（环境科学专业论文）微囊藻毒素降解菌cj5厌氧降解mclr过程的研究.pdf

降解产物，该产物既不同于已报道的m c s 好氧降解中间产物，也与c j 5 菌降解 m c l r 的产物a d d a 不同。由于该产物在2 3 8n m 处有特征吸收峰，说明该产物含 有完整的a d d a 基团，这一结果说明c j 5 菌的降解途径可能与目前已知的m c s 好 氧降解途径不同。由于e d t a ，p m s f ，盐酸苯甲脒，胃蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶 抑制剂均对c j 5 菌粗酶降解m c l r 无抑制作用，并且对该产物的产生和累积没有 影响，说明该产物可能是c j 5 厌氧降解m c s 的起始反应的初始产物。 ( 3 ) 以c j 5 菌d n a 为模板，利用优化的p c r 反应条件扩增m _ r a 基因，结 果均未扩增出目标条带，而阳性对照样品可以扩增出相应条带，说明c j 5 菌可 能不含川 基因。这一结果也进一步证明c j 5 菌降解m c s 的机理不同于已知的 好氧降解途径。 关键字：微囊藻毒素，厌氧降解菌，酶降解 n a b s t r a c t m i c r o c y s t i m ( m c s ) i sag r o u po fh e p t a p e p t i d eh e p a t o t o x i np r o d u c e d b y c y a n o b a c t e r i a , w h i c ha lew i d e l yd i s t r i b u t e di n e u t r o p h i cw a t e r i t sp o t e n t h e p a t o t o x i c i t ya n dt u l t l o rp r o m o t i o na c t i v i t yh a v ep o s e dr i s k st oe c o s y s t e ma n d h u m a nh e a l t h i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tb i o d e g r a d a t i o ni st h em a i n p a t h w a yt h a tl e a d s t ot h ed e c r e a s eo fm c si ne u t r o p h i cw a t e re n v i r o n m e n t , a n db i o d e g r a d a t i o np r o c e s s i s c o n s i d e r e da sap o t e n t i a lm e t h o dt og e tr i do fm c sc o n t a m i n a t i o nf r o mw a t e rb o d i e s t od a t e ，a b o u t4 0m c - d e g r a d i n gb a c t e r i ah a v eb e e ni s o l a t e da n di d e n t i f i e df r o m d i f f e r e n te n v i r o n m e n t a ls a m p l e s ，a n dt h em e c h a n i s mo fm c s d e g r a d a t i o nb yp u r e i s o l a t ea l s oh a v eb e e ni n v e s t i g a t e dt os o m ee x t e n t h o w e v e r , m o s to f s t u d i e so nm c s b i o d e g r a d a t i o nh a v eb e e nr e s t r i c t e dt ou n d e ra e r o b i cc o n d i t i o n sa n da l lm c d e g r a d i n g b a c t e r i ai s o l a t e df r o me n v i r o n m e n t a ls a m p l e sa l ea e r o b i cb a c t e r i a l i t t l ei n f 0 咖a “o ni s a v a i l a b l ea b o u tt h em c sa n o x i co ra n a e r o b i cd e g r a d a t i o na n di t sm e c h a n i s m s r e c e n ts t u d i e sc o n f i r m e dt h a tm c s 啪b e d e g r a d e db yt h es e d i m e n ts a m p l e s u n d e ra n o x i ca n da n a e r o b i c c o n d i t i o n s ， s u g g e s t i n g t h a ta n o x i co ra n a e r o b i c d e g r a d a t i o nm a y b ea ni m p o r t a n tp a t h w a yt or e m o v em c si nn a t u r a le n v i r o n m e n t b u t u n t i ln o wn of u t h e rs t u d yo na n a e r o b i cd e g r a d a t i o no fm c sw a sr e p o r t e d a n a n a e r o b i cm c s d e g r a d i n gb a t e r i u mc j 5w a si s o l a t e df r o mt h es e d i m e n to fl a l ( e d i a n c h ip r e v i o u s l y i tc a l ld e g r a d em c s e f f e c t i v e l yu n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o na n d w a si d e n t i f i e da sa c i d a m i n o b a c t e r s p t h r o u g ht h ea n a l y s i so f16 sr d n a s e q u e n c e i n p r e s e n ts t u d y , t h ea n a e r o b i cm c sd e g r a d a t i o np r o c e s sb yc j 5w a sf u l t h e ri n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t so fi n i t i a l i n o c u l u m ，t e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，e x t r ac a r b o na n dn i t r o g e n s o u r c ea n di n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fm c l ro nt h ed e g r a d a t i o no fm c sw e r es t u d i e di n t h es t a t i ce x p e r i m e n t s t h ep o s i t i o no fd e g r a d a t i o ne n z y m ew h i c hr e s p o n s i b l ef o rt h e m c l rd e g r a d a t i o nw a si n v e s t i g a t e dt h r o u g h e n z y m a t i cd e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t s p c r a m p l i f i c a t i o nw a sp e r f o r m e dt ot e s t i f yw h e t h e rs t r a l l lc j 5c o n t a i n sm l r ag e n e t h em a i nr e s u l t sa lea sf o l l o w e d ： ( 1 ) t e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eh a v em o r es i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo na n a e r o b i c d e g r a d a t i o no fm c l r m c l rc 锄b er a p i d l yd e g r a d e da t2 0 c 3 0 c ，w h i l et h e i i i d e g r a d a t i o no fm c l rw a ss l o w a tl o wt e m p e r a t u r e s ( 10 c 、15 c ) ，w i t ha6d a y so r8 d a y sl a gt i m eb e f o r ed e g r a d a t i o n ，r e s p e c t i v e l y m c l rw a se a s i l yd e g r a d e du n d e r n e u t r a la n d a l k a l i n e ( p h = 7 0 - 10 o ) c o n d i t i o n sa n dw a sd e g r a d e dc o m p l e t e l yw i t h i n 12d a y sw i t h o u to b v i o u sl a gp h a s e h o w e v e r , a b o u t2 0d a y sl a gt i m ew e r en e e d e dp r i o r t ot h eo n s e to f m i e r o e y s t i n d e g r a d a t i o nu n d e ra c i dc o n d i t i o n s ( p n = 4 0a n d5 o ) ，a n d m c l rw a sc o m p l e t e l yd e g r a d e du n t i l ld a y4 0 i na d d i t i o n , e x t r ac a r b o no rn i t r o g e n s o u l c e sh a v en os i g i n i f i c a n te f f e c to nt h ed e g r a d a t i o na b i l i t yo fc j 5 ( 2 ) t h er e s u l t so fe n z y m ea s s a ys h o w e dt h a tt h em c s d e g r a d a t i o ne i l z y m e s b e l o n gt oi n t r a c e l l u l a re n z y m e s an e w k i n do fd e g r a d a t i o np r o d u c tw a sd e t e c t e d d u r i n gt h ed e g r a d a t i o no fm c l rb yt h ei n t r a c e l l u l a re n z y m eo fc j 5 ，w h i c hw a s d i f f e r e n tb o t hf r o mt h ef i n a lp r o d u c ta d d ap r o d u c e dd u r i n gt h ed e g r a d a t i o no fm c l r b yc j 5s t r a i na n df r o mt h ep r o d u c t sp r o d u c e dd u r i n ga e r o b i cm c l rd e g r a d a t i o n t h e f a c tt h a tt h i sp r o d u c tp o s s e s st h ec h a r a c t e r i s t i cu v a b s o r p t i o ns p e c t r a ( k m a x 2 2 38 n m ) o f a d d as u g g e s t e dt h a ti tc o n t a i n st h ei n t a c ta d d ag r o u p t h ep r o t e a s ei n h i b i t o r e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h i sp r o d u c tm i g h tb et h ei n i t i a lp r o d u c tp o d u c e dd u r i n g， a n a e r o b i cd e g r a d a t i o no fm c l rb yc j 5 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee n z y m a t i c d e g r a d a t i o np a t h w a yo fm c l rb yc j 5w a sd i f f e r e n tf r o mt h a tb yo t h e ra e r o b i c m c d e g r a d e r s ( 3 ) n om i r ag e n eh o m o l o g u ew a sd e t e c t e di nc j 5 ，s u g g e s t i n gt h a tc j 5m i g h t d e g r a d em c st h r o u g han e wp a t h w a yd i f f e r e n tf r o ma e r o b i cb a c t e r i a k e yw o r d s ：m i c r o c y s t i n s ，a n a e r o b i cb a c t e r i u m ，e n z y m a t i cd e g r a d a t i o n i v 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 微囊藻毒素的产生及其基本性质 由于人类的生活与生产活动及对水环境的缺乏管理和保护，大量的含氮或 磷的废水排入水体环境中，水体富营养化频率增加，造成了全球范围内频繁的 水华藻类污染，对人类饮用水源及身体健康造成威胁【1 3 1 。水华蓝藻的大量生长， 其危害之一就是向水体环境中释放藻毒素f 4 】，而微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ， m c s ) 主要是由蓝藻所产生的一类有毒的次级代谢产物，并且是蓝藻水华污染中 出现频率最高、产生量最大并且危害最严重的分布较为广泛一类藻毒素。m c s 是一类具有生物活性的环状七肽物质【5 l ，它的基本结构如图i - i 所示。 ( 6 ) d g i u ( i s o ) ( 7 ) n m e t h y l d e h y d r o a l a ( m d h a ) o ( 1 ) d a i a ( 2 ) l - x r ：c o o h ( 4 ) l - z ( 3 ) d c r y t h r o - 3 - m c t h y l a s p ( i s o ) 图1 - 1 微囊藻毒素( m c s ) 的分子结构 f i g u r e1 一l t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fm i c r o c y s t i n s 由图1 - i 可见，m c s 是由7 种氨基酸组成的环状分子，包括了d 一谷氨酸， d 一丙氨酸，d 一赤一b 甲基天冬氨酸，n 一甲基脱氢丙氨酸，a d d a ，两种可变的l 一 氨基酸组成。其中a d d a ( 3 一氨基一9 一甲氧基一2 ，6 ，8 - - - 甲基- 1 0 一苯基一4 e ，6 e - - - 烯酸) 是m c s 生物活性表达的必需基团，但是单独的a d d a 的生物毒性远比m c s 武汉理工大学硕士学位论文 的生物毒性低【6 j 。两种可变的l 一氨基酸位于分子环状结构上2 、4 位置上，根 据两个l 一氨基酸的不同可形成不同的m c s 异构体，目前，已经发现了8 0 多种 m c s 异构体【7 8 】。其中存在较普遍、毒性较大、研究最多的是m c l r 和m c r r ，l 、 r 分别代表亮氨酸、精氨酸。m c s 是蓝藻细胞自身合成的细胞内毒素，随着细胞 衰亡破裂后释放出来进入水体并对很多生物物种表现出毒性【9 1 。y o s h i d a l l 2 ，1 3 】 研究了m i k a t a 湖中的多种微囊藻，发现有1 2 种微囊藻能够产生微囊藻毒素。 关于m c s 产生的机理目前还尚未探明，并非所有的水华藻类都产生m c s ，目前主 要有两种被认可的假设：一种是环境因子的影响，另一种是遗传因素造成的差 异【m 1 7 】。随着水华频率地不断增加及藻类大量生长，将会有更多种类的微囊藻 毒素被发现及鉴定出来，m c s 伴随着蓝藻细胞衰亡破裂而在水环境中累积，一 定程度上对水生生态系统和人类健康造成危害【2 8 一。 水华藻类的污染已经成为国内外备受关注的水环境问题，而水华藻类产生 的m c s 也已经被认为是威胁水体生态环境、水生生物以及人类健康的一类污染 物而被广泛关注。m c s 不仅能引起生物的急性中毒，还会引起生物体潜在的慢 性中毒【1 3 1 ，主要由m c s 引起的水生生物、家畜等中毒甚至死亡事件已经有很多 报道n 钔，并且由于饮用水中的m c s 污染所引发生物急性肝中毒甚至死亡事件也 有报道1 2 0 , 2 1 】。世界卫生组织( w h o ) 在其推荐的饮用水标准中规定微囊藻毒素一l r 限值为0 0 0 1 m g l ：我国现行生活饮用水卫生规范( 2 0 0 1 ) 和地表水环境 质量标准( g b3 8 3 8 - 2 0 0 2 ) 中也增加了微囊藻毒素( m c l r ，1p g l ) 等指标， 且地表水环境质量标准( g b 3 8 3 8 - 2 0 0 2 ) 中也将m c l r 规定为集中式生活饮用 水水源地特定监测项目之一。国家环境保护总局颁布的中华人民共和国国家 标准( g b 3 8 3 8 - 2 0 0 2 ) 中也在集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限 值列出微囊藻毒素一l r 的标准值，同样为o 0 0 1 m g l 瞄j 。 1 2 微囊藻毒素的毒性效应及其危害 m c s 是水华水体中最常见的一类藻类毒素，研究表明它具有强烈的肝毒性、 神经毒性、细胞毒性以及遗传毒性【4 1 4 】；随着水华爆发的频率上升，m c s 广泛分 布于水环境中，由于其环状结构相当稳定，在水中的溶解度可以达到1g l 以 上，在水环境中的自然物理化学条件下降解十分缓慢，不易挥发和沉淀，也不 易被水体中沉积物及悬浮颗粒物吸附，从而对水环境生态系统造成直接或潜在 危害。自从1 8 世纪8 0 年代，f r a n c i s 等团】发现蓝藻水华引起家畜及畜类中毒， 2 武汉理工大学硕士学位论文 这是首次发现水华m c s 的危害的报道，此时m c s 的危害并没有引起广泛关注； 而1 9 9 6 年巴西一医院发生的因使用m c s 污染的透析液而导致了6 0 病人死亡的 重大事故，1 0 0 多人也因为饮用含有m c s 的水导致急性肝功能障碍【2 4 】：2 0 0 5 年， 在阿尔及利亚一淡水湖中发现了1 2 只乌龟的死亡，证实也是因为m c s 的毒害引 起的，这是首次发现由于m c s 中毒引起乌龟的死亡事件1 1 8 】；m c s 污染及毒害作 用已经引起了全球各国的广泛关注，国内外学者针对m c s 的毒性开展了一系列 的研究实验，研究了其对水生生物及动物的危害程度i l o 2 5 2 6 1 。目前对于m c s 毒 理学的研究，主要集中在毒素的肝受体、毒素在细胞中的转运原理、毒素毒性 作用的分子机理、促肿瘤作用的分子机制以及在自然环境中的传递方式和代谢 行为等方面【l4 1 。研究发现，蓝藻水华产生的m c s 与人类的肝癌病理有着密切的 关系，m c s 进入生物的细胞后，主要作用于肝脏，能强烈的抑制蛋白磷酸酶( p p i 、 2 a ) 的活性，致使细胞内多种蛋白质过磷酸化从而引起肝细胞的损伤，使肝细 胞膜通透性改变，细胞膜脂质被破坏，流动性降低，造成肝内出血甚至肝坏死， 从而诱发肝脏发生病变1 1 8 2 7 - 2 9 1 ，孙瑜【3 0 1 研究了m c l r 对人体肝细胞h l 7 7 0 2 的两 种蛋白的蛋白磷酸化的影响，得出m c s 除了主要的肝毒性，还具有神经毒性， h a i d e r 2 j 研究了m c s 的各种毒性作用，对于神经毒性毒性是因为m c s 能够抑制乙 酰胆碱的分泌，而乙酰胆碱是神经系统传输过程中连接神经递质结合及细胞膜 上的离子通通道的重要物质，此物质被抑制，细胞膜上的离子通道被关闭，可 能会引起肌肉抽搐，甚者肌肉麻痹。微囊藻毒素还对性腺、肾上腺、肺及胃等 器官也有不同程度的损害【6 】。在2 0 0 6 年，m c s 已经被划入为危害人类健康的一 种潜在的致癌物质1 3 l j 。 1 3 微囊藻毒素的微生物降解 由于m c s 的环状结构和间隔双键，在水体环境中相当稳定，一般的蛋白质 水解酶不能使其水解。一旦水华爆发，藻类大量生长繁殖，m c s 不断释放到水 体环境中，不仅污染自然水体水生环境，而且能通过生物富集作用及食物链传 递，从而危害水生生物和人体的健康。随着水华爆发日益频繁，m c s 对水生生 态系统及人类健康的威胁也越来越大，研究如何有效地消除水体环境中m c s 污 染也成为世界各国所共同面临的难题0 2 】。m c s 在自然水体环境中主要可以通过 光降解、水体稀释、共沉淀、生物降解等在水体中迁移和转化，m c s 能与水体 中一些具有吸附性的颗粒物产生共沉淀，虽然能在短期内一定程度上减轻水体 武汉理工大学硕士学位论文 中微囊藻毒害，但这一过程不能改变水体中m c s 的总量，而且m c s 会在某个 时刻解吸再次释放到水体环境中；而水体稀释也只是一种暂时降低水体中的 m c s 浓度的方法，并不会改变m c s 在水体中的总量：虽然物理法能够在短时 间内对大规模的m c s 的应急处理具有很好的效果，但是这并不能冲根本上消除 m c s 的危害；而光降解也证明是自然水体中m c s 降解的一种途径p i3 4 ，但是 由于水华藻类、水生生物及水体中的颗粒物会影响水体的透明度，自然光不能 完全透过水体，会降低光降解m c s 的效率。目前，很多科学家都致力于水体中 m c s 的去除方法及安全性研究，在目前研究的物理、化学、生物处理方法之中， 虽然物理化学方法能在一定程度上有效处理水体中的m c s ，但物理化学方法需 要的运行成本高、易产生二次污染，很难付诸到实际应用中。生物处理是一种 有效、安全去除水体中有机污染物的有效方法，也是消除自然环境中m c s 污染 的主要途径之一【3 5 3 6 j 。由于微生物的代谢和繁殖速度快、数量较多，从而具有 更好的研究和利用价值，所以微生物降解m c s 是未来水环境m c s 污染治理和 修复的研究重点之一 3 2 , 3 7 , 3 8 】。研究表明，m c s 能够被天然水体及水体沉积物中 一些特殊的土著菌群降解，通过打开m c s 环状结构及改变a d d a 侧链结构而使 其转化为小肽分子从而消除或降低m c s 的毒性【1 6 】。a l a m r i1 3 9 】通过蛋白磷酸酶 ( p p l a ) 抑制试验，研究了m c r r 生物降解过程中对蛋白磷酸酶的抑制作用 影响，结果说明随着m c s 浓度的降低，对p p l a 的抑制作用越小，证明随着 m c s 的生物降解，m c s 对生物体的毒性降低，说明微生物降解是一种安全有效 去除m c s 的方法。研究发现，m c s 在好氧和厌氧条件下都能够被自然水体和 水体沉积物中的土著微生物降解，且研究显示微生物降解m c s 不是由降解底物 诱导而是其本身具有降解m c s 的能力：并且水解酶对底物的特异性相对较广， m c s 降解菌也能有效降解其它环状多肽污染物p 吼4 0 。 目前已经报道m c s 能够被自然水体或沉积物中的土著菌群降解成无毒或 者低毒的产物，国内外很早就开展了自然水体及沉积物中的混合菌群降解m c s 的研究。c o u s i n s 4 1 , 4 2 发现水库水样可以将m c s 完全降解，h y e n s t r a n d 4 2 】利用c 标记的m c l r 研究证明了湖水水样中的微生物能够将其完全降解；e d w a r d l 3 6 1 研究了分别从不同水体采集的水样对不同m c s ( m c l r ，m c l f ) 的降解，证 明了不同来源的水体均能够降解m c s ；l a m 4 3 】也报道利用下水道污水作为接种 体，m c s 能够快速的降解，同时，j o n e s 4 4 报道了不同的水体也能够降解m c l r ： c m l t a m a c h e r l 4 5 】研究了沉积物接触条件下，微生物降解是m c s 去除的主要途径， 在好氧条件下m c s 能够被沉积物中土著菌群快速降解。 4 武汉理工大学硕士学位论文 国内学者也对水环境中m c s 的微生物降解十分关注。金丽娜【删研究了长期 发生水华的滇池沉积物样品中的土著菌群能够快速降解m c s ；杨静东【4 7 】以m c r r 和m c l r 作为唯二的碳氮源，从太湖水华水体中分离得到了能够降解m c s 的微生 物菌群j s m 0 0 4 ，表明j s m 0 0 4 对m c s 具有很好的降解效果，在2 4 d 时内就可以将 初始浓度分别为3 6 4m g l 的m c r r 和2 6 2m g l 的m c l r 降解完全，并且在弱碱 性条件下j s m 0 0 4 对m c s 的降解效果更佳。c h e n i 4 s l 研究发现太湖沉积物和水体样 品均能有效地将m c s 降解，证明太湖水环境中m c s 浓度的降低主要是因为微生物 降解作用，且沉积物对m c s 的降解速率比水体降解速率快。 已有研究表明，m c s 不仅能够在好氧条件下能够被微生物快速降解，在厌 氧条件下也能够被微生物快速降解。h o i s t 4 9 1 研究了序批式反应器分别在好氧和 缺氧条件下对m c s 的降解，发现在好氧反应器中，2 4 小时微生物能够将m c l r ， m c r r 及m c y r 降解9 0 以上，而在缺氧条件下，m c s 能够有效地被反应器 沉积物中的微生物降解，且加入n 0 3 和葡萄糖能够促进此缺氧降解反应，并且 通过同位素标记检测到有c 0 2 的生成，说明m c s 可以最终矿化生成无毒性产物。 c h e n l 5 0 1 研究了滇池沉积物菌群对m c l r 的缺氧降解情况，结果表明，在缺氧条 件下，沉积物菌群在4 天内能够将5m g l 的m c l r 降解到检测限以下，并且 检测到一终产物的生成，经e s i m s m s 分析鉴定此产物为a d d a 。随后陈晓国 p i j 研究了水华水体沉积物对m c l r 的厌氧降解情况，证明在厌氧条件下，m c l r 也能够被沉积物中的土著菌群作为唯一的氮源而快速降解，菌群在2 天内能够 将5m 叽的m c l r 完全降解，在m c l r 厌氧降解过程中也检测到终产物a d d a 的累积：李祝p 2 j 也研究了1 1 处水华水体底泥样品中土著微生物菌群在厌氧条件 下对m c s 的降解，发现m c s 在厌氧状态下能够被底泥微生物快速降解。在富 营养化水体中，尤其水华大面积爆发时，水体的透明度通常较低，水体底层及 沉积物中的m c s 不易被光降解，而且在底层及底泥中往往形成缺氧或厌氧环 境，这种情况下好氧降解被限制，厌氧降解则成为m c s 的主要降解途径。m c s 的厌氧降解也是m c s 生物降解的主要途径之一。 1 4m c s 降解菌 已有研究结果表明，水华水体及沉积物中广泛存在着m c s 降解菌。国内外 学者已经从水环境及沉积物样品中分离和纯化出多种能够有效降解m c s 的菌 株，并且对菌株进行了鉴定。大多分布在变形菌门( p r o t e o b a c t e r i ap h y l a ) 、放 5 武汉理工大学硕士学位论文 线菌门( a c t i n o b a c t e r i ap h y l a ) 和厚壁菌门( f i r m i c u t e sp h y l a ) ，且不同的菌株 对m c s 降解能力有所不同。 分离出的变形菌门( p r o t e o b a c t e r i ap h y l a ) 下的m c s 降解菌主要分布在 s p h i n g o m o n a s 、s p h i n g o p y x i s 、b u r h h o l d e r i a 和m e t h l o b a c i l l u s 。19 9 4 年j o n e s 4 4 1 首次从自然水体中筛选出一株m c s 降解菌m j p v ，并鉴定为鞘氨醇单胞菌 ( s p h i n g o m o n a ss p 土对m c l r 、m c r r 具有一定的降解能力，这是关于降解 m c s 微生物纯菌种的最早报道；随后p a r k l 5 3 l 从一水华水体中分离出一株具有降 解m c r r ，m c y r ，m c l r 能力的菌株y 2 ，能够利用m c s 为唯一的碳氮源， 通过生化分类及1 6 sr d n a 序列鉴定该菌株与鞘鞍醇单胞菌属( s p h i n g o m o n s a ) 细菌的相似度较高，能够在4 天内将三种m c s 完全降解。i s h i i 5 4 j 等水环境样品 中分离出一株m c s 降解菌7 c y ，能够m c s 和n o d ，能够在4 天内将6 m g l 的m c s 完全降解，但是7 c y 不能单独降解n o d ，该菌只在m c r r 存在的条 件下才能降解n o d 。v a l e r i a l 5 5 】以m c r r 为唯一的碳氮源，从一遭受蓝藻水华 污染的饮用水体中分离出一株m c s 好氧降解菌c b a 4 ，通过1 6 sr d n a 鉴定为 s p h i n g o m o n s as p ，在好氧条件下能够在3 6 小时内能够将初始浓度为2 0 0 l ag l 的m c r r 完全降解，并且发现该菌降解m c r r 是以脱甲基为降解的第一步反 应的，与先前报道的m c l r 降解途径不同。 h o t 5 6 1 等从生物砂滤器中分离鉴定出一株m c s 降解菌l h 2 1 ，属于鞘鞍醇单 胞菌( s p h i n g o p y x i ss p ) ，能够有效去除源水中的m c s ，并发现通过m c s 驯化 后，该菌对m c s 的降解能力加强。l e m e s l 4 3 】从沿海一咸水湖中分离出m c l r 降 解菌伯克氏菌( b u r h h o l d e r i as p ) ，能够利用m c l r 作为唯一的碳源。 分离出的m c s 降解菌中属于放线菌门( a c t i n o b a c t e r i ap h y l a ) 的菌主要包 括a r t h r o b a c t e rs p p 、b r e v i b a c t e r i u ms p 和r h o d o c o c c u ss p 。m a n a g e 5 7 j 也从淡水 湖中分离出了三株m c s 降解菌，通过1 6 sr r n a 序列鉴定分别为节杆菌 ( a r t h r o b a c t e rs p p ) ，短杆菌( b r e v i b a c t e r i u ms p ) ，红球杆菌( r h o d o c o c c u ss p ) ， 均属于放线菌门( a c t i n o b a c t e r i ap h y l u m ) ，这是首次分离纯化出的不属于变形 菌门( p r o t e o b a c t e r i a ) 的m c s 降解菌。 厚壁菌门( f i r m i c u t e s p h y t a ) 下的芽孢杆菌纲( b a c i l l i ) 中也发现了能够降 解m c s 的菌株。a i a m r i l 3 9 1 从一水华湖水中分离出一株m c s 降解菌a m r i 0 3 ， 通过1 6 sr r n a 序列分析将该菌鉴定为芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) ，该菌经过2 天 的迟滞期后能够在5 天内将初始浓度为1 0m g l 的m c r r 完全降解。 国内学者对m c s 降解菌的分离鉴定也做了很多研究。h u s s 】从太湖沉积物 6 武汉理工大学硕士学位论文 中分离出一株m c s 好氧降解菌j 1 0 ，该菌是严格好氧菌，革兰氏阴性，细胞形 态为杆状，能够利用甲醇作为唯一的碳源，在固体平板上长出黄色的单菌落， 通过1 6 sr d n a 序列分析鉴定为嗜甲基菌( m e t h y l o b a c i l l u s 艰) ，属于b 变形菌 纲( b e t a p r o t e o b a c t e r i a ) ； 王光云p 9 j 利用m c l r 作为唯一的碳源，从发生水华的巢湖底泥中分离筛选 出一株高效降解微囊藻毒素的菌株：m 6 菌，通过对该菌株的生理生化特征及 1 6 sr r n a 序列分析，鉴定该菌属于芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 。 刘晓文1 2 。7 】从腐烂水华上清液中分离出一株高效m c s 降解菌，经1 6 sr r n a 序列分析鉴定该菌株为微嗜酸寡养单胞菌( s t e n o t r o p h o m o n a sa c i d a m i n i p i l a ) ， 能够在5 天内将初始浓度为1 5 4m g l 的微囊藻毒素完全降解。c h e n l 7 】从太湖水 华淤泥中分离出能够高效降解m c l r 和m c r r 的降解菌：e m s ，经过1 6 s r r n a 鉴定为寡养单胞菌( s t e n o t r o p h o m o n a ss p ) ，能够在2 4 小时内将初始浓度 为0 7m g l 的m c l r 和1 7m g l 的m c r r 完全降解，经过h p l c 检测发现 m c l r 和m c r r 降解过程中有一种中间产物峰积累，但是随着m c l r 及m c r r 的降解完全和时间的推移中间产物峰消失，说明m c l r 及m c r r 能被e m s 菌 完全降解且无降解产物的累积。并且在碱性环境中对m c s 的降解更易进行。该 菌为好氧、革兰氏阴性菌，杆状，并且经过扫描电镜观察该菌不产生孢子，不 运动，且在固体平板上长出白色单菌落。赵俊斌唧j 也从表层水体中筛选出一株 m c l r 降解菌d h u 2 8 ，属于嗜麦芽寡养单胞菌( s t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i a ) ， 能够利用m c l r 作为唯一的碳源、氮源生长【6 。刘凯英等人从从水华表层水体 中分离出一株高效m c r 降解菌d h u 3 8 ，经过对菌株的细胞形态结构、生理生 化及其1 6 sr d n a 序列分析鉴定属于荧光假单胞菌( p s e u d o m o t l a s f l u o r e s e e l i s ) ， 能够以m c r r 为唯一碳氮源生长，6 d 内可将初始质量浓度为2 0m g l 的m c r r 降解为6 2 3m g l 。 何宏型6 2 】从云南滇池底泥沉积物中筛选分离出一株高效降解m c s 的纯菌 株：u s t b 0 4 ，经过中国科学院微生物研究所鉴定为食酸戴尔福特菌( d e l f i i a a c i d o v o r a n s ) ，该菌在固体平板上能长出球状、浅黄色的单菌落，菌落表面光滑。 该菌能够利用m c s 作为唯一的碳源和氮源生长，并且在2 天内能够将初始浓度 分别为9 0 2m g l 的m c r r 和3 9 6m g l 的m c l r 完全降解。日平均降解能力 分别达到了4 5 1m g l 和1 9 8m g l ，是目前为止报道的降解m c s 能力最强的菌 株；并且发现在外加氮源和碳源时可以促进该菌的生长，但是对m c s 降解过程 无明显的促进作用。且进一步研究了该菌在葡萄糖和酵母粉分别作为碳源、氮 7 武汉理工大学硕士学位论文 源的条件下仍能保持对m c s 的降解能力，说明u s t b 0 4 菌降解m c s 的活性不 需要m c s 的诱导i 了7 6 2 。 以上分离出的m c s 降解菌均为好氧降解菌，而对于兼性或厌氧降解菌的分 离报道不多。李祝【5 2 】研究了中国1 1 处不同湖泊底泥中土著微生物对m c 的厌 氧降解，在2 0 天内能够降解7 0 左右的m c ，并且从底泥中比较分离得到一株 能够快速厌氧降解m c s 的降解菌d 7 1 ，革兰氏阴性菌，经过鉴定为兼性厌氧 菌，属于变形菌门肠杆菌科；本实验室也从滇池底泥沉积物中分离出一株m c l r 好氧降解菌x 2 0 ，经1 6 sr d n a 鉴定也属于鞘鞍醇单胞菌( s p h i n g o m o n a ss p ) ， 能够在2 天时间内将初始浓度为5m g l 的m c l r 全部降解，另外本实验室还 从滇池底泥沉积物中分离出一株厌氧降解菌c j 5 ，经1 6 sr d n a 鉴定为氨基酸杆 菌臼c i d a m i n o b a c t e rs p ) ，属于厚壁菌门( f i r m i c u t e sp h y l u m 夕，是报道的m c s 降解菌中新的菌属，也是第一次发现并分离纯化出厚壁菌门中的菌属在厌氧条 件下能够有效降解m c s 的菌，其1 6 sr d n a 序列已经提交至n c b i 的g e n b a n k ， 登录号为g u 5 7 0 1 9 5 1 6 3 1 。 综上所述，m c s 降解菌广泛存在于自然环境中，已经分离出4 0 余株降解 菌，主要包括鞘鞍醇单胞菌( s p h i n g o m o n a ss p ) ；嗜甲基菌( m e t h y l o b a c i l l u ss p ) 【5 引，假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) 6 4 】，乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u ss p ) ，双歧杆菌 ( b i f i d o b a c t e r i u ms p ) 1 6 5 】，节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) ，短杆菌( b r e v i b a c t e r i u ms p ) ， 红球杆菌( r h o d o c o c c us p ) ，芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 1 3 9 ，寡养单胞菌 ( s t e n o t r o p h o m o n a ss p ) ，青枯菌( r a l s t o n i as p 夕等，并且这些菌都属于好氧降 解菌，主要属于变形菌门( p r o t e o b a c t e r i ap h y l u m ) 和放线菌门( a c t i n o b a c t e r i a p h y l u m ) 和厚壁菌门( f i r m i c u t e sp h y l u m ) 。且不同的降解菌对m c s 的降解速 率或者存在的迟滞期各不相同，主要原因可能是因为自然环境( p h 、温度等其 他营养条件) 条件不同、不同条件下微生物组成不同或降解菌的种类不同、m c s 初始浓度或种类的不同等环境因素的影响；在实验室条件下还可能是因为初始 接种量的不同、培养基种类、加碳氮源的不同及培养条件不同的影响。 1 5 降解途径研究进展 虽然自然界中广泛存在着不同m c s 降解菌，且不同降解菌对m c s 的降解 能力所有不同。目前对于m c s 的微生物降解的研究，不仅仅围绕降解菌分离及 鉴定方面，已经深入到对m c s 的生物降解途径的研究。对降解菌株中提取酶对 8 武汉理工大学硕士学位论文 m c s 的降解的已有研究，但对这些酶的种类及酶是如何通过酶促反应来降解 m c s 的报道还不多。由于m c s 是环状多肽，a d d a 是m c s 表达抑制蛋白磷酸酶 活性的基团，推测a d d a 结