（制糖工程专业论文）生物法生产低聚葡萄糖的研究.pdf

摘受 摘要 本文旨在研究以生物法生产低聚葡萄糖，为低聚葡萄糖的工业化提供新的技术依 据。 首先研究了肠膜明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 发酵产葡聚糖。文中依据肠 膜明串珠菌的生长曲线和摇瓶发酵曲线，确定了肠膜明串珠菌对数生长期为2 6 3 6h ， 稳定期为3 6 6 0h ；2 6h 之后发酵液中开始产生葡聚糖。通过摇床发酵实验确定了发酵 液最佳配方：蔗糖1 0 0g l 、蛋白胨5 0g l 、c a c o s0 8g l 、m g s 0 40 0 2g l 、( n h 4 ) 2 8 0 4 o 0 2g l ；摇床发酵最佳条件：温度2 5 、活化液接种量5 、发酵液装液量1 0 0 2 5 0m l 、 摇床转速1 5 0r m i n 、发酵液起始p h 值7 5 。在此条件下，摇瓶和发酵罐发酵的蔗糖转 化率分别为6 2 5 8 和7 0 2 5 。 第二研究了发酵液的脱蛋白、脱色及葡聚糖的提取和沉淀工艺。研究发现t c a 法 脱蛋白效果最好，以0 1 t c a 脱蛋白，蛋白的脱除率为8 1 5 ，葡聚糖的损失率为 1 0 2 ；活性炭对发酵液的脱色效果较好，实验结果表明：1 0 l 活性炭用于脱色发酵 液时，脱色率为8 0 1 9 ，葡聚糖损失率为1 9 2 4 ；接着研究了n a c l 、k c l 、n a o h 对 葡聚糖提取的效果，结果表明：0 6m o l l 的k c i ，6 0 提取效果最好，葡聚糖得率为 4 3 5 7g k g ；最后考查了乙醇沉淀葡聚糖的效果，结果表明：6 0 时，6 0 乙醇终浓度 沉淀葡聚糖效果较好，葡聚糖得率为4 1 2 8g k g ； 第三研究了普鲁兰酶( o p t i m a xe c 3 2 1 4 1 ) 酶解葡聚糖生产低聚葡萄糖。通过酶解 实验确定酶解葡聚糖的最优条件为：p h4 4 、温度5 4 。c 、反应时间o 5h 、酶活浓度 2 0 0 0 a s p u g ，在此条件下，9 4 1 1 的葡聚糖可以降解为低分子量的糖。 最后探讨了低聚葡萄糖的结构和性质。高效液相色谱表明酶解产物中低聚葡萄糖占 7 4 5 5 ，比市面上销售的低聚异麦芽糖i m 0 5 0 0 的活性成分高。红外光谱表明低聚葡萄 糖含有a 吡喃糖苷键。通过葡聚糖相对粘度的测定，发现低聚葡萄糖的粘度随着温度的 增加而降低，随着溶液p h 的增加而增加，p h 在4 0 8 0 的范围内粘度增加速度较快， 低聚葡萄糖有着与其它低聚糖相当的热稳定性。通过低聚葡萄糖相对溶解度的测定，发 现6 0 低聚葡萄糖相对溶解度最大，达到8 2 ，冷冻干燥的产品溶解性最好，相对溶 解度达到7 9 - 8 5 。 关键词：发酵；葡聚糖；低聚葡萄糖；普鲁兰酶；酶解 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eo b j e c t i v eo ft h i sw o r kf o c u s e do nu s i n gb i o l o g i c a lm e t h o dt op r o d u c eag l u c o s e o l i g o s a c c h a r i d e ，w h i c hp r o v i d e dn e wt e c h n o l o g y f o r t h ei n d u s t r i a l i z a t i o no fg l u c o s e o l i g o s a c c h a r i d e f i r s t l y , d e x t r a np r o d u c e db yl e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e sw a ss t d u t i e d a c c o r d i n gt ot h e g r o w t hc u r v eo fl e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e sa n dt h et i m ec o u r s eo fg r o w t hi ns h a k ef l a s k ， l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s eo fl e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e sw a sb e t w e e n2 6ha n d3 6h ，a n d s t a t i o n a r yp h a s ew a sb e t w e e n3 6ha n d6 0h ：a f t e r2 6hd e x t r a nw a ss y n t h e s i s e di n f e r m e n t a t i o nb r o t h f e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t sh a db e e nt a k e nt od e t e r m i n et h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nl i q u i dm e d i u m ：s u c r o s e10 0g l ，p e p t o n e5 0g l ，c a c 0 30 8g l ，m g s 0 40 0 2 g l ( n h 4 ) 2 s 0 40 0 2g l ；t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si nt h es h a k e r ：t e m p e r a t u r ei s 2 5 t h ei n o c a t i n gr a t eo fa c t i t i v a t i o ns o l u t i o ni s5 t h ec u l t u r em e d i u mo ff e r m e n t a t i o n l i q u i di s 10 0 2 5 0m l ，t h er o t a t i o ns p e e do fs h a k i n gt a b l ei s15 0r m i n ，t h es t a r t i n gp ho f f e r m e n t a t i o nl i q u i di sp h7 5 a to p t i m u mm e d i u ma n do p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ec o n v e r s i o n r a t eo fs u c r o s ei ns h a k ef l a s ka n di nf e r m e n t o rw a s6 2 5 8 a n d7 0 2 5 r e s p e c t i v e l y s e c o n d l y ，t h ed e p r o t e i n i z a t i o na n dd e c o l o r a t i o no ff e r m e n t a t i o nl i q u i d ；t h ee x t r a c t i o n a n dt h ep r e c i p i t a t i o no fd e x t r a nw e r es t u d i e d 。砀em e t h o do ft c aw a st h eb e s tt or e m o v e p r o t e i n s o 1 t c aw a su s e df o rd e p r o t e i n i z a t i o n ，t h er a t eo fd e p r o t e i n i z a t i o nr e a c h e d81 5 w h i l et h er a t eo fd e x t r a nl o s i n gw a so n l y10 。2 ，殇ed e c o l o r a t i o ne f f e c ti sb e r e rb yt h e m e t h o do fa c t i v ec a r b o n t h er a t eo fd e c o l o r a t i o nr e a c h e d8 0 19 w h i l et h er a t eo fd e x t r a n l o s i n gw a s19 2 4 t h e nt h r e ee x t r a c t i o nm e t h o d s e f f e c t so ft h ed e x t r a nh a db e e nc o m p a r e d ， n a c l ，k c l ，n a 0 h t h er e s u l t ss h o w e dm a tt h em e t h o do f0 6m o l lk c lw a st h eb e s tf o r e x t r a c t i o na t6 0 。c ，t h ey i e l dr a t eo fd e x t r a ni s4 3 5 7g l ( g t h ee f f e c to fe t h a n o lp r e c i p i t a t i o n d e x t r a nw a se x a m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t6 0 e t h a n o lt e r m i n a lc o n c e n t r a t i o nw a sm o r e e f f e c t i v et od e p o s i t ed e x t r a na t6 0 。c ，t h ey i e l dr a t eo fd e x t r a ni s41 2 8g k g t h i r d l y , t h ep r o d u c t i o no fg l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d eb yt h ep u l l u l a n a s e ( o p t i m a xe c 3 2 1 41 ) e n z y m o l y s i s i n gd e x t r a nw a ss t u d i e d t h r o u g ht h e e n z y m o l y s i se x p e r i m e n t ， o p t i m u mc o n d i t i o n sf o re n z y m o l y s i sd e x t r a nw e r e ：p h4 4 ，t h et e m p e r a t u r e5 4 ，t h er e a c t i o n t i m e0 5h t h ee n z y m ec o n c e n t r a t i o n2 0 0 0a s p u g t h er e s u l t ss h o w e dt h a t9 4 1 1 d e x t r a n c a nb ed e g r a d a t e dt ol o wm o l e c u l a rw e i g h tc a r b o h y d r a t e f i n a l l y , g l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d e s t r u c t u r ea n dn a t u r ew e r ep r e l i m i n a r yd i s c u s s e d t h e h i g h l ye f f e c t i v el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) i n d i c a t e dt h a tg l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d ew a s 7 4 5 5 i ne n z y m a t i ch y d r o l y s a t e ，w i t i lh i g h e ra c t i v ei n g r e d i e n tt h a ni s m a l t o o l i g o s a c c h a r i d e s i m 0 5 0 0i ns a l e s t h ei n f r a r e dc h r o m a t o g r a p hi n d i c a t e dt h a tt h eg l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d e i n c l u d e da l p h ap y r a n o s eg l u c o s i d el i n k a g e t h r o u g ht h eg l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d er e l a t i v e v i s c o s i t y sd e t e r m i n a t i o n ，i tw a sd i s c o v e r e dt h a tg l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d ev i s c o s i t yd e c r e a s e d w h i l et e m p e r a t u r ei n c r e a s e i n g ；a n di n c r e a s e dw h i l ep hd e c r e a s e i n g ；a n di nt h ep h4 - 8s c o p e t h ev i s c o s i t yi n c r e a s e df a s t e r ；g l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d eh a dt h ee q u i v a l e n tt h e r m o s t a b i l i t ya s w e l la so t h e ro l i g o s a c c h a r i d e s t h r o u g ht h eg l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d er e l a t i v es o l u b i l i t y d e t e r m i n a t i o n , i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h eg l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d er e l a t i v es o l u b i l i t yw a st h e i i 人b s t r a c t b i g g e s t ，r e a c h i n g8 2 a t6 0 。c ；t h es o l u b i l i t yo fp r o d u c tb yt h ef r e e z e - d r y i n gw a st h eb e s t a n dt h er e l a t i v es o l u b i l i t yr e a c h e d7 9 - 8 5 k e yw o r d s ：f e r m e n t a t i o n ，d e x t r a n ，g l u c o s eo l i g o s a c c h a r i d e ，p u l l u l a n a s e ，e n z y m o l y s i s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： e l 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日 期： 皇靼 第一章绪论 第一章绪论帚一早 珀下匕 1 1 引言 1 9 9 3 年，在旧金山召开的首届国际糖生物工程会议上，著名生物化学家哈特( h a r t ) 认为：生物化学中最后一个广袤前沿糖生物学的时代正在加速来临【1 】。随着糖链生 物学功能的揭示与认识，糖生物学正成为一个新科学前沿，继基因工程、蛋白质工程之 后，糖工程已成为最引人注目的新生物技术学科，低聚糖的研究是糖工程中的主要组成 部分口j 。功能性低聚糖( f u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e ) 作为新生理活性物质，在疾病诊断与防 治、营养与保键、植物生长及抗病、畜牧养殖等方面的应用倍受关注【3 】。 至2 0 0 2 年，世界低聚糖总产量己达1 5 万吨，2 0 0 7 年全球低聚糖总产量有3 0 万吨， 发展速度十分惊人，据估计，世界低聚糖终端产品市场销售额将超过5 0 0 亿美元。低聚 糖早已成为国际市场上极其重要的医药保健品、低聚糖农药、低聚糖肥料新原料。我国 具有低聚糖产业发展的特色与资源优势，在倡导绿色健康、农业增殖、环境保护等背景 下，应抓住机遇，大力发展自主技术。功能性低聚糖的研究及应用不仅有助于提高我国 的学术地位，并将在我国形成新的明星产业。 1 2 目前国内所生产低聚糖的分类 低聚糖分为功能性低聚糖和普通低聚糖两大类。19 9 9 年我国公布的“功能性低聚糖 通用技术规则行业标准”对功能性低聚糖的定义为：( 1 ) 功能性低聚糖是由2 1 0 个相同或 不同的单糖，以糖苷键聚合而成；( 2 ) 具有糖类某些共同的特性，可直接代替糖料作为甜 食品配料，但不被人体胃酸、胃酶降解，不在小肠吸收，可到达大肠部；( 3 ) 具有促进人 体双岐杆菌的增殖等生理功能【4 】。蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖和麦芽三糖等属于普通 低聚糖，它们可被机体消化吸收【5 】。下面具体介绍几种低聚糖的特性、应用及其国内外 生产状况。 1 2 1 低聚异麦芽糖( i s m a l t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 低聚异麦芽糖又称分枝低聚糖，是目前所有低聚糖产品中产量最大、市场销售最多 的一种，是以大麦、小麦、马铃薯和大米为原料生产的【6 】。低聚异麦芽糖是2 5 个不等 的0 【d 葡萄糖基以0 【( 1 6 ) 糖苷键结合，还含葡萄基以a 一( 1 _ 4 ) 糖苷键结合的低聚糖，如 潘糖，低聚异麦芽糖是双歧杆菌的增殖因子。商品低聚异麦芽糖主要由异麦芽糖、潘糖、 异麦芽三糖和四糖组成，占总糖的5 0 以上。低聚异麦芽糖兼备功能性低聚糖和低热量 糖醇甜味剂的双重优点，是最好、最稳定的功能性糖醇，具有“双歧因子、难龋齿、改 善便秘、低热量和减肥”等生理功能【_ 7 8 】。异麦芽低聚糖可改善面团的流变学特性，异麦 芽低聚糖可使面粉吸水率下降：面团的形成时间、稳定时间延长；弹性增加【9 】。商品低 聚异麦芽糖产品分两种规格：主成分5 0 以上的为i m 0 5 0 0 和主成分8 5 以上的为 i m 0 9 0 0 。我国在1 9 9 7 年才有企业生产，2 0 0 0 年山东保龄宝生物技术有限公司进行 i m 0 9 0 0 低聚异麦芽糖工业化生产，成为国内首家年产达l 万吨的企业。 江南人学硕i ：学位论义 1 2 2 低聚果糖( f r u c t o - o l i g o s a c c h a r i d e s ) 又称低聚蔗果糖或寡果糖，它广泛存在于自然界，是在蔗糖分子上以d ( 1 _ 2 ) 糖苷 键与1 3 个果糖结合而成的低聚糖，主要由蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖组成的混合 物10 1 ，含量超过5 0 个果糖基的多聚糖可用做脂肪的替代物。 1 2 3 低聚麦芽糖( m a l t o - o l i g o s a c c h a r i d e s ) 低聚麦芽糖是葡萄糖基以仅- ( 1 _ 4 ) 糖苷键连接，是在解枝酶如支链淀粉酶、异淀粉 酶的作用下水解淀粉生产的不同链长低聚麦芽糖，这些0 【淀粉酶具有不同的反应特性， 因此可以生产出不同链长和不同低聚麦芽糖含量的糖浆。 1 2 4 低聚木糖( x y l o o l i g o s a c c h a ri d e s ) 生产低聚木糖的原料是从玉米芯中提取的多聚木糖 p ( 1 _ 4 ) 糖苷键结合】，低聚木糖 在低聚糖的市场上占据比例较小，但随着低聚糖市场的不断扩大，其生产和需求将不断 增加。我国是一个农业大国，每年都产生大量的玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等农业废弃物， 这些弃物中含有丰富的木聚糖类半纤维素，然而并未得到有效利用。因此，开发利用这 一大类半纤维素制备低聚木糖，具有一定的经济效益和社会效益【1 。 1 2 5 低聚半乳糖( g a l a t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 低聚半乳糖是在乳糖分子上通过p 一( 1 _ 6 ) 糖苷键结合1 4 个半乳糖的杂低聚糖，其 产品中含有半乳糖基乳糖、半乳糖基葡萄糖、半乳糖基半乳糖等，属于葡萄糖和半乳糖 组成的杂低聚糖。母乳喂养的婴儿肠道中双歧杆菌数目最多，这归功于人奶中的低聚半 乳糖。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的低聚半乳糖，母乳中含量稍多。低聚半乳 糖甜味比较纯正，热值较低( 1 7k c a l g ) ，甜度为蔗糖的2 0 4 0 ，保湿性极强。在p h 为中性条件下有较高的热稳定性，1 0 0 。c 下加热1h 或1 2 0 下加热3 0m i n 后，低聚半 乳糖无任何分解。低聚半乳糖同蛋白质共热会发生美拉德反应，可以用于特殊性质的食 品如面包、糕点等的加工【1 2 1 。 1 2 6 大豆低聚糖( s o y b e a n - o l i g o s a c c h a r i d e s ) 大豆分离蛋白和浓缩蛋白的副产物大豆乳清中，包括各种低分子蛋白、多糖类、肽、 低聚糖类等物质，而碳水化合物中含量较高的是大豆低聚剜1 3 , 1 4 】。常见大豆低聚糖由水 苏糖、棉子糖和蔗糖组成，不能被人体的消化酶分解 1 5 , 1 6 ，但它可被肠道内的双歧杆菌 充分利用【1 7 】。液态大豆低聚糖为淡黄色、透明粘稠状液体；固体产品是淡黄色粉末，极 易溶于水中。 大豆低聚糖的热稳定性较强，1 4 0 下不分解，在1 6 0 下不会被破坏，在酸性条件 p h3 下加热其稳定性优于蔗糖【l8 】；大豆低聚糖粘度低于麦芽糖，而略高于蔗糖和果葡 糖浆，和其他糖一样，随温度升高，粘度降低；渗透压接近于蔗糖，比蔗糖略耐1 9 】；精 制大豆低聚糖与蔗糖相近，甜度为蔗糖的7 0 ；大豆低聚糖的保湿、吸湿性比蔗糖小， 水分活性接近于蔗糖，也能降低水分活性，具有良好的耐酸性，抑制微生物繁殖。在食 2 第一一章绪论 品中可起保鲜、保湿的作用。大豆低聚糖除可调整肠道帮助消化外，还有控制血压、中 和脂肪、补充矿物质、控制血糖、降低胆固醇和防龋齿等功效【2 刚。 1 2 7 龙胆低聚糖( g e n t l o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 由若干个葡萄糖基以d ( 1 _ 6 ) 糖苷键链合的化合物，是以葡萄糖浆为原料，在葡萄 糖基转移酶的作用下合成的。目前日本市场上出现较多的龙胆低聚糖产品，其形式有糖 浆和粉沫二种，呈现特有的可可样淳厚的苦味；对热非常稳定，具有较高的吸湿性；在 没感觉出苦味的添加量范围内；具有去除蔬菜等辣味效果【2 1 1 。 1 2 8 帕拉金糖( p a l a t i n o s e ) 低聚糖帕拉金糖也叫异麦芽酮糖，是麦芽酮糖合成酶作用于蔗糖生成的，由一分子 葡萄糖和一分子果糖以0 【( 1 _ 6 ) 键结合方式形成。帕拉金糖是二糖，甜度比蔗糖低，不 会引起龋齿，可被小肠消化吸收，因此不是双歧杆菌增殖因子。然而帕拉金糖分子内脱 水缩合形成帕拉金低聚糖，则不被人胃肠消化吸收而达到大肠，促进双歧杆菌的增殖。 帕拉金糖是蔗糖的一种异构体，是天然的营养型糖，可避免多食蔗糖的缺点和疾病【2 2 1 。 1 2 9 甲壳低聚糖( c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 甲壳低聚糖( c o s ) 是由甲壳素( c h i t i n ) 和壳聚糖( c h i t o s a n ) 经水解后产生的一 类低聚合度( n = 2 - 2 0 ) 、可溶于水的乙酰氨基 d ( 1 _ 4 ) 苷键结合 糖类化合物，c o s 水溶 性好，容易被吸收利用，且生物活性比壳聚糖更强，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化1 2 3 】、调 节肠道菌群和降血糖的作用1 2 4 。特别是聚合度为6 左右的壳寡糖，更具有许多独特的生 理活性和功能性质，近年来受到广泛关注 2 5 , 2 6 1 。 1 2 1 0 聚葡萄糖( p o l y d e x t r o s e ) 聚葡萄糖是采用天然淀粉、葡萄糖等为原料通过人工合成的抗消化糖类，是一类水 溶性的膳食纤维及低热量填充剂，1 9 7 3 年由r e n n h a r d 博士在美国辉瑞( p f i z e r ) 公司的中 心研究实验室发明，以满足低热量食品市场对低热量填充剂( 赋形剂) 的需求。聚葡萄糖 可以取代糖和油脂以降低食品热量而又能对食品的口感和质构起到同样好的作用。自 1 9 8 1 年被美国食品与药物管理局批准食品添加剂后广泛使用于食品行业。 聚葡萄糖的性状：为白色或类白色固体颗粒，易溶于水，不易被人体消化吸收、持 水性，溶解度7 0 ，l o 水溶液的p h 值为2 5 7 0 ，无特殊味，是一种具有保健功能 性的食品组分。进入人体消化系统后，产生特殊的生理代谢功能，从而防治便秘，脂肪 沉积。由于离子交换和胶体的形成，减少人体对有毒及致癌物质的吸收，又可调节胆固 醇水平，降低肠内p 葡萄糖，苷酸酶活性，排除血管硬化诱因等等。 1 3 低聚糖的生理功能 1 3 1 直接生理功能 1 3 1 1 低热量，难消化 由于大多数功能性低聚糖的糖苷键不能被人体内的消化酶水解，摄食后难以消化吸 垩堕叁兰堡：! ：兰些笙义 收，因而能量值很低或为零。例如一般的糖类热量值为2 1k j i g ，而果糖的发热量仅为 3 6k j g ，低聚半乳糖热值也仅为7 1k j g 。 1 3 1 2 有水溶性膳食纤维作用 功能性低聚糖也是一类低分子量的膳食纤维，与一般膳食纤维相比有如下优点：甜 昧圆润柔和，有较好的组织结构和口感特性；易溶于水，使用方便，且不影响食品原有 的性质；在推荐范围内不会引起腹泻；整肠使用显著；日常需求量较少，约3g 左右等。 如聚葡萄糖属于水溶性的膳食纤维，是一种低热量、无糖、低血糖指数的特殊碳水化合 物，还具有益生元的特点【2 7 】。 1 3 1 3 防止龋齿 龋齿主要是由突变链球菌( s t r e p t o c o c c u sm u t a n s ) 引起的，大量研究表明突变链球 菌产生的葡萄糖转移酶，不能将低聚糖分解成粘着性的单糖如葡萄糖、果糖、半乳糖等， 另外突变链球菌从功能性低聚糖生成的乳酸，也明显比从非功能性低聚糖蔗糖、乳糖生 成的乳酸少，故功能性低聚糖是一种低龋齿性糖类f 2 8 】。 l 314 肠道中有益菌群双歧杆菌增殖 功能性低聚糖通过消化道不被酸和酶分解，直接进入大肠为双歧杆菌利用，使双歧 杆菌得以迅速增加【2 9 1 。如人体摄入低聚果糖后，双歧杆菌数量可以增加1 0 0 1 0 0 0 倍。 1 3 2 间接生理功能 1 3 2 1 抑制病原菌 双歧杆菌能防止外源性病原微生物的生长和内源性有害微生物的过度生长，这种抑 制作用主要源于双歧菌产生的短链脂肪酸( 乙酸：乳酸= 3 ：2 ) 的抑菌作用，双歧杆菌产生 的双歧菌素对志贺氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等可有效抑制。 1 3 2 2 抑制有毒物代谢和有害酶的产生 服用功能性低聚糖能够抑制有毒物质的产生，降低有害酶的生成量，这己在人体实 验和人类粪便微生物的测试中得到证实。 1 3 2 3 防止腹泻 由于功能性低聚糖能降低病原菌的量，故它对腹泻有预防作用和治疗效果，能有效 地平衡胃肠道的微生物菌群，有利于肠胃失调者的治疗。此外，许多研究者认为母乳喂 养的婴儿比代乳品喂养儿健康。 1 3 2 4 防止便秘 由于功能性低聚糖类导致双歧菌的量增加，相应增加了乙酸、乳酸的分泌量，因而 刺激了肠的蠕动和通过渗透压增加粪便水份，故有防止便秘的作用，但对严重便秘患者， 低聚糖的治疗效果不明显。 1 3 2 5 降低血清胆固醇 服用功能性低聚糖后，使血清胆固醇的含量明显下降。如日摄入6 1 2 9 功能性低聚 糖2 周3 个月可减少血清胆固醇2 0 5 0m l ，研究血清胆固醇生长，增加高密度脂蛋白 ( h d l ) 在整个胆固醇中的比重( 在女性中明显，在男性中不显著) 。p h i l i p p ea l l i e t 等人将 低聚果糖和低聚甘露糖加入婴儿奶粉中发现，可以降低血清胆固醇【3 0 1 。 4 第一章绪论 1 3 2 6 保护肝功能 摄入低聚糖，有毒的代谢产物减少，从而减少了肝的去毒负担。如给6 9 岁有肝炎 和便秘病患者服用3 0 d 的大豆低聚糖，5 天后症状明显得以改善【3 l 】。 1 3 2 7 降低血压的作用 摄入低聚糖有降血压作用。h a t a 等对4 6 个高血脂患者作实验，让他们日服用低聚 果糖5 周，血压平均下降7 9 9 8p a ( 6m m h g ) ，同时血糖值下降，但不显著。 1 3 2 8 提高机体免疫力和抗肿瘤 大量试验表明，双歧杆菌在肠道内大量繁殖对小动物有抗癌作用，这种作用归功于 双歧杆菌的细胞，细胞壁物质和细胞间物质使机体免疫力提高。双歧杆菌可诱导抗埃希 氏大肠杆菌感染的细菌免疫。 1 3 2 9 营养素吸收促进作用，产生营养素 双歧杆菌能产生维生素b 1 、b 2 、b 6 、b 1 2 、烟酸、叶酸，含双歧杆菌的发酵乳制 品改善了乳糖不耐症。双歧杆菌对矿物元素有促进吸收的作用，如聚果糖、异构低聚麦 芽糖可增强钙的吸收【3 2 】。 1 3 2 1 0 血糖值的改善作用 y a m a s h i t a 等进行非胰岛素依赖型糖尿病患者的低聚糖口服实验，结果表明低聚果 糖具有明显的降低血糖作用，对非胰岛素依赖型糖尿病有一定的疗效【3 3 1 。 1 4 低聚糖的应用 1 4 1 功能性食品配料 在我国功能性低聚糖年产5 万吨左右，大部分作为食品配料使用。在食品工业中的应 用，较多地应用于含乳饮料，少量用于糖果、酒类，有一部分作为保健品或保健品的配 料上市，总的来说，应用的品种较少，绝对用量较小。在欧洲，功能性低聚糖不作为食 品添加剂管理，作为食品配料广泛应用于各类食品，低聚果糖成功应用于酸乳、饮料、 乳酪、馅料、冰淇淋、巧克力、糖果、肉制品等。如比利时和西班牙市场有含低聚果糖 的乳饮料；荷兰市场的有含低聚果糖的米粉点心。 1 4 2 低聚糖饲料 我国饲料工业已发展成为我国工业体系中重要的支柱产业之一，已跃居世界第二大 生产大国，对饲料添加剂的需求将大幅增加，低聚糖饲料添加剂将大有作为。低聚糖对 动物也有和对人体相似的功效。低聚糖添加于饲料的主要功效为：促进双歧杆菌增殖；提 高排便速度；减少血氨浓度；增进矿物质吸收和增强免疫能力。此外还有不少关于低聚 糖对预防沙门氏菌感染以及减少幼禽畜下痢的报道。 1 4 3 低聚糖农药 低聚糖新型生物农药具有以下优点：水溶性好；对人畜无害；不污染环境；长期或多 次诱导不会使植物产生特异抗病性；使用剂量低而且价格与有机农药相近。随着目前人 们对绿色食品的需求量日趋增加，低聚糖农药的市场将越来越大，所以低聚糖生物农药 5 垩堕叁堂竺：! ：堂丝堡兰 作为一类新型的植物激素及植物抗性激活因子在农作物生长发育和病虫害防治中具有 广阔的开发前景。 1 4 4 低聚糖生化肥料 低聚糖对土壤微生物也有菌群调节作用，能提高化肥的利用率。使用生化肥料是农 业发展的方向，低聚糖将大有作为。 1 5 低聚糖的生产方法 低聚糖的生产总体上遵循以下三个原则：( 1 ) 多个单体聚合；( 2 ) 多糖分解成低聚糖； ( 3 ) 糖基转移法。目前世界上低聚糖的具体细分的生产方法有： 1 5 1 化学合成法制备低聚糖 低聚糖的化学合成要比多肽及核酸等其他生物聚合物的化学合成复杂得多。化学合 成低聚糖的最大的困难在于，每个糖单体都有多种异构体，由糖单体组成的低聚糖链可 能的异构体数目往往是巨大的。此外，每个糖分分子都有多个性质类似的羟基基团糖苷 键形成时又引入0 【和d 糖苷异构体。此种方法得率低，成本比较高，难以实现低聚糖的 规模性生产【3 4 1 ，主要用于实验室的研究制备低聚糖【5 5 】。 1 5 2 酶法制备低聚糖 利用酶技术生产功能性低聚糖，分为水解法和转移法【3 5 】。 1 5 2 1 多糖水解法制备低聚糖 通过多糖水解来制备需要的低聚糖，多糖水解法是利用自然界中含量丰富的淀粉、 葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、果聚糖、果胶等天然多糖为原料，应用酶的定向和控制水 解作用而获得具有一定结构和聚合度的低聚糖。上述多糖也可通过酸的作用水解成单糖 和低聚糖化合物，但是总的来说，酸水解获得的水解物中的糖类组分复杂，具有符合要 求的特定的低聚糖数量有限【3 6 1 。 ( 1 ) 低聚果糖的第一种工业生产方法 控制菊粉的水解度，水解生成的产物与酶反应产物类似，但在葡萄糖末端不全是以 p ( 1 _ 2 ) 糖苷键与果糖相连。水解生成的低聚果糖的链比酶反应的链长从菊苣中提取的 菊粉中，含有低聚果糖和一些多聚糖。 ( 2 ) 低聚木糖的工业生产方法 低聚木糖一般是以富含木聚糖的植物为原料，通过木聚糖酶的水解作用然后分离精 制而获得。自然界中很多霉菌和细菌能产生木聚糖酶。 1 5 2 2 糖基转移法制备低聚糖 利用糖基转移或其他反应来合成需要的低聚糖。利用糖基转移酶合成低聚糖的主要 问题有两个：一是微生物糖基转移酶产量一般较低；二是微生物糖基转移酶稳定性相当 差。以下几种低聚糖的工业生产方法即为此种方法。 ( 1 ) 低聚异麦芽糖的工业生产方法 以淀粉为原料，第一步是用i f , 淀粉酶水解淀粉得到麦芽糖浆，第二步用0 【d 葡萄糖 6 第一币绪论 苷酶和d 淀粉酶共同作用，进行糖基转换得到异麦芽糖等。 ( 2 ) 低聚果糖的第二种工业生产方法 以蔗糖为底物，利用黑曲霉、镰刀霉、同本曲霉等菌种分泌的果糖苷酶和果糖基转 移酶进行酶反应，在蔗糖分子的p ( 1 2 ) 糖苷键上与l 3 个果糖分子结合，形成的蔗果 三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，属于果糖和蔗糖构成的直链杂低聚糖。 ( 3 ) 低聚半乳糖的工业生产方法 以高浓度乳糖做底物，在具有半乳糖基转移活性的半乳糖苷酶的作用下，首先将乳 糖水解成半乳糖和葡萄糖，然后再将半乳糖转移到乳糖基上，制得的低聚半乳糖是在乳 糖中的半乳糖基一侧结合1 4 个分子的半乳糖的混合物。 1 5 3 高温缩聚法制备低聚糖 高温缩聚法制备低聚糖是在高温高压的条件下，将单体和催化剂等混合反应制备低 聚糖的一种方法，丹尼斯克公司生产的聚葡萄糖，商品名为利体素，即为此种方法生产。 具体方法如下： 工业上制取低聚葡萄糖的传统方法是用食品级葡萄糖、山梨醇、柠檬酸以8 9 ：1 0 ： 1 的大概比例混合后，在高温真空条件下，经过熔融缩聚、溶液中和、产物脱色三步法 而得。也可采用淀粉水解产物代替葡萄糖。反应时山梨醇作为增塑剂，柠檬酸、无机酸 ( 磷酸、盐酸等) 作为催化剂。反应温度为1 3 0 c 2 9 5 c 之间。反应时间视温度、真空度 而异，温度和真空度越高，反应时间越短，一般几十小时左右【3 7 1 。此种方法简单高效， 目前市面上销售的葡聚糖大多为此方法生产。 这种方法生产的葡聚糖有以下几个缺憾：分子量分布不容易控制；高温反应产生色 素，漂白困难；产物的酸度较高，限制了产品在非酸性的食品中的应用。 1 5 4 提取法制备低聚糖 在工业上大豆低聚糖是以生产大豆蛋白( 浓缩大豆蛋白、分离大豆蛋白) 的副产品大 豆乳清为原料，将大豆乳清加热处理或用酸调p h 至等电点去除蛋白质，过滤。滤液再通 过超滤反渗透膜或离子交换树脂进行脱色、脱盐。最后经浓缩得大豆低聚糖浆，再经干 燥、粉碎可得粉状产品【3 引。 1 5 5 发酵法制备低聚糖 采用发酵法生产低聚半乳糖的研究较少。s h i nhj 等例采用小红酵母发酵合成低聚 半乳糖，其方法为：将5m l 细胞悬浮液接种于4 5m l 培养基中，3 00 c 发酵6 0h ，其产 率达到6 4 。 1 6 低聚葡萄糖的生产方法 目前国外对葡聚糖的结构、性质及其改性的研究较为广泛深入，但是对低聚葡萄糖 的研究不多，国内则更少，综合国内外低聚葡萄糖的生产方法如下： 7 垩堕叁堂! ! ! ! ：竺篁笙苎 1 6 1 发酵法制备低聚葡萄糖 m a r i a n as a n t o s 等人发现，在发酵液中加入与蔗糖一起加入麦芽糖、乳糖或者半乳 糖能够促进较少聚合度的低聚葡萄糖产生 4 0 , 4 1 】。 1 6 2 特殊技术制备低聚葡萄糖 超声波、双螺杆挤压、蒸汽喷射蒸煮等技术可以使得葡聚糖的长链结构变短，而且 可以降低低聚葡萄糖溶液的粘度4 2 1 。上节1 5 4 中所描述的高温缩聚法生产的低聚糖实 际上也是一种低聚葡萄糖。 1 6 3 发酵法与酸解法结合制备低聚葡萄糖 蔗糖经肠膜状明串株菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，再经稀盐酸水解，最后 以乙醇阶梯分离，而经处理制得中等分子量的低聚葡萄糖，目前通常称为右旋糖酐 4 3 , 4 4 。 1 6 4 发酵法与酶解法结合制备低聚葡萄糖 毛壳属真菌生产的一种内切右旋糖酐酶( e c3 2 1 1 1 ) ，是专一性地切割葡聚糖内部 0 【一d ( 1 _ 6 ) 糖苷键生产低聚葡萄糖【4 5 1 。 本文采用普鲁兰酶酶解微生物发酵得到的高分子量葡聚糖的方法制备低分子量的 低聚葡萄糖，得到的低聚葡萄糖分子量较小，分子量分布比较窄，而且不含葡萄糖。这 种方法耗能低，反应温和，比较容易控制。分解不用酸和碱，不污染环境，保持了多糖 原有的活性。 1 7 低聚葡萄糖的分子结构和性质 自然界中低聚葡萄糖很少，其前体物葡聚糖则广泛存在于细菌、真菌、蘑菇、海藻 及高等植物中以及微生物所分泌的黏液中，是构成细胞壁的重要组成部分。 1 7 1 低聚葡萄糖的分子结构 低聚葡萄糖的结构如下图l l 所示【4 6 1 。 图1 - 1 低聚葡萄糖的结构示意图 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r a ld i a g r a mo fg l u c o s eo h g o s a c c h a r i d e 8 第一币绪论 低聚葡萄糖的化学结构主要是由吡哺葡萄糖的仅( 1 _ 6 ) 键首尾脱水缩合而成的线性 化合物，在分子结构中含有不同比例的0 c ( 1 2 ) 、o 【( 1 - - * 3 ) 及c 【( 1 _ 4 ) 糖苷键的支链，因 此可分为直链与支链两种构型【4 7 1 。一般说的直链构型是指主链中有9 3 9 7 左右均为 0 【一( 1 _ 6 ) 链，而支链仅占极小比例。 陈素明等用1 3 c 和1 h 核磁共振方法对肠膜明串珠菌合成的低聚葡萄糖前体物葡聚 糖进行了结构测定【4 引。测定结果表明，葡聚糖的主链是0 【一d ( 1 _ 6 ) 糖苷键连接，侧链分 支点主要是由0 【一d ( 1 _ 3 ) 组成。菌种的类别【4 9 1 、发酵温度、底物浓度、发酵培养基钙镁 含量、氮源和碳源的比例都会对低聚葡萄糖的结构产生影响。发酵温度高，支链多，培 养基浓度高，支链多。 1 7 2 低聚葡萄糖的性质 1 7 2 1 低聚葡萄糖的溶解性 根据生产低聚葡萄糖细菌的不同，低聚葡萄糖结构也不同，导致其性质也不同。总 体来说，a ( 1 6 ) 糖苷键为主链增加了低聚葡萄糖的稳定性，低聚葡萄糖组分的分子量 可以影响溶解的时间。低聚葡萄糖溶液显示牛顿流体粘度特性【4 9 1 。 1 7 2 2 低聚葡萄糖的代谢特性 低聚葡萄糖的代谢特性是其被应用的重要原因。 ( 1 ) 热值很低：低聚葡萄糖的主链结构是c 【( 1 _ 6 ) 糖苷键组成，人体中缺乏降解 a ( 1 _ 6 ) 糖苷键的酶，难以消化吸收。f i g d o r 等人用1 4 c 标记的低聚葡萄糖，喂养小鼠实 验，约6 0 低聚葡萄糖从粪便排出，得出低聚葡萄糖热值仅为4 2k j g 。j o h n s w r i t e ， g s r a n b o t r a 等模拟人体内的条件下对低聚葡萄糖进行酶解，测量推算出热量值约为 4 2k j g 。证明其确为难消化糖类。 ( 2 ) 非胰岛素依赖性：低聚葡萄糖难以被吸收，摄入后也不刺激胰岛素的分泌， 不易引起血糖升高，适合糖尿病患者。 ( 3 ) 非龋齿性：低聚葡萄糖不被蛀牙病原菌变异链球菌发酵，故对牙齿没