（发酵工程专业论文）产13丙二醇新型基因工程菌的构建.pdf

摘要 摘要 1 ，3 丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚 酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1 ，3 一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法，由 于从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产l ，3 一丙二醇还存在产物浓度低、生产周期 长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此，利用基因工程技术 构建高产菌株备受国内外研究者青睐，被认为是今后的发展方向。 以甘油为底物转化生产1 ，3 丙二醇的生物合成途径中，由于n a d h 的不足，抑制 了1 ，3 一丙二醇氧化还原酶的活性，引起3 一羟基丙醛累积，进而能抑制甘油脱水酶的活 性，从而阻止了菌体的生长和产物1 ，3 丙二醇的牛成，严重影响1 ，3 丙二醇产量的提高。 为了解决这一矛盾，本研究首先利用p c r 方法从大肠杆菌中克隆1 1 6k b 的1 ，3 丙二醇 氧化还原酶同工酶的编码基因y q h d 及2 8 0k b 来源于克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基 因d h a b 构建了重组菌e s c h e r i c h i ac o l i 旧c o l i ) j m10 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) 。并对e c o l i j m l 0 9 ( p e t a c ) 、重组菌ec o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) 发酵甘油生产1 ，3 丙二醇的 性能进行了初步考察。结果表明，e c o l ij m l 0 9 ( p e t a c ) 不能利用甘油合成1 ，3 丙二醇， 而重组菌ec o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) 能利用甘油转化为l ，3 丙二醇。对重组菌 ec o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) 进行酶活测定，结果发现，重组菌ec o l i j m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) 甘油脱水酶酶活力为1 5u m g 蛋白，而l ，3 丙二醇氧化还 原酶同工酶酶活力为1 0u m g 蛋白，而在对照菌株( p e t a e ) 中只能检测到1 ，3 一丙二醇氧化 还原酶同工酶的酶活，酶活力为4u m g 。 在构建了可利用n a d p h 为辅酶的重组菌最c o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) 的基 础上，为进一步加强1 ，3 一丙二醇氧化还原酶的表达以减少3 羟基丙醛累积，故以克雷伯 氏菌染色体d n a 为模板克隆得到d h a t 基因，并表达载体p u c t a c d h a t ，同时与重组 质粒p e t a c d h a b t a c - y q h d 共转化ec o l ij m l 0 9 ，得到稳定的重组大肠杆菌双质粒系统， 使大肠杆菌可利用两种辅酶( n a d h 、n a d p h ) 将甘油转化为1 ，3 丙二醇。对重组菌 ec o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ，p u c t a c d h a t ) 进行酶活测定，结果发现，重组菌 ec o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ，p u c t a c d h a t ) 甘油脱水酶酶活力为2 3u m g 蛋白， 而1 ，3 丙二醇氧化还原酶同工酶酶活力为1 2u m g 蛋白，1 ，3 丙二醇氧化还原酶活力为 6 u m g 。对重组菌的酶活测定结果表明，串联1 ，3 丙二醇氧化还原酶砌口t 的甘油脱水 酶酶活力显著提高。 对重组菌ec o l ij m l 0 9 进行发酵试验，在含甘油5 0 l 的发酵培养基中，重组菌 ec o l ij ml0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) 与重组菌ec o l ij m l0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ， p u c t a c d h a t ) 经诱导后l ，3 一丙二醇的产量分别为1 5 2 l 及1 8 6 l 。发酵结果表明， 重组菌ec o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ，p u c t a c d h a t ) 比ec o l ij m l 0 9 ( p e t a e d h a b t a c - y q h d ) l ，3 一丙二醇的产量提高了2 2 3 。通过正交分析法优化了重组菌ec o l i j m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ，p u c t a c d h a t ) 的发酵培养基，其适宜的组成为：甘油2 0 l 、v b l 20 0 1g l 、k h 2 p 0 47 5g l 、m 9 2 + o 6 7g l 和酵母膏5 l ，重组菌ec o l i 摘要 j m l 0 9 ( p e t a e d h a b t a c - y q h d ，p u c - t a c d h a t ) 在此培养基中l ，3 - 丙二醇的产量达到2 2 5 l 。 关键词：1 ，3 丙二醇；甘油；基因工程；大肠杆菌；克雷伯氏菌；甘油脱水酶；l ，3 丙 二醇氧化还原酶同工酶；1 ，3 丙二醇氧化还原酶；共转化 i i a b s t r a e t a b s t r a c t l ，3 - p r o p a n e d i o lh a sn u m e r o u sa p p l i c a t i o n s i nt h em a n u f a c t u r eo fp o l y m e r s ，f o o d s ， l u b r i c a n t s ，a n dm e d i c i n e s i n d u s t r i a l1 ，3 - p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o nh a sa t t r a c t e da t t e n t i o na sa n i m p o r t a n tm o n o m e rt os y n t h e s i z ean e wt y p eo fp o l y e s t e r , p o l y t r i m e t h y l e r i et e r e p h t h a l a t e 1 ， 3 - p r o p a n e d i o li sp r o d u c e db yt w om e t h o d s ：c h e m i c a ls y n t h e s i sa n dm i c r o b i a lc o n v e r s i o n h o w e v e r , t r a d i t i o n a lc h e m i c a lc o n v e r s i o no f1 ，3 - p r o p a n e d i o li sd i f f i c u l t ，w h i c hh a sal o w s e l e c t i v i t ya n dc o n s e q u e n t l yi t sh i 曲p r i c eh i n d e r st h eu t i l i z a t i o no fl ，3 - p r o p a n e d i o li n p o l y m e r i n d u s t r i e s i n t e r e s th a sn o wb e e nf o c u s e do nt h ep r o d u c t i o no fl ，3 - p r o p a n e d i o lb y r e c o m b i n a n ts t r a i nf e r m e n t a t i o n t h el a c ko fn a d hi nt h eg l y c e r o lm e t a b o l i s mi n h i b i tt h ea c t i v i t yo f1 ，3 - p r o p a n e d i o l o x i d o r e d u c t a s e ，a n di n d u c et h ea c c u m u l a t i o no f3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d e h y d e ，w h i c hc a ni n h i b i t t h ea c t i v i t yo fg l y c e r o ld e h y d r a t a s e ，a n dp r e v e n tt h ec e l lg r o w t ha n dt h ep r o d u c t i o no f1 ，3 - p d t or e s o l v et h ep r o b l e m ，t h i sr e s e a r c hw a st oc o n s t r u c tar e c o m b i n a n ts t r a i nw h i c hc o u l d c o n v e r tg l y c e r o lt o1 ，3 - p r o p a n e d i 0 1 t h es t r u c t u r eg e n ey q h df r o maw i l d t y p ee s c h e r i c h i a c o l ie n c o d i n g1 3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s ei s o e n z y m ea n dt h es t r u c t u r eg e n ed h a bf r o mk p n e u m o n i a ee n c o d i n gg l y c e r o ld e h y d r a t a s ew e r ea m p l i f i e db yu s i n gp c rm e t h o d t h e e x p r e s s i o nv e c t o rp e t a ch a r b o r i n gy q h dg e n ea n dd h a bg e n ew a st r a n s f o r m e di n t oe c o l i j m10 9t oy i e l dt h er e c o m b i n a n ts t r a i ne c o l ij m10 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) f e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e db ye c o l ij m l 0 9 ( p e t a c ) ，e c o l ij m l 0 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d l s h o w e dt h a tn ol ，3 - p r o p a n e d i o lw a sp r o d u c e di nec o l ij m10 9 ( p e t a c ) ，o n l yt h es t r a i n h a r b o r i n gb o t hd h a bg e n ea n dy q h dg e n ec o n v e r t e dg l y c e r o lt o1 ，3 - p r o p a n e d i o la f t e r i n d u c t i o nb yi p t g t h er e c o m b i n a n te n z y m ea c t i v i t ya n a l y s i ss h o w e dt h a tt h es p e c i f i c e n z y m a t i ca c t i v i t yo fg l y c e r o ld e h y d r a t a s ea n d1 ，3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s ei s o e n z y m ei n ec o l ij m10 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) w e r e15u r n g p r o t e i na n d 10u m gp r o t e i n ， r e s p e c t i v e l y w h i l e ，t h es p e c i f i ce n z y m a t i ca c t i v i t yo f1 ，3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s ei ne c o l ij m10 9 ( p e t a c ) w e r eo n l y4 u r n gp r o t e i n w h i l e ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t a c - d h a b t a c - y q h dh a r b o r i n gt h eg e n e se n c o d i n g d h a ba n dy q h dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ij m10 9 as t a b l et w op l a s m i ds y s t e mw a s o b t a i n e dv i ac o t r a n s f o r m a t i o no fp e t a c d h a b t a c - y q h da n dp u c - t a c d h a ti n t oe c o l ij m 10 9 ， w h i c hc o n v e r tg l y c e r o lb yu s i n gt w oc o e n z y m e ( n a d h ，n a d p h ) ，a n dd e c r e a s et h e a c c u m u l a t i o no f3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d e h y d e a n dt h es p e c i f i ce n z y m a t i ca c t i v i t yo fg l y c e r o l d e h y d r a t a s ea n dl ，3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s ei s o e n z y m ei ne c o l ij m10 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ，p u c - t a c - d h a t ) w e r e2 3u r n gp r o t e i na n d 12u m gp r o t e i n ，r e s p e c t i v e l y 1 ， 3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s ei s o e n z y m ea c t i v i t yo fe c o l ij m 10 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ， p u c - t a c - d h a t ) w a sh i g h e rt ot h a to f e c o l ij m 10 9 ( p e t a c d h a b t a c - y q h d ) i i i t h ep r o d u c t i o no f1 ，3 - p r o p a n e d i o lo n5 0 lg l y c e r o lb yec o l ij m l0 9 ( p e t a c d h a b - t a c - y q h d ) w a s1 5 2g la n dt h ep r o d u c t i o no fl ，3 - p r o p a n e d i o lb yec o l ij m 10 9 ( p e t a c - d h a b t a c - y q h d ，p u c t a c d h a t ) w a s1 8 6g la f t e ri n d u c t i o n m e a n w h i l e ，t h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t s h o w e dt h ei n c r e a s eo f2 2 3 o f1 ，3 - p r o p a n e d i o ly i e l db yec o l ij m10 9 ( p e t a c d h a b t a c y q h d p u c - t a c d h a t ) w a so b t a i n e dc o m p a r e dw i t hec o l ij m l0 9 ( p e t a c d h a b m c - y q h d ) t h eo r t h o g o n a ld e s i g nm e t h o d w a st h e na p p l i e dt of u r t h e ro p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o no ft h er e c o m b i n a n ts t r a i n am a t h e m a t i c a lm o d e lw a st h e nd e v e l o p e dt os h o wt h e e f f e c to fe a c hm e d i u mc o m p o s i t i o n sa n dt l l e i ri n t e r a c t i o n so nt h ep r o d u c t i o no fl ， 3 - p r o p a n e d i o lb yr e c o m b i n a n ts t r a i nec o l ij m 10 9 t h em o d e le s t i m a t e dt h a t ，am a x i m a l y i e l do fl ，3 - p r o p a n e d i o lc o u l db eo b t a i n e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o n so fg l y c e r o l ，v i t a m i nb 1 2 ， k h 2 p 0 4 ，m g 十a n dy e a s te x t r a c tw e r es e ta t2 0g l ，o 01g l ，7 5g l ，o 6 7g la n d5g l ， r e s p e c t i v e l y t h ey i e l du n d e rt h eo p t i m a lp a r a m e t e r sa n dp r o c e s sc a nr e a c h2 2 5e g l k e yw o r d s ：1 ，3 - p d ；g l y c e r o l ；r e c o m b i n a n t ；e s c h e r i c h i ac o l i ；kp n e u m o n i a e ；g l y c e r o l d e h y d r a t a s e ；1 ，3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s ei s o e n z y m e ；1 ，3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s e ； c o t r a n s f o r n l a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是举人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：主丝亟 日 瓤： ) 8 8 。6 。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：弓铯破 导师签名：立丝 导师签名：咳衫住 日 期： 。口孑名易 五= ：!： 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 牛物炼制技术( b i o r e f i n e r yt e c h n o l o g y ) 或白色生物技术( w h i t e b i o t e c h n o l o g y ) ，近几年 受石油价格不断攀升的影响而越发受到人们的关注【l 】。2 0 0 6 年原油价格由4 0 美元桶上 升至7 0 余美元桶。2 0 0 7 年继续攀升，最高纪录接近1 0 0 美元桶( 9 8 6 1 美元桶) 【】。以甘 油为原料生产高附加值产品1 ，3 丙二醇越来越受到人们的关注。 1 ，3 一丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其丰要功能是作为合成聚 酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。由于从自然界中筛选的微牛物厌氧发酵甘油生产l ，3 丙二 醇还存在产物浓度低、生产周期长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业 生产。因此，利用基因工程技术构建高产菌株备受国内外研究者青睐，被认为是今后的 发展方向。 1 21 ，3 一丙二醇的性质及应用领域 物理性质：1 ，3 丙二醇( 1 ，3 - p r o p a n e d i o l ，l ，3 - p d ) 是一种无色无味透明的液体，易 溶于水、乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3 j ，相对密度为1 0 5 3g c m 3 ，熔点2 7 ， 沸点2 1 1 ，自燃温度为4 0 0 。 化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯。1 。3 一丙 二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。 1 ，3 丙二醇是一种重要的化工原料。其主要用途有： 1 ) 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料；也 广泛应用于食品、化妆品和制药等行业1 4 j 。 2 ) 1 ，3 丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯p t t 的原料”】。p t t 纤维克服了p e t 纤 维的刚性和p b t 纤维的柔性，兼具聚酯和聚酰胺纤维的优点，特别是它优异的回弹性 和易染性，从而引起纤维材料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品，用于生产 薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料，国外已把它列为2 l 世纪的新型纤维之 一【6 】。 1 31 ，3 丙二醇的生产及市场情况 受l ，3 丙二醇产量有限的影响，长期以来它的售价一直偏高，1 9 9 1 年其价格为每公 斤3 6 美元，是7 , - - 醇、1 ，2 一丙二醇、l ，4 丁二醇、2 ，3 一丁二醇等其他二醇的十几倍以致 几十倍。到1 9 9 5 年，s h e l l 公司首先实现了p t t 的商品化并在g e i s m a r 建有一套年产4 0 0 0 吨1 ，3 一丙二醇的工业装置，另外d e g u s s a 公司也是世界上生产p t t 和1 ，3 丙二醇的大 公司，具有年产5 万吨1 ，3 丙二醇的能力。随着产量的大幅度增加，其价格降为每公斤 江南大学硕士学位论文 3 - 5 美元。 1 ，3 丙二醇的市场目前主要由d e g u s s a 公司、d u p o n t 公司和s h e l l 公司垄断，但 均以化学合成法牛产1 ，3 丙二醇i ”，我国的1 ，3 丙二醇产量非常少，2 0 0 2 年以前仪有少 数几家化学试剂厂( 如北京化工厂，上海试剂一厂等) 用缩水甘油酸乙酯经氢化铝、锂 还原制得试剂产品。由于p t t 广阔良好的应用前景，国内有越来越多的企业加入到了 1 ，3 丙二醇的大规模工业化生产的开发队伍中来，但大部分工业用1 ，3 丙二醇仍需从国 外进口i s 。 1 41 ，3 丙二醇的生产方法 由于1 ，3 - p d 价格昂贵阻碍了p t t 的发展，因此1 ，3 - p d 工业化牛产是p t t 生产的 关键。目前，1 ，3 一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法。工业上主要采用化 学法合成1 ，3 丙二醇 9 , 1 0 , 1 1 j ，包括丙烯醛水合法、环氧乙烷法、环氧丙烷法等，其中德国 d e g u s s a 公司的丙烯醛水合法、s h e l l 公司的环氧乙烷法已投入工业法牛产。化学合成 法具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化剂、污染环境等缺点，因此，各国都 致力于开发生物发酵法生产1 ，3 丙二醇的技术。 1 5 微生物发酵法生产1 ，3 丙二醇的研究进展 1 5 1 生产茵种 自1 8 8 1 年f r e n n d 发现巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ) 能发酵甘油产生1 ，3 丙二醇以来，至今所发现的1 ，3 一丙二醇牛产菌均为细菌，主要有肺炎克雷伯杆菌 ( k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ) 、弗氏柠檬菌( c i t r o b a c t e r f r e u d i i ) 、成团肠杆菌( e n t e r o b a c t e r a g g l o m e r a n s ) 、短乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb r e v i s ) 、布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u c h n e n ) 、 丁酸梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 和巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ) 等【1 2 1 3 , 1 4 ，它们只能利用甘油而不能由糖类等廉价碳源直接产生1 ，3 一丙二醇。虽然五 p n e u m o n i a e 和c f r e u n d i i 是1 ，3 丙二醇较好的生产菌种，具有较高的底物转化率和生产强 度，但由于它们可能产牛的致病性，在培养过程中要有安全防护措施 i5 1 ，故在实际应用 中受到一定限制。 1 5 21 ，3 丙二醇生物合成途径 l ，3 一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物，并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而 来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中 产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的a t p ，在某些产物形成的同时释 放还原力n a d h ；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1 ，3 一丙二醇【1 6 】。以 甘油为底物转化生产1 ，3 丙二醇的生物合成途径见图1 1 【1 7 】。 2 第一章绪论 l ，3 一丙 述原酶 1 ，3 - 丙二醇磷酸一2 一羟基丙酮 图l - lkp n e u m o n i a e 厌氧条件下甘油的代谢途径 f i g 1 - 1t h em a i nm e t a b o l i s mp a t h w a yo fg l y c e r o li nkp n e u m o n i a e 氧化途径主要包括以下步骤l l 驯： ( 1 ) 甘油经甘油脱氢酶( g d h ) 催化生成2 羟基丙酮( d h a ) ，此酶为厌氧酶，以 n a d 十为辅酶； ( 2 ) 2 羟基丙酮在a t p 及2 羟基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羟丙酮( d h a p ) ； ( 3 ) 磷酸二羟丙酮代谢生成丙酮酸，然后进一步代谢生成乙酸、乙醇、乳酸等代谢 副产物。氧化途径生成生物能量a t p 和还原力n a d h ，并伴随有微牛物细胞的牛长。 还原途径主要有两步酶反应： ( 1 ) 甘油脱水酶( g d h t ) 在辅酶b 1 2 存在下将甘油转化为中间产物3 羟基丙醛 ( 3 h p a ) ： ( 2 ) 在n a d h 存在下，3 羟基丙醛在1 ，3 一丙二醇氧化还原酶( p d o r ) 催化下牛成 1 ，3 一丙二醇。还原途径消耗氧化途径生成的过量n a d h ，使微生物细胞内的还原物质达 到平衡。 1 5 2 11 ，3 丙二醇牛物合成途径中的关键酶 1 5 2 1 1 甘油脱水酶的结构及性质 人们对多种微牛物中甘油脱水酶的性质进行研究发现，其中甘油脱水酶分子量相差 不大，但其来源不同，酶的活力、最适p h 及最适温度各不相同。金属离子及其络合物 对甘油脱水酶活性有一定影响。 甘油代谢过程中甘油脱水酶，需要维生素b 1 2 作为辅酶，在甘油存在下发生自杀失 活( s u i c i d ei n a c t i v a t i o n ) ，维生素b 1 2 的c o c 键不可逆断裂，形成5 脱氧腺苷和烷基 钴胺素类似物，被修饰的辅酶和甘油脱水酶紧密结合，使酶失去活性。在再激活蛋白、 a t p 、m n 2 + 或m 9 2 + 存在下，被修饰的辅酶能够被完整的辅酶替代，使甘油脱水酶能够 重新被激活f 晒l 。 1 5 2 1 21 ，3 一丙二醇氧化还原酶 1 ，3 丙二醇氧化还原酶( 1 ，3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s e ，p d o r ，e c l 1 1 2 0 2 ) ，又 称l ，3 一丙二醇脱氢酶( 1 ，3 - p r o p a n e d i o ld e h y d r o g e n a s e ) ，是微生物中特有的一种酶。由 于1 ，3 一丙二醇氧化还原酶活性测定及结构分析较为困难，近年来才逐渐对其有比较深入 的了解。此酶对底物甘油和辅酶n a d + 都非常专一，其活性可被二价阳离子的鳌合物强 3 江南大学硕_ 上学位论文 烈抑制，f e 2 + 、m n 2 + 可使其活性恢复。 1 5 2 2 代谢中间产物3 - h p a 对菌体生长及产物牛成的影响 3 - h p a ( 3 羟基丙醛) 是还原途径中的唯一中间产物，经研究表明，3 - h p a 能抑制 菌体生长和甘油代谢，主要是因为3 一h p a 影响甘油脱水酶的活性。对ea g g l o m e r a n s 的 研究发现i l 州，当3 h p a 的累积浓度到3 0 m m 时，甘油消耗、菌体生长停止，这主要是 因为随着甘油的代谢，n a d + 浓度增大，抑制了1 ，3 一丙二醇氧化还原酶的活性，引起3 h p a 积累。 1 5 3 基因工程研究 产1 ，3 丙二醇基因工程菌的构建策略丰要有五条途径( 见图1 2 ) 2 0 - 2 3 】： ( 1 ) 通过基因工程方法强化还原途径中限速酶( 甘油脱水酶的表达) ，以及阻断副产 物代谢途径。目前己成功分离到编码激活因子的基因。 ( 2 ) 将1 ，3 丙二醇生产菌的d h a b 、d h a t 基因克隆到甘油生产菌中，从而获得能将 葡萄糖转化为1 ，3 一丙二醇的基因工程菌。 ( 3 ) 将甘油牛产菌的d a r l 、基因克隆到l ，3 丙二醇产生菌中，从而获得能 将葡萄糖转化为1 ，3 丙二醇的基因工程菌。 ( 4 ) 将l ，3 一丙二醇产牛菌的d h a 基因克隆到大肠杆菌中，获得能转化甘油为1 ，3 丙二醇的基因工程菌。 ( 5 ) 将1 ，3 一丙二醇的d h a b 、d h a t 基因和甘油牛产菌的d a r l 、基因克隆到 大肠杆菌中，从而获得能将葡萄糖转化为1 ，3 丙二醇的基因工程菌。 0 图1 - 2 基因工程菌的构建策略 f i g 1 2c o n s t r u c t i o ns t r a t e g yo fr e c o m b i n a n ts t l - a l i l 1 5 。4 国内外微生物法合成l ，3 丙二醇研究现状 微生物法生产l ，3 一丙二醇主要有两条途径：一条途径是以德国h e n k e l 公司为代表 的技术路线，利用肠道细菌在厌氧条件下直接将甘油歧化为1 ，3 一丙二醇2 4 1 ；另一条途径 是以美国d u p o n t 公司【1 6 2 5 1 1 5 2 6 7 1 和g e n e r c o r 公司为代表的技术路线，利用基因工程菌 首先将葡萄糖转化为甘油，然后再转化为1 ，3 丙二醇 2 8 l 。 1 ) 葡萄糖牛物转化生产1 ，3 - p d 4 第章绪论 从自然界分离获得的菌种只能以甘油为碳源，无法直接利用葡萄糖生产l ，3 一p d 以 降低微生物发酵法的成本。为此，d u p o n t 公司和基因克( g e n e c o r ) 公司江叫利用基因工程 技术，在大肠杆菌中插入取自酿酒酵母的基因，从而将葡萄糖转化为甘油，再插入取自 柠檬酸杆菌和克雷氏菌的基因，将甘油转化为1 ，3 - p d ，开发了由葡萄糖一步法生产l ，3 p d 的发酵技术，使生产效率提高了近5 0 0 倍，有效地提高了l ，3 - p d 的产率。d u p o n t 公 司和英国t a t e & l y l e 公司合作【3 们，于2 0 0 0 年在一套规模为4 5 4 吨年的中试装置上对 该技术进行了验证并获得成功。该技术的关键是使用了转基因的微生物，并通过2 种微 生物结合制得一种酶，利用这种酶可实现高速发酵。化学系统公司将该生物技术与其他 几种生产1 ，3 - p d 的化学工艺路线迸行了比较，结果表明，杜邦公司的以葡萄糖为原料 的微生物发酵工艺路线相对于以丙烯醛为原料的老工艺路线有明显的优势，与壳牌公司 的环氧乙烷工艺路线竞争也有很大的发展潜力。 2 ) 甘油生物转化生产1 ，3 - p d 以甘油为原料的微生物发酵生产1 ，3 - p d 工艺是基于自然界存在克雷伯氏杆菌和丁 酸梭状芽孢杆菌，而它们具有在厌氧条件下使甘油转化成l ，3 - p d 的能力。由于菌体生 长和氧化代谢支路都要消耗部分甘油，使得甘油转化为1 ，3 - p d 的摩尔转化率最高只能 达n o 5 左右。欧共体国家针对甘油过剩现状，积极开展甘油生物转化1 ，3 - p d t 2 7 j 。虽 然牛物柴油的快速发展提供了大量廉价的副产物甘油，但由于发酵液中1 ，3 - p d 含量最 高只有5 左右，且为了得到纯度为9 9 ，9 的l ，3 - p d 产品，需要采取相当复杂的精制工 艺，在生产成本上还难以与化学合成法相竞争。 3 ) 美国杜邦公司在g e n e n c o r 工业酵母素公司协助下p ，以用d n a 的办法生产出一系列 的微生物和酵母素，以谷物糖浆为原料生产出l ，3 - p d ，实验室规模试生产，产出率很好， 现在该公司正准备进行牛产试验。 4 1 混合菌发酵 采用混合菌发酵，由甘油产生菌将葡萄糖转化为甘油，再由1 ，3 丙二醇产生菌将甘 油转化为l ，3 丙二醇，实现葡萄糖到甘油的直接转化。h a g n i e 等人1 3 引采用s c e r v i s i a e 和cf r e u n d i i 或kp n e u m o n i a e 混合菌发酵，1 ，3 - p d 的浓度为4 7 8 l 。由于两个菌的培 养条件的差异，为优化控制带来一定的困难，相关研究仍需进一步深入。 5 ) 双底物发酵 采用甘油和葡萄糖双底物发酵，可提高甘油转化率，降低原料成本。h b i e b l 3 3 对 cb u t y r i c u m 和cf r e u n d i i 的双底物发酵进行了研究。由葡萄糖作为碳源供菌体生长及 必要的维持代谢，甘油作为转化1 ，3 - p d 的原料，甘油转化率达到9 0 。由于葡萄糖效 应的影响，只能在较低浓度下流加葡萄糖，虽然转化率提高了，但限制了最终产物浓度 的提高。 国内生物法生产l ，3 丙二醇的研究起步较晚，主要是利用足p n e u m o n i a e 厌氧条件 下将甘油转化为l ，3 丙二醇，研究重点多集中于菌种筛选和发酵工艺优化方面，目前主 要研究单位有清华大学、大连理工大学等。清华大学刘德华教授以葡萄糖或粗淀粉，如 木薯粉为原料，采用双菌种两步发酵法生产1 ，3 一丙二醇，该技术路线避开了甘油原料成 5 江南大学硕土学位论文 本价格较高的问题，从而使发酵生产1 ，3 丙二醇在经济性上成为可能。在l ，3 丙二醇后 提取的过程中，针对1 ，3 丙二醇发酵过程副产较大量的有机酸( 盐) 的特点，采用了电渗 析脱盐技术，并通过絮凝、浓缩和精馏等工序，制得的1 ，3 一丙二醇产品纯度达到9 9 9 2 ， 收率达8 0 以上。该技术己在5 0 0 0 升发酵罐上通过中试p 引。该中试产品在仪征化纤、 辽阳石化公司等单位试用，与国外进口的1 ，3 - p d 进行聚合生产p t t 的对比试验结果 表明，清华大学生物法1 ，3 一丙二醇中试产品聚合得到的p t t 的特性粘度、色泽等关键 技术指标超过了进口产品，可以满足聚酯合成和纺丝等技术的需要。 大连理工大学生物化工研究所研究开发甘油转化生产1 ，3 - p d 的技术，已经取得进 展。提出以玉米为原料，经发酵两步生产1 ，3 - p d 的新工艺，即首先将玉米淀粉变糖化 液，经氧发酵生成甘油，然后经过厌氧发酵n 1 ，3 - p d 。 清华大学与华东理工大学对以克雷伯氏菌和葡萄糖作为辅助底物发酵生产1 ，3 - p d 进行了研究，在甘油为底物的发酵中，通过掺加葡萄糖作为辅助底物可以提高1 ，3 - p d 转 化率，同时缩短发酵时间，通过选择合适的葡萄糖加入速率，其转化率最高可以达到 6 4 9 【3 5 】。 微生物转化法生产1 ，3 一丙二醇目前尚处于实验室以及中试研究阶段，部分研究机构 己完成中试，即将进行工业化牛产。微生物转化法生产l ，3 丙二醇是以生物技术为特征 的“绿色工业”，向传统石油化工提出了强有力的挑战，具有重要意义。 1 6 展望 尽管p t t 具有如此多的优点，而且早在19 4 1 年研究p e t 树脂时就已成功地在实验 室合成了p t t 。但直至2 0 世纪9 0 年代p t t 才实现规模化工业生产，究其根本原因就 是制备p t t 的主要原料l ，3 丙二醇单体低成本规模化工业生产比较困难，2 0 世纪9 0 年 代，国际上几家大公司相继在1 ，3 一丙二醇合成新工艺上取得突破，使得p t t 这一优良 材料走进人们的日常生活成为可能。 当前p t t 的工业开发和应用发展很快，但1 ，3 一丙二醇仍然是限制p t t 工业化的主 要因素，因此1 ，3 一丙二醇的牛产已引起众多大跨国化工公司的高度重视，可以预见1 ，3 丙二醇的生产将成为本世纪各大企业竞争的新热点之一。微生物发酵法较化学合成法具 有显著的优点，必将取代化学合成法，但要实现工业化，尚须进一步改进发酵工艺和提 取技术以降低生产成本，以便在与化学合成法的竞争中取得更大的优势。利用p t t 制成 的新的合成纤维材料和工程塑料，应用前景非常广阔。据s h e l l 公司预测，到2 0 1 0 年， 包括非纤维应用在内的全球p t t 需求量将达到每年1 0 0 万吨f 捌。 1 7 立题意义和本论文的研究内容 1 7 1 立题意义 我国作为纺织大国对l ，3 一丙二醇的需求量日益增加，但目前工业生产1 ，3 一丙二醇都 是通过化学合成法，化学合成法反应条件要求苛刻，设备要求高，带来环境污染等诸多 6 第章绪论 不利因素；就目前来看，在经济上与化学法相比还不占优势。研究适合工业化生产的微 生物转化法已迫在眉睫。 国外主要是d u p o n t 公司以及g e n e n e o r 公司研究微生物转化法合成1 ，3 丙二醇，文 献报道在严格厌氧条件下发酵水平可达7 0 - - 一8 0g l 。虽然尼p n e u m o n i a e 和cf r e u n d i i 是转化1 ，3 丙二醇较好的菌种，但由于它们作为肠道菌可能的致病性，故在实际应用上 受到一定的制约。 随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术对菌种进行改造越来越受到人们的青 睐。因此构建新型基因工程菌成为降低发酵成本实现微生物法工业化的重要手段。 1 ，3 丙二醇( 1 ，3 - p d )