（制糖工程专业论文）低色素出芽短梗霉的选育及其培养条件优化.pdf

中文摘要 中文摘要 短梗霉多糖是一种由出芽短梗霉发酵生成的胞外多糖。本文主要研究了低色素出芽短梗霉的选 育、培养条件的优化、发酵罐验证实验和产品的分离提纯等。 ， 首先通过紫外线、硫酸二乙酯( d e s ) 诱变，获得一株低色素出芽短梗霉变异株g 一5 8 ，发酵液 颜色白色，吸光度0 3 0 0 ，最终p h 值稳定在3 4 _ 3 5 ，多糖产量1 9 2 9 l 以上；发酵性能稳定。由 单因素实验和正交实验所得各种数据及推论，可以总结出以下结论：当蔗糖5 0 l ，m g s 0 4 0 4g l ， ( n h 4 ) z s 0 40 4 9 l ，酵母膏0 3 9 l ，n a c l4 9 l ，k h t p o t6 9 l 时，选用3 6 h 接种龄，2 ( v v ) 接种量，在 2 8 条件下发酵出芽短梗霉，短梗霉多糖产量达到2 3 9 l ，发酵液的吸光度0 0 4 。 然后进行发酵罐验证实验，得到如下结论：结果基本与前面结论一致，以搅拌速度与通气量的 不同组合发酵，搅拌速度4 0 0 r m i n 、通气量3l m i n 是最佳组合，多糖产量达到2 4 1g l 糖转化 率达4 8 2 。 最后由以上发酵过程研究和多糖分离提纯单因素及正交实验的各种数据，可总结出以下结论： 在最佳发酵条件的基础上，将1 2 0 h 短梗霉多糖发酵液加蒸馏水稀释5 倍，以4 0 0 0 r m i n 的速度离心 3 0 m i n 分离菌体，将上清液p h 值调为7 0 ，经7 0 热处理( 灭酶) l o m i n 后冷却至室温，加3 倍体积 的9 5 乙醇，搅拌，4 c 放置1 2 h ，使短梗霉多糖充分沉淀，再以4 5 0 0 r m i n 的速度离心1 5 m i n 分离 多糖沉淀，粗多糖用6 5 酒精洗涤3 次后过滤或离心，经6 0 热风干燥得到纯品。 短梗霉多糖产量约为2 0 9 l ；提纯得率为8 9 2 ，最终产品纯度为9 5 2 ，多糖呈雪白色、易溶 于水，与标准品类似。 关键词：出芽短梗霉短梗霉多糖菌种诱变选育发酵提纯 m a b s t r a c t a b s t r a c t p u l l u l a ni sa l le x o p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c e db ya u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s t h i sa r t i c l eh a dar e s e a r c ho n t h em u t a t i o na n ds c r e e n i n go fa u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sw i t hr e d u c e dp i g m e n t a t i o n ，o p t i m i z a t i o no fm e d i u m a n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s ，m e d i u mf e r m e n t a t i o na n dt h ep u r i f i c a t i o n f i r s t l y , ap i g m e n t f r e em u t a n ta u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sg 一5 8w a sg o tb yu va n dd e s t h ec o l o ro f f e r m e n t a t i o n j u i c ew a sm i l kw i t ho dv a l u e0 3 0 0 ，p hw a s3 4 - 3 5 p u l l u l a np r o d u c t i o nw a s1 9 2 9 ma tl e a s t a c c o r d i n gt ot h ef o r m e rr e s u l t ，t h i sc o n c l u s i o nw a sr e c e i v e d ：w h e ns u g a r5 0 9 l ，m g s 0 4 0 4g l ，( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 o 4 9 l ，y e a s te x t r a c to 3 9 m ，n a c l4 9 l ，k 2 h p 0 46 e d l ，i n o c u l u mt i m e3 6 h ，i n o c u l u ma m o u n t2 ( v v ) ，2 8 c ， t h ep u l l u l a np r o d u c t i o nw a s2 3 s l ，o di so 0 4 s e c o n d l y , t h em e d i u mf e r m e n t a t i o nc o n c l u s i o nw a sc o n s i l i e n tw i t ht h ef o r m e rr e s u l t w h e nt h es t i r v e l o c i t y4 0 0r m i na i rf l u x3 l m i n ，t h ep u l l u l a np r o d u c t i o nr e a c h e dt o2 4 1g m ，s u g a rt r a n s f o r m a t i o nr a t e w a s4 8 2 f i n a l l y , t h ep u r i f i c a t i o nc o n c l u s i o nw a sg o tt h a t ：a f t e r1 2 0 hf e r m e n t a t i o n ，d i l u t et h ef e r m e n t a t i o nj u i c e 5t i m e s ，c e n t r i f u g a ls e p a r a t i o ni n4 0 0 0 r m i nf o r3 0 m i n ，t u r nt h ep hv a l u eo fu p p e rl i q u i dt o7 0 ，h e a tw i t h 7 0 f o r1 0m i n ，a d d e d3t i m e sa l c o h o l ( 9 5 ) ，s t i r r e d ，k e p t1 2 ha t4 4 ，c e n t r i f u g e da t4 5 0 0 r m i nf o r 15 m i n ，w a s h e dw i t ha l c o h o l ( 6 5 ) f o r3t i m e s ，c e n t r i f u g e da g a i n ，d e s i c c a t e da t6 0 ，t h ep u r i f i c a t i o n p r o d u c t i o nw a so b t a i n e dw i t ht h ey i e l do f2 0 9 l ( 8 9 2 ) t h ep r o d u c t i o n sp u r i t yw a s9 5 2 t h e p r o d u c t i o nw a sw h i t ec o l o r ，d i f f i u e n ta n ds i m i l a rt ot h es t a n d a r dp u l l u l a n k e yw o r d s ：a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n ，p u l l u l a n ，m u t a t i o na n ds c r e e n i n g ，f e r m e n t a t i o n ，p u r i f i c a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：- 二i l l 日期：砷年6 月一日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：2 盆导师签名： 日期：砂7 年易月，勺e t ， 第一章绪论 第一章绪论 1 1 短梗霉多糖定义及其化学结构 1 1 1 短梗霉多糖 短梗霉多糖，英文称之为p u l l u l a n ，而中文中有“普鲁兰”、“茁霉多糖”、“茁霉聚糖”、“短梗霉 多糖”以及“卜多糖”等众多同义词。现短梗霉多糖一词比较通用。短梗霉多糖是出芽短梗霉 ( a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) 在培养过程中利用糖代谢产生的细胞外水溶性多糖。 1 1 2 短梗霉多糖的结构 n 图1 - 1 ：短梗霉多糖的化学结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo f p u l l u l a n 短梗霉多糖是一种中性大分子，聚合物相对分子质量一般在4 8 x 1 0 4 2 2 1 0 6 ( 商品普鲁兰糖平 均相对分子质量为2 x 1 0 5 ，大约由4 8 0 个麦芽三糖组成) ，聚合度1 0 0 5 0 0 0 。其相对分子质量的大小 受培养条件的影响较大，控制发酵条件可固定其相对分子质量于一定范围。初始p h 、磷酸盐浓度直 接影响其相对分子质量大小；培养温度、通气量以及因细胞过度培养而产生短梗霉多糖酶( 普鲁兰 酶) 使多糖发生降解等多种因素对其相对分子质量的大小也有一定的影响。 1 9 6 1 年b e n d e r 等人发现了短梗霉多糖酶，它专一水解q - 1 ，6 一葡萄糖苷键，其水解产物为麦芽 三糖。在此基础上w a l l e n f e l s 等人确认短梗霉多糖是一种由3 个a - 1 ，4 一糖苷键连接的麦芽三糖经 a l ，6 一糖苷键聚合而成的直链多糖，通过深入的研究发现，多糖链中的麦芽三糖重复单位有时会被 麦芽四糖，偶尔也会被麦芽糖和葡萄糖残基所取代。此外，除了线状主链结构外，有些多糖还存在 较多的麦芽三糖支链结构。 1 2 短梗霉多糖的理化性质及其在食品中的应用 1 9 6 2 年b o u r e n g 等人发现短梗霉多糖含中性和酸性两种组分。e l i n o v 等人发现中性多糖具有典 型的麦芽三糖重复单位的线状结构。 短梗霉多糖，无味无臭，无毒，易溶于水、二甲基甲酰胺，溶液粘稠稳定，呈中性，不溶于乙 醇、油脂、丙酮和氯仿等有机溶剂。 1 2 1 无毒性、安全性 无论是急性、亚急性和慢性试验，还是变异源性试验都表明，短梗霉多糖不引起任何生物学毒 性和异常状态，用于食品和医药工业安全可靠。 1 2 2 耐热性 短梗霉多糖具有很好的耐热性，粉末状短梗霉多糖对热的反应与淀粉相同，与其它高分子材料 不同，它的炭化不产生有毒的气体。 1 2 3 耐盐性 不同浓度的盐分含量不会影响短梗霉多糖溶液的粘度。短梗霉多糖在用作食品添加剂时其溶液 浓度不因食盐的存在而起变化。 江南大学硕士学位论文 1 2 4 耐酸碱性 短梗霉多糖属于中性多糖，粘度受温度、p h 值影响小，有很好的耐酸性能。短梗霉多糖在p h 3 ( 常温条件) 时才发生水解。而在碱性条件下加热焦化着色。 因此短梗霉多糖常用于高盐食品和调味料的增稠，如酱油、虾酱。增稠效果明显优于其它多糖， 如刺槐豆胶、卡拉胶。 1 2 5 酶解性 短梗霉多糖在动物消化器官内酶作用下消化得很慢，利用它的低消化性，可制低热量食品和饮 料。短梗霉多糖还具有使双歧杆菌增殖和治疗便秘的作用。 自然界微生物产生的脱支酶可使其水解，因此，短梗霉多糖可以降解，不污染环境。 l - 2 6 可塑性 短梗霉多糖的可塑性强，可以用来制膜，任意造型。它的成型物不需要添加增塑性和稳定性物 质。 短梗霉多糖溶液能与其它高分子材料如c m c 、海藻酸钠、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸等有很好的共 溶性，因此，在食品中可以与其它的聚合物添加剂混合使用。 短梗霉多糖水溶液有滑爽的感觉，具有改善口感的作用。 1 2 7 成膜性 短梗霉多糖具有透明性、硬度强、有光泽、耐油、可热封、可食、表面摩擦系数小、弹性强、 但延伸率低等特点。短梗霉多糖可直接制成薄膜，或在物体表面涂抹或喷雾涂层也可成为紧贴物体 的薄膜，薄膜的最特殊性质是比其它高分子薄膜的透气性能低，氧、氮、二氧化碳等几乎完全不能 通过。薄膜还具有较大的透湿性。短梗霉多糖粉加入适量水后，经加热，加压即可形成弹性好、易 染色的包装材料。该产品废弃后不污染环境，可谓一种无公害的塑料。质量浓度为5 的短梗霉多糖 和质量浓度为5 的甘油形成的膜具有较高的阻气性和拉伸强度。故短梗霉多糖是一种极有前途的保 鲜材料，以及理想的医用生产原料。 短梗霉多糖在粘弹性、乳化性、可塑性等方面十分优良。可利用涂膜和辊压法制成不同厚度的 膜，也可直接在物体表面涂抹成膜。短梗霉多糖膜具有玻璃纸样光泽及透明度和强度，耐油、耐热 封，可食。短梗霉多糖膜作为食品保鲜膜广泛应用于水果、蔬菜、鸡蛋，特别是含油食品，如火腿、 方便面、肉等。殷小梅等把短梗霉多糖用于温州蜜柑常温保鲜，结果表明，用l 短梗霉多糖溶液 涂膜的柑橘贮藏1 4 0 天后好果率仍有8 5 9 5 ，比用聚乙烯膜单果包装高3 1 9 0 ，有效延长了柑橘采 后寿命。鸡蛋保鲜中昭儿3 儿劓，在1 5 - 2 5 。c 下，未做处理的鸡蛋保存2 0 天已不能食用，而利用含短梗霉 多糖处理后，同样条件下，保鲜期延长5 6 倍。火腿生产中最大的问题是p o v ( 超氧化值) 超标， 用取代度1 0 的短梗霉多糖醋酸酯涂膜，在5 下保存6 个月，外观不见发霉，p o v 值仅对照组的 1 4 。王长海晗儿副等在海产品保鲜方面研究表明，以短梗霉多糖溶液做被膜荆处理后，能有效防止海 产品水份蒸发，抑制挥发性盐基氮的产生和某些营养物质的氧化损耗，保持了海产品的原有风味。 徐金泽哺1 的研究结果表明，短梗霉多糖对绿茶中的茶多酚有较好的保护作用。 大米、小麦、玉米、大豆、大麦等在蒸煮时易互相粘结成团，如在加工前加入0 0 1 - 1 的短 梗霉多糖，这些缺点可以解决。 1 2 8 粘度特性， 短梗霉多糖是线状结构，因此它的粘度远低于其它多糖。短梗霉多糖溶液粘度随平均相对分子 质量的增加而增加，也随浓度的增大而增大，但比其它高分子物质的增加幅度小，并且它的粘度的 热稳定性较好，9 0 加热1 小时其粘度仅降低1 0 。质量浓度为1 5 的溶液粘度是相同质量浓度黄 原胶溶液的i i 0 0 0 。 短梗霉多糖水溶液对木材、纸张、纤维、食品、玻璃、金属、水泥等具有极强的粘接能力。性 能高于淀粉、变性纤维、氰丙烯酸、酚树脂等。用乙二醛处理可增加抗水性。 1 3 研究与生产概况 2 第一章绪论 国外从1 9 6 0 年开始进行研究，1 9 7 6 - 1 9 8 0 年为第一个研究高峰，1 9 8 4 1 9 9 6 年为第二个研究高 峰，主要集中在对其产生机理和应用的研究。其中包括短梗霉多糖衍生物的结构鉴定、性质、应用 的研究以及短梗霉多糖改善食品品质方面的研究。日本目前年产量己达万吨，垄断国际市场，价格 2 0 0 0 - 3 0 0 0 日元k g 。 国内从1 9 8 0 年开始研究，已经2 0 多年，是“七五”“八五”攻关项目，在研究中筛选到了一些 多糖产量高色素含量低的菌株。但是国内生产技术与先进国家相比还有差距，原料利用率还不高， 后提取成本较高，目前尚未见工业化生产报道。中科院化冶所开发了一条1 0 吨年的生产线旧1 ，为 工业化生产打下了基础。 日本在短梗霉多糖的研究中做了大量工作，1 9 7 6 年日本h a y a s h i b a r a ( 林原公司) 开始短梗霉多 糖商业化生产，1 9 8 2 年开始生产短梗霉多糖膜，目前依然垄断国际市场旧1 。 1 4 立题的意义和依据 短梗霉多糖应用广泛，前景广阔，但一直没有更大规模生产，价格昂贵，主要是因为出芽短梗 霉发酵生产短梗霉多糖现在有以下四个主要问题。 1 4 1 黑色素的去除 在发酵过程中，出芽短梗霉会分泌出与黑色素( m e l a n i n ) 类似的黑色或墨绿色物质，这种物质 牢固地粘附在短梗霉多糖上，很难用一般方法除去，可以用s a v a g e 分馏法除去，但要完全除去黑色 素，必须重复多次，而每次分馏会损失大约1 5 9 6 的多糖u 刚，所以最终得率很低。这种方法只适宜于 少量多糖提取，应用在工业上是不实际的。 黑色素( m e l a n i n ) 是广泛存在于动物、植物和微生物中的棕黑到黑色的色素。这种色素能提高生 物生存、竞争的能力，但对于生物的生长、发育不是必不可少的。微生物所产黑色素是多种多样的， 主要分为胞内黑色素和胞外黑色素。胞外黑色素又有许多种，其性质也各不相同，有可溶性的和不 可溶性的。当前，黑色素研究越来越多，黑色素有十分广泛的应用，例如在化妆品或染发剂的装饰 作用、防紫外线辐射、清除自由基、以及生物杀虫剂的光保护剂。而且，近些年来发现一些可溶性 黑色素在体外对艾滋病病毒有显著的抑制作用。但在食品中因为黑色很难接受，必须除去黑色素。- 黑色素合成的底物是酪氨酸，前两步由酪氨酸酶在有氧条件下催化，后续步骤自动进行，这其 实类似于食品中的酶促褐变。 温度升高、紫外线照射等都能增加黑色素的分泌。黑色素易氧化，在银离子或h 2 0 2 作用下脱色。 黑色素能和金属离子结合从而提高微生物在高金属浓度环境下的存活率。 出芽短梗霉分泌的黑色素是水不溶性的，带正电，通过静电吸附在短梗霉多糖分子表面，很难 用一般方法除去，限制了短梗霉多糖的应用。 1 4 2 发酵通氧限制 由于菌丝体和多糖在发酵后期，发酵液粘度很大，传氧传质速度慢，在一定程度上限制了工业 生产速度。 1 4 3 短梗霉多糖酶解 短梗霉多糖酶( 普鲁兰酶) 与短梗霉多糖同时产生，短梗霉多糖酶( 普鲁兰酶) 可分解短梗霉 多糖，特别是在发酵后期，短梗霉多糖被大量分解成小分子多糖，从而使得提取困难，糖的得率降 低。 1 4 4 多糖提取成本 短梗霉多糖提取消耗大量乙醇，虽然乙醇可以回收，但成本还是很高。 综上所叙，必须选育多糖产量高而色素产量低的菌株，设计新型反应器，优化培养条件，选择 得率高的提纯工艺才能大量生产高质量短梗霉多糖。 近年来随着国内研究的深入，越来越多的公司和研究机构关注短梗霉多糖的工业化生产，但往 往由于产量或色素的问题而受到影响。本实验正是在这样的背景下与有关企业联合，对出芽短梗霉 3 江南大学硕士学位论文 的进行深入研究，从根本上解决了色素问题，并且多糖的产率也比较理想。为我国的短梗霉多糖相 关产业的发展提供了技术参考，对出芽短梗霉多糖的工业化生产具有重要的意义。 1 5 研究的任务 目前国外特别是日本对短梗霉多糖的研究已经很成熟，并已实现了工业化生产，而我国未见有 工业化生产的报道，尚处于基础研究阶段。因此本课题主要研究以下几个方面，以期为工业化生产 提供理论依据。 ( 1 ) 出芽短梗霉的诱变及筛选； ( 2 ) 菌种发酵条件的优化及验证； ( 3 )短梗霉多糖的分离提纯； 4 第二章出芽短梗霉的诱变及筛选 第二章出芽短梗霉的诱变及筛选 2 1 出芽短梗霉 2 1 1 出芽短梗霉 出芽短梗霉u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) 是一种具有复杂生活史的多形态真菌，其中文名有“茁霉”、 “芽生侧茁霉”、“黑酵母”、“出芽短梗霉”及“短梗霉”等，现通用出芽短梗霉一词。 由于出芽短梗霉形态的特异性，及其在发酵特点上与酵母细胞有相似之处，曾被人认为是一种 “黑酵母”。但它可以形成真菌丝和厚垣孢子等，这些特点却与酵母细胞相差甚远，故其归属问题曾 一度混乱。目前，据其生理特征和孢子产生的特征等将之归属于半知菌门，丛梗孢目，暗色丛梗孢 科，短梗霉属。有酵母状、菌丝体状、厚垣孢子、芽生孢子等多种细胞形态。p h 值是细胞形态的决 定因素，在低p h 值时大部分菌体呈丝状体，这种形态的菌体不产多糖但生物量增加很快；较高p h 值时呈酵母状，是产多糖的主要菌体。 2 1 2 出芽短梗霉的两态性 出芽短梗霉在其生活史中具有酵母样和真菌菌丝体两种形态，这两种形态的形成受培养基成分、 培养条件等各种因素的影响，它们可以相互转变：由于两种形态合成有用代谢产物的能力不同，因 而对两种形态相互转变的研究较多。 在限制性培养基中连续培养出芽短梗霉的酵母样菌丝体，其两态性受z n 2 + 的流入浓度控制。在恒 定的稀释率( 0 0 8 h q ) 下，随着z n 2 + 的流入浓度增加( 从o 增加到7 6um o l l ) ，培养物从z n 2 + 限制状态转 变为碳限制状态，在此期间，培养物逐渐经过以形态、胞外多聚糖浓度和生物量为基础的三个生长 阶段：当z n 2 + 浓度保持o 4 5um o l l 以下时，培养物处于第一个生长阶段，这个阶段的生长是z n 2 + 限制 状态，超过9 0 的生物量是酵母样生长形态，z n 2 + 流入浓度的增加导致生物量和胞外多聚糖浓度呈比 例增加；当z n 2 + 流入浓度在o 4 5pm o l l 至j j o 8 0 | jm o l l 时，发现培养物处于第二个生长阶段，在此阶 段，两种营养物质同时受到限制，虽然碳源( 葡萄糖) 被耗尽，但是z n 2 + 流入浓度的增加导致稳定态的 生物量呈比例增加，生物量的增加以消耗胞外多聚糖产量为代价，使多聚糖产量逐渐降低，培养物 仍然保持酵母生长状态；在第三个生长阶段( z n 2 + 流入浓度高于0 8 0 jm o l l ) ，当增 j 口z n 2 流入浓度 时，稳定态生物量没有增加，培养基的p h 值影响出芽短梗霉两种形态的转变，即当将出芽短梗霉培 养在限制氮源、缓冲能力低的葡萄糖培养基中时，原来的酵母样细胞会转变为厚垣孢子，而在最佳 条件下，发生形态转变的初始p h 值必须在6 左右，在上述的培养基中，p h 值在前两天内下降到2 以下； 如果向培养基中添加缓冲溶液或反复调整p h 值到它原来的值，则不会形成厚垣孢子。培养基中的碳 源和氮源也有影响，将出芽短梗霉培养在含有葡萄糖、限制氮源和低缓冲能力的培养基可诱导酵母 样细胞向厚垣孢子的转变；当用葡萄糖作为碳源时，浓度必须高于3 才能诱导形态转变。另一方面， 氮源( 硫酸铵) 的生长限制浓度并非必须，较高浓度实际会刺激厚垣孢子的出现，而其它氮源，如谷 氨酸或磷酸铵，不能诱导酵母样细胞向厚垣孢子的转变。 出芽短梗霉在从酵母样到菌丝体的形态转变过程中，细胞中的物质也会发生变化，其中蛋白质 和r n a 的含量明显下降，菌丝体的蛋白质含量为酵母样的7 6 ，r n a 的含量仅为3 8 ，而d n a 则是唯 一含量增加的成分。在几种抑制大分子合成的化合物中，只有羟基脲对出芽短梗霉的形态有明显的 影响，对培养物中的大分子成分也随时间而改变，变化方式类似于在乙醇一吐温8 0 一氨培养基和没有 乙醇或葡萄糖的饥饿培养基中的培养物；脂肪的组成和比例也会发生变化，前三天培养符合对数生 长期，葡萄糖和铵被快速消耗，直到后者耗尽为止，同时p h 值下降到2 左右，这个时期不饱和脂肪 酸含量下降，同时长链醛类的比例增加。第三天到第六天这个时期“巨细胞”占优势，它们积累了 大量的三酰甘油脂，磷脂和游离同醇也在这个时期合成，表明膜正在合成；从第六天开始可以看到 厚垣孢子，同时磷脂和游离固醇开始下降，而饱和三酰甘油脂产量继续增加，厚垣孢子的脂肪组成 暗示了它们是抗性形态，这种形态由对数生长期末培养基不利的环境条件所诱导。在菌丝体和酵母 5 江南大学硕士学位论文 样形态中6 一磷酸葡萄糖脱氢酶活性高于磷酸果糖激酶；在形态转变过程中，最突出的变化发生在 较大的细胞中( 3 d ) ，尤其是柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶活性的变化。但是，在 不含葡萄糖或乙醇的培养物( 没有发生形态转变) 中也发现有类似的变化。因而，观察到的酶活性变 化可能是因为缺乏葡萄糖，说明在形态和所研究的几种酶之间没有明显的联系n 1 。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 出芽短梗霉m 2 6 8 ，从上海冠生园集团有限公司技术中心( 上海工业微生物研究所) 购买。 2 2 2 培养基 液体培养基( g l ) ：蔗糖5 0 0 ，( n h t ) z s 0 40 6 ，i 已h p 0 45 0 ，m g s 0 40 2 ，n a c i1 0 ，酵母浸膏0 6 ， p h6 5 。在1 2 1 下灭菌3 0 m i n 。2 8 。c 摇瓶培养，转速2 0 0 r m i n 。 固体培养基：液体培养基再加琼脂2 0 9 l 即可。 2 2 3 材料与仪器 硫酸二乙酯( d e s ) ：上海化学试剂厂。 试剂：除工业酒精外均为国产分析纯。 p h 计：m e t t l e r - t o l e d od e l t a3 2 0p n 计。 2 2 4 实验方法 2 2 4 1 菌种的紫外诱变与筛选 取一直径6 c m 的无菌培养皿，加入5 m l 2 4 h 培养液于磁力搅拌器上搅拌，并在1 5 w 紫外灯下照射， 照射距离为3 0 c m ，控制照射时间；在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液稀释后，涂布培养皿，每 个加样0 i m l ，涂匀，2 8 c 避光培养1 2 0 h ，挑取高产低色素( 菌落直径大、表面湿润、颜色浅或白 色) 变异株。以同样操作，用未经紫外线照射的细胞稀释液涂布平板作对照。 挑取颜色浅的单个菌落至液体培养基中，2 8 摇瓶培养7 2 h ，测定发酵液中色素及短梗霉多糖 含量。 2 2 4 2 菌种的硫酸二乙酯( d e s ) 诱变与筛选 取2 4 小时培养液4 m l 、硫酸二乙酯( d e s ) 0 3 m l 及0 i m o l l 磷酸缓冲液( p h 7 0 ) 1 6 m l 混合， 振荡一定时间，加入终止试剂2 5 硫代硫酸钠0 8 m l ，终止诱变。将上述经诱变处理的菌悬液稀释后， 涂布培养皿，每个加样0 i m l ，涂匀，2 8 培养1 2 0 h ，挑取高产低色素( 菌落直径大、表面湿润、 颜色浅或白色) 变异株。以同样操作，用未经硫酸二乙酯( d e s ) 诱变的细胞稀释液涂布平板作对照。 挑取颜色浅的单个菌落至液体培养基中，2 8 摇瓶培养7 2 h ，测定发酵液中色素及短梗霉多糖 含量。 2 2 4 3 紫外诱变时间对出芽短梗霉存活率的影响 采用间歇法取样，即在紫外光下，0 5 m i n 为间隔，分别于不同时间 ( o 5 m i n ，1 o m i n ，1 5 m i n ，2 o m i n ，2 5 m i n ，3 o m i n ) 取样，稀释，然后取0 1 m l 样品涂布于平板上， 避光培养7 2 h ，计算每个平板中的菌落个数及菌体存活率。 2 2 4 4 硫酸二乙酯( d e s ) 诱变时间对出芽短梗霉存活率的影响 6 个诱变处理液样品分别振荡不同时间( 5 m i n 、i 0m i n 、1 5m i n 、2 0 m i n 、2 5 m i n 、3 0 m i n ) 加入 终止试剂，终止诱变。取样，稀释，然后取0 i m l 样品涂布于平板上，2 8 。c 培养7 2 h ，计算每个平 板中的菌落个数及菌体存活率。 2 2 4 5 发酵液颜色和吸光度测定 采用7 2 1 型分光光度计测定提取多糖后的溶液中的色素。蒸馏水为空白，波长扫描，波长调至 最大透光率( 6 5 4 n m ) ，再用此波长测各发酵液在4 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i n 去菌体后上清液吸光度u 。 2 2 4 6 生物量测定 定量量取发酵液，在4 0 0 0 r m i n 下离心3 0 m i n ，倾出上清液用于糖测定。沉淀的菌体用蒸馏水 6 第二章出芽短梗霉的诱变及筛选 洗涤离心2 次，于1 0 0 c 下干燥至恒重，用称重法测定生物量n 引。 2 2 4 7 粗多糖 离心上清液加入2 倍无水乙醇，搅拌，4 c 放置过夜，使短梗霉多糖充分沉淀。沉淀液以4 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 得短梗霉多糖沉淀，沉淀用9 5 酒精洗涤3 次再依次用无水丙酮、无水乙醚洗涤，7 0 干燥至恒重，即得短梗霉多糖粗品u 引，称重，计算产量。 2 2 4 8 稳定性对比实验 将变异株连续转接发酵5 代，进一步观察其发酵特征：发酵液p h ，多糖产量，发酵液颜色，发 酵液吸光度等。 2 3 结果与讨论 2 3 1 诱变时间对出芽短梗霉存活率的影响 2 3 1 1 紫外诱变时间对出芽短梗霉存活率的影响 采用紫外线照射菌株，分别分析不同时间对菌株存活率的影响，结果如图2 - 1 所示。 1 2 0 1 0 0 母8 0 篓6 0 悼4 0 2 0 o o1234 照射时间m i n 图2 1 紫外线照射时间对菌株存活率的影响 f i g 2 - 1t h ee f f e c to fu vo nl a w nl i v a b i l i t y 由图2 1 可知，随着紫外线照射时间的增加，菌株的存活率下降，0 5 m i n 时存活率只有2 3 4 ， i m i n 的存活率是1 2 8 ，表明原始菌株对紫外照射敏感，故可采用该法进行诱变。本实验采用紫外 线照射0 5 m i n 进行菌种诱变筛选。 2 3 1 2 硫酸二乙酯( d e s ) 诱变时间对出芽短梗霉存活率的影响 用d e s 处理菌株，分析不同时间对菌株存活率的影响，结果如图2 - 2 所示。 更 褥 ! g 雉 01 0 2 0 3 0 4 0 诱变时间m i n 图2 - 2d e s 诱变时间对菌株存活率的影响 7 趵加0 f i g 2 2t h ee f f e c to fd e so nl a w nl i v a b i l i t y 从图2 - 2 可以看出，当诱变时间为1 0 m i n 时，存活率是2 7 ，1 5 m i n 是8 6 ，出芽短梗霉对硫 酸二乙酯( d e s ) 敏感，可以用该方法进行菌种诱变筛选，本实验采用1 0 m i n 。 2 3 2 低色素变异菌株的筛选 2 3 2 1 诱变谱系 原始菌株m 2 6 8 lu v 6 - 4 ，g - 5 ( 2 株) ld e s 争1 1 ，g _ 1 5 ( 2 株) lu v g 一2 0 ld e s 6 - 3 6 ，6 - 4 6 ( 2 株) lu v g 一5 8 ，g _ 6 0 ( 2 株) 由于筛选菌株工作量较大，谱系较复杂，所以只列举了筛选过程中多糖产量高、色素含量低的 具有代表性的菌株，其它菌株并没有逐一列举。下图2 - 3 为诱变次数与突变百分率的关系图。 iz345 诱变次数 图2 3 诱变次数与突变百分率的关系 f i g 2 - 3t h er e l a t i o nb e t w e e nu vp l u s e dd e sa n dm u t a t i o np e r c e n t a g e 紫外线( u v ) 的作用光谱与核酸的吸收光谱相一致，d n a 最容易受紫外线的影响从而发生结构 的变化，如d n a 链的断裂，d n a 分子内和分子间的交联，核酸与蛋白质的交联，胞嘧啶和尿嘧啶的 水合作用及嘧啶二聚体的形成。 硫酸二乙酯( d e s ) 主要在于使d n a 的磷酸及碱基部分发生烷化作用，这样d n a 在复制时就产生 错误，尤其是嘌呤类更容易起烷化作用。 诱变采用u v 与d e s 相结合的方法，反复进行诱变，从而扩大诱变幅度，增加优良菌株的比例， 经过3 次紫外线( u v ) 诱变和2 次硫酸二乙酯( d e s ) 诱变，共获得9 株性状优良菌株。在诱变过程 中，每次都是选取上次诱变的最优菌株培养并用于下一次诱变。 2 3 2 2 变异菌株菌落特征及发酵特征 对原始菌株和变异株进行培养，对比结果如下表所示： 8 蛎 ： 衢 坫 5 o 芝哥象忸骰粼 第二章出芽短梗霉的诱变及筛选 表2 1出芽短梗霉m 2 6 8 及其变异菌株菌落特征 t a b 2 1t h el a w nc h a r a c t e ro fm 2 6 8a n da b e y a n c e s 菌落特征反映了菌株的性能，菌落大小体现了菌体繁殖的快慢与多糖产量的高低，以大者为优； 发酵液颜色与菌落颜色一致，菌落颜色浅发酵液颜色也浅，以白色为优。采用观察菌落特征的方法 筛选多糖产量高而色素含量低的优良菌株大大简化了菌种筛选的步骤，缩短了筛选时间。 表2 2 出芽短梗霉m 2 6 8 及其变异菌株发酵特征 及出2 1t h ef e r m e n t a t i o nc h a r a c t e ro fm 2 6 8a n da b e y a n c e s 综合表2 1 及表2 2 可见，变异菌株与原始菌株m 2 6 8 在菌落特征和发酵特征有显著不同，菌落 与发酵液颜色变浅，生长后期无菌丝体产生；g - 1 5 、g - 5 8 产量有所提高，g - 4 、g - 2 0 、g _ 3 6 、g 一6 0 9 江南大学硕士学位论文 产量变化不大，g 一5 、6 - 4 6 产量大幅度下降；从p h 值与产量的关系看，p h 高，产量高一些。因为这 尚不是最佳培养条件，通过培养基与培养条件优化，产量应该还有一定提高。 2 3 3 变异菌株稳定性 选择g 一5 8 为实验菌株，连续发酵5 代，结果如表3 所示。发酵液颜色白，吸光度0 2 9 5 0 3 0 0 ， 最终p h 值稳定在3 4 3 5 ，多糖产量1 9 2 9 l - 1 9 5g l 。由此可见出芽短梗霉低色素变异株g 一5 8 是稳定的。 表2 3 变异菌株g - 5 8 发酵性能稳定性 t a b 2 3f e r m e n t a t i o ns t a b i l i t yo fg - 5 8 2 4 本章小结 紫外线( u v ) 的作用光谱与核酸的吸收光谱相一致，d n a 最容易受紫外线的影响从而发生结构 的变化，如d n a 链的断裂，d n a 分子内和分子间的交联，核酸与蛋白质的交联，胞嘧啶和尿嘧啶的 水合作用及嘧啶二聚体的形成。 硫酸二乙酯( d e s ) 主要在于使d n a 的磷酸及碱基部分发生烷化作用，这样d n a 在复制时就产生 错误，尤其是嘌呤类更容易起烷化作用。 通过紫外线( u v ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 反复诱变，最后获得一株低色素出芽短梗霉变异株g 一5 8 ， 发酵液颜色白色，吸光度0 3 0 0 ，最终p h 值稳定在3 4 3 5 ，多糖产量1 9 2 9 l 以上；发酵性能稳 定。在其它文献报道中乜儿3 删阻3 ，往往是只注意多糖产量的高低或发酵液颜色的深浅，本实验则是从 诱变菌株开始，以诱变筛选出低色素高产糖量的菌株为目的，并达到理想的结果。 在短梗霉多糖发酵生产中，优良菌种是关键，c , - 5 8 虽然产量中等，但发酵液颜色浅，简化了脱 色工艺，降低了成本。优化培养条件，g 一5 8 还有增加产量的潜力。 l o 第三章出芽短梗霉发酵条件的优化及验证 第三章出芽短梗霉发酵条件的优化及验证 3 1 引言 天津市工业微生物研究所新型糖资源研发中心以本所保藏的出芽短梗霉为出发菌株，诱变筛选 出一株高产菌株，分别以蔗糖和淀粉为碳源，优化各种发酵条件，摇瓶培养9 6 h ，多糖的原料转化率 超过3 0 ，在多糖产率和抑制黑色素产生方面均取得了突破性进展。 金其荣等以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、n t g 诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素 较少的而且转化率较高的诱变菌株，以该菌株进行摇瓶、小罐发酵试验，多糖产率达6 0 9 l 7 0 9 l ， 糖转化率可达6 0 7 0 ，并对发酵液进行后提取实验研究，取得了一定的成果。 孙万儒等利用质量分数为1 0 的淀粉水解物进行批式发酵，在优化条件下，转化率最高为5 2 ， 虽然比报道的水平高，但未达 ! u k a t o 的专利水平1 1 劓。在此研究基础上，通过对流加补料方式、流加 起始时间、批式流加间隔时间、补料液的组成等对发酵过程的各种参数，如产物量、转化率、生物 量、溶氧、发酵液p h 值、发酵液粘度和产物相对分子质量等的影响研究，确定了短梗霉多糖流加补 料发酵的优化条件，使发酵转化率达到7 0 以上，产物平均相对分子质量在1 0 万以上。 李信等对短梗霉胞外多糖( e p 5 ) 的发酵动力学进行了研究u 副，其发酵过程与一般微生物胞外多糖 发酵特性类似，具有典型假塑性非牛顿型流体特性，发酵后期的高粘度发酵液会影响氧的传递，而 导致菌体生长的停止和多糖合成的抑制，可通过加大通气和加快搅拌转速来解决。出芽短梗霉菌体 前期生长速度较快，至, 1 4 s h 生长趋于稳定期，其胞外多糖合成随菌体生长不断上升，至1 1 8 4 h 多糖的产 量达到最高，为1 4 2 4 9 l 。发酵实验基于l u e d e k i n g p i r e t 方程，得到了描述发酵过程的动力学数学模 型和模型参数，同时对实验数据与数学模型进行了验证比较。 方宣钩等利用紫外( u v ) 随机诱变获得了两株多糖产量高、色素低的出芽短梗霉突变株z y 0 4 7 和 z y 0 7 3 ，其产量分别为1 5 1 5 m g m l 和1 4 2 2 m g m l 。通过培养基适宜的碳氮比和发酵条件优化，获得的 优化培养基方案为：蔗糖5 ，k i p 0 40 5 ，n a c l0 1 ，m g s 0 。- 7 h 2 00 0 2 ，( n h 4 ) 2 s 0 40 0 3 ，酵母 浸出粉0 0 9 。优化的发酵条件为：初始p h6 5 ，接种量5 ，种龄4 8 h 的二级种子，装液量7 5 m l ，占 总容积的2 5 。采用上述优化条件短梗霉多糖产量为2 1 1 l m g m l ，转化率为5 4 1 ，与原发酵条件作 对比，多糖产量和转化率分别提高5 1 和3 2 。 张汉波等采用多因素实验正交优选法对出芽短梗霉0 u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) 的原生质体制备和 再生条件进行了研究。发现在用y e p d 作生长培养基，菌龄2 4 h ，复合酶 w ( 蜗牛酶) = 0 2 5 ，w ( 纤维 素酶) = 0 2 5 处理，0 6 m o l lk n o 。作渗透压稳定剂的情况下，原生质体制备率最高，酶解l h ，制 备率为1 0 0 ，再生率为0 3 5 。如用p d h 为再生基础培养基，在添加c ( c a c l ：) = 5 0m o l m 3 ，w ( p e g ) = 1 0 ( m w 6 0 0 0 ) 等再生促进因子的情况下，再生率可提高到1 2 3 。 马海蓉等研究发现h 1 ，碳源、氮源、金属离子、起始离子及磷酸盐的选择均影响发酵生产转化 短梗霉多糖。食用淀粉作为碳源比工业淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖等产糖效率更高n 6 1 。各种铵盐如 ( n 地) 。s 0 4 ，n h t c l 和( n i t 。) 。c o s 都可以作为氮源使出芽短梗霉生长，但铵盐的用量对糖的转化率有影响， n h 4 + 的最佳作用浓度0 0 2 m o l m 3 。k + 和p 0 4 3 一能促进短梗霉多糖的产生，其中k + 的最佳作用浓度范围是 o 0 2m o l m 30 0 4m o l m 3 ，超过高限会抑制短梗霉多糖的产生。发酵的最佳起始p h 为6 左右，一般生 产短梗霉多糖最适培养温度在2 8 左右。 本章实验基于实验室诱变选育的出芽短梗霉菌株，并根据其发酵生长特性研究其发酵条件的优 化，以往的研究往往只侧重于短梗霉多糖的产量，而忽视了其它相关问题，本章是在色素等问题基 本解决的情况下继续探讨其发酵条件。 本实验室通过紫外线、硫酸二乙酯( d e s ) 交替诱变，长期筛选获得一株低色素出芽短梗霉变 异株g - 5 8 ，发酵液颜色乳白，可以直接将发酵液用酒精沉淀法制得短梗霉多糖，省去了传统的洗涤、 去色素工艺，降低了成本，大大有利于工业化的生产，并进行了最佳培养基组分与三角瓶最佳发酵 条件研究。在此基础上，为较大规模发酵所需要，本文对变异株g 一5 8 在1 0 升发酵罐的发酵条件进行 了研究。相关文献报道要么色素较低而多糖转化率不高，要么就是往往只关注多糖的产量和转化率 而忽略了色素问题，本实验室变异株g 一5 8 不仅解决了色素问题，而且多糖的转化率也接近了以往文 献报道的高产水平，有较大的实际意义。 3 2 材料与方法 3 2 1 菌种 原始菌种由上海工业微生物研究所提供，本实验使用菌株为原始菌种的诱变菌株g 一5 8 3 2 2 培养基 基础培养基( g l ) ：蔗糖5 0 0 ，