（发酵工程专业论文）l谷氨酰胺高产菌株的选育和发酵条件优化.pdf

摘要 摘要 本论文首先确定了发酵液中l 谷氨酰胺的定性定量测定方法，然后应用代谢 控制发酵原理，系统地研究了l 谷氨酰胺产生菌的选育，并确定了摇瓶发酵条件， 主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 纸层析分光光度计法测定发酵液中l 谷氨酰胺的含量。首先确立了展 开剂为正丙醇：氨水( v ) = 5 ：2 时，l 谷氨酰胺与l 谷氨酸之间的分离效果最好， 二者之间无重叠现象。采用7 2 1 分光光度计测定吸光度，最佳吸收波长选择在5 1 0 n 1 处有最大吸光度，对测定的准确性有利；洗脱时间为3 0m i n 时效果最佳；进一 步对样品进行重复性试验、加标回收率试验，经反复试验，最终结果表明该方法 重复性良好，回收率高，说明用此法测定l 谷氨酰胺含量具有较高的可靠性，为 后续研究工作奠定了坚实的基础。 ( 2 ) 以嗜乙酰乙酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u m ) y g l3 ( m s o k ) 为出发菌株，采用u v 、d e s 和n t g 诱变处理，采用磺胺胍、硫酸铵两种药物平 板，及分别以琥珀酸、l 谷氨酸为唯一碳源平板的定向筛选，最后获得一株l 谷 氨酰胺产生菌y l 0 1 2 ( m s o r , s g r ，( n h 4 ) 2 s 0 4 r , s u c g , l g 1 u o ) 。在未经优化的条件下 发酵液中可积累l 。谷氨酰胺3 4 3 舡，比出发菌株产量提高了1 5 4g l 。 ( 3 ) 通过对种子培养基的优化，及培养条件的研究，最后得出种子培养基的 最佳组成为( g l ) ：葡萄糖2 5 ，硫酸铵5 ，k h 2 p 0 41 ，m g s 0 4 7 i - i ：o0 5 ，玉米浆4 0 ， c a c 0 32 0 ；培养条件为：种子培养基初始p h 为7 0 ，装液量定为2 5 0m l 三角瓶装4 0 m l 种子培养基，3 0 ，1 0 0r m i n ，培养9h 。通过对发酵培养基的优化，及培养 条件的研究，最后得出摇瓶发酵培养基的最佳组成为( g l ) ：葡萄糖1 2 3 4 ，硫酸 铵4 7 8 ，k h 2 p 0 41 0 ，m g s 0 4 7 h 2 00 6 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 0 5 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 ， z n s 0 4 7 h ：o0 0 0 5 ，玉米浆4 3 ，c a c 0 33 0 ：最佳培养条件：发酵液培养基初始p h 为7 5 ，接种量为8 ，装液量为2 5 0n 儿三角瓶装1 5 m l 发酵培养基，3 0 ，1 0 0r m i n ， 培养7 2h 。产酸稳定在4 0 6e d l ，比未经优化提高了18 。 关键词：l 谷氨酰胺；纸层析；育种；条件优化 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ed i s s e r t a t i o nf i r s t l yi n v e s t i g a t e dt h em e t h o do fq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o no fl g l u t a m i n ei nb r o t h t h e na c c o r d i n gt ot h em e t a b o l i cc o n t r o l p r i n c i p l e s ，t h es t u d yi n v e s t i g a t e do nt h eb r e e d i n go fl - g l u t a m i n e p r o d u c i n gs t r a i na n d t h es u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fs h a k i n gf l a s ka n ds oo n t h em a i nr e s e a r c h c o n t e n t sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ec o n c e n t r a t i o n so fl - g l u t a m i n ei nb r o t hw e r ed e t e r m i n e d 丽t hp a p e rc h r o m a t o g r a p h ya n ds p e c t r o p h o t o m e t e r t h e n i tw a sd e t e r m i n e dt h ec o m p o s i t i o no fe x h i b i - t i o nl a y e rs y s t e mi np a p e rc h r o m a t o g r a p h y t h eb e s tr a t i oo ft h ee x h i b i t i o nl a y e ra g e n t w a sn - p r o p y la l c o h o l ：a m m o n i aq n 、) 2 5 ：2 。u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h eg l u t a m i n ea n dt h e g l u t a m i ca c i dc a nb es e p a r a t e dv e r yw e l l i tw a sa l s of o u n dt h a tt h eb e s tw a v e l e n g t ha t 510n n lo ft h e7 21s p e c t r o p h o t o m e t e r , a n dt h eb e s te l u t i o nt i m ew a s3 0 m i n f u r t h e r m o r e ， i tw a sc a r r i e do u tt h er e p e a t e dt e s tt ov a l i d a t et h ep r e c i s i o na n dv a i u er e c o v e r yr a t eo f t h es a m p l e i tw a sf o u n dt h a tu s i n gt h em e t h o dt oa n a l y s el - g l u t a m i n eh a db e t t e r r e p e a t a b i l i t ya n dr e c o v e r yr a t e t h e s er e s u l t ss i g n i f i e dt h a tt h em e t h o dh a dh i g h e r r e l i a b i l i t y ，w h i c hp r o v i d e df a v o r a b l eb a s ef o rt h ef u r t h e rs t u d y ( 2 ) t h el g l u t a m i n e - p r o d u c i n gs t r a i nw a sd e r i v e df r o mt h eo r i g i n a ls t r a i n ( c o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u m ) y g13 ( m s o k ) a n dm u t a t e db yt h em e t h o d so fu l t r a v i o l e t v ) ，d i e t h y ls u l f a t e ( d e s ) a n dn m e t h y l - n - n i t r o n n i t r o s o g u a n i d i n ef n t g ) t h e nt h e p l a t es c r e e n i n gm e t h o du s i n ga n a l o g u e s ：s u l f a g u a n i d i n e ( s g ) ，h i g hc o n c e n t r a t i o n ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，m e a n w h i l e ，s u c c i n a t ea n dl g l u t a m i ca c i da ss o l ec a r b o ns o u r c ew a su s e da s t r a i no fy l 012 ( m s o r ，s g g ，( n h 4 ) 2 s 0 4 r ，l g l u g ，s u c c 3w h i c hc o u l da c c u m u l a t e l g l u t a m i n e w a so b t a i n e d n l cc o n c e n t r a t i o no fl g l u t a m i n ei n t h ec u l t u r ew a s e n h a n c e df r o m18 7g lt o3 4 3g lb yu s i n gt h i ss t r a i n ( 3 ) t h eo p t i m i z a t i o no fm e d i u mc o m p o n e ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s f o r y l 012w a sc o n d u c t e d t h eo p t i m u ms e e dm e d i u mc o n t a i n s ( g l ) ：g l u c o s e2 5 ， ( n h 4 ) 2 s 0 45 ，c o r ns t e e pl i q u o r4 0 ，k h 2 p 0 41 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，c a c 0 32 0 ，p h7 o ；a n d t h eo p t i m u mm e d i u mv o l u m ew a st h e4 0m l 2 5 0m l c u l t u r i n ga t3 0 o nr e c i p r o c a - t i n gs h a k e r , w i t hs h a k i n ga t10 0 r m i n , i n o c u l a t e dt i m e9h t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o n m e d i u mc o n t a i n s ( g l ) ：g l u c o s e12 3 4 ，( n h 4 ) 2 8 0 44 7 8 ，c o r ns t e e pl i q u o r4 3 ，k h 2 p 0 4 1 0 ，m g s 0 4 。7 h 2 0o 6 ，h 1 s 0 4 。4 h 2 00 0 0 5 ，f e s 0 4 。7 h 2 00 01 ，z n s 0 4 。7 h 2 0o 0 0 5 ， c a c 0 33 0 t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r et h e15m l 2 5 0m l ，o r i g i n a lp h 7 5 ，s e e dv o l u m e8 ，a t3 0 谢t l ls h a k i n ga t1 0 0r m i nf o r7 2h i nt h eo p t i m i z e d m e d i u mt h ec o n c e n t r a t i o n so fl g l u t a m i n ei nt h ec u l t u r ew a se n h a n c e du pt o4 0 6g l k e y w o r d s ：l - g l u t a m i n e ；p a p e rc h r o m a t o g r a p h y ；b r e e d i n g ；o p t i m i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 签 名： 兰整 日 期：7 , o v 8 厶】弓 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容扣纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 兰盆 导师签名： 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 l 一谷氨酰胺( l g l u t a m i n e ) 是l - 谷氨酸丫一羧基酰胺化的一种氨基酸，具有许 多特殊的功能，被归类为条件必需氨基酸【1 - 3 1 。目前国外临床上主要将它应用于治 疗精神萎靡、酒精中毒及胃和十二指肠溃疡等疾病。另外它还具有增进神经机能， 改善脑出血后的记忆障碍，促进智力不佳儿童的智力发展，防止癫痫发作等功能， 是一种极有发展前途的新药【4 】。 1 2l 谷氨酰胺的理化性质 l 谷氨酰胺化学名2 ，5 一二氨基5 一氧代戊酸，分子量1 4 6 1 5 ，分子式为 c 5 h t o n 2 0 3 ，结构式如下： o0 n h z 0 h 解离常数p k ( - - c o o h ) = 2 1 7 ，p k ( 一n h 3 + ) = 9 1 3 ，等电点p i = 5 6 5 ，比旋光度 a d 2 9 = + 6 1 ( c = 2 ，6m o l l h c l ) ，熔点，1 8 5 - 1 8 6 ，稍有甜味，易溶于水，难溶 于甲醇、乙醇、乙醚、苯、丙酮、醋酸乙酯和氯仿等有机溶剂 5 1 。 1 3l 一谷氨酰胺的生理特性 l 谷氨酰胺是哺乳动物血浆中含量最丰富的一种游离氨基酸。许多研究表明， l 谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，在剧烈运动、受伤、感染等应激条件下，l 谷氨酰胺的需要量大大超过了机体合成l 谷氨酰胺的能力，这时，体内l 谷氨酰 胺含量降低，蛋白质合成量减少，出现小肠粘膜萎缩与免疫功能低下现象。l 谷 氨酰胺还可为多种快速分裂细胞如肠粘膜上皮细胞和活化的淋巴细胞等提供能 源，在促进受损肠道的修复以及维持正常的局部免疫功能中发挥着其它氨基酸不 可替代的重要作用。近年来，l 谷氨酰胺因其独特且复杂的生理功能逐渐成为营 养学、生理学、免疫学等学科领域的研究热点【6 j 。 l 谷氨酰胺的代谢主要受谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶的调节。前者催化谷 氨酸和氨合成谷氨酰胺，主要存在于骨骼肌和脑组织；后者催化l 谷氨酰胺水解 为谷氨酸和氨，主要存在于一些快速增殖、分化的细胞中，如粘膜细胞、淋巴细 1 鋈塑奎堂堡主兰垡丝壅 胞和内皮细胞等。 骨骼肌是l 谷氨酰胺合成及储存的主要组织。谷氨酰胺是骨骼肌细胞自由氨 基代谢池中最丰富的氨基酸，约占整个氨基酸总量的6 1 ，浓度大约为血浆中谷氨 酰胺浓度的j 0 倍，此浓度梯度有利于l 谷氨酰胺由骨骼肌进入血液循环，进而被 转运至小肠和肝等器官进行代谢。 肾脏和肠粘膜淋巴细胞也可利用部分l 谷氨酰胺。肾脏中l 谷氨酰胺的代谢主 要是生成氨，对调节机体酸碱平衡具有重要作用，l 谷氨酰胺在肠粘膜淋巴细胞 的代谢主要是作为其能量来源和核酸、蛋白质等合成的供体。肝脏既含l 谷氨酰 胺酶又含l 谷氨酰胺合成酶，两者的协调作用对维持血液中l 谷氨酰胺的浓度平衡 具有重要作用。 小肠是利用l 谷氨酰胺的主要器官。小肠粘膜细胞具有相当高的l 谷氨酰胺酶 活性，是l 谷氨酰胺代谢的主要场所。l 谷氨酰胺在维持小肠代谢、结构和功能上 起重要的作用，是淋巴细胞增殖所必需的。研究发现，l 谷氨酰胺在整个宿主防 御机制中有重要作用，l 谷氨酰胺的耗竭将导致整个机体的免疫抑制。 1 4l 谷氨酰胺的营养和应用 l 谷氨酰胺为人体条件性必需氨基酸，其作用主要是增强或提高人体免疫功 能，维持酸碱平衡增加肌肉细胞蛋白质合成；l 谷氨酰胺对肠道粘膜有积极的营 养和保护作用，可作为单一的氨基酸营养物质发挥作用，促进溃疡愈合；可大量 用于高强度劳动和运动后的疲劳恢复；维持肾脏、胰腺、胆囊和肝脏的正常功能； l 谷氨酰胺还有增进脑神经机能的作用，对预防和治疗神经衰弱有一定的作用， 可以改善脑出血后遗留的记忆障碍，还能促进智力不足儿童的智力发育，防止癫 痫病发作【7 j 。同时，l 谷氨酰胺还是一种很好的饲料添加剂。 1 4 1l 谷氨酰胺的营养 ( 1 ) 肠道营养 l 谷氨酰胺在维持小肠代谢、结构和功能上起重要的作用。l 谷氨酰胺既能作 为肠粘膜细胞能量代谢的底物，又能为快速周转的蛋白质和核酸提供原料。l 谷 氨酰胺利用率下降会降低细胞增殖率，只有小肠上皮细胞l 谷氨酰胺的利用率相 当高时，才能确保细胞分化和粘膜细胞的更新。研究发现，注入外源l 谷氨酰胺 酶，诱导血浆中l 谷氨酰胺耗竭，将会导致小肠粘膜的水肿、溃疡和部分坏死。 经研究表明，含有l 谷氨酰胺的全胃肠外营养可提高肠粘膜细胞内l 谷氨酰胺酶 的活性，刺激肠道粘膜细胞对l 谷氨酰胺的利用，增加空肠粘膜重和d n a 含量， 减少与常规静脉灌注相联系的绒毛萎缩，而且l 谷氨酰胺与表皮生长因子具有协 同作用。另有研究表明，含l 谷氨酰胺的t p n 增加了肠道绒毛长度和氮含量瞄j 。 ( 2 ) 免疫组织营养 淋巴细胞中富含高活性的l 谷氨酰胺酶，受到免疫刺激时，酶的活性增加。 2 第一覃绪论 在体外培养大鼠肠淋巴细胞，当培养基中缺乏谷氨酰胺时，3 h 胸腺嘧啶整合进入 d n a 的速率很低，培养基中补充一定量l 谷氨酰胺可明显提高3 h 胸腺嘧啶的整 合进入速率，因而l 谷氨酰胺是淋巴细胞增殖所必需的。b u r k e 等证实，t p n 加 速大鼠肠道细菌易位，但当提供富含l 谷氨酰胺的t p n 时，细胞易位下降，这与 正常的i g a 分泌水平以及细菌在肠细胞粘附下降相关联，表明供应l 谷氨酰胺增 加了肠道免疫功能。当小鼠饲以富含l 谷氨酰胺的t p n 时，免疫功能增强。另外， 研究发现，l 谷氨酰胺在整个宿主防御机制中有重要作用，l 谷氨酰胺的耗竭将导 致整个机体的免疫抑n r 9 1 。 ( 3 ) 胰脏组织营养 研究证实，肠内供应谷氨酸胺可支持胰脏生长及其功能。发现l 谷氨酰胺能 显著增加胰脏重量、d n a 含量和蛋白质含量，也可增加总的胰蛋白酶原和脂酶含 量，l 谷氨酰胺可促使胰腺泡增生。l 谷氨酰胺可以防止由于过量摄入碳水化合物 导致的脂肪肝，认为添加l 谷氨酰胺可刺激胰高血糖素分泌，从而降低门脉胰岛 素与胰高血糖素比例，增加肝脏脂类的输出【l0 1 。 1 4 2l 谷氨酰胺的应用 ( 1 ) 在胃肠道的应用 l 谷氨酰胺可引起门静脉血中胰高血糖素的浓度增加，而胰高血糖素可使l 一 谷氨酰胺酶的活性增高，从而增加肠粘膜对l 谷氨酰胺的利用，可使肠上皮细胞 内的多胺含量增加，促进上皮细胞的分化。l 一谷氨酰胺可防止胃溃疡，缓解腹泻。 经常有上消化道症状的病人是那些必须服用非激素类抗炎药物治疗，如关节炎、 痛经和严重头痛的病人，l 谷氨酰胺可防止药物性胃炎，因此对患有以上症状的 病人是一种合理的选择。 l 谷氨酰胺在抑制腹泻时，可以起到减少电解质和水丢失的重要作用。 ( 2 ) 在运动产品中的应用 在体育界，血浆l 谷氨酰胺水平作为评价过度训练的一个指标倍受关注。测 定血液中的l 谷氨酰胺含量可作为过度训练的检测、评价指标。健美爱好者及竞 技运动员在进行高强度的力量训练时，体内l 谷氨酰胺的水平可下降5 0 ，此时若 不能通过饮食或自身合成得到足够的l 一谷氨酰胺，肌肉蛋白就会发生分解，这不 仅影响了肌肉的体积，也会降低机体的免疫能力，这时应当及时补充l 谷氨酰胺 以便于有效地防止肌肉蛋白的分解，通过细胞的水合作用，增加细胞的体积，促 进肌肉的生长。口服l 谷氨酰胺能使生长激素的水平提高4 倍，并使胰岛素和睾酮 分泌增加，促进肌肉的生长和身体的增高、增强u 。 研究表明，l 谷氨酰胺的服用应以第1 周1 0g o d ，第2 周2 , - - 4g d 维持，6 周后循 环，这样能有效地增长增粗肌纤维细胞，促进运动员肌肉增长，改善运动员的身 体状况。因此l 谷氨酰胺常作为运动食品添加剂，用于加强肌肉功能和运动能力。 ( 3 ) 在药物方面的应用 鋈堕奎堂堡主堂垡笙塞 外科创伤、大手术和严重感染常会导致全身炎症反应综合症( s i r s ) ，继而发生 多器官功能障碍综合征( m o d s ) ，严重影响病程的发展，对s i r s 进行及时干预能 阻止m o d s 的发生，从而提高外科危重病的抢救成功率。s i r s 是以炎症过度反应 和免疫异常为其重要的病理生理特征。针对s i r s 的特征运用免疫营养手段改善病 人的免疫功能和调理急性炎症反应，是目前营养支持领域研究的热点。本研究运 用谷氨酰胺增强的肠外营养对普外科危重病人进行治疗，观察病人营养、免疫功 能和病情的变化【l 引。 作为临床药物，l 谷氨酰胺用于治疗胃溃疡、缓解腹泻。日本于1 9 7 9 年将l 谷氨酰胺作为抗溃疡药物投放市场，疗效和经济效益十分显著，其胃药制剂现已 进入我国市场。近年来国外临床研究又有新突破，目前已大量用于治疗运动员的 运动综合症和高强度劳动或运动后的疲劳恢复，重建免疫系统，有利于治疗和支 持肝脏功能，减少癌症治疗中化疗和放射治疗的副作用。同时临床上大量用于治 疗腹部溃疡、克罗恩氏病、肠炎和溃疡性淋巴管炎，广泛用于维持大脑机能，治 疗弱智、癫痫症、帕金森氏综合症、肌肉萎缩症和酒精中毒等【1 3 1 。 ( 4 ) 在饲料中的运用 含l 谷氨酰胺的饲料可以增加动物肠道对l 谷氨酰胺的摄取，激活谷氨酰胺 转运载体，刺激肠粘膜细胞谷氨酰胺酶的活力。饲料中补充l 谷氨酰胺可以明显 改善由于幼仔断奶应激所造成的损害，防止肠绒毛的萎缩，维持肠道正常的形态 结构，改善幼仔的生长发育1 1 4 , 1 5 1 。 l 谷氨酰胺是猪乳中含量最丰富的氨基酸，是仔猪肠道绒毛生长的主要能量 来源。当早期断奶仔猪的母源谷氨酰胺供应消失后，来自肌肉和血液中的内源谷 氨酰胺尚不足以维持肠道绒毛的完整性，不能维持小肠上皮细胞的代谢、增殖和 成熟、免疫细胞的正常功能，导致绒毛萎缩、腹泻，从而抑制采食量，这是早期 断奶综合症产生的根本原因。而仔猪日粮中添加l 谷氨酰胺有利于维持正常的肠 道功能和结构，提高机体免疫力，显著降低腹泻。促进采食，减轻断奶应激给仔 猪造成的损伤【l 昏一j 。 1 5l 谷氨酰胺的国内外市场及生产情况 2 0 0 6 年全球l 谷氨酰胺市场需求量达到8 , 0 0 0t 以上。国外主要生产公司为日 本味之素公司、美国a d m 公司等。2 0 0 3 年全球l 谷氨酰胺需求量约为3 , 0 0 0t ， 消费主要集中在经济发达的国家和地区，如美国、日本和欧洲等。在日本，l 谷 氨酰胺作为胃肠类药物及健脑产品已得到广泛应用，产量逐年上升，1 9 7 7 年日本 用发酵法生产年产量达1 0 0t ，1 9 7 9 年产量为5 0 0t ，1 9 9 0 年为1 ，2 0 0t ，2 0 0 2 年达 到1 , 5 0 0t ；在美国，l 谷氨酰胺主要用于治疗胃溃疡等疾病的保健品及运动员的 营养补剂；在德国，l 谷氨酰胺作为治疗胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病的药物而 被载人药典；韩国作为后起的l 谷氨酰胺生产国，目前年产量已经达到5 0 0t 。 4 第一章绪论 近几年，我国l 谷氨酰胺生产发展迅猛，市场需求迅速扩大，国内市场需求 总量2 ，0 0 0t 以上。食品级l 谷氨酰胺的价格约8 - 9 万元t 。 1 6l 谷氨酰胺的生产方法 由于l 谷氨酰胺具有广泛的用途，促使其生产得以迅速发展。目前主要的生 产方法有化学酰化法、酶法和直接发酵法。 1 6 1 化学酰化法 化学酰化法是采用发酵法制得的l 谷氨酸进行酰化制取l 谷氨酰胺。1 9 6 0 年 b o i s s o n n a s 首先发现l 谷氨酸吖甲酯在甲醇溶液中酰胺化时，加入适量的二硫化 碳，它与氨基加成而产生氨基二硫代甲酸铵，会把氨基保护起来，从而阻止l 谷 氨酸吖甲酯的环化，并生成l 毗咯烷酮羧酸铵。在酰胺化后，经过酸化能自动地 放出二硫化碳而生成l 谷氨酰胺。以后陆续有人对酰化法进行了改良。成都有机 化学研究所涂君利等人在常压的条件下，将l 谷氨酸及甲醇混合冷却至o 加入 浓硫酸，搅拌反应，混合物在冰盐浴中通入氨中和；在冰盐浴冷却及过量氨条件 下，搅拌加入二硫化碳密闭静置4 5d 过滤，滤液无氨臭后加冰醋酸酸化，除去二 硫化碳得白色固体即为l 谷氨酰胺粗品。粗品热溶液用活性炭吸附过滤，经甲醇 洗涤、烘干可精制l 谷氨酰胺。这种直接由l 谷氨酸通过浓硫酸作脱水催化剂， 进行部分酯化反应制成l 谷氨酸丫- 甲酯，对中间产物l 谷氨酸1 ，甲酯不经过分离 和净化，直接在二硫化碳的存在下与液氨的甲醇溶液进行反应而得l 谷氨酰胺的 方法，缩短了酰胺化过程的反应时间【2 u j 。 由于化学酰化法生产l 谷氨酰胺成本比较高，从而限制了l 谷氨酰胺的使用。 1 6 2 酶法生产l - 谷氨酰胺 酶法是用n h 4 + 和谷氨酸作原料，经谷氨酰胺合成酶催化生产l 谷氨酰胺，其 转化机理如图1 1 所示。 a t pa d p l g 1 u + m + 二：= = ；= = 么l g l n g i n 合成酶 图1 - 1l 谷氨酰胺酶法合成反应式 f i g 1 1e n z y m ee q u a t i o no fs y n t h e s i z i n gl - g l u t a m i n e 与化学酰化法合成l 谷氨酰胺相比，酶法具有一定的优点，如反应步骤简单、 副反应少、易分离、容易实现自动化等。但是从图1 1 可以看出，酶法合成l 谷 氨酰胺需要解决两个问题：即谷氨酰胺合成酶和底物a t p 的来源。由于此法合成 l 一谷氨酰胺的产量较低( 据陈群英报道产量为2 2g l ) ，且a t p 价格昂贵，难以在 工业上应用，因而酶法生产l 谷氨酰胺还有待于进一步深入研究2 1 1 。 江南大学硕士学位论文 1 6 3 直接发酵法生产l - 谷氨酰胺 用发酵法生产l 谷氨酰胺是选择合适的菌种，控制培养基成分及配比，给微 生物以最佳的环境条件，利用微生物的新陈代谢，可以大幅度提高l 谷氨酰胺的 产量。1 9 6 3 年木下一千等首先发现在谷氨酸发酵液中，除了谷氨酸以外，还有l 谷氨酰胺。1 9 6 3 年，木下祝郎在谷氨酸微球菌发酵液中也发现有谷氨酰胺存在。 1 9 7 9 年，中西透等人经进一步实验证实，改变发酵条件，可以使谷氨酸产生菌从 谷氨酸发酵转向l 谷氨酰胺发酵【2 2 j 。8 0 年代后，我国也进行谷氨酰胺发酵，现在 工业生产多采用这种方式。 1 7 发酵法生产l 谷氨酰胺的国内外研究现状 目前，用发酵法生产l 谷氨酰胺发酵水平日本为7 0g l ，韩国为5 0e r , 。吉 田文弘等报道，将黄色小杆菌1 0 3 4 0 为亲株用诱变方法得到一株磺胺胍抗性变异 株a j 3 6 8 4 ，发酵3 0h ，得到3 6g l 谷氨酰胺，而其亲株仅产9 2g l 。k o i c h in a b e 以里加黄杆菌f e r m p 3 5 5 6 为亲株经诱变得到的青霉素抗性变异株里加黄杆菌 7 0 3 ，发酵4 8h ，谷氨酰胺产率为2 5g l ，该菌的显著特点是不需要生物素，但需 色氨酸作为基本的营养物质和硫胺素作为刺激物。以黄色短杆菌或谷氨酸小球菌 为亲株得到的磺胺胍抗性变异株，也能高产l 谷氨酰胺。纸屋治司等用黄色短杆 菌1 4 0 6 7 作为出发菌株，通过诱变，选育出一株维生素b t z 抗性株a j l l 2 0 0 。在此 基础上进一步赋予磺胺胍抗性，选育出一株高产l 谷氨酰胺的双重抗性变异株 a j l1 2 0 1 ，它能生成对糖收率为4 3 的l 谷氨酰胺。 国内也有人用类似的诱变方法获得l 谷氨酰胺的产生菌。由于此方法具有普 遍性，同时诱变剂也易得，因此目前常用此方法获得l 谷氨酰胺产生菌。 上海科技大学王福源等人用北京棒状杆菌a s1 2 9 9 为出发菌株进行诱变，得到 一株l 谷氨酰胺产生菌a x 8 ( s g k ) ，l 谷氨酰胺积累量为2 3g l j 。 天津轻工业学院的刘永生等人以天津短杆菌t g ：8 6 6 作为出发菌株，经原生质 体融合，最终选育出一株l 谷氨酰胺产生菌，经过实验在适宜条件下平均积累谷 氨酰胺2 7 3g t , 幽j 。 天津轻工业学院张克旭等人以天津短杆菌t g 8 8 6 1 7 4 作为发菌株，用亚硝基 胍，硫酸二乙酯进行诱变，获得一株l 谷氨酰胺产生菌g w 7 7 ，平均产l 谷氨酰胺 为3 1 4g l ，最高达3 3 2g 刖2 5 j 。 1 9 9 8 年，上海工业微生物研究所李爽等人以黄色短杆菌s g r 和d o n r 抗性菌株 作为出发菌株，在1 6l 罐中进行了研究，产l 谷氨酰胺为5 2 2g l ，转化率为3 3 3 。 上海市工业微生物研究所解云峰等人以产谷氨酸的黄色短杆菌为出发菌株，经 n t g 诱变，筛选出抗磺胺胍的l 谷氨酰胺高产菌株，突变株b f 3 6 6 摇瓶试验产l - 谷氨酰胺5 8 3 虮，发酵周期4 2h t 2 6 j 。 自1 9 9 2 年起，山东大学微生物技术国家重点实验室以实验室分离保存的一株 6 第一章绪论 菌株作为出发菌株，经过近五年的定向选育和菌种构建，成功地选育了l 谷氨酰 胺产生菌株，并对该菌株进行了摇瓶发酵研究，找到了高产培养基配方。后又在 德国b b r a u n 自控发酵罐上进行了较为系统的研究，小试发酵最高达6 5g l 的水 平。目前，该实验室己初步完成l 谷氨酰胺发酵提取工艺，提取总收率4 5 以上。 2 0 0 2 年湖北工学院生物工程系汪世华等采用丫射线硫酸二乙酯吖一射线进行复 合诱变，并结合黄胺胍抗性得到一株高产菌株s h 4 4 ，产量高且稳定性好，最高水 平为5 5 8e d l ，平均为5 5 3e d l t l l 。 2 0 0 4 年上海迪赛诺生物科技有限公司夏海平等以l 谷氨酰胺生产菌株g b 2 0 为 出发菌株，利用亚硝基胍诱变方法进行诱变筛选，获得目标菌株g b 2 0 9 0 9 0 ，再以 目标株为出发菌种，经过发酵过程的工艺优化，在5l 小发酵罐生产水平达7 5e , m 以上，在7 0m 3 发酵罐生产水平达7 0g l 以上【z 7 j 。 1 8 研究意义 l 谷氨酰胺作为人体中含量最多的一种氨基酸，在调节人体蛋白质的合成、 抑制蛋白质的降解、刺激细胞生长、激活免疫系统、提高生长激素水平等方面起 着重要作用。因其独特的代谢功能和营养特性，已逐渐成为营养学、生理学、免 疫学等学科领域的应用热点。 目前，消化道溃疡和脑神经功能疾病在我国乃至世界都属多发病，因为药用 谷氨酰胺需求量很大，有巨大的潜在市场。因此谷氨酰胺的研究开发对我国氨基 酸工业及医疗保健事业将是一个很大的贡献，具有明显的社会效益。随着全球经 济的发展，医疗保健水平的进步和人们对l 谷氨酰胺认识的不断增加，以l 谷氨 酰胺为原料的营养强化产品市场将会更加广阔。 我国在发酵法生产谷氨酰胺水平与国外相比，还有明显差距，如果能在菌种、 发酵控制及提取水平上有所突破，必将对我国谷氨酰胺产业产生极大的推动作用。 1 9 本论文的研究内容 本文以嗜乙酰乙酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u m ) y g l 3 ( m s o k ) 为 出发菌株，选育得到一株l 谷氨酰胺产生菌y l 0 1 2 ( m s o r ，s g r ，f n h 4 ) 2 s 0 4 r , s u c g ， l - g l u g ) ，对影响该菌株代谢的培养基组成及摇瓶发酵条件进行优化，具体研究内 容如下： ( 1 ) 纸层析分光光度法测定发酵液中l 谷氨酰胺的含量。 ( 2 ) l 谷氨酰胺产生菌的选育：以微生物遗传育种学为理论基础，采用氨基 酸结构类似物定向育种技术，选育遗传性状稳定、培养条件粗放的l 谷氨酰胺产 生菌。 ( 3 ) l 谷氨酰胺摇瓶发酵条件的研究：在摇瓶发酵条件下，对种子培养基及 培养条件，发酵培养基及培养提条件进行优化。 7 江南大学硕士学位论文 第二章发酵液中l 谷氨酰胺含量测定方法的确定 2 1 引言 目前国内外生产l 谷氨酰胺主要应用发酵法生产，因此对发酵液中l 谷氨酰 胺的测定需要简便易行、成本较低的方法。现在较常用的l 谷氨酰胺分析方法主 要有：氨基酸自动分析仪法、酸水解测氨法、高效液相色谱法、纸层析法。氨基 酸自动分析仪法准确、可靠，但测定重现性差，费时，样品处理繁琐删；酸水 解测氨法用于测定发酵液中l 谷氨酰胺时，不能排除培养基中的铵盐，严重影响 结果的准确性；高效液相色谱法一般需进行柱前衍生，且只能用于杂质较少时的 测定；纸层析法通过展开剂展开，经显色，洗脱后比色，操作简单、成本较低、 易于掌握，但定量测定不够精确，受外界环境条件的影响较大，比较适合在l 谷 氨酰胺产生菌筛选过程对大批量的发酵液进行测定。 2 2 材料 2 2 1 主要试剂 l 谷氨酰胺 正丙醇 氨水 茚三酮 丙酮 无水乙醇 硫酸铜 2 2 2 主要仪器设备 微量进样器 层析纸 色谱纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 t g l 1 6 g 高速台式离心机 7 2 1 分光光度计 电热鼓风干燥箱 g s p 7 7 0 3 磁力搅拌器 h - 1 微型混合器 电子天平 层析缸 中国科学院上海微生物研究所 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海振兴化工一厂 中国医药集团上海化学试剂公司 无锡东升玻璃仪器厂 新华一号 上海医用仪器分析厂 上海第三分析仪器厂 上海市跃进医疗器械厂 江苏泰县姜埝无线电厂 上海沪西仪器厂 m e t t l e 公司 无锡湖景玻璃仪器厂 8 兰三兰垄壁望! 兰：查篁墼壁鱼重型壅查鎏塑堡塞 2 2 3 主要试剂配制 显色液：o 5g 茚三酮溶于1 0 0m l 丙酮中。 洗脱液：o 1 c u s 0 4 ：7 5 乙醇( w ) = 2 ：3 8 。 l 一谷氨酰胺标准液：用分析天平准确称取0 0 5 0 0g 色谱纯l 谷氨酰胺溶于5 。o o m l 的蒸馏水中，配制成1 0 0 的l 谷氨酰胺标准液。其余浓度是由浓度为1 o o 的标准液稀释得到的。 2 3 方法 纸上层析的操作是在一张特制的滤纸上，在距离纸的底端1 5e m 处点上要分离 的样品溶液，放在密闭的容器内，使溶剂从有样品的一端流向另一端，从而使样 品中的混合物得到分离。再通过显色，使分离后的各物质在滤纸的各个不同位置 上显示出来。 2 3 1 定性定量测定l 谷氨酰胺的主要步骤 ( 1 ) 层析操作：将l 谷氨酰胺标准液( 或发酵液) 点样于新华一号滤纸，在 距离下端1 5c m 处点样，点距2c m ，每种溶液点样1 此，放置于层析缸中，上行展 开，展开约1 5c m 停止层析。 ( 2 ) 显色操作：层析结束后，用电吹风吹干滤纸，均匀喷洒上显色剂，放于 1 0 5 烘箱中烘干5m i n ，滤纸上出现紫红色氨基酸斑点即可。 ( 3 ) 标准曲线的绘制：剪下l 谷氨酰胺显色斑点于带塞的玻璃试管中( 盖住 试管口，防止乙醇挥发) ，用5 0m l 的洗脱液洗脱一定时间，然后在7 2 1 分光光度计 上测定吸光度( 波长5 1 0n i 1 ，光程1 0c m ) ，绘n l 谷氨酰胺标准曲线。 ( 4 ) 样品( 即发酵液) 测定：在测定发酵液中l 谷氨酰胺时，需将发酵液离 心，取上清液，适当稀释，点样1 此展开后，吹干，显色，剪下l 谷氨酰胺显色斑 点，洗脱，测定吸光度，根据l 谷氨酰胺标准曲线算出它们的含量。 2 3 。2 标准偏差 平均值( x ) = y x i n 标准偏差( s d ) = 【( x i x ) 2 ( n 1 ) 1 0 5 回收率= ( 测得总质量一本底质量) a n 标质量1 0 0 2 4 结果与分析 2 4 1 层析展开剂的选择 实验发现，在l 谷氨酰胺菌种选育中，利用纸层析分析时，由于l 谷氨酰胺 与l 谷氨酸不易完全分开，所以选择合适的层析溶剂很重要。因此本实验对l 谷 氨酰胺在5 种层析系统中的展开结果进行了考虑，通过测定l 谷氨酰胺，l 谷氨 9 南大学硕学位论文 酸的r f 值和观察色斑的方法进行了比较川，结果见表2 表2 - 1l 一誉氨酰胺在各种层析溶制中展开结果比较 t a b l e 2 - 1 t h e d e p l o y m e n t r e s u l t s o f l - g l u t a m i n e i ns o l v e n ts y s t e m s 从代谢机制分析，l 一谷氨酰胺是由l - 谷氨酸t 一羧基酰胺化生成的，并且l 谷 氨酸不可能完全转化为l 一谷氨酰胺，因此这2 种氨基酸会同时存在于发酵液中， 所以要定性定量分析需选择理想的层析溶剂进行分离。由表2 1 可知，正丙醇：氨 水( v v ) = 5 ：2 是较理想的层析溶剂，对l 一谷氨酰胺和l 一谷氨酸的层析结果见图2 - 1 。 聱 参囊 萨播鲁 l - g i ul - ( 3 i n 匿2 - 1 发酵液中l 各氨酰睦和l 谷氨酸纸层析结果 f i 9 2 。1r e s u l t s o f l _ g l u t a m i n ea n d l q 3 1 u l a m i ca c i d p a p e rc h r o m a t o g r a m 2 4 2 洗既菠最佳唛牧建缶的潮定 剪下l - 谷氨酰胺标准液斑点于带塞的玻璃试管中，加入5 0 m l 的洗脱液洗脱 4 0 r a i n 后，分别在不同的波长下测定洗脱液的吸光度( a ) ，实验结果见图2 2 。 ，枣 。，囊 叠，囊 ，鼙，警 ， 拳 第二章发酵液中l 谷氨酰胺含量测定方法的确定 0 0 8 0 0 r 7 0 0 6 o 0 5 粤0 0 4 o 0 3 0 0 2 o 0 l 0 4 0 04 5 05 0 05 5 06 0 06 5 07 0 0 波长( r i m ) 图2 2 不同波长下洗脱液的吸光度 f i g 2 - 2r e l a t i o n s h i pb e t w e e na b s o r b e n c ya n da b s o r bw a v e l e n g t h 由图2 2 可以看出，在波长5 1 0n r n 处，洗脱液a 值最大，因此测定l 谷氨酰 胺时，选用的最佳吸收波长为5 1 0a m 。 2 4 3 最佳洗脱时间的测定 o 0 8 0 0 7 o 0 6 0 0 5 驾o 0 4 o 0 3 o 0 2 o 0 1 0 l o2 03 04 05 06 0 洗脱时间( m i n ) 图2 3 不同洗脱时间对应的洗脱液吸光度 f i g 2 - 3r e l a t i o n s h i pb e t w e e na b s o r b e n c ya n dp r e s e r v i n gt i m ee l u e n t l 谷氨酰胺标准液点1 皿，显色洗脱后放置不同时间，在波长为5 1 0n r l l 下测 定洗脱液的吸光度。试验发现，洗脱2 0m i n 以后，洗脱液颜色稳定。由图2 3 可 以看出，当洗脱时间为3 0m i n 时，吸光度达到最大值，放置时间继续延长，吸光 度基本无变化，所以洗脱时间选用3 0m i n 。 2 4 4l 谷氨酰胺标准曲线的测定 在最佳吸收波长5 1 0n l t l ，洗脱时间为3 0r a i n 的条件下，测定l 谷氨酰胺的标 准曲线。由图2 4 得出：l 谷氨酰胺标准液浓度在o 2 至1 o 之间时l 谷氨酰 胺的量与吸光度( a ) 之间的线性关系明显。 江南大学硕士学位论文 o 1 2 0 1 0 0 8 驾0 0 6 0 0 4 0 0 2 o 0o 20 40 60 8l l 一谷氨酰胺含量( ) 1 2 图2 4l 谷氨酰胺标准曲线 f i g 2 -