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鼠尾藻中多不饱和脂肪酸分离与纯化的初步研究 摘要 多不饱和脂肪酸已广泛应用于食品、医疗保健等各个领域。目前脂肪 酸主要来源于植物、鱼类、微生物、微藻类等，现有的生产水平难以满足 市场的需求。而海洋大型藻类资源丰富、含量高，从海藻中开发多不饱和 脂肪酸，寻求新的多不饱和脂肪酸来源，具有广阔的前景。鼠尾藻( s a r g a s s u m t h u n b e r g i i ) 是中国近海的一种常见的大型海藻。目前，关于鼠尾藻的研究 开发很少，本文对鼠尾藻中的多不饱和酸进行了提取、分离研究，为从海 洋藻类中多不饱和脂肪酸的开发利用提供理论基础。 本文研究主要包括四个部分，第一部分，通过单因素试验和正交试验， 确定鼠尾藻细胞破碎最佳方法。实验结果显示超声波破碎鼠尾藻细胞的最 佳工艺条件是：在超声波功率7 0 0 w 、总作用时间为1 5 m i n 、超声时间l o s 、 间隔时间为l o s 时，脂质提取率最高为1 0 7 。并比较了其他不同破壁方法， 实验结果表明超微粉碎与超声波破壁方法相结合效果最好。 第二部分，根据中心复合旋转设计原理，在单因素试验的基础上，采 用三因素五水平的响应曲面分析法，建立了鼠尾藻中脂质提取的二次多项 式数学模型，并以脂质的提取率为响应值作响应面和等高线，考察了提取 时间、溶剂的量和石油醚乙醚溶剂配比对脂质提取的影响。结果表明，脂 质提取的优化工艺条件为2 0 0 9 海藻粉、提取时间1 9 3 9 h 、溶剂的量 18 9 0 m l 石油醚百分含量4 6 2 6 。在此工艺条件下，脂质的提取率达最大 值。 第三部分，研究毛细管气相色谱法测定鼠尾藻中多不饱和脂肪酸。最 终色谱条件是：采用d b w a x ( 6 0 mx 0 3 2 m i n x 0 2 5 1 t m ) 色谱柱，进样口温度 2 5 0 。c ，柱温2 3 0 * c 2 0 m i n ，流速1 7m l m i n i , f i d 检测器、检测器温度3 0 0 。c 。 实验结果显示此方法相对标准偏差0 5 2 4 - 1 2 9 7 ，回收率9 7 6 9 9 8 ，各成分的线性相关系数厶o 9 9 。此方法简便，具有较高的准确度和精 确度，可应用于藻类中多不饱和脂肪酸的分析。 第四部分，利用响应曲面分析法优化尿素包合法富集鼠尾藻中多不饱和 脂肪酸工艺。采用三因素中心复合旋转设计来研究尿素脂肪酸质量比值 1 ) ，结晶温度( x 2 ) 、结晶时n ( x 3 ) 对响应变量的影响，并建立二次多项式 数学模型。实验表明，最佳工艺条件是尿素脂肪酸质量比值是3 5 ，结晶温 度5 。c ，结晶时间2 0 4 h ，在此工艺条件下，最大多不饱和脂肪酸的纯度可达 8 5 0 2 o 研究结果表明，鼠尾藻中多不饱和脂肪酸是值得开发利用的优质多不 饱和脂肪酸源，采用上述方法多不饱和脂肪酸的纯度可达8 5 ，为我国藻 类资源开发利用提供新的方法。 关键词：鼠尾藻多不饱和脂肪酸提取尿素包合 s t u d yo ne n ri c h m 匣n tt op u f a so f s a r g a ss u mt h u n b e r g i i a bs t r a c t p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d sh a sb e e nw i d e l yu s e df o o d ，h e a l t hc a r ea n d o t h e r f i e l d s c u r r e n t l y , p o l y u n s a t u r a t e df a t t y a c i d si sf r o m p l a n t s ，f i s h ， m i c r o o r g a n i s m s ，m i c r o a l g a e t h ep r e s e n tp r o d u c t i o nl e v e lc a nn o tm e e tt h e d e m a n do fp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s a sad o m i n a n tp l a n to fs e ag r o u pi n w o r l d ，l a r g e s c a l ea l g e ab ec o n s i d e r e da sa b u n d a n tp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s s o u r c e s t h u s ，i ti sw o r t hd e v e l o p i n gp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ss o u r c e sa n d i t m a yb r i n gap r o m i s i n gp r o s p e c tt oh u m a nb e i n g s a r g a s s u mt h u n b e r g i ii s a c o m m o nb i ga l g a e b u tl i t t l es t u d yo ns a r g a s s u mt h u n b e r g i iw a sc a r r i e do v e l t h i sr e s e a r c ha t t e m p t st om a k eas y s t e m a t i cr e s e a r c ho nt h ep o l y u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d ss e p a r a t e df r o mi t , w h i c hw o u l dp a y aw a yt oe x p l o r a t i o na n d p r o d u c t i o no fp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d so fa l g a e t h es t u d yw a sc a r r i e do u to ff o u ra s p e c t s t h ef i r s ta s p e c ti st oi d e n t i f yt h e b e s tc o n d i t i o n so fc e i ls a r g a s s u mt h u m b e r g i i - - b r e a kt h r o u g ht h es i n g l e - f a c t o r e x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h er e s u l t s s h o w e d ：t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so nc e l l b r e a ko fs a r g a s s u mt h u m b e r g i iw i t ht h eu l t r a s o n i cm e t h o d i l l w e r ep o w e r7 0 0w 、t o t a lw o r kt i m e15 m i n 、w o r k i n t e r v a lt i m e lo s 10 sa n dt h e e x t r a c t i n gr a t ec a l lr e a c h1 0 7 c o m p a r e dw i t ho t h e rc e l l b r e a km e t h o d s ，t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eu l t r a m i c r o s m a s h i n g a n du l t r a s o n i c c e l l b r e a km e t h o d sw e r eb e s t t h es e c o n da s p e c tm a i n l ys t u d i e dt h ee x t r a c t i o np r o c e s so fl i p i df r o m s a r g a s s u mt h u m b e r g i i o nt h e b a s i so fo n ef a c t o rt e s t sa n dt h ec e n t r a lc o m p o s i t e r o t a t a b l ed e s i g np r i n c i p l e ，t h em e t h o do f r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s 谢t 1 13f a c t o r s a n d5l e v e l sw a sa d o p t e d as e c o n do r d e rq u a d r a t i ce q u a t i o nf o re x t r a c t i o no f l i p i dw a sb u i l t r e s p o n s es u r f a c ea n dc o n t o u rw e r eg r a p h e dw i t ht h ee x t r a c t i o n r a t eo fl i p i da st h er e s p o n s ev a l u e b a s e do nt h ea n a l y s i so ft h er e s p o n s es u r f a c e p l o t s a n dt h e i r c o r r e s p o n d i n g c o n t o u rp l o t s ，e f f e c t so fe x t r a c t i o nt i m e i m p r e g n a n tc a p a c i t ya n dp e t r o l e u me t h e r t od i e t h y le t h e rr a t i ow e r ee x p l o r e d b y u s i n gt h i sn e wm e t h o dt h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o nw a so b t a i n e da s f o l l o w se x t r a c t i o nt i m et9 39h o u r si m p r e g n a n tc a p a c i t y18 9 0 m la n dp e r c e n t o fp e t r o l e u me t h e r4 6 2 6 u n d e rt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n t h ea v e r a g e e x t r a c t i o nr a t eo fl i p i dw a st h em o s tv a l u e t h et b s r da s p e c td e t e r m i n e dt h ec o n t e n t so fp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d si n s a r g a s s u mt h u m b e r g i ib yc a p i l l a r yg a sc h r o m a t o g r a p h y d b - w a x ( 6 0m x 0 3 2 m m x 0 2 5pm ) w a su s e d t h ei n j e c t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 5 0 c t h et e m p e r a t u r e o fc o l u m nw a sk e p ta t2 30 cf o r2 0m i n f i dd e t e c t o rw a su s e da n dd e t e c t i o n t e m p e r a t u r ew a s30 0 c ，f l o wr a t ew a s1 7 m l m i n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a tt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s0 5 2 4 1 2 9 7 t h ea v e r a g e i v r a t er a n g e df r o m9 7 6 t o9 9 8 ；r 2 o 9 9 t h em e t h o di s s i m p l e ，a c c u r a t e r e p r o d u c i b l ea n ds u i t a b l ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs a r g a s s u mt h u m b e r g i i t h ef o u r t ha s p e c t , r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e dt oo p t i m i z e d c o n d i t i o n sf o rp r o d u c t i o no fp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( p u f a s ) c o n c e n t r a t e s f r o ms a r g a s s u mt h u m b e r g i i at h r e e - f a c t o rc e n t r a lc o m p o s i t er o t a t a b l ed e s i g n ( c c r d ) w a su s e d t o s t u d y t h ee f f e c to f u r e a - t o f a t t y a c i d r a t i o ( x t ) ， c r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r e ( x 2 ) a n dc r y s t a l l i z a t i o nt i m e ( x 3 ) s e c o n do r d e r p o l y n o m i a lr e g r e s s i o nm o d e l s f o rr e s o n s ev a l u ew e r ee m p l o y e dt og e n e r a t e r e s p o n s es u r f a c e s u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n st h em a x i m u ma m o u n to f t h et o t a l p u f a s ( 8 5 0 2 ) f r o ms a r g a s s u mt h u m b e r g i iw e r eo b t a i n e da tau r e a - t o f a t t y a c i dr a t i oo f3 5 ，ac r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r eo f 一5 ，a n dac r y s t a l l i z a t i o nt i m e o f2 0 4 h t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a ts a r g a s s u mt h u m b e r g i ii sw o r t h d e v e l o p i n gp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ss o u r c e sa n di tm a yb r i n gap r o m i s i n g p r o s p e c tt oh u m a nb e i n g k e y w o r d s ：s a r g a s s u mt h u m b e r g i # p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ；e x t r a c t i o n ； u r e ac o m p l e x a t i o n v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成 果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经 发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研 究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：舡玉兰 学位论文使用授权说明 口8 年旯f b 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 曰葡时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：舡五兰 新签名舷浠钟万月，日 鼠月l 藻中多不饱和脂肪酸分离与绒1 七的初步研究 1 1 研究背景 第一章绪论 1 1 1 多不饱和脂肪酸的结构和命名 多不饱和脂肪酸( p 0 1 y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，p u f a s ) 是指含有两个或更多个双 键的长链脂肪酸。根据靠近双键碳原子的位置，p u f a s 可分为- 3 ，- 6 等系列脂肪酸。 所谓o - 3 系列p u f a s 就是从碳链的甲基一端数起在碳原子数第3 位上存在有双键的 p u f a s ，主要包括二十碳五烯酸( e p a ) 、二十二碳六烯酸( d h a ) ，亚麻酸( g l a ) ，二十二碳五 烯酸( d p a ) - 6 系列的p u f a s 是从碳链的甲基一端数起在碳原子数第6 位上存在有双键 的p u f a s ，主要包括亚油酸( l a ，十八碳二烯酸) 和花生四烯酸( 从，二十碳四烯酸) - 3 和- 6 之间是不能互转化的。但在体内由于可竞争相同的酶系而能相互影响。从，g l a e p a 和d h a 人体内不能合成，需要从食物中摄取，所以是人类的必需脂肪酸。p u f a s 在机 体内具有较广泛的生理功能和生物学效应，而且双键愈多，不饱和程度愈高，营养价值 也愈高。 1 1 2 多不饱和脂肪酸的生理功能 1 1 2 1 多不饱和脂肪酸对心血管疾病的影响 p u f a s 防治心血管病的作用是多方面的。抗心律不齐，主要是抗心室纤颤效应，另 外d h a 、e p a 在体内能够抑制胆固醇的合成，增加胆固醇的排泄，改变脂蛋白中脂肪 酸的组成，从而增加其流动性。因此，可以改善高血脂症状、降血压、预防和治疗动脉 粥样硬化。不仅具有抑制血小板凝集，阻止血栓素合成的作用，而且自身能转化成抗血 小板凝集素，使血管扩张；还具有增加血小板细胞膜流动性，改善细胞膜通透性、改变 细胞信号【1 1 、调节心肌细胞中n d 、c a + 转化器1 2 及钙离子通道的动态平衡等作用【3 1 。 因此，可以防止脑血栓的形成，预防心肌梗塞，保护血管壁不破裂。国内外做了大量这 方面的研究，主要表现如下： 鼠置藻中多不饱和脂肪酸分离与纯1 七的初步研究 1 降血脂研究表明，g l a 、e p a 、d h a 具有明显的降低胆固醇( t c ) 的功效，降 血脂效应表现在降低血清甘油三酯、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和升高血清高密度 脂蛋白的作用，从而增加其极性及流动性。h a r r i s 等【4 】报道6 1 3 p u f a s 可以抑制肝脏甘 油三酯( t g ) 和脂蛋白胆固醇( v l d l 广) 的合成，从而降低血浆t g 浓度。在一个随机试验 中，高血脂患者被分为两组，一组患者每天给予4 0 m g 辛伐他汀和4 9o m a c o r ( 鱼油制剂， 每个胶囊含有8 4 0 m ge p a ) ，另一组患者给予相同剂量的辛伐他汀和安慰剂。相对安慰 剂组，用药组的血浆t g 浓度下降2 0 3 0 ，v l d l c 浓度下降3 0 4 0 ，而l d l c 没有升高【习 2 降血压p u f a s 可使高血压患者的血压降低且显示出作用与剂量成正相关，但对 正常的血压几乎没有作用 6 1 ，在试验中，1 3 5 6 名高血压患者每天服用3 6 9 鱼油能使患者 的血压平均降低2 1 - 1 6 m m h g 7 1 。 3 降低心源性猝死率d a r t 嗍是首次关于摄取p u f a s 和预防心肌梗塞关系的研 究。在这个研究中，1 0 1 5 人每周至少食用深海鱼类两次，对照组1 0 1 8 人不食用。两年之 后，心肌梗死的发病率虽然没有降低，但是死亡率降低2 9 。在t r i a l 9 1 等实验中，11 3 2 4 名 冠心病患者被随机分组，其中一组患者每天给予3 不饱和脂肪酸8 5 0 r a g ，三年半之后， 此组患者的猝死发病率降低4 5 。 4 抗心律失常在一个随机双盲试验中，c h r i s t e n s e n 等【1o 】发现补充鱼油能够提高患 者心肌梗死后的心律变异性，从而降低恶性心律失常及猝死的发生率。l e a f 等【1 1 】报道在 动物模型中鱼油对冠状动脉闭合手术后的心室颤动有保护作用，给患有心肌症的新生小 鼠补充e p a 和d h a ，能够终止药物介导的心律失常。 5 治疗动脉粥样硬化t i e s 等【1 2 】报告，3 p u f a s 能够影响动脉粥样硬化的进程， 通过血管造影术可以看出，给冠心病患者补充( i ) 3 p u f a s 能使冠脉的病变范围减小，这可 能与其降低血浆脂质、减轻炎症反应、减少生长因子的合成以及抑制平滑肌的增殖有关 1 1 2 2 多不饱和脂肪酸能延缓炎症 p u f a s 对防治某些炎症疾病，如类风湿性关节炎、牛皮癣和哮喘等，已取得良好的效 果，大剂量的p u f a s 能使类风湿性关节炎患者的关节柔软度、清晨僵直、握力和间歇性 疲劳等得到改善。把常规抗炎药和鱼油结合应用，可减轻类风显性关节炎患者引起的疼痛 和行动不便。p u f a s 的抗炎作用机制可能是由于竞争性的拮抗从的代谢产物所具有的 致炎作用。提高p u f a s 的摄入量，能够提高p u f a s 在细胞膜中的比重，竞争性的抑制从 的代谢，从而减少具有很强致炎作用的从代谢产物的生成，延缓炎症的发生和发展【1 3 1 2 广西大掌硕士论文 鼠暑藻中多不饱和i l l 肪酸分离与绒代的初步研究 1 1 2 3 多不饱和脂肪酸能够抑制肿瘤生长 大量实验表明，d h a 和e p a 具有较好的抗癌作用，其抗癌机理主要有四个方面： 通过致线粒体膜损伤、促进细胞内活性氧的产生、激活c a s p a s 蛋白酶以及调控凋亡 相关基因的表达等多种途径参与肿瘤细胞的凋亡过程【1 4 1 ；癌细胞的膜合成对胆固醇的 需要量大，而c - ，3 脂肪酸能降低胆固醇水平，从而能抑制癌细胞生长；在免疫细胞中 的d h a 和e p a 产生了更多的有益生理效应的物质，参与了细胞基因表达调控，提高了 机体免疫能力，减少了肿瘤坏死因子；e p a 和d h a 大大增加细胞膜的流动性，有利 于细胞代谢和修复，阻止肿瘤细胞的异常增生【1 ”6 1 。t e r r y t l 7 1 等报告增加p u f a s 的摄 入量能够降低乳腺癌，前列腺癌以及和激素相关的癌症发病率。刘翼红等【1 6 】研究发现绝 经后的乳腺癌病人，摄入的e p a 和d h a 在膳食中的比例及乳腺脂肪组织中d h a 占磷 脂的比例，明显低于乳腺良性疾病病人，建议摄入3 脂肪酸可以预防乳癌的发生。 1 1 2 4 多不饱和脂肪酸能够提高免疫力 对细胞免疫的影响主要是通过调节免疫细胞膜上受体和分子的表达，影响细胞的免 疫反应来实现的。p u f a s 在降低心血管和炎症疾病的发生率上作用明显。也可以抑制t 细胞增殖【l 羽。膳食中不饱和脂肪酸的摄入量不同，产生的作用效果不同，一般认为，少 量的脂肪酸对免疫系统有促进作用。v 酊t i e r 【1 9 j 在膳食脂肪对s d 大鼠母鼠和幼鼠免疫调 节作用的研究中发现，鱼油组大鼠与其它脂食脂肪相比，母鼠和幼鼠的淋巴细胞表面 c d 2 5c d 5 4c d 2 8c d 5 6 明显增加，从而表明饮食中加入能增加机体的免疫监视水平。 另外，主要消费不饱和脂肪酸( 主要是鱼油) 的人群与主要消费脂肪酸( 豆油) 的人 群相比，前者感染的发生率显著低于后者，这表明多不饱和脂肪酸可以提高免疫力。 1 1 2 5 多不饱和脂肪酸能够促进生长发育提高智力 不仅能促进胎儿和婴幼儿的生长发育，而且对脑和视网膜、皮肤和肾功能的健全十 分重要。临床观察发现母乳喂养婴儿的红细胞和含量较牛奶喂养的高；食母乳的婴儿到 7 - - 8 岁时智商要高于人工乳喂养的儿童，这一差异与d h a 有关。因为d h a 能够促进 智力的发育并影响视力水平。陈文雄 2 0 1 研究了p u f a s 和牛磺酸对大鼠脑神经发育的影 响，牛磺酸作为神经调节因子，调节突触形成的活动，促进突触形成。实验证明p u f a s 是突触体膜中磷脂酰乙醇胺的主要成分可促进神经细胞对牛磺酸的摄取，从而具有健脑 益智作用。正因为如此，国际市场上已开发了多种含d h a 、e p a 等的保健食品和药品。 1 1 2 6 多不饱和脂肪酸的其它生理功能 p u f a s 对抑郁症、躁狂症以及精神分裂症都有治疗作用【2 1 ，捌，还有降血糖、养颜， 减肥，益寿等多种功效。而d h a 、e p a 则有保护视力，抗过敏等其它作用。 3 广西大学硕士论文 鼠足藻中多不戗蚜口脂肪酸分离与绒1 七的初步研究 1 1 3 多不饱和脂肪酸的提取和富集方法 多不饱和脂肪酸含有多个烯键，因此，都很容易氧化分解，产生一些挥发与非挥发 性物质，如：醛、酮、醇、酸以及碳基化合物，这些化合物对人体都有不同程度的害处 防止其氧化变质的最好方法是使之与空气( 氧气) 隔绝，即注入惰性气体( 如n 9 ，另外， 低温保藏o o c 以下) 、添加抗氧化剂、使用脱氧剂等也有一定效果。依据多不饱和脂肪 酸的物化和生物学特性，用于提取、浓缩p u f a s 方法国内外报道的有下列几种。 1 1 3 1 低温结晶法， 又称溶剂分级分离法，该方法利用低温下不同的脂肪酸或脂肪酸盐在有机溶剂中溶 解度不同来进行分离纯化。一般来说，脂肪酸在有机溶剂中的溶解度随碳链长度的增加 而减小，随双键数的增加而增加，这种溶解度差异随温度的降低表现得更为显著。所以 将混合脂肪酸溶于有机溶剂，通过降温至一4 0 c 8 0 并恒温一段时间，这样饱和及低 不饱和脂肪酸就以晶体析出，而多价不饱和脂肪酸仍留在溶剂中，过滤除去其中大量的 饱和脂肪酸和部分低不饱和脂肪酸，将滤液蒸去溶剂就可获得所需的多价不饱和脂肪酸 2 3 - ：2 4 。李和1 2 5 】等选用丙酮一乙醇( 9 ：1 ) 混合溶剂，对鱼油脂肪酸进行低温结晶分离，降温 速率控制在15 c m i n ，降至一4 7 时恒温搅拌2 5 m i n ，一次分离后( e p ：a + d i i a ) 含量由 7 * , - - 1 5 提高到5 0 一5 8 ；同法进行第2 次分离，降温速率仍为1 5 c n f m ，降到5 1 后 恒温4 0 m i n ，( e p a + d h a ) 含量可达7 3 * , - - , 7 9 ，并除去了无用的脂肪酸( 饱和及低不饱和 脂肪酸) 和胆甾醇等成分。 低温结晶法工艺原理简单、操作方便，有效成分不易发生氧化、聚合、异构化等变 性反应，适合于中小企业使用，有一定现实意义，但需要回收大量的有机溶剂，且分离 效率不高，常与其他分离方法配合使用。 1 1 3 2 尿素包合法 尿素包合法是一种较常用的多不饱和脂肪酸分离方法，其基本特点是可以把脂肪酸 混合物按脂肪酸不饱和程度的差异进行分离，其原理是尿素分子在结晶过程中能够与饱 和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成较稳定的晶体包合物析出，而多不饱和脂肪酸由于双键 较多，碳链弯曲，具有一定的空间构型，不被尿素包合，因此采用过滤方法除去饱和脂 肪酸和单不饱和脂肪酸与尿素形成稳定的包合物，就可得到较高纯度的多不饱和脂肪 酸。朱自强口6 】等认为，尿素脂肪酸形成的包合物应视作真实的化合物，而不是混合晶体。 白新鹏 2 7 1 利用尿素包合法使鱼油中的3 多不饱和脂肪酸的含量由5 0 提高到8 0 以 上。朱世云【2 8 1 等采用尿素包合法对大连鱼油中的e p a 和d h a 进行富集，在较佳操作条 4 厂。西大掣硕士啼套文胄l j t , - o t - 中多不饱和脂肪酸分离与纯化的初步研究 件下，一次富集产品中( e p a + d 姒) 含由原来的3 1 2 3 提高到7 4 3 。李国文1 2 9 等用尿 素包合法富集鱼油乙酯，也能使最终产品中的e p a 和d h a 总含量由原料中的3 0 5 6 上升到7 0 2 2 。张燕平等3 0 】人进行了苏子油中亚麻酸的纯化研究，经纯化后的样品亚 麻酸的含量可提高至8 4 2 4 。朱丹等【3 l 】人将苏子油进行尿素包合，可将亚麻酸由5 7 4 提高到8 9 3 尿素包合法成本较低、设备简单，试剂便宜、操作简便，尤其是不在高下进行，能 比较完全地保留其营养和生理活性，特别适宜于富含p u f a s 的油的处理【3 0 】。尿素包合 法是一种简便有效的方法【3 3 洲。应用较普遍，适合商业化。 1 1 3 3 吸附分离法( 银离子络合法) 该方法利用吸附剂选择性吸附分离多烯不饱和脂肪酸。典型的是银离子能与不饱和 脂肪酸的双键形成络合物。目前，对银离子a g + 与不饱和碳一碳双键成键，普遍接受的 是d c w a r - c h a t t - - d u n - c a r s o n 模型( 简称d c d 模型) 【3 5 1 ，d c d 模型假设成键包含两个相互 依赖的部分：1 碳一碳双键中尢电子与a 矿形成一个配位键，这是双键到a g + 的键合；2 a g + 反过来给出一对d 电子到碳一碳双键的矿轨道上，形成矿键，这是a g + 到双键的键合。 将银离子固定在吸附剂载体上，不同饱和度的脂肪酸在吸附剂上的吸附能力不同因而得 以分离。因此a g 十能与高度不饱和脂肪酸的碳一碳双键形成络合物，双键越多，络合作 用越强，络合越稳定。s aa a 、e p a 含4 个和5 个双键，它们都能与a g + 形成很稳定 的亲水络合物，而从油相中分离出来【蛔。a d l o f t 3 刀等将溶有一定比例a g n 0 3 的固定相装 入层析柱中，把待分离的脂肪酸醋通过该层析柱，并从柱顶加入洗脱液，每隔一段时间 收集洗脱液，混合物中含有双键的组分将与银离子作用，双键越多，作用力越强，停留 时间也就越长，于是，混合物中组分按饱和、低度不饱和及高度不饱和的顺序，依次随 洗脱液流出。最后将e p a 的浓度由2 9 1 提高到8 7 7 ，d h a 的浓度由2 0 5 提高到 9 5 4 。 吸附分离法的优点在于分离效果好，产品纯度高，缺点是有些洗脱剂容易污染产品， 而且分离规模较小，只用于实验室少量样品的制备，不适用于工业化大规模连续生产。 近年来，人们开始采用大型高压液相色谱装置来制备高纯度的多价不饱和脂肪酸。 1 2 3 4 分子蒸馏法 分子蒸馏法是一种特殊的液液分离技术【3 8 1 ，国外在2 0 世纪3 0 年代就出现这种技术， 并在6 0 年代开始工业化应用1 3 9 其原理是利用混合物组分挥发度的不同而得到分离。该 方法一般在绝对压强为1 3 3 p a , - o 0 1 3 3 p a 的高度真空下进行。在这种条件下，脂肪酸分子 5 鼠置藻中多不供驴p 脂肪酸分离与多屯化的初步研究 间引力减小，挥发度提高，因而蒸馏温度比常压蒸馏大大降低。分子蒸馏时，饱和脂肪 酸和单不饱和脂肪酸首先蒸出，而双键较多的不饱和脂肪酸最后蒸出瞄】。徐世民等 经过一级分子蒸馏，得到e p a 、d p a 和d h a 的总含量为5 4 8 6 ( 质量分数) 的海狗油产品， 收率为9 2 7 。李东伟【4 l 】等采用尿素包合法与分子蒸馏法相结合的工艺提纯鱼油，能使 ( e p a + d h a ) 含量从2 5 * * - - 3 0 提高到8 0 以上，而且产品外观、色泽均很好，可与国外同 类产品媲美。 分子蒸馏法的优点在于蒸馏温度较低，可有效防止多不饱和脂肪酸受热氧化分解， 而且所生产的产品色、臭指标较好，缺点是需高真空设备，且能耗较高。 1 1 3 5 膜分离法 1 9 9 4 年佐桥裕子等人将鱼油水解后，将水解液利用可通透分子量2 0 0 0 0 的膜来分 离水解液中的大小分子，进而达到浓缩的目的。其产品中的e p a 和d h a 浓度达 3 4 1 4 2 1 。 1 2 3 6 脂肪酶浓缩法 酶在鱼油多不饱和脂肪酸的富集上的应用在国外已有较多研究，但国内在这方面的 研究还较少。目前酶在鱼油处理中的应用主要有三方面：脂肪酶催化鱼油水解、酶催化 酯交换、酶催化酯化。酶法水解是在脂肪酶催化下鱼油发生部分水解，尽量把e p a 和 d h a 等多不饱和脂肪酸保留在甘油酯中，水解掉其他脂肪酸，从而提高e p a 和d h a 在甘油酯中的含量。g e r a l de m cn e i l l 等人【4 3 】利用c a n d i d ar u g o s a 或g e o t r i c h u mc a n d i d u m 脂肪酶选择性水解鱼油，可以使其中的多不饱和脂肪酸由原来的3 0 提高到5 0 。y u j i s h i m a d a 等人m 】利用g e o t r i c h t t me a n d i d u m 脂肪酶水解金枪鱼油，可得到含e p a + d h a 达4 8 7 的甘油酯。由此看来，虽然选择性水解鱼油来富集多不饱和脂肪酸是一种简单 的方法，但富集的效率并不是很高，多不饱和脂肪酸的最高含量只能达到5 0 ，因此， 进一步探索脂肪酶催化或结合其他方面可行的新方法是人们追求的目标【4 5 1 。 s h a r o n a s p u r v e y 等人【4 6 】利用p s e u d o m o n a ss p e c i e s ( p s 3 0 ) 脂肪酶催化鲱鱼油和鲸脂油 与y 亚油酸( g l a ) 的酸解反应，g l a 与鲱鱼油和鲸脂油的结合率分别为3 9 6 和 3 7 1 。酶催化酯交换于酯化相比之下，酯交换法所用的高纯度e p a 、d h a 较酯化法要 少，但酯交换反应速度要比酯化慢且反应不完全。酯交换法还有待进一步改进f 4 7 】。要通 过前面介绍的各种方法得到较纯的多不饱和脂肪酸甘油酯是非常困难的，因此，人们提 出了用酶法合成多不饱和脂肪酸甘油酯。先使鱼油完全水解，再提纯制得高纯度的e p a 、 d p a 和d h a ，在酶催化下与甘油发生酯化反应，然后再分离提纯，此法可得到纯度较 6 鼠毛藻中多不俄蚜口脂肪酸分离与纯化的初步研究 高的e p a 、d p a 和d h a 甘油酯。c e r d a u 等人【4 8 j 利用n4 3 5 脂肪酶合成甘油与多不饱和 脂肪酸的反应，甘三酯中e p a 和d h a 分别为2 7 4 与4 5 1 。 此方法还不是很成熟，要得到较纯的多不饱和脂肪酸甘油酯是非常困难的且脂肪酶 价格昂贵，固定化效果不稳定。 1 1 3 7 超临界c 0 2 萃取法 超临界流体萃取是近几年发展起来的一种新的分离技术，也是目前国内外研究的热 点。超临界流体萃取的基本原理是通过调节温度和压力使原料各组分在超临界流体中的 溶解度发生大幅度变化而达到分离的目的。与传统萃取方法相比，由于超临界流体具有 良好的近于液体的溶解能力和近于气体的扩散能力，因此萃取效率大大提高。另外，超 临界流体萃取常选用二氧化碳( 临界温度3 1 3 c ，临界压力7 3 7 4 m p a ) 等临界温度低且化 学惰性的物质为萃取剂，因此特别适用于热敏物质和易氧化物质的分离【4 9 】。黄俊辉等【5 0 】 应用超临界二氧化碳从海带中提取多不饱和脂肪酸，总多不饱和脂肪酸含量达到6 7 2 毛灿等人f 5 l 】利用超临界c 0 2 萃取能把鱼油中的e p a 和d h a 从3 0 - 4 5 提高到6 5 7 5 。卢 晓等【5 2 】利用超临界c 0 2 萃取获的含量为8 9 2 e p a 甲酯、和9 1 i d h a 乙酯。侯相林等 【5 3 1 在超临界相中通过酶催化酯交换反应获得脂肪酸乙酯，再经过精馏柱控制可得到纯度 为9 1 亚麻酸。 超临流体萃取特别适用于热敏物质和易氧化物质的分离，可有效分离链长差别较大 的脂肪酸，但若将碳链长度相近的脂肪酸开，还必须结合其他分离技术。 1 1 3 8 复合法 仅用一种富集方法，往往达不到富集目的，许多学者研究了多种方法相结合来提取 纯度更高的多不饱和脂肪酸。例如超临界c 0 2 萃取和尿素包合法相结合可实现优势互 补，超临界c 0 2 萃取按碳链长度分离脂肪酸，而难以分离碳原子数相同而双键数不同的 脂肪酸，如c 2 0 ：0 、c 2 0 ：1 、c 2 0 ：4 、c 2 0 ：5 ，尿素包合法则按双键数的不同分离脂肪酸。 邱榕等【5 4 1 研究了在超临界c 0 2 中尿素包合法浓缩鱼油中e p a 、d h a 的试验，结果表明 e p a 的含量从1 6 8 0 提高至2 2 2 2 ，d h a 的含量从5 3 4 2 提高至6 3 1 6 。r u b i n 等【5 5 】 利用尿素包合法与冷冻结晶法相结合，能得到天然的1 0 0 纯度的e p a 和1 0 0 纯度的 d h a 。张曙武等人把碱金属盐与尿素包合法相结合，用此法【5 6 】制得的e p a 和d h a 不仅 纯度高，而且防止了多不饱和脂肪酸的异构化 一 7 广西大国页士论文鼠尾藻中多不供u p 脂肪酸分离与多巴1 匕的初步研究 1 1 4 多不饱和脂肪酸的来源及特点 1 1 4 1 来源于植物 从植物种制备多不饱和脂肪酸也有研究，如松籽、亚麻、紫草、栀子、橡胶籽、亚 麻籽、养麦籽等从中提取多不饱和脂肪酸在国内也见过报道【5 7 石3 1 ，但多不饱和脂肪酸含 量低主要成分是亚麻酸和亚油酸，几乎不含有s a 、a a 、e p a 、d h a 。 1 1 4 2 来源于微生物 研究人员近年来也发现许多真菌中有积累多不饱和脂肪酸的现象，在高山被孢霉 ( m o t i e r e l l aa l p i n a ) 樟疫霉( p h t o p h h o r ac i n n a m o n n i ) 、终极腐霉( p v t h i u m u l t i m u m ) 、长袍被 孢霉似e l o n g a t a ) 畸雌腐霉i r r e g u l a r ) 等真菌中发现了e p a 的存在，在破囊壶菌 ( t h r a u s t o c h y t d u ms p ) 和裂殖壶菌( s c h i z o c h y t r i u ms p ) 等海洋微生物中发现了多不饱和脂 肪酸的积累。利用真菌生产的工作还处于尝试和探索阶段，如果仅采用现有的真菌菌种 和技术生产p u f a s 仍然存在成本偏高，工艺流程不成熟，对外界因子干扰敏感，产量 有限等问题。 1 1 4 3 来源于鱼油 p u f a s 最早是从海洋鱼类的鱼油中分析出来的，来源于鱼油的p u f a s 是研究的最 早、最深入的。e p a 含量高的有：南极磷虾的脂质、狭鳍鱼肝油、墨鱼肝油、远东拟沙 丁鱼油；d h a 含量高的有远东拟沙丁鱼油、墨鱼肝油、秋刀鱼油。但是有鱼油来生产 p u f a s 存在很多弊端，第一，由于加工过程中，鱼油多被氢化处理，使长链不饱和脂肪 酸加氢饱和，降低了鱼油p u f a s 的含量；第二，鱼油易受环境因素如光、水分、温度、 氧等影响而发生氧化，产生大量过氧化物，造成鱼油酸败；第三，摄取劣变鱼油，对于人 的身体健康也会产生不良的影响；第四，鱼油多由深海鱼类中提取，这些鱼类价格较高， 是鱼油p u f a s 产品价格居高不下的又一瓶颈；第五，鱼油本身带有浓烈的鱼腥味，影响 人们对它的接受程度；第六，鱼油存在着动物脂肪所固有的胆固醇，