（制糖工程专业论文）假单胞菌属no2120产d甘露糖异构酶的研究.pdf

摘要 摘要 假单胞菌属n o 2 1 2 0 产d 甘露糖异构酶的研究 学科、专业：工科、制糖工程 硕士研究生姓名：张荆 指导老师：童群义教授 本论文对出发菌株假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 进行紫外诱变，进行了两轮诱变 之后筛选到了2 株酶活较高的菌株n o 2 1 2 0 和n o 2 1 3 7 。但是传代实验表明n o 2 1 2 0 遗 传稳定性好。 用d i s c h e 所介绍的半胱氨酸咔唑法测定d 甘露糖异构酶活力，我们在实验的基础 上对该方法进行了改进，并对新方法从试剂加入顺序、显色时间、显色温度、稳定性、 半胱氨酸盐酸盐溶液的有效时间、甘露糖对显色反应的影响、重现性、回收率、最低检 出限等方面进行了考查，确定了简便快捷，可靠的测定方法。 确定了该菌株产酶的最佳摇瓶产酶条件：发酵初始p h 7 0 ，培养温度3 0 ，装液量 5 0 m l 2 5 0 m l ，摇床转速2 0 0 r m i n ，接种量4 。 通过单因子实验、p l a c k e t t b u r m a n 实验设计、响应面分析法对假单胞菌属n o 2 1 2 0 产d 甘露糖异构酶的培养基进行优化：果糖1 5 3 ，玉米浆粉2 ，酵母膏o 2 ，k z h p 0 4 0 2 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，n a c l0 0 5 ，t w e e n 8 00 1 5 。采用优化配方酶活可以达到 6 8 2 8 u m l 最佳产酶时间为3 6 h 。 通过单因素实验和正交实验得出超声波破碎提取d 甘露糖异构酶最佳工艺条件为： 输出功率4 5 0 w ，每次辐射时间5 s ( 间歇时间5 s ) ，工作总时间5 5 m i n ，每克细胞的缓 冲液加入量为5 m l g 。 粗酶液先后通过硫酸铵分级沉淀、透析脱盐得到初步纯化的d 甘露糖异构酶。对 d 甘露糖异构酶酶法制备d 甘露糖的工艺进行了初步研究：采用缓冲液p h 值为7 5 ， 反应温度为5 5 ，反应时间为3 2 h ，但是增加底物浓度对转化率影响不大。 关键词：假单胞菌属；d 甘露糖异构酶；紫外诱变；d 甘露糖 a b s t r a c t a b s t r a c t s t u d yo nd m a n n o s ei s o m e r a s ep r o d u c e db yp e s u d o m o n a ss p n o 212 0 s u b j e c t & m a j o r ：e n g e e r i n g & s u g a rp r o d u c i n gp r o j e c t n a m eo fm a s t e rc a n d i d a t e ：z h a n gj i n g s u p e r v i s o r ：p r o t o n g q u n y i i nt h i ss t u d y , t h ep a r e n t a ls t r a i np s e u d o m o n a ss p w a su l t r a v i o l e tm u t a t e d a f t e rt w o r o u n d sm u t a g e n e s i s ，t w os t r a i n s ( n o 212 0a n dn o 213 7 ) o b t a i n e dw e r eb e s ts t r a i n s 嘶mh i 曲 e n z y m ea c t i v i t y b u tt h er e s u l tp r o v e dt h a tn o 2 12 0h a ds t e a d yt r a n s m i s s i b i l i t y n e a c t i v i t yo fd m a n n o s ei s o m e r a s ew a sd e t e m i n e db yt h ei m p r o v e dm e t h o db a s e do n t h ec y s t e i n e - c a r b a z o l et e s ti n t r o d u c e db yd i s c h e w eh a v ei m p r o v e di tf o rc o l o rt e s tt i m e ， c o l o rt e s tt e m p e r a t u r e ，s t a b i l i t y , t h ee f f e c t i v et i m eo fc y s t e i nh y d r o c h l o r i c d e ，t h ee f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o no fr e a c t i o np r o d u c t s as i m p l ea n dc o n v e n i e n t ，r e l i a b l em e t h o dw a ss e tu p 、i t l l g o o dr e p r o d u c t i o n , r e c o v e r yr a t ea n dt h el i m i to fd e t e r m i n a t i o nb yi m p r o v i n gc y s t e i n e c a r b - a z o l et e s t n ec o n d i t i o no ff l a s kf e r m e n t i o nw a sd e t e r m i n e d ：i n i t i a lp h7 0 ，t e m p e r a t u r e3 0 c ， m e d i u mv o l u m e5 0 m lo fp e r2 5 0 m ls h a k i n gf l a s k ，t h es p e e do fr o t a r ys h a k e r2 0 0 r m i n ，s e e d v o l u m e4 i no r d e rt oi n c r e a s et h ep r o d u c t i o no fd - m a n n o s ei s o m e r a s e ，t h ec u l t u r em e d i u mo fp e s u d o m o n a ss p n o 212 0w a so p t i m i z e dt h r o u g hs i n g l e - f a c t o r ，p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g na n d r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ：f r u c t o s e1 5 3 ，c o r ns t e e pp o w d e r2 ，y e a s te x t r a c to 2 ， k 2 h p 0 40 2 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5 ，n a c l0 0 5 ，t w e e n - 8 00 15 t h ey i e l do fd - m f l n n o s e i s o m e r o s ec o u l dr e a c h e d6 8 2 8 u m lu n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n i nt h i sp a p e r ，u l t r a s o n i cw a v ew a su s e dt od i s r u p tt h ec e l lo fp s e u d o m o n a ss p n o 212 0 a f t e r s i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t a n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t , t h eo p t i m u md i s c r u p t i o n c o n d i t i o n s ：o u t p u tp o w e r4 5 0 w , e a c hd u r a t i o no fr a d i a t i o nt i m e5 s ( w i t ha 5 si n t e r v a l ) ，t o t a l w o r k i n gt i m e5 5 m i n ，t h ea m o u n to f p h o s p h a t eb u f f e rp e rg r a mc e l l s5 m l g d - m a n n o s ew a si s o m e r i z e df r o md - - f r u c t o s eu s i n gd - m a n n o s ei s o m e r o s ei nf o u rf o r m s ： p ho fb u f f e rw a s7 5 ，t e m p e r a t u r ea n dt i m eo fr e a c t i o nw e r e5 5 a n d3 2 h ，r e s p e c t i v i l y b u t t h er e a c t i o n p r o g r e s s e ds t e a d i l y w i t h o u ts i g n i f i c a n ti n h i b i t i o na ti n c r e a s i n gs u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s k e y w o r d s ：p s e u d o m o n a ss p ；d m a n n o s ei s o m e r a s e ；u l t r a v i o l e tm u t a g e n e s i s ； d m a n n o s e i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获 得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 签名：剑 日期：矽7 年忽月易日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：蛆一 导师签名： 吼叫年嗍r 6 日 引言 1 引言 1 1d - 甘露糖的结构与性质 甘露糖分子式c 6 h 1 2 0 6 ，分子量1 8 0 1 6 ，密度1 5 3 9 。有直链和环状两种结构。其与 果糖为同分异构体。构型有d 和l 两种，自然界常见的是d 一甘露糖( 结构图1 ) 。它 味甜，是蔗糖的0 6 倍，葡萄糖的0 8 6 倍左右，略带苦的后味，具有还原性，可被微生 物发酵。 = h l l 嚣：匿i 了o hh o o h h o 墨一 图1d - 甘露糖的结构 f i g 1t h e s t r u c t u r eo fd m a n n o s e d 甘露糖为白色粉末结晶，晶形有0 【型和p 型。a 和d 均为半缩醛式，都有变旋现 象，在水溶液中0 【型【q 】d 2 0 = + 2 9 3 。- - + 1 4 6 。，p 型【仅】d 2 0 _ - 1 7 。- - + 1 4 6 。( 平衡) ，纯净的d - 甘 露糖的平衡混合物中0 【型和b 型各自所占的比例分别为6 4 和3 6 。在过饱和d 甘露 糖溶液中加入0 【型或p 型晶种，则可以析出相应的结晶体【l 】。 1 2d 一甘露糖的应用 在食品方面，甘露糖作为糖类，无疑首要的用途是甜昧剂，用于食品饮料的添加剂； 在医药方面的应用，甘露糖对糖尿病、肥胖病、便秘和高胆固醇等疾病患者有良好的辅 助治疗作用；在饲料方面，d 甘露糖可能会削弱一些细菌附着在鼠类肠组织上的能力 【2 4 1 。美国得克萨州科研人员从1 9 9 7 年开始研究，他们用试管对d 甘露糖以及另外几种 糖的这种能力进行了审查和对比，结果表明，d 甘露糖显示出的效果最佳，在实验中它 抑制了9 0 以上的细菌附着，并在生活的肉用仔鸡上进行实验。甘露糖无不良作用，它 天然存在与糖类中。除此之外，它还会产生代谢变化，象葡萄糖一样，成为家禽的一种 能量来源。 甘露糖还是其衍生物的前体，通过甘露糖衍生的化合物更多、用途更广。目前较为， 熟知的是甘露醇，甘露醇比甘露糖运用的要广，它是低热量甜味剂、口香糖及果糖的防 粘剂、营养的增补剂、组织的改良剂及片剂的赋形剂。在工业上可用于塑料行业制造松 香酸脂及人造甘油树脂、炸药、雷管( 硝化甘露醇) 等。在医药上是良好的利尿剂，可降 低颅内压、眼内压，是急救药的首选药之一【3 】。 江南大学硕士学位论文 1 3d 一甘露糖的来源 1 3 1 从自然界植物中提取 用象牙果、椰子壳在硫酸中水解，利用其难溶于乙醇的特性，加入乙醇使甘露糖沉 淀，得到较纯净的甘露糖，而过程中产生的寡糖则溶于乙醇中被去除。这样得到的甘露 糖熔点为1 3 3 ， a d 2 0 = + 2 9 0 - - + 1 4 0 ，主要是0 【型甘露糖，此生产方法一直被沿用。这 种方法需要大量的植物，受地域、季节的影响，对环境保护也不利i lj 。 近几年，大部分棕树籽除了出口日本和西欧等国用作牛饲料外，其余基本上无其他 用途。直接从棕树籽中降解分离得到d 甘露糖的方法，产率可达3 0 左右。本方法简 便、产率高、易于大量生产，将为我国甘露糖来源开辟了一条途径，也为棕树籽的利用 找到了出路1 6 j 。 1 3 2 化学法 葡萄糖异构化【7 】：葡萄糖在钼酸盐催化下，差向异构部分转化生成甘露糖，对葡萄 糖甘露糖混合液进行液相加氢后，可以用来制备晶体甘露醇，同时联产液体山梨醇。 此法产生的甘露糖醇和山梨糖醇难分离，且成本高。 国内也有报道介绍咖啡渣在酸性条件下水解制取d 甘露糖【8 j 。 1 3 3 酶法转化生成d - 甘露糖 据报道，由于我国半纤维素资源丰富，中国科学院微生物所利用分离我国极端环境 的微生物，完成了d 甘露低聚糖酶中试发酵工艺，应用该酶开发了酶法生产甘露低聚糖。 1 9 9 3 年，日本宫崎大学与田野制药株式会社合作，从土壤分离到假单胞菌m i 生产 耐6 0 。c 高温甘露糖异构酶，d 。甘露糖异构酶可将d 果糖可逆性转化成d 甘露榭9 1 。可 以生产出大量廉价的甘露糖，使生产成本大大降低。此法有很大的发展潜力。 1 4d 一甘露糖异构酶的研究现状 d 甘露糖异构酶( e c5 3 1 7 ) 可催化d 甘露糖到d 果糖的可逆异构化作用。这样 就可以用价格便宜的d 果糖生产d 甘露搪，这是降低生产成本的理想途径。国外对此 研究的也较少。 p a l l e r o n i 和d o u d o r o i t t l o 】最先在嗜糖假单胞菌中发现了这种新型的酶d 一甘露糖异 构酶，他们描述这种酶是第一种与游离己糖有高度亲和性的异构酶。水田芹黄单胞菌u l j 也同样被发现产d 甘露糖异构酶。 t a k a s a k j 【1 2 1 等利用土壤中分离到的假单胞菌m i 产生耐热甘露糖异构酶。在o 1 md 甘露糖，p h 7 0 条件下反应3 0 m i n ，其最适温度约为6 0 。高于5 0 酶不稳定。 2 0 0 3 年，j u nh i r o s e ，t a k a s a k i 9 1 等用固定化放射形土壤杆菌细胞将d 果糖连续异 构化成d 甘露糖，该研究将产生耐热d 甘露搪异构酶的放射土壤杆菌m 1 菌株的细胞， 吸附到在壳聚糖或和戊二醛交联( 含清蛋白) 固定化。反应柱中的固定化细胞可以在5 5 2 引言 进行连续反应生产d 甘露糖。部分纯化的d 甘露糖异构酶已经固定化，用于d 果糖到 d 一甘露糖转化，其连续反应是在一个温和的温度下( 4 0 ) 进行。 a 卜nh e y f e r g u s o n l l 4 】等使耻垢分枝杆菌m s m e g m a t i s 细胞在以甘露糖做唯一 碳源的培养基上生长，其细胞产出甘露糖异构酶，酶纯化后，催化d 一甘露糖到d 果糖 的可逆转化效率可提高6 0 倍。酶容易制备，而且相对稳定。 1 5 酶法转化生成d 一甘露糖 d 甘露糖异构酶( e c5 3 1 7 ) 能将d 果糖转化为d 甘露糖，反之亦然，同时也能 使d 来苏糖异构成d 木酮糖，但是对其他糖类没有作用，例如d 、l 鼠李糖，d 、l 海藻糖，d 葡萄糖，d 核糖，d 、l 木糖，d - 5 可拉伯糖等。 1 6 立题依据、意义及研究内容 1 6 1 立题依据及意义 我国d 甘露糖及其衍生物甘露醇落后的生产现状与良好的市场前景形成非常不协 调的发展态势。为了摆脱不利局面，主要任务是进行合成技术的改进，扩大规模，提高 质量，以满足市场需求。同时加大下游产品生产与应用的研究力度，促进d 甘露糖及 其衍生物甘露糖醇生产与发展。因此，必须寻求新的技术、新的原料生产高质量、价格 低廉的甘露糖。 原有的生产方式由于存在成本高、生产条件苛刻、分离难或受环境影响等各式各样 的缺点而受到限制。而微生物发酵法由于不受原料的限制，分离过程相对简单，越来越 受到人们的重视。目前发现的最经济的方法是利用微生物产d 甘露糖异构酶，可将廉 价的果糖转化为d 甘露糖。 1 6 2 本课题研究内容 ( 1 ) 假单胞菌属诱变育种的初探； ( 2 ) 半胱氨酸咔唑法测定酶活力方法的确定； ( 3 ) 摇瓶发酵条件的优化； ( 4 ) 产酶发酵培养基的优化； ( 5 ) d 甘露糖异构酶的提取条件、初步纯化； ( 6 ) 初步研究d 甘露糖异构酶转化d 果糖到d 甘露糖的工艺条件。 江南人学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 菌种 假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 中国工业微生物菌种保藏中心保藏。 2 2 培养基 斜面及平板培养基( ) ：牛肉膏0 3 ，蛋白胨0 。5 ，琼脂1 5 ，p h 7 0 1 种子培养基( ) 葡萄糖0 1 ，酵母膏0 3 ，p h 7 。0 1 初始发酵培养基( ) 葡萄糖1 0 ，酵母抽提物0 3 ， k 2 h p 0 4 0 2 ，p h 7 0 。1 2 1 灭菌2 0 。 2 3 主要试剂 葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、牛肉膏、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、d 甘露糖、d 果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、尿素、七水硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、氯化钠、七水硫 酸铁、可溶性淀粉、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化锂、硫酸、d l 半胱氨酸盐酸盐、 无水乙醇、柠檬酸、硫酸铵、氯化钙、氯化钡、氯化钴、氯化钠均购于国药集团化学试 剂有限公司：硫酸铵、氯化铵购于中国医药( 集团) 上海化学试剂公司，硫酸铜购于中 国亭新化工试剂厂( 上海) ，硫酸锌购于中国金山化工厂( 上海) ，以上均为分析纯试 剂。 吐温2 0 、吐温6 0 、吐温6 0 均购于国药集团化学试剂有限公司，咔唑购于中国远航 试剂厂，以上均为为化学纯试剂；鱼粉蛋白胨和琼脂购于国药集团化学试剂有限公司， 均为生化试剂。玉米浆粉由泰州市一鸣生物制品有限公司提供。 2 4 主要仪器 s w c j 1 f 型超净工作台，苏州净化有限公司；手提式压力蒸汽灭菌锅，上海医用 核子仪器厂；2 0 0 0 型分光光度计，尤尼科( 上海) 仪器有限公司；j y d 9 0 0 智能超声波 破碎仪，上海之信仪器有限公司；h h $ 2 1 6 型恒温水浴，上海精密仪器厂；j - 2 0 x p l 高 速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；h y g i i a 型旋转式摇床，上海新蕊自动化 设备厂 2 5 实验方法 2 5 1 培养方法 ( 1 ) 种子培养：取生长良好的斜面菌种5 环，接种子装有种子培养基床培养1 5 h 。 ( 2 ) 发酵培养：吸取5 ( 体积分数) 种子发酵液至装有适当发酵培养基的2 5 0 m l 三角瓶中，3 0 。c 振荡培养4 8 h 。 2 5 2 粗酶液的制备 发酵液冷冻离心( 4 ，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ) ，弃去上清液，向沉淀中加入0 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液( p h 7 o ) ，洗涤2 次，最后沉淀分散于磷酸盐缓冲液( p h 7 00 0 5 m o l l ) 4 材料与方法 悬浮，终体积是原发酵液的1 5 ，然后在冰浴条件下进行超声波破碎( 4 5 0 w ，5 5 m i n ) ， 冷冻离心( 4 ，1 5 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ) ，上清液即粗酶液。 2 5 3 试剂的制备 ( 1 ) 果糖标准溶液【1 5 】：称取分析纯果糖1 2 5 0 m g ( 于5 5 。c 真空干燥恒重) ，用去 离子水溶解，定容至2 5 m l ( 5 m g m l ) ，存放于冰箱备用，使用时稀释1 0 0 倍( 5 0 9 9 m l ) 。 ( 2 ) 0 1 2 ( w v ) 酒精咔唑溶液：称取咔唑3 0 0 m g ，用无水乙醇溶解并定容至 2 5 m l ，放置在棕色瓶中，2 4 h 后使用。冰箱保存，长期可用，用时，取出部分平衡至室 温。 ( 3 ) 1 5 ( w v ) 半胱氨酸盐酸盐溶液：称取生化试剂d l 一半胱氨酸盐酸盐0 3 7 5 9 ， 用蒸馏水溶解，并稀释定容至2 5 m l 。 ( 4 ) 7 0 ( v v ) 硫酸溶液：量取分析纯浓硫酸4 5 0 m l ，在不断搅拌下徐徐倒入 1 9 0 m l 蒸馏水中。 ( 5 ) 0 1 m o l ld 甘露糖溶液：称取无水d - 甘露糖0 4 5 9 ，用p h 7 0 ，0 0 5 m o l l 磷 酸盐缓冲液定容至2 5 m l 。 2 5 4 酶活力测定方法 半胱氨酸咔唑法【1 6 1 ，根据实际情况改进。吸取1 5m ld 甘露糖( 0 1 m o l l ，用p h 7 0 o 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液配制) 于试管中，加入0 5 m l 粗酶液，5 0 反应3 0 m i n ，取0 2 m l 的反应液，加入0 8 m l0 5 m o l l 的h c l 0 4 中止反应，再经适当稀释，测定果糖的质量浓 度。在相同条件下，以同样加入体积的0 0 5 m o l lp h 7 0 磷酸盐缓冲液作对照。在取2 5 m l 具塞试管分别加1 0 m l 稀释一定倍数的反应液及对照反应液，然后每管中加入6 0 m l 硫酸溶液，0 2 m l 半胱氨酸盐酸盐溶液，摇匀，立即加入0 2 m l 咔唑酒精溶液，剧烈震 荡，于6 0 水浴中保温1 0 m i n ，取出冰浴冷却5 m i n ，用1 0 m m 光径的比色皿，在5 6 0 n m 波长下比色。 d 甘露糖异构酶酶活定义1 9 ：以d 甘露糖为底物，l m l 发酵液每分钟转化生成ll x g 果糖所需的酶量为一个酶活力单位，u m l 。 酶活( u m l ) = 稀释倍数转化生成的果糖量( “g m l ) 转化时间( m i n ) 2 5 5d - 果糖转化率的测定 2 5 5 1 转化率的定义 采用高效液相色谱法( h p l c ) 测定反应一段时间后，酶转化得到的d 甘露糖的量 与反应体系中加入的d 果糖的量的比值，即为d 果糖的转化率。 2 5 5 2 转化率的测定方法 采用高效液相色谱( h p l c ) 色谱型号：w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱仪h p l c 色谱柱：s u g a r p a k l ，6 5 m m i d 3 0 0 m m 柱温：8 5 流动相：纯水，流速为0 4 m l m i n2 4 1 0 示差折光检测器 2 5 6 假单胞菌属诱变育种的初探 2 5 6 1 紫外诱变出发菌株种子液的生长曲线测定 从诱变育种的角度出发，为了保证处理时具有一定的细胞浓度，以增加可能变异的 细胞总数，处于对数生长期的细胞对诱变剂敏感，易筛选到突变菌株，常选用对数生长 中后期的细胞供诱变处理【1 7 】。 本实验采用比浊法测定出发菌株种子液的生长曲线。将出发菌株取5 环接种于种子 培养基中，3 0 培养。每隔3 h 取出一定体积种子液，在6 0 0 n m 波长下测定o d 值，以时 间为横坐标，以o d 值为纵坐标作图，可以得到出发菌株的生长曲线，以空白种子液为 空白。选取对数生长中后期的种子液制成单细胞悬液。 2 5 6 2 单细胞悬液的制备 诱变处理的菌体呈单细胞分散状态，可以均匀地接触诱变剂，提高诱变效果。一般 情况下，使用物理诱变剂处理时，用生理盐水配制成菌体的单细胞悬液i l 引。 将培养至对数生长期的出发菌株菌液10 0 0 0 r m i n ，离心10 m i n 得到菌体，弃去上清 液洗涤2 次，再用无菌生理盐水( o 8 5 的n a c l 溶液) 悬浮，在己灭菌、装有玻璃珠的 三角瓶中振荡o 5 h ，即制成细胞悬液。 2 5 6 3 紫外诱变剂量的确定 诱变剂的最适剂量应该是使所希望得到的突变菌株在存活群体中占有最大的比例， 这样可以减少以后的筛选工作量。剂量的大小常以致死率和变异率来确定。 2 5 6 4 致死率的计算 取5 m l 制备好的菌悬液移入6 e r a 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒，开启紫 外灯( 1 5 w ，照射距离3 0 c m ) 预热3 0 m i n 。打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，分别照射 o 、3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 、1 5 0 、1 8 0 、2 1 0 、2 4 0 s 。以未经紫外照射的菌液作对照，分别取 紫外照射和未经紫外照射的菌液l m l ，经适当稀释分离。取0 1 m l 菌液涂平板，每组三 个平皿，平板用黑布或牛皮纸包裹【l9 i 。置于3 0 培养4 8 h ，用平板菌落计数法计数，计 算不同时间的致死率。 致醚呦= 塑型黑菩怒产心。 2 565 菌种初筛 初筛的目的主要是简单快速淘汰掉大量的负突变株以及生长速度较慢的菌株，减轻 摇瓶筛选的工作量。初筛对生产性能测定的准确性要求较低，方法也要简单易行1 2 们。采 用半胱氨酸咔唑法【l6 1 。在平板上随机挑选5 0 个突变株，接于斜面培养，编号n o 1 5 0 。 每个突变株采用种子培养基，3 0 培养1 5 h ，以5 ( 体积分数) 接种量接入发酵培养 基中，3 0 * ( 2 振荡培养4 8 h 。取1 0 m l 发酵液离心( 4 ，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ) ，用磷 6 材料与方法 酸盐缓冲液( p h 7 0 ，0 0 5 m o l l ) 洗涤菌体2 次，弃去上清液。菌体中加入o 1 m ld 甘 露糖液( o 1 m o l l ，用p h 7 00 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液配制) ，5 0 ，反应3 0 m i n 。 本实验总共进行2 轮紫外诱变，每次筛选出的产酶量较高的突变株同前述方法进行 下一轮紫外诱变。 2 5 6 6 摇瓶复筛 将初筛获得的菌株按顺序编号，对初筛挑选出来的较好菌株接种于5 0 m l 2 5 0 m l 种 子培养基，于3 0 ，振荡培养1 5 h 后，以5 的接种量接种至5 0 m l 发酵培养基，每株 菌做3 个平行，3 0 ，振荡培养4 8 h ，按2 5 4 所述测定酶活，选出酶活较高的菌株。 2 567 遗传稳定性的测定 将通过诱变筛选得到的产d 甘露糖异构酶活力较高的菌株连续培养6 代，每代都 进行摇瓶培养，测定酶活力，确定诱变菌株是否稳定。 2 5 7 半胱氨酸一咔唑法快速测定d _ 甘露糖异构酶酶活力方法的确定 2 5 7 1 试剂加入顺序的试验 。 取0 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ，o 8 m l5 0 1 , t g m l 果糖标准溶液于具塞试管中( 准备2 组) ， 用蒸馏水补足到l m l 。第一组先加0 2 m l1 5 半胱氨酸盐酸盐，再加入6 0 m l7 0 硫 酸溶液，摇匀后立即加入0 2 m lo 1 2 酒精咔唑溶液，剧烈震荡：第二组则是先加入硫 酸溶液后，立即加入0 2 m l1 5 半胱氨酸盐酸盐，摇匀，立即加入酒精咔唑溶液，剧烈 震荡。两组均置于6 0 下显色1 0 m i n ，取出急冷，于5 6 0 n m 比色。 2 5 7 2 显色温度的选择 取0 1 m l 酶反应液，经适当稀释，吸取l m l 溶液，在每管中加入6 0 m l7 0 硫酸 溶液，0 2 m l 半胱氨酸盐酸盐溶液，摇匀立即加入0 2 m l 酒精咔唑溶液，剧烈震荡，分 别在3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 的温度下显色1 0 m i n ，取出急冷，于5 6 0 n m 比色。以 同样稀释倍数的磷酸盐缓冲液( p h 7 00 0 5 m o l l ) 为对照。 2 5 7 3 显色时间的选择 取0 1 m l 酶反应液，经适当稀释，吸取l m l 溶液，在每管中加入6 0 m l7 0 硫酸 溶液，0 2 m l 半胱氨酸盐酸盐溶液，摇匀立即加入0 2 m l 酒精咔唑溶液，剧烈震荡，在 已确定的温度下显色5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 m i n ，取出急冷，于5 6 0 n m 比色。以 同样稀释倍数的磷酸盐缓冲液( p h 7 00 0 5 m o l l ) 为对照。 2 5 7 4 显色稳定性 取0 4 m l5 0 i - t g m l 果糖标准溶液于试管中，用蒸馏水补足到l m l ，加入6 0 m l7 0 硫酸溶液，0 2 m l 半胱氨酸盐酸盐溶液，摇匀立即加入0 2 m l 酒精咔唑溶液，剧烈震荡， 在6 0 的水浴中保温1 0 m i n ，冷却时间分别取5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、6 0 、1 9 0 、1 2 0 m i n ， 测定吸光值。 7 江南人学硕上学位论文 2 5 7 5 半胱氨酸盐酸盐溶液的有效时间 取0 4 m l5 0 p g m l 果糖标准溶液于试管中，用蒸馏水补足到l m l ，加入6 0 m l7 0 硫酸溶液，加入0 2 m l 分别放置了2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2h 的半胱氨酸盐酸盐溶液，摇 匀立即加入0 2 m l 酒精咔唑溶液，剧烈震荡，于6 0 的水浴中保温1 0 m i n ，取出急冷， 于5 6 0 n m 比色。 2 5 7 6 底物( 甘露糖) 浓度显色的影响 在l m l 溶液中，使果糖的浓度不变( 2 5 p g m l ) ，体系中d 甘露糖分别稀释0 、 5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 倍，在确定的显色条件下显色，比较不同浓度的底物对果糖测定的 干扰。 2 5 8 摇瓶发酵条件的优化 2 5 8 1 初始p h 对菌种产酶的影响 用h c l 和n a o h 将基础培养基初始p h 分别调成5 0 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、9 0 ， 培养4 8 h 后测定酶活力，以确定合适的初始p h 。 2 5 8 2 发酵温度对产酶的影响 在基础培养基中接种后，分别置于2 6 、2 8 、3 0 、3 2 、3 4 c 培养4 8 h 后，测定酶活， 以确定合适的培养温度。 2 5 8 3 装液量及转速对产酶的影响 在已确定条件的基础上，在2 5 0 m l 的摇瓶中分别装入3 0 、5 0 、7 0 、9 0 m l 基础培养 基，接入种子液进行摇瓶发酵，测定酶活力，以确定装液量；然后改变摇床转速1 6 0 、 18 0 、2 0 0 、2 2 0 、2 4 0 r m i n ，测定酶活力，以确定合适的摇床转速。 2 5 。9 发酵培养基的优化 2 591 最适碳源的选择 改变初始产酶培养基中碳源的种类，分别以1 ( w v ) 的d 甘露糖，葡萄糖，果糖， 蔗糖，可溶性淀粉，乳糖，麦芽糊精作为碳源进行摇瓶发酵试验，测定酶活，进行最适 碳源的筛选。 2 5 9 2 最适氮源的选择 以2 ( w v ) 蛋白胨，2 ( w v ) 黄豆粉，2 ( w v ) 牛肉膏，2 ( 呐) 玉米浆粉，0 2 ( w v ) 酵母抽提物，2 ( w ，v ) 玉米浆粉和0 2 ( w v ) 酵母抽提物复合，2 ( w v ) 尿素，2 ( w v ) 硫酸铵，2 ( w v ) 氯化铵，5 种有机和3 种无机氮源进行最佳氮源的筛选。 2 59 3 最适无机盐的选择 以果糖为碳源，2 ( w v ) c f i 米浆粉和0 2 ( w v ) 酵母抽提物复合物为氮源，分别以 0 0 5 ( w v ) 的m g s 0 4 7 h 2 0 ，m n s 0 4 ，c a c l 2 ，n a c i ，f e s 0 4 7 h 2 0 作为无机盐进行筛选。 8 材料与方法 2 594t w e e n 的选择 在前面已优化的培养基条件的基础上，分别添加o 2 的t w e e n 2 0 ，t w e e n 6 0 ， t w e e n 8 0 进行实验。 2 595pia c k e t t - b u r m a n 设计筛选影响产酶的主效因子 p l a c k e t t b u r m a n 实验设计法是由r l p l a c k e r 和j p b u r m a n 于1 9 4 6 年提出的部分因 子设计法【2 。该方法虽然不能考察各因子之间的交互作用，但它可以利用最少的实验次 数，从众多所考察的因素中快速有效地筛选出主要的影响因子。根据单因素实验选取对 产酶有影响的6 个因素，选取了n = 8 的p l a c k e t t b u r m a n 试验设计，每一个因素取1 和 + 1 两个水平，但对某个因素两水平的差值不能过大，以隐盖了其他因素的重要性【2 2 1 。 + l 水平取1 水平的1 2 5 倍，以d 甘露糖异构酶的酶活作为响应值( y ) 。 2 596 最陡爬坡实验 通过p l a c k e t t b u r m a n 实验设计，可以剔除非关键因素，但由于所得数学模型本质上 是多元线性方程，只能指出各关键因素的调整方向，难以胜任确定关键因素最佳浓度范 围的任务。而响应面拟合方程也只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区 域，拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义【2 3 】。所以，优化工作的第 二步就是要寻求种既能改善现有实验水平，又能快速有效地接近最优点邻近区域的方 法，这样才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡实验以实验值变化的梯度方向为爬 坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最大响应区域阴】。 通常取通过区域中心并且垂直于拟合曲面等高线的直线为最速上升路径。沿着路径 的步长与拟合的一阶模型的回归系数的符号和大小成比例。实验中实际的步长多是根据 经验或实际需要来确定的。 2 597 响应面实验设计 响应面方法综合了实验设计和数学建模，它可以通过局部实验回归实验因素与响应 值之间的函数关系。中心组合设计( c e n t r a lc o m p o s h ed e s i g n ) 是一种最为常用的响应面 方法。该方法可以利用有限的实验次数，评价各因子的影响，并能分析各因子之间相互 作用的程度。根据实验值可以得到各因素水平及其相互作用与响应值之间关系的二次多 项式，通过回归此式可以对各因子进行优化，得到最佳组合。 2 5 10 超声波破碎提取d _ 甘露糖异构酶 发酵液冷冻离心( 4 ，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ) ，弃去上清液，向沉淀中加入0 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液( p h 7 0 ) ，洗涤2 次，再用相同浓度的磷酸盐缓冲液( p h 7 0 ) 悬浮，然 后在冰浴条件下进行超声波破碎，冷冻离心( 4 ，1 5 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ) ，上清液即 粗酶液。 2 5 1 1d 一甘露糖异构酶的初步纯化 2 5 1 1 1 ( n h 4 ) 2 s 0 4 分级盐析曲线的绘制 9 垩堕查兰堡圭堂垡丝兰 经最佳超声波破碎条件提取的粗酶液，用洲h 4 ) 2 s 0 4 进行分级盐析1 2 s l 。冰浴中磁力 搅拌器下分段缓慢加入( n h 4 ) 2 s 0 4 粉末( 研磨过的) 至1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、 6 0 和7 0 饱和度，4 。c 静置过夜，离心，测定不同饱和度上清液的酶活力，由此确定 d 甘露糖异构酶分段盐析所需要的硫酸铵的饱和度。 2 5 1 1 2 ( n r h ) z s 0 4 分级盐析 根据盐析曲线，在粗酶液中先加入低饱和度的( n h 4 ) 2 s 0 4 量，4 静置过夜后离心得 上清液，再向其中加入( n i - h ) 2 s 0 4 达到高饱和度，离心收集沉淀，然后用p h 7 0 的磷酸 盐缓冲液( o 0 5 m o l l ) 将其溶解，透析过夜，得到初步纯化的粗酶液。 2 5 12d 一果糖到d 一甘露糖的酶转化工艺 2 5 1 2 1 反应体系的p h 值对酶法制备d 甘露糖的影响 分别采用p h 6 5 、p h 7 0 、p h 7 5 、p h 8 0 、p h 8 5 的反应体系研究p h 对酶法制各d - 甘露糖的影响。反应体系( 1 m l ) ：果糖浓度2 0 0 m g m l ( 用0 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液配 置) ，d 甘露糖异构酶粗酶液，反应温度为5 5 ，用h p l c 测定d 甘露糖的浓度，分 析不同p h 条件下，转化率随时间变化的曲线。 2 5 1 2 2 温度对d 果糖到d 甘露糖转化率的影响 文献【2 5 l 所报道的d 甘露糖异构酶的最适温度在5 5 c 左右且在此温度之下都有较好 的稳定性，温度超过5 5 c 后酶活明显下降，选用5 0 。c 、5 5 c 和6 0 。c 的反应体系进行反应， 反应体系( 1 m l ) ：果糖浓度2 0 0 m g m l ( 用0 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液配置) ，d 甘露 糖异构酶粗酶液，反应p h 7 5 ，用h p l c 测定d 甘露糖的浓度，分析不同温度下，转化 率随时间变化曲线。 2 5 1 2 3 转化时间对d 果糖到d 甘露糖转化率的影响 反应体系( 1 m l ) ：果糖浓度2 0 0 m g m l ( 用0 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液配置) ，d - 甘露糖异构酶粗酶液，反应p h 7 5 ，反应温度为5 5 。c ，反应分别进行1 2 h 、2 2 h 、3 2 h 、 4 2 h 、5 2 h ，用h p l c 测定d 甘露糖的浓度，分析不同反应时间对转化率的影响。 2 5 1 2 4 底物浓度对d 果糖到d 甘露糖转化率的影响 反应体系( 1 m l ) 中底物果糖浓度分别为1 0 0 m g m l 、2 0 0 m g m l 、3 0 0 m g m l 、 4 0 0 m g m l ( 用0 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液配置) ，d 甘露糖异构酶粗酶液，反应p h 7 5 ， 反应温度为5 5 ，反应3 2 h 后用h p l c 测定d 甘露糖的浓度，分析底物浓度对转化率 的影响。 1 0 结果与讨论 3 结果与讨论 3 1 假单胞菌属诱变育种的初探 3 1 1 出发菌株种子生长曲线的测定 g 苫 o 03691 21 51 82 12 42 73 0 时间( h ) 图2 出发菌株的生长曲线 f i g 2g r o w t hc u r v eo fp a r e n t a ls t r a i n 图2 表明，6 1 5 h 为对数生长期，在一个较短的延迟期后，菌株开始进入对数期， 至对数生长末期时菌浓度达到最高值，培养15 h 后进入平衡期，菌体浓度基本保持不变。 因此，选用培养至1 2 1 5 h 的种子液制备单细胞悬液，进行诱变处理。 3 1 2 紫外诱变剂量的确定 紫外线能使多种生物体致死和产生突变，其中也包括细菌【2 6 弓0 1 。紫外线能诱发微生 物突变的有效波长范围是2 0 0 - - - 3 0 0 n m ，最有效的波长为2 5 3 7 n m ，