（材料学专业论文）猪皮胶原蛋白的提取及其与壳聚糖共混性能研究.pdf

摘要 本文利用胃蛋白酶在酸性条件下从猪皮中提取胶原蛋白，并研究不同去乙酰度壳聚 糖与胶原蛋白共混样品的性能。采用正十二烷基磺酸钠( s d s ) - 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ( p a g e ) 对胶原蛋白样品进行分析，并估算其相对分子质量。利用紫外可见分析对所提取 胶原蛋白定性分析。用傅立叶红外( f r i r ) 胶原蛋白，示差量热扫描仪( d s c ) ，乌氏 ( u b b e l o h d e ) 黏度计对聚糖与胶原蛋白共混样品的相容性，生物活性进行了详细的探讨。 并参照a a t c c 方法对共混样品的抑菌性能进行探讨，并讨论壳聚糖不同去乙酰度及浓 度对抑菌率的影响。 电泳结果证明，所提取的胶原蛋白为i 型具有完整的生物活性的胶原蛋白，并估算 其相对分子质量为3 2 0k d 。特性粘度测试表明，壳聚糖溶液的h 】m 值随壳聚糖去乙酰度 的增加而逐渐增加，四种去乙酰度壳聚糖溶液的h 】m 均明显比胶原蛋白溶液的【1 1 】m 大， 而且壳聚糖胶原蛋白共混溶液的h l m 值随着壳聚糖含量的增加而增加。而根据不同去乙 酰度的壳聚糖胶原蛋白共混溶液的b 1 2 值均明显大于b d ，则可说明胶原蛋白与壳聚糖 具有相容性。胶原蛋白与不同去乙酰度的壳聚糖共混之后，f f i r 分析表明，胶原蛋白 的变性程度随壳聚糖含量的增加而增加，即生物活性随壳聚糖含量增加而降低。d s c 分 析表明，胶原蛋白壳聚糖共混样品的变性温度( t d ) 随其内壳聚糖含量由0 逐渐增加 到2 0 时先降低，之后随壳聚糖含量增加至4 0 时其t d 值陡然升高至较对应纯壳聚糖 分子之变性温度更高之数值；但当壳聚糖含量大于4 0 时，随着壳聚糖含量增加，其 t d 值反而明显下降然后再逐步上升至接近壳聚糖分子之变性温度。 抑茵性能研究表明，壳聚糖溶液的最小有效抑菌浓度是0 0 3w t ，且壳聚糖的浓度 和乙酰度越高，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果越好。而壳聚糖月交原蛋白共混溶液的抑菌 率随着壳聚糖含量的增加而增加，相同壳聚糖浓度下，抑菌率随着壳聚糖去乙酰度增加 而增加。 关键词：猪皮胶原蛋白壳聚糖去乙酰度相容性生物活性抑菌性 a b s t r a c t i n t h i ss t u d y ，c o l l a g e nw a se x t r a c tf r o mt h ep i g s k i nu s i n ga c i ds w e l l i n g - p e p s i nm e t h o d v a r y i n gc o m p o s i t i o n so fc h i t o s a n c o l l a g e ns p e c i m e n sw e r ep r e p a r e db yb l e n d i n gc o l l a g e n a n dc h i t o s a nm o l e c u l e sw i t hv a r y i n gd e g r e e so fd e a c e t y l a t i o ni ns o l u t i o n s t h em i s c i b l e ， a n t i b a c t e r i a la n db i o a c t i v ep r o p e r t i e so fc o l l a g e n c h i t o s a nb l e n d sw e r e i n v e s t i g a t e db y i n t r i n s i c v i s c o s i t ym e a s u r e m e n t s ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n a l y s i s ，t r a n s e f o r m i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ( f t i r ) a n dd i f f e r e n ts c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) a n a l y s i sr e s p e c t i v e l y t h e i n f l u e n c e so fd i f f e r e n td e g r e e so fd e a c e t y l a t i o no nt h em i s c i b l e ，a n t i b a c t e r i a la n db i o a c t i v e p r o p e r t i e s o fc h i t o s a n c o l l a g e n s p e c i m e n sa r er e p o r t e d i nt h i s s t u d y p o s s i b l er e a s o n s a c c o u n t i n gf o r t h ei n t e r e s t i n gp r o p e r t i e so fc h i t o s a n c o l l a g e ns p e c i m e n so b s e r v e di nt h i ss t u d y a r ep r o p o s e d s d s - p a g ea n a l y s i sr e s u l t e di nal ，a 2 ，b l ，b 2a n d 7f i v et y p i c a ll i n e ss u g g e s t e dt h a tt h e e x t r a c t i o np r o d u c ti st y p ei c o l l a g e n ，a n dt h ee v a l u a t e dm o l e c u l em a s sw a sa b o u t3 2 0k d t h eu va n a l y s i ss u g g e s t e dt h eu vf e a t u r e so ft h ee x t r a c t i o np r o d u c ta c c o r d e dw i t ht h a to f c o l l a g e n t h e 【1 1 】mv a l u e so fc h i t o s a ns o l u t i o n si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t hi n c r e a s i n gt h e i r d e a c e t y l a t i o nd e g r e e s i tw a si n t e r e s t i n gt on o t et h a tt h eh 】mv a l u e so ft h ec h i t o s a ns o l u t i o n s w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo ft h ec o l l a g e ns o l u t i o n s m o r e o v e r ，t h e 【”】mv a l u e so f c h i t o s a n c o l l a g e nm i x t u r es o l u t i o n si n c r e a s e dc o n s i s t e n t l ya st h ec h i t o s a nc o n t e n t si n c r e a s e f r o m0t o1 0 0w t o nt h eo t h e rh a n d ，i tw a sw o r t hn o t i n gt h a tt h ee v a l u a t e db 1 2v a l u e so f t h ec h i t o s a n c o l l a g e ns o l u t i o n sw e r es i g n i f i c a n t l yl a g e rt h a nt h e i ri d e a lb l lv a l u e s ，w h i c h s u g g e s t e dt h a tt h ec h i t o s a na n dc o l l a g e nm o l e c u l e sw i t hv a r y i n gd e a c e t y l a t i o nd e g r e e sw e r e m i s c i b l ei nt h em o l e c u l a rl e v e lf o ra l lc o m p o s i t i o n so ft h ec h i t o s a r d c o l l a g e nm i x t u r es o l u t i o n s p r e p a r e di nt h i ss t u d y f r i ra n a l y s i sc o n f i r m e dt h a tt h ec o l l a g e nh a v et h ei n t e g r a t e dt r i p l e h e l i xs t r u c t u r e ，w h i c hm e a n st h ec o l l a g e no w nb i o a c t i v i t y a f t e rb l e n d i n gc h i t o s a nw i t h c o l l a g e n ，t h er a t i o so ft h ep e a ka b s o r b a n c eo fc o l l a g e n c h i t o s a ns p e c i m e n sr e d u c e da st h e c h i t o s a nc o n t e n t si n c r e a s e t h o s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ep e r c e n t a g e so fp r e s e r v e dt r i p l e h e l i xs t r u c t u r e sp r e s e n ti nc o l l a g e nm o l e c u l e so fc o l l a g e n c h i t o s a ns p e c i m e n si n c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n g t h e c o l l a g e nc o n t e n t s d s cr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt dv a l u e so ft h e c h i t o s a n c o l l a g e ns p e c i m e n si n c r e a s es i g n i f i c a n t l yw i t hi n c r e a s i n gt h ec h i t o s a nc o n t e n t so f c h i t o s a n c o l l a g e ns p e c i m e n s ，a n dt h et dv a l u e si n c r e a s ed r a m a t i c a l l yw h e nt h ec h i t o s a n c o n t e n t so fc h i t o s a n c o l l a g e ns p e c i m e n sr e a c h4 0w t a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n a l y s i s s u g g e s t e dt h a t t h em i n i m u mc h i t o s a n i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n s ( m i c ) o ft h ec h i t o s a n s o l u t i o n sw a s0 0 3w t ，a n dt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u si n c r e a s e s e d u c o n s i s t e n t l yw i t hi n c r e a s i n gt h ed e a c e t y l a t i o nd e g r e e so ft h ec h i t o s a nm o l e c u l e s ，a n dt h e c o l l a g e n c h i t o s a n a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u sc h a n g e dw i t ht h es a m e t r e n d s k e yw o r d s ：p i g s k i n ；c o l l a g e n ；c h i t o s a n ：d e a c e t y l a t i o nd e g r e e s ；m i s c i b l ep r o p e r t i e s ； a n t i b a c t e r i a lp r o p e r t i e s ；b i o a c t i v ep r o p e r t i e s i i i 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名：同妊惠 日期：洳年月日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服 务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保 密论文在解密后遵守此规定) 黧：嘎嘞裂h 7 指导教师虢獗侈乡犰嗍一h 7 第一部分绪论 第一部分绪论 胶原蛋白具有相当好的保水性，膨润性，人体内胶原蛋白生成后，会自然代 谢而由新生成胶原蛋白取代，人体肌肤才能维持弹性；不过随着生理老化，胶原 蛋白生成的速率减缓，因此皮肤就会容易失去光泽和弹性，脸上皱纹就会愈来愈 多。近年来，人类追求延长寿命，年轻化，美容等诉求，使得胶原蛋白成为许多 生医，美容保养，化妆及食品的主要诉求成分，其中在食品和美容保养产品方面， 更是受到消费者的青睐。根据d a t a m o n i t o r 统计【，2 0 0 4 年全球化妆美容产品市 场规模高达1 , 4 0 0 亿美元，估计2 0 0 8 年的全球销售值将大幅提升至1 , 7 8 0 亿美元； 在亚洲2 0 0 8 年将可达到4 9 0 亿美元，约占全球市场的2 7 8 。而根据g o l d m a n s a c h s l 2 l 的估计，全球化妆美容产品产业每年以7 速度成长，其中又以亚洲地区 成长最快。除上述用途外，由于其与人体优良之兼容与细胞生长特性，胶原蛋白 可应用到医药，生医，化工，食品工业等用途；其中最主要的应用领域是作为 生医材料，如人工皮肤，食道，气管，烧伤保护膜，润滑人工关节等用途。 胶原蛋白在动物细胞中是扮演结合组织的角色，广泛存在于动物细胞的一种 蛋白质。工业生产胶原蛋白方式多是由动物皮肤( 如猪，牛) 及筋骨等结缔组织中 抽取。文献上由动物体内分离纯化胶原蛋白的方法虽不尽相同，但大致首先以化 学修饰试剂或酵素分解去除动物组织中脂质，醣蛋白及多醣类进而纯化得到胶原 蛋白细纤维。其中，c n b r ( c y a n o g e nb r o m i d e ) 虽具毒性却是常用的化学修饰试剂， 但也增加胶原蛋白溶液纯化后除去毒性的困难度。酵素水解胶原蛋白能使胶原蛋 白溶于水中，此法能避免化学修饰试剂反应后无法有效移除的问题；目前已成为 提取胶原蛋白的重要关键的技术与趋势。上述经化学修饰试剂或酵素分解去除动 物组织，再以酸性溶液将组织中的胶原蛋白溶解释出，并利用酵素分解( 例如： 胃蛋白膊) 将胶原蛋白分子中可产生交联的前端胜肽( t e l o p e p t i d e s ) j c j 除，使其无法 聚集成细纤维与沉淀析出，进而形成水可溶性之胶原蛋白，反复对胶原蛋白溶液 进行盐析离心步骤作进一步之纯化。 本课题的前期研究探讨了将生体高分子胶原蛋白与纺织品结合，搭配制作不 同结构植绒不织布探讨植绒不织布结构( 植密，植绒长度与细度变化) 对胶原蛋 白溶液吸收与释放性能影响进行了系统探讨。其中并与市售水针法制程所制得 不织布样品进行对胶原蛋白溶液吸收与释放性能进行比较。找出最适化胶原蛋白 湖北大学硕士学位论文 提取纯化制程及高吸收释放胶原蛋白溶液植绒不织布最适化制程与结构条件。 本文在前有的提取方法基础上改进了胶原蛋白提取方法，在酸性环境下利用 胃蛋白酶从猪皮中提取胶原蛋白，通过各种分析测试证明所提取的胶原蛋白具有 完整的三螺旋结构，即具有完整的生物活性。同时将所提取胶原蛋白与不同去乙 酰度的壳聚糖进行掺混，对胶原蛋白和壳聚糖共混的相容性以及掺混后胶原蛋白 的活性，抑菌性能进行了较系统研究，为壳聚糖和胶原蛋白的应用提供了比较有 意义的依据。 2 第二部分文献f f i f 顾 第二部分文献回顾 2 1 胶原蛋白概述 胶原蛋t 兰t ( c o l l a g e n ) 是脊椎动物中最主要的蛋白质，也是人类和其它哺乳动物中含 量最丰富的蛋白质。胶原蛋白具有独特的组织分布和功能，它广泛分布于结缔组织， 皮肤，骨骼，内脏细胞间质及韧带，巩膜等部位。胶原蛋白也是结缔组织及其重要的 结构蛋白，起着支撑器官，保护肌体的功能，是决定结缔组织韧性的主要因素。胶原 蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的2 5 - 3 0 ，相当于体重 的6 【1 2 1 。 到目前已经定义了1 9 种类型的胶原蛋白【3 4 1 ( 表2 1 1 ) 。根据胶原蛋白分子结构及 功能上的差异，又可将胶原蛋白分成七大类( 图2 1 1 ) ，分别为：( 1 ) 纤维状胶原蛋白， 包括t y p e i ，i i ，i i i ，v 及x i ；( 2 ) 网状结构胶原蛋白，包括t y p ei v ，及x ；( 3 ) 于 纤维表面上的胶原蛋白，包括t y p ei x ，x i i ，x i v ，x v i 及x i x ；( 4 ) 球状纤维胶原蛋白， 主要为t y p ev i ；( 5 ) 于基底膜上形成锚状纤维胶原蛋白，主要为t y p ev i i ； ( 6 ) 含有穿 过细胞膜区域胶原蛋白，包括t y p ex l i i 及x v i i ；( 7 ) 新发现且未完全定义的胶原蛋白， 包括t y p ex v 及x v i i l 5 ，6 1 。 3 湖北大学硕十学位论文 表2 卜1 胶原蛋白的类型【4 1 墅p !堡垒! ! 里f ! 望! 坠! ! 垒竺! ! ! 璺! 璺璺至! ! 堕! 呈! i u 1 ( i )v e f yw i d e s p r e a d ，b e i n gm a i nc o n s t i t u e n to fm a j o rf i b r eb u n d l e st h a t g i v es t r e n g t h1 0c o n n e c t i v et i s s u e s ；m o s ta b u n d a n tc o l l a g e nt y p e ， p a r t i c u l a r l yi nd e r m i s ，b o n e ，l i g a m e n ta n dt e n d o n 1 l i i i i v v v l v i l v i i i i x x x l x i i x i i i x i v x v x v l x v i i x v i i i x i x a 2 ( i ) al ( 1 i ) u , o i l ) ql ( i v ) a2 ( i v ) q 3 ( i v ) u4 ( i v ) a 5 ( i v ) a 6 ( i v ) ql ( v ) q 2 ( v ) u3 ( v ) a “v 1 ) u2 ( v i ) q 3 ( ) u 1 ( v i i ) q l ( v i i i ) q 2 ( v i i i ) q l ( i x ) q 2 ( i x ) q 3 ( i x ) ql ( x ) n l ( x 1 ) u 2 ( x 1 ) q 3 ( x d q1 ( x i i ) q l ( x i i i ) a1 ( x i v ) q 1 ( ) ( v ) ql ( x v l ) a1 ( x v u ) u 1 ( x v i n ) ql ( x i x ) a p p e a r st ob eam i n o rf o r n l f o u n di nd e r m i sa n dd e n t i n t h em a i nc o l l a g e no fc a r t i l a g e ，w h e r ei tf o r m st h em a i n t h i n 丘b r i l s a l s of o u n di ni n t e r v e r t e b r a ld i s k f r e q u e n t l ya s s o c i a t e dw i t ht y p el ，i ne x t e n s i b l et i s s u e ss u c ha sb l o o d v e s s e l s d e r m i sa n di n t e s t i n e m o r ea b u n d a n ti nf o e t a lt i s s u e s l o c a t e di nb a s e m e n tm e m b r a n e s ，a san o n f i b r i lf o r m i n gc o l l a g e n a p p e a r st of o r mat w o d i m e n s i o n a ln e t w o r k w i d e s p r e a di nl o wq u a n t i t y ；a p p e a r sa s s o c i a t e dw i t ht y p ei e o l l a g e n f i b r i l sw h e r ei tm a yf o r ma c o r ef i l a m e n t w i d e s p r e a d ，f o r m i n gb e a d e df i l a m e n t s d i f f e r e n t a l t e r n a t i v e l ys p l i c e df o r m se x i s t f o r m sa n c h o r i n gf i l a m e n ts t m c t u r et h a tl i n k st h ee p i t h e l i a l b a s e m e n tm e m b r a n et ou n d e r l y i n gf i b r i l l a rt i s s u e as h o r tc h a i nl e n g t hc o l l a g e n ，a s s o c i a t e dw i t h e n d o t h e l i a lc e l ll a y e r s s u c ha sd e s c e m e t sm e m b r a n e i ns o m et i s s u e si tm a yf o r mah e x a g o n a ll a t t i c e h a sa ni n t e r r u p t e dt r i p l eh e l i xc o l l a g e n ，a n dm a yc o n t a i n ag l y c o s a m i n o g l y c a nc h a i n f o u n di nc a r t i l a g ea n d v i t r e o u sb o d y w h e r ei ti sa s s o c i a t e dw i t ht y p ei ic o l l a g e n as h o r t c h a i nc o h a g e n ，f o u n di nh y p e r t r o p h i cm i n e r a l i z i n g c a r t i l a g e ，w i t has i m i l a rs t r u c t u r et ot y p ev i i ic o l l a g e n f o r m sf i b r i l sw h i c ha r ea s s o c i a t e dw i t ht y p e1 1c o l l a g e n i nc a r t i l a g ea n di n t e r v e n e b r a ld i s c a c o l l a g e nw i t ha ni n t e r r u p t e dt r i p l eh e l i x ，a s s o c i a t e d w i t ht y p elc o l l a g e nf i b r i l s a p p e a r st ob ew i d e s p r e a di nl o wq u a n t i t y , s h o w i n gd i f f e r e n t f o r m sd u et oac o m p l e xp a t t e r no fa l t e r n a t i v es p l i c i n g af i b r i l a s s o c i a t e dc o l l a g e nw i t ha ni n t e r r u p t e dt r i p l e h e l i x f o u n di ns k i n i se x p r e s s e di nf i b r o b l a s t sa n ds m o o t hm u s c l ec e l l s ：h a sa t r i p l eh e l i xw h i c hi si n t e r r u p t e di ns e v e r a lp l a c e s i se x p r e s s e di nf i b r o b l a s t sa n dk e r a t i n o c y t e s ：h a sat r i p l e h e l i xw h i c hi si n t e r r u p t e di ns e v e r a ip l a c e s b u l l o u sp e m p h i g o i da n t i g e n i se x p r e s s e da td e r m a l e p i d e r m a l i u n c t i o n ：h a sat r i p l eh e l i xw h i c hi s i n t e r r u p t e di ns e v e r a lp l a c e s i se x p r e s s e di nh i g h l yv a s c u l a n s c dt i s s u e s ：h a sat r i p l e h e l i xw h i c hi si n t e r r u p t e di ns e v e r a lp l a c e s v a s c u l a r , n e u r o n a l ，m e s e n c h y m a l ，a n ds o m ee p i t h e l i a l b a s e m e n tm e m b r a n ez o n e s s i m i l a rt ox v 4 第二部分文献回顾 力 n p r o p e p t i d e s i ，1i ，ii | ，v ，x l 图2 卜1 七类不同分子结构的胶原蛋白f 5 】 5 湖北大学硕士学位论文 2 2 胶原蛋白分子及纤维结构 胶原蛋白的生物合成分两个阶段，前期在细胞内，后期在细胞外。首先是在细胞 内合成前胶原a 一肽链，接下来是前胶原q 一肽链的羟基化和糖基化，然后是胶原q 一 肽链的连接，并由细胞内分泌到细胞外，再由前胶原转变为原胶原分子，由原胶原聚合， 共价交联形成胶原微纤维，进而聚合形成胶原纤维和胶原束。 经x 光射线研究分析发现特殊螺旋结构的原蛋白分子具有重复的g l y x y 的序列， 其中x 和y 一般是脯胺酸( p r o l i n e ) 和氢脯胺酸( h y d f o x y p r o l i n e ) 1 7 1 。g l y - p r o h y p 排列方 式构成在i 型胶原蛋的分子中约占1 0 。胶原蛋白是由三条多肽链( p o l y p e p t i d ec h a i n ) 所组成，形成三股螺旋结构。每条分子链内胺基酸间的距离是2 9 1 a ，且扭转角度约为 1 0 。每隔第三个甘胺酸( g l y c i n e ) 之间的距离是8 7 a ( 图2 2 1 ) t 8 。1 0 l 。由于脯胺酸具有n cq 结构在刚性环状结构内，以防止多肽链中cq c = o 键的旋转，所以脯胺酸在胶 原蛋白中起到了增进三股螺旋结构的稳定性的作用【1 1 l 。氢氧基脯胺酸能够形成分子内 氢键，从而稳定胶原蛋白的三股螺旋结构，而且氢脯胺酸为胶原蛋白分子中特殊存在的 胺基酸，所以可以通过测定氢脯胺酸的含量从而得知胶原蛋白的浓度。在生理状态下， 五个胶原蛋白分子会自发聚集形成微纤维( m i c r of i b r i l s ) 。依其所在组织及功能不同，可 再聚集形成更大之胶原蛋白纤维，其直径可达1 0 t m 以上( 图2 2 2 ) 。由于胶原蛋白分 子组成微纤维时，会成周期性6 8a m ( 即1 个d p e r i o d ) 的间隔排列，微纤维间聚集时会 规律性的排列，故在穿透式电子显微镜下可以观察具有周期性相间的明暗带( 图2 2 3 ) e 1 2 ， 1 4 1 。 6 第二部分文献回顾 4 帆： 口l y c i h e p r e d o j k l i n k n t l yi m i noa c i d s 图2 2 1 胶原蛋白分子之三股螺旋结构示意图【1 2 】 f c r 仃l a t 屺no f 帕o f l o r d s 1 5n m l 国殳z 丕忑2 c o i b g 拂m o l e c u l e l o p mn m t _ o t e r a i 啊e 啪 图2 2 2 胶原蛋白纤维组成示意图【1 2 】 7 湖北大学硕e 学忙论文 图2 23 胶原蛋白纤维之穿透式电子显微镜照片1 ” 23 胶原蛋白的纯化及重组 胶原蛋白样品的提取纯化制备与下列多项因素有关。比如，动物组织，反应溶剂， 酵素，胶原蛋白提1 0 ( ，溶解与纯化制程等的选用，都是决定所得胶原蛋白类型，分子量 与纯度的重要因素l l s - 1 7 1 。文献 一r r i 动物体内分离纯化胶原蛋白的方法虽不尽相同，但大 致首先以化学试剂或酵桑分解去除动物纰织t 一脂质，醣蛋白及多醣类进而纯化得到胶原 蛋白细纤维。水解蛋白质常川的化学试剂为c n b r ( c y a n o g e nb r o m i d e ) ，其具有专一性 切除胺基酸之特征，切点位置于蛋白质中甲硫脏酸( m e t ，m e t h i o n i n e ) 的部份，但凼只辨识 这种胺基酸，切 柬的片段过于庞大，刚此提岛分析上的困难度。盐析机淀法足利用 蚩白质随溶液中盐类浓度不同其溶解度办小而沉淀析m 蛋白质。其原耻是山于蛋 白质分了表面电荷的改变，或j 片分子上极性旦址m 极性区域j 水分子| 作用而得到结果， 并使用只有极细7 l 径的透析膜来分离小分了量的盐类行进步纯化。 第二二部分文献同顾 酵素水解胶原蛋白能使胶原蛋白溶于水中1 1 9 j ，此法能避免有毒化学试剂反应后无法 有效移除的问题；目前已成为提取胶原蛋白的重要关键的技术与趋势。上述经化学试 剂或酵素分解去除动物组织，再以酸性溶液将组织中的胶原蛋白溶解释出，并利用酵素 分解( 例如：胃蛋白酶) 将胶原蛋白分子中可产生交联的前端胜肽( t e l o p e p t i d e s ) 切除，使其 无法聚集成细纤维与沉淀析出，进而形成水可溶性之胶原蛋白。进一步利用不同盐浓 度溶液而沉淀析出不同种类胶原蛋白的原理( 见表2 3 1 ) ，如此再经由反复的盐析及离 心步骤对胶原蛋白做进一步的纯化1 2 0 1 。 虽然前端肽( t e l o p e p t i d e ) 的切除因而使胶原蛋白 丧失自发性交联的能力1 2 1 1 ；但在3 7 ，中性条件下，前述经萃取纯化的胶原蛋白分子 却仍会发生重组的现象。 胶原蛋白分子具有疏水区( h y d r o p h o b i cr e g i o n ) 和带电区 ( c h a r g e dr e 西o n ) ；低温时疏水区表面多为水分子所覆盖，胶原蛋白分子起初为带电区正 负电荷间之相互吸引而成间隔交错排列( q u a n e r s t a g g e r e do v e r l a p ) 。但当温度上升时系 统能量增加，疏水区内原先规则排列之水分子逐渐脱离胶原蛋白分子表面，因此暴露出 之疏水区藉由疏水键( h y d r o p h o b i cb o n d s ) 相互结合，造成胶原蛋白细纤维重组合并之结 构( 见图2 3 1 ) 【2 2 1 。 9 “ 湖北大学硕士学位论文 s t e pi 3 7 i 。 a 6o s t e p 3 7 6 a o o 0 勺 o 图2 3 1 胶原蛋白分子重组现象1 2 3 1 1 0 第二部分文献同顾 2 4 提取胶原蛋白的研究 蛋白质的提取的一般的提取，分离，纯化过程如下：破碎生物组织，用适 当的缓冲液将蛋白质提取出来；用离心方法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片 与溶液分开；用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；进一步 用色谱法或电泳法使各种蛋白质分开；在适当条件下使蛋白质结晶或制成冻 干粉。胶原蛋白的提取，一般有两种手段：一是溶剂的化学法；二是酶的生物 化学法。 表2 4 1 不同种类胶原蛋白沉淀析出所需盐浓度1 2 4 】 湖北大学硕士学位论文 2 4 1 胶原蛋白提取 提取胶原蛋白的关键是得到具有三螺旋结构的胶原蛋白，而不至于过度水解 成明胶。目前提取胶原蛋白的方法主要有酶法【2 5 1 ，中性【2 3 j 或碱法【2 6 1 提取等。用 木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶等酶对胶原蛋白做较弱的酶处理皮块，只是作用于胶原 蛋白的非螺旋端肽，而不会改变胶原蛋白的三螺旋结构，再用稀酸提取，就可获 得保持生物活性的，低抗原性的胶原蛋白【2 5 】。金勇1 2 3 l 采用中性( p h 7 5 ) 缓冲 液氯化钠一三羟甲基氨基甲烷一盐酸( n a c l t r i s h c l ) 为萃取液，从新鲜猪 皮中成功的提取了保持三螺旋结构的胶原蛋白。另外还有碱法高温【2 6 】从皮革边 角余料中提取胶原蛋白等。 2 4 2 胶原蛋白来源 2 4 2 1 从牛腱中提取胶原蛋白 赵苍碧【2 5 】选择胃蛋白酶和无花果蛋白酶两种酶试剂研究了从牛腱中提取胶 原蛋白的一些影响因素。在提取的过程中，影响因素有温度，底物，所选择的 缓冲液，p h 值，酶以及相应的辅酶或抑制剂，其中酶的选择和酶的用量将直接影 响提取，纯化以及三螺旋结构的破坏程度。 2 4 2 2 从牛皮中提取胶原蛋白 我国华西医科大学制药厂从1 9 8 7 年开始进行从小牛皮中提取胶原蛋白的 研究。所得产品为白色纤维状固体，溶于等渗生理缓冲液中，低温是为流动液 体，升温至3 7 。c ，1 2 1 5 秒内凝聚成具有弹性的白色胶状固体。经s d s p a g e 凝 胶电泳测定，具有i 型胶原蛋白5 条特征谱带。 2 4 2 3 从猪皮中提取胶原蛋白 赵胜年【2 6 1 用胰酶从鲜猪皮中提取胶原蛋白。将猪皮洗涤去污，加水于锅中 沸水煮5m i n ，捞出，刮去脂肪，脱毛；至于高压釜中，加入2 倍水量，在0 1 5m p a 1 2 第二部分文献同顾 下保持1 5m i n 。取出熟猪皮及汤，移入反应罐中，加入胰酶，调节p h 值，控制反 应温度和时间，酶解结束后，升温灭火，离心分离沉淀，用于下次酶解，上清液 经浓缩后喷雾干燥，制成胶原蛋白粉。 2 4 2 4 从其他材料中提取胶原蛋白 孙海晨等【2 7 】提出了较简便的方法从鼠尾腱中提取胶原蛋白，得到浓胶原蛋 白溶液后制成凝胶。钱娴娟【冽等提出了较为简便的从鸡肋骨中提取i i 型胶原蛋 白的方法，改方法提纯效率高，回收率达8 3 ，提取时间短，胶原蛋白纯度高， 而且方便简洁实用性强。秦玉青等【2 9 】研究了用胰酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶和 胃蛋白酶从鱿鱼皮中提取胶原蛋白，发现胃蛋白酶效果最好，胶原蛋白的提取率 高达9 5 ，但是由于提取温度远高于鱿鱼皮胶原蛋白的变性温度，所以得到的不 是具有三螺旋结构的胶原蛋白而是明胶。 2 5 胶原蛋白与相关疾病及研究 胶原蛋白与人体健康和临床疾病( 见表2 4 1 ) 关联的研究始于6 0 年代初期。 其中过度产生或损失胶原蛋白均可能造成若干疾病。比如，过度产生胶原蛋白， 可能造成肝脏硬化，肺脏纤维化和肿瘤成长等疾病；而胶原蛋白损失可能带来 包括类风湿性关节炎，伤口溃疡及结缔组织损坏等疾病的产生。 1 3 湖北大学硕+ 学位论文 a d v a n t a g e s ： 2 5 2 胶原蛋白做为生医材料的优缺点【3 0 】 a v a i l a b l ei na b u n d a n c ea n de a s i l yp u r i f i e df r o ml i v i n go r g a n i s m s ( c o n s t i t u t e s m o r et h a n3 0 o fv e r t e b r a t et i s s u e s ) ； n o n - a n t i g e n i c ； b i o d e g r a d a b l ea n db i o r e a b s o r b a b l e ； n o n - t o x i ca n db i o c o m p a t i b l e ； s y n e r g i cp l a s t i cd u et oh i g ht e n s i l es t r e n g t ha n dm i n i m a le x p r e s s i b i l i t y ； h e m o s t a t i c - - p r o m o t e sb l o o dc o a g u l a t i o n ； f o r m u l a t e di nan u m b e ro fd i f f e r e n tf o r m s ； b i o l o g i c a ld e g r a d a b i l i t yc a nb er e g u l a t e db yc r o s s - l i n k i n g ； e a s i l ym o d i f i a b l et op r o d u c em a t e r i a la sd e s i r e sb yu t i l i z i n gi t sf u n c t i o n a lg r o u p s ； c o m p a t i b l ew i t hs y n t h e t i cp o l y m e r s ； d i s a d v a n t a g e s ： h i g hc o s to fp u r et y p eic o l l a g e n ； v a r i a b i l i t yo fi s o l a t e dc o l l a g e n ( e g c r o s s l i n kd e n s i t y ，f i b e rs i z e ，t r a c ei m p u r i t i e s ， e t c ) ； h y d r o p