体吸收转化，而化学合成法生产 的辅酶q 1 0 ，侧链有顺式和反式两种异构体，生物活性极差，不易被人体完全吸收，从 而难以充分发挥其药理作用。 在各种辅酶q 1 0 的合成路线中，不同的方法存在不同的问题。侧链直接合成法存在 的主要问题有：( 1 ) 在侧链的合成过程中，存在如何保持双键的构型问题；( 2 ) 由于生产 辅酶q 1 0 的成本主要体现在茄尼醇的消耗上，因此减少侧链的合成步骤，提高各步的收 率，特别是提高最后的母核与侧链偶联反应的收率是降低生产成本的关键；( 3 ) 减少各步 反应的副产物也为最后产品的精制提供了更加简单、方便的方法。 侧链延长法中存在的主要问题有：( 1 ) 选择合适的偶联基团有利于提高偶联的效率， 保持分子的正确构型；( 2 ) 选用适当的保护基团，既要提高基团与被保护基团的反应效率， 又要使它在脱保护时易于离去。在全合成方法中，存在的关键问题是：( 1 ) 串联式反应的 步聚过长，总收率很低；( 2 ) 由于连接次数过多双键构型发生转化的几率增多，要保持双 键的正确构型就愈加困难。 6 第一章文献综述 1 3 3 微生物发酵法 与生物组织提取法相比，通过微生物发酵法生产辅酶q 1 0 有几个基本的优点：( 1 ) 发酵产物为天然产品，生物活性好，易被人体吸收：( 2 ) 没有原材料的制约，可通过规 模放大提高生产能力。但是要达到工业化生产还有两方面的要求：( 1 ) 有产量高且性能稳 定的辅酶q 1 0 规模化生产菌种；( 2 ) 辅酶q 1 0 的下游分离技术较复杂，分离设备要求高。 在辅酶q 1 0 的微生物发酵生产中，生产菌株的选择是首要的。迄今为止，国内外有 关辅酶q 1 0 的生产菌报道主要有：真菌类，主要有假丝酵母、隐球酵母等；细菌类，主 要有假单菌胞属、土壤杆菌属、红极毛杆菌、脱氮极毛杆菌等，还有光合细菌等。除了 应用代谢控制理论选育辅酶q 1 0 的高产突变株或重组菌株提高发酵产量外，对所选菌株 的发酵条件进行优化也是提高生产菌生产能力的有效途径。发酵过程中影响辅酶q 1 0 的合成的因素主要有培养基、培养条件、培养模式及前体物质的添加等。发酵培养基的 优化包括碳源、氮源、生长因子、前体物质等，培养条件的控制包括培养基中的p h 值 控制和溶氧控制等。从菌体中提取辅酶q 1 0 的方法主要包括如下三种： ( 1 ) 醇碱皂化法( 刘玲等2 0 0 4 ) 量取5 0 m l 的菌体，之后将菌体放入蒸馏瓶中，加入2 0 9 联苯三酚，1 6 9 氢氧化钠， 1 9 m l 甲醇，1 7 m l 去离心水，9 0 下回流l h ，在自来水下迅速冷却，然后加入5 0 m l 石油醚萃取，浸提2 3 次，静置分层，取上清液，用去离子水洗涤至中性，再以无水硫 酸钠脱水，一2 0 冷凝析出胆固醇等杂质，过滤取上清，6 0 下挥发除去石油醚，即可 获得辅酶q 1 0 的粗品，用无水乙醇溶解，待测。 ( 2 ) 碱皂化法( 邱卫华等2 0 0 4 ) 量取5 0 m l 的菌体，之后将菌体放入蒸馏瓶中，加入p h 为5 5 的酸性水，搅匀，在9 0 加热回流3 h 后，缓慢加入1 3 1 5 倍体积的氢氧化钠，再于9 0 水浴锅中回流皂化 1 h ，迅速冷却至室温，加入石油醚浸提2 3 次，静置分层，取上清液，去离子水洗至中 性，以无水硫酸钠脱水至澄清，2 0 冷凝析出胆固醇等杂质，过滤取上清，6 0 下挥 发除去石油醚，即可获得辅酶q 1 0 的粗品，用无水乙醇溶解，待测。 ( 3 ) 溶剂萃取法( y o s h i d ah e ta 1 1 9 9 8 ) 量取5 0 m l 的菌体，之后将菌体放入蒸馏瓶中，常温加入丙酮搅拌振荡抽提2 h ，得到 总的脂类提取物，并将提取液蒸馏至干，然后加入脂溶性有机溶剂，提取出辅酶q 1 0 ， 7 湖北大学硕士学位论文 2 0 。c 冷凝析出胆固醇等杂质，过滤取上清，6 0 下挥发除去脂溶性有机溶剂，即可获 得辅酶q l o 的粗品，用无水乙醇溶解，待测。 1 4 辅酶q 1 0 的鉴定与分析方法 1 4 1 可见光分光光度法 根据在碱性条件下，氰基乙酸乙酯可取代辅酶q 1 0 分子上的甲氧基生成蓝色这一原 理，取少量试样和辅酶q 1 0 标准品，分别加无水乙醇、氰基乙酸乙酯和氢氧化钾试液， 摇匀，见有显蓝色反应时，于6 2 0 n m 波长处测定吸光度。绘制辅酶q 1 0 的标准曲线， 最后计算样品中辅酶q l o 的含量。 1 4 2 紫外分光光度法 根据辅酶q 1 0 在2 7 5 n m 波长下有稳定的吸光度的特点，取辅酶q 1 0 标准样，溶于 无水乙醇，在2 7 5 n m 波长下测定其吸光度，制作辅酶q l o 的标准曲线，最后根据样品 的吸光度计算辅酶q 1 0 的含量。样品的紫外吸收曲线于标准品的曲线大体一致，但由于 在提纯辅酶q l o 时，反复使用有机溶剂，以及细胞内一些杂质的溶出，故观察到的样品 紫外吸收曲线在2 7 5 n m 波长下会有一些偏离，还有一些小的杂峰，因此用这种方法测定 辅酶q 1 0 的含量会带来一些误差。此时，可以通过层析对粗提液进一步提纯处理并结合 紫外检测来测定辅酶q 1 0 的含量。 1 4 3 高效液相色谱分析( h p l c ) 将样品的粗提液进行层析等方法进一步提纯以后，再进行高效液相色谱分析，可以 鉴定提纯效果。此时采用h p l c 检测会发现杂质种类很少，对辅酶q 1 0 的测定没有干扰。 为了进一步证实，还可以通过改变检测波长，在另一波长下对标准品与样品进行h p l c 检测。同时还可以根据辅酶q 1 0 的还原态时没有吸收峰这原理，加一定的硼氢化钠于 待测样品中，若发现刚才检测的吸收峰消失，则可进一步证实那的确是辅酶q 1 0 ，最后 通过计算吸收峰的面积得出辅酶q 1 0 的含量。 1 5 辅酶q 10 的生物合成途径 r u d n e y 于1 9 7 6 年提出了辅酶q 1 0 的微生物合成途径。包括三步：聚异戊二烯基焦 第一章文献综述 磷酸的合成、醌环核心的合成以及两者的结合。 1 5 1 聚异戊二烯焦磷酸侧链的合成 在聚异戊二烯焦磷酸合成酶( p o l y p r e n y ld i p h o s p h a t es y n t h a s e ) 催化下，法尼醇焦磷 酸( f p p ) 与类异戊二烯焦磷酸( i p p ) 发生缩合反应，形成不同聚合度的聚异戊二烯焦磷酸， 辅酶q l o 侧链的合成是由聚十异戊二烯基焦磷酸合成酶催化的。该步的合成途径与代谢 调节机制如图所示( 刘克杉等2 0 0 6 ) 乙酰c o a ( e m p 途经产生) i 忆酰乙酰c o a 硫解酶 乙酰乙酰c o a i jh m g - c o a 合成酶 b 羟基。1 3 甲基戊二酸单酰c o a i 上h m g - c o a 还原酶，2 c oi i ( n a d p h ) 甲羟戊酸( m v a ) 异戊烯基焦磷酸异构酶 异戊烯基焦磷酸( i p p ) 牛儿基焦磷酸( g p p ) 上口p 法尼醇焦磷酸( f p p ) 一二甲烯丙基焦磷酸( d m a p p ) 聚异戊烯基焦磷酸( p p p ) 一驾裟酸 胆固醇多萜醇糖蛋白合成 辅酶q 1 0 图卜2 对羟基苯甲酸的合成途径与代谢调节机制 1 5 2 对羟基苯甲酸的合成 对羟基苯甲酸为辅酶q 1 0 提供醌环，在不同生物中对羟基苯甲酸的合成途径是不同 的，在大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌中由分支酸直接产生，而在酵母菌中由分支酸或酪 氨酸代谢获得。 9 湖北人学硕十学位论文 1 5 3 聚异戊二烯基侧链转移到对羟基苯甲酸上 聚异戊二烯基侧链和对羟基苯甲酸合成后，由对羟基苯甲酸聚异戊烯焦磷酸转移 酶( p h b p o l y p r e n y t r a n s f e r a s e ) 将聚异戊二烯侧链转移到对羟基苯甲酸上。微生物体内辅 酶q i o 合成中该步是由对羟基苯甲酸聚十异戊二烯基焦磷酸转移酶( p h b d e c a p r e n y t r a n s f e r a s e ) 催化的，所形成的化合物经过脱羧，邻位羟基化和甲基化生成甲氧 基苯酚，再经过酚基对位羟化，氧化及聚异戊二烯基团邻位甲基化，形成5 一脱甲氧基辅 酶q 1 0 ，再经5 位羟基化和甲基化后就生成辅酶q 1 0 ( g r u n l e r j e ta 1 1 9 9 4 ) 。 1 6 辅酶q 1 0 高产菌的育种策略 1 6 1 发酵菌株 用于工业生产的菌种首先要求不产生生物毒素或其它有害物质，同时要求菌种具有 高的产物表达量，其次要求发酵周期短，对营养物质要求低且不易退化变异( 袁静等 2 0 0 4 ) 。迄今为止，国内外报道的辅酶q i o 生产菌株主要有：酵母菌属( 如假丝酵母、尚 德尔酒香酵母、隐球酵母等) ，细菌属( 主要有假单菌胞属、土壤杆菌属、红极毛杆菌、 脱氮极毛杆菌、氢极毛杆菌等) ，还有霉菌( 如三孢布拉氏霉) 等( 张克旭等1 9 9 8 ) 。 1 6 2 营养缺陷型突变株的选育 根据辅酶q 1 0 生物合成的代谢调节机制，减弱或切断辅酶q i o 的分支途径( 如由 分支酸到色氨酸、预苯酸到l - 苯丙氨酸、对羟基苯丙酮酸到l 酪氨酸代谢支路) 即有 可能提高辅酶q l o 产量。通过选育色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的营养缺陷型，不仅可以 解除色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸对d a h p 合成酶的协同反馈抑制或单一芳香族氨基酸对 d a h p 合成酶的反馈抑制，而且可节约碳源，使中间产物分支酸更多地用于合成辅酶 q i o 。刘克杉以根癌土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 为原始菌株，通过用亚硝基胍 及硫酸二乙酯的双重诱变处理，筛选到酪氨酸、天冬氨酸双重缺陷型的突变株，其辅酶 q 1 0 产量较原始菌株提高了9 1 2 8 ( 刘克杉等2 0 0 5 ) ：o l s o n 和r u d n e y 发现类胡萝卜 素与辅酶q i o 均以聚异戊二烯为前体物进行合成代谢，减少类胡萝卜素的生成量可能会 促进辅酶q 1 0 的生物合成( o l s o n e o 1 9 8 3 ) 。因此，选育类胡萝卜素缺陷型的突变株可 提高辅酶q i o 的含量；y o s h i d a 以类球红细菌k y - 4 1 1 3 为出发菌株( y o s h i d ah e ta 1 1 9 9 8 ) ， 1 0 第一章文献综述 初始的辅酶q 1 0 含量为2 4 m g g 干细胞，进行突变育种，筛选出类胡萝卜素缺陷型的高 产突变株c l - 3 7 、c o 2 2 、c o 一2 2 1 1 分别较出发菌株提高了8 8 、1 5 0 、2 6 3 ，目前日 本已经利用诱变菌株c o 2 2 1 1 进行发酵生产，其产量可达到7 7 0 m l 发酵液 ( e i z i l u 19 9 3 ) 。 1 6 3 代谢拮抗物抗性突变株的选育 解除阻遏物对辅酶q 1 0 合成或其相关合成代谢的反馈作用也可增加辅酶q l o 的产 量。抗辅酶q 1 0 合成反馈抑制的结构类似物主要有：l 乙硫氨酸( 合成辅酶q l o 的前 体l 甲硫氨酸的结构类似物) 、红霉素、维生素k 3 以及一些芳香族化合物( 辅酶q 1 0 的结构类似物或呼吸系统的抑制剂) 等。潘春梅以放射型根瘤菌( r h i z o b i u m r a d i o b a c t e r ) w s h 2 6 0 1 为原始菌株，以放线菌素d 抗性作为筛选高产辅酶q 1 0 突变株的 筛选模型，经紫外线和亚硝基胍复合诱变，得到了辅酶q i o 的高产菌株( 潘春梅等2 0 0 4 ) ， 再通过摇瓶试验优化培养，最终使辅酶q 1 0 产量达3 4 m g l ，是诱变和优化前产量的3 6 倍；蒋昵真( 蒋昵真等2 0 0 6 ) 以辅酶q 1 0 产生菌c p u 0 4 0 2 为原始菌株，经紫外线照射 和离子束注入诱变，用含辅酶q l o 结构类似物和呼吸链抑制剂的抗性平板定向筛选辅酶 q 1 0 高产菌，结果辅酶q l o 产量从1 8 1 9 l ag g 干菌重提高到2 8 7 51 1g g 干菌重，比原始 菌株提高了5 8 ：r u p e r t 等对锁掷酵母属( s p o r i d i o b o l u sr u i n e n i a ) 用紫外线、n t g 等方法 诱变后在含百草枯，维生素k 3 或抗霉素等平板上筛选出具有抗性的诱变株，后再经发 酵条件的优化，辅酶q 1 0 产率由原来的0 9 2 m g g d c w 提高到3 1 2 m g g d c w ，生物量由 原来的1 8 l 提高到7 3 6 9 l ( p f a l l e r e ta l 2 0 0 4 ) ：吴品芳利用y 射线、紫外线诱变三孢 布拉氏霉，筛选到了一株l 甲硫氨酸抗性菌j s f 4 - j 8 ，其辅酶q 1 0 产量达2 0 5 1 m g l ， 比原始菌株j s f 4 提高了4 6 ( 吴品芳等2 0 0 6 ) ，在此基础上，又增加了d 酪氨酸和对 氨基苯丙氨酸抗性标记，得到了具双重抗性标记( l 甲硫氨酸和d 酪氨酸或对氨基苯丙 氨酸) 的突变株j s f 4 j d 5 及j s f 4 j b l ，其辅酶q 1 0 产量分别达2 4 8 2 m g l 及2 7 2 8 m g l ， 较菌株j s f 4 j 8 分别提高了2 1 和3 3 ，而较原始菌株j s f 4 产量分别提高了7 6 7 及 9 4 2 。 1 6 4 利用基因工程技术构建辅酶q i o 工程菌 利用分子生物学技术找到辅酶q l o 生产菌株的关键酶基因一2 ，3 二甲氧基5 甲基 6 癸异戊烯基苯醌合成酶基因，通过重组d n a 技术筛选带有目标基因的细胞，将目的 湖北大学硕士学位论文 基因引入生产菌株( 如酵母菌等) ，增强合成目的产物的能力，这是构建辅酶q 1 0 发酵重 组菌株的基础。国内外已在大肠杆菌中实现辅酶q 1 0 的合成或将大肠杆菌中的关键酶基 因克隆到光合细菌中并强化表达，得到辅酶q 1 0 高产菌株。近年来，科研人员对参与辅 酶q l o 生物合成的基因进行了研究并取得了一定成果，但是由于辅酶q l o 合成步骤复 杂，参与的基因较分散，构建合适的基因工程高产菌还需要较长的时间。 利用分子生物学技术，将产辅酶q 1 0 的关键酶基因通过基因载体引入到大肠杆菌 中，使关键酶基因拷贝数增加并高效表达，从而增强辅酶q 1 0 的合成能力，这就是基因 工程构建发酵产辅酶q 1 0 菌株的基本路线。在微生物细胞中合成辅酶q 1 0 的限速步骤 为其核心结构苯醌环的前体对羟基苯甲酸( p h b ) 与侧链结构聚异戊二烯焦磷酸( v v v ) 的 缩合反应，催化该反应的酶为对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶( s i b e r tm 1 9 9 2 ) 。 在大肠杆菌中，该酶是由l a b i a 基因编码，对长链聚异戊二烯焦磷酸底物( p p p ) 的聚合长 度专一性要求不高，对底物的识别具有相对宽广的专一性；而侧链聚异戊二烯焦磷酸的 形成则是由聚异戊二烯焦磷酸合成酶所决定的，它催化法尼基焦磷酸( f p p ) 与类异戊二 烯焦磷酸( i v p ) 的缩合，形成一定聚合度的聚异戊二烯焦磷酸，决定了辅酶q 的种类( 周 雪峰等2 0 0 1 ) 。在大肠杆菌中，该酶是由i s p b 基因编码( k e n i e h i a s a i 1 9 9 4 ) ，最终产生 辅酶q 1 0 ，若通过灭活其i s p b 基因并引入外源性聚十异戊二烯焦磷酸合成酶基因，则 有可能在大肠杆菌中构建辅酶q 1 0 的生物合成的体系。 通过酶切、回收所需片断，并经p c r 扩增得到了氧化葡糖杆菌聚十异戊烯焦磷酸 合成酶基因( d d s a ) 。通过测序发现与其他异戊烯焦磷酸合成酶基因具有同源性 ( 3 0 0 - - 5 0 ) ，将其克隆到表达型载体上，诱导表达融合载体，在聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( s d s p a g e ) 上出现相应的条带。范怡选择了l o 种不