（发酵工程专业论文）冰核活性细菌xampelina+ts206的固定化技术及其在冷冻浓缩领域的应用研究.pdf

中文摘要 中文摘要 本研究以冰核活性细菌x a n t h o m o n a sa m p e l i n a t s 2 0 6 为实验菌种( 以下简称2 0 6 ) ，主 要做了以下几方面研究工作：( 1 ) 筛选出了适合2 0 6 进行大量生长和高水平表达冰核活 性蛋白的培养基，比较了一些物质对冰核活性和生物量的提高产生显著影响程度，发现 鱼蛋白胨和乳糖的浓度对冰核活性的提高产生显著影响程度，玉米浆影响程度较小，生 物量影响程度大小的顺序依次为鱼蛋白胨 乳糖 甘油 玉米浆，其较优的发酵温度为 18 ，发酵时问为4 8 h 。( 2 ) 采用共同定化和海藻酸盐直接固定化两种方法，建立了2 0 6 的包埋技术。结果表明包埋量对冰核活性有较大影响，利用海藻酸盐固定化冰核活性较 高，但渗漏量较大；利用共固定化冰核活性较低，但渗漏量很低两种固定化方法的凝胶 珠添加量与综合评分相关不大；海藻酸盐固定化综合评分与固化时间正相关，共固定化 综合评分与固化时间略呈负相关。( 3 ) 进行了苹果汁的冷冻浓缩实验，发现通过添加固 定化的冰核活性细菌并进行搅拌可以获得较优结果，另外2 0 6 具有优化溶质在液相和冰 相分配的性质。 关键词：冰核活性细菌培养慕优化固定化海藻酸盐聚乙烯醇冷冻浓缩 a b s t r a c t a b s t r a c t i n ab a c t e r i ax a n t h o m o n a sa m p e l i n a t s 2 0 6w a su s e d i nt h i sr e s e a r c h t h em a i n r e s e a r c h e sf o c u so nt h r e e f i e l d s ：( 1 ) t h e f e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r s o n i m p r o v i n g i c e n u c l e a t i o n a c t i v i t y a n dt h eb i o m a s so fi c en u c l e a t i o n a c t i v e b a c t e r i a ( x a n t h o m o n a s a m p e l m a t s 2 0 6 ) w a ss t u d i e d t h ep u r p o s ei st od e d u c et h eb e s ti n g r e d i e n to ft h ec u l t u r e m e d i u ma n dt h eb e s tt e m p e r a t u r et h er e s u l t ss h o wt h a tf i s h - p e p t o n ea n dl a c t o s ea f f e c ti c e n u c l e a t i o n a c t i v i t y al o tw h e r e a sc o r n s t e e pl i q u o rh a s l i t t l ee f f e c to ni tt h eo r d e ro f i m p o r t a n c et ot h ee f f e c to n b i o m a s so fm i c r o b es h o u l db ef i s h p e p t o n e l a c t o s e g l y c e r o l c o r ns t e e pl i q u o r t h eb e s tf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ei sl8 a n dt h eb e s tt i m eo fc u l t u r ei s 4 8h ( 2 ) b o t hc o i m m o b i l i z a t i o na n da l g i n a t eg e lw e r eu s e df o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fi c e n u c l e a t i o n a c t i v e b a c t e f i a ( x a n t h o m o n c t ，a m p e l i n a t s 2 0 6 ) t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e q u a n t 时o fe m b e d d i n ga f f e c t st h ei c en u c l e a t i o na c t i v i t yg r e a t l y ac o n c l u s i o nc a nb ed r a w t h a th i g hi c en u c l e a t i o na c t i v i t yc a ng o ti na l g i n a t eg e lb u tt h ea n t i - l e a k i n gc a p a b i l i t ya p p e a r s w e a k e r , w h e r e a st h ea n t i l e a k i n gc a p a b i l i t yi sb e t t e ra n dt h ei c en u c l e a t i o na c t i v i t ya p p e a r s l o w e ri nc o i m m o b i l i z a t i o n c o m p r e h e n s i v es c o r eh a sl i t t l e c o r r e l a t i o nw i t ht h en u m b e ro f b e a d si nt h et w oi m m o b i l i z a t i o nw a y s ，w h e r e a si ti n c r e a s e sw i t ht h et i m eo fi m m o b i l i z a t i o n i n a l g i n a t eg e l a n ds h o w sl i t t l e p e r t i n e n c y w i t ht h et i m eo fi m m o b i l i z a t i o ni n c o i m m o b i l i z a t i o n ( 3 ) t h ee x p e r i m e n t s o nf r e e z i n gc o n c e n t r a t i o no f a p p l ej u i c e l e a d e dt ot h e c o n c l u s i o nt h a tab e t t e rr e s u l tc a nb ed r e wb ya d d i n gi m m o b i l i z e di n a b a c t e r i aa n ds t i r r i n g i na d d i t i o n ，t h i ss t r a i nh a st h ec h a r a c t e ro fo p t i m i z i n gt h ed i s t r i b u t i o no fs o l u t eb e t w e e n l i q u i da n d i c e k e yw o r d s ：i c e - n u c l e a t i o na c t i v e ( i n a ) b a c t e r i a 、o p t i m i z a t i o no fb a c t e r i ac u l t u r e ， a l g a eg e l ，p v a ，f r e e z i n gc o n c e n t r a t i o n 第一章前言 第一章前言 一、该研究的背景 ( 一) 冰核活性细菌和冰核活性蛋白的研究 1 冰核活性细菌简介 冰核活性细菌( i c en u c l e a t i o na c t i v eb a c t e r i a ，简称i n a 细菌) 厂泛附生于植物表面 ( 尤其是叶表面) ，它是一类在2 - 5 条件下催化诱发植物体内水分产生冰核而引起 霜冻的细菌。1 9 7 4 年l r m a k i 等【1 1 首先发现p s e u d o m o n a ss y r i n g a e ( 丁香假单胞菌) 可 在过冷水( 低于o 时仍呈液态的水) 中诱导催化形成冰晶，其后sel i n d o w l 2 和h k k i m 等l3 】分别又发现了e r w m i a ( 欧文氏菌) 和x a n t h o m o n a s ( 黄单胞菌) 两属中的一些种也 具有这种生冰核活性。所有这些冰核细菌均是革兰氏阴性细菌，并且是植物致病菌。正 常情况下( 由于植物细胞水具有过冷却作用) 植物即使在7 8 的低温下也不结冰， 不会产生霜冻，但当冰核活性细菌存在时，它们作为最强的异质冰核因子，造成冰晶的 生长而使植物组织结构遭到破坏，提高了过冷却温度，进而引起对宿主植物叶表面细胞 的冻伤损害。i n a 细菌的种类和数量受地理纬度、气候条件、植物种类及不同季节的影 响和制约而有明显差异。我国幅源辽阔，基本涵盖冰核细菌的种类。目前在我国发现的 冰核细菌共有3 个属和1 7 个种或变种h i ，其中尸m a r g i n l i s , p s e u d o m o n a s5 p ( 非荧光菌) 户 s y r i n g a ep v s ，eh e r b i c o l ap v s ，ea m y l o v o l ap v s ，x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v c e r e a l i s 这六 个种为国内外首次记录具有冰核活性的细菌，而et 2 t l a n a s ( 菠萝欧文氏菌) 和ps y r i n g a e 为我国优势种类，其中p5 y r i n g a e 具有较高的冰核活性，并且是华北地区霜冻损害的主要 致病冰核细菌。 2 冰核活性蛋白的分类和性质 1 9 8 1 年y a n k o f s k y l 5 1 等将冰核细菌产生的冰核蛋白物质分为三种类型：一型冰核 ( t y p e i ) ，在2 c 以下有冰核活性，这种类型的冰核活性是最强的；二型冰核( t y p e l i ) ， 在一5 c 以下有冰核活性，它的冰核活性要弱于一型冰核；三型冰核( t y p e l i i ) ，在一7 以 下有活性，冰核活性是最弱的。1 9 9 0 年t u r n e d 6 1 更精确的划分了三种冰核的活性温度范 围，分别是4 4 以上；一4 8 57 。c 年d 一7 6 以下。在国外的研究中1 1 2 1 还采用了两个重要 的参数来表示冰核活性的大小，即成核温度与产冰核频率。成核温度( n u c l e a t i o n t e m p e r a t u r e ) ，是指相同浓度的冰核活性细菌在指定的时间内可以产生冰核的最高温度。 第一章前言 指定时间一般为2 分钟，临界温度越高冰核活性就越强。产冰核频率( f r e q u e n c y ) ，即在 一定温度下一个细胞表达的冰核活性蛋白形成冰核的机率。例如：一5 时每滴菌悬液l o ul 中含有1 07 个细胞刚好可以形成一个冻滴，而过少的细胞则不能形成冻滴，那么在 此温度下该菌的产冰核频率为1 0 ，产冰核频率越高它的冰核活性就越高。l i n d c ) w 州关 于冰核活性的公式为： 一 n ( t ) = ( - - l n f ) v 式中：n ( t ) 是在温度t 下的产冰核频率，p 采冻滴的百分比，v ：液滴的体积。 冰核活性蛋白的浓度可以由冰核活性细菌的浓度来代替，这样就可以通过测定临界 温度和产冰核频率来表征一个i n a 细菌的冰核活性大小，同时从某种程度上就建立了一 个量化标准。 喜 器 量 a b c 一a t u r e n u c l e a t i o nt e m p , , n a t u t e ： abl i m e 为冰点温度，b 为最低过冷点温度，c 为环境温度，一b 为冷冻时阍 图1 。1 水的过冷现象 f i g 1 1s u p e r c o o l i n go f w a t e r 冰核活性蛋白是一种膜结合蛋白，属于条件胁迫蛋白。一般涉及四种表达形式：冰 核活性蛋白分布在天然冰核细菌的外膜上( 如pa y r i n g a e 丁香假单胞菌) ；以无细胞冰核 ( c e l l f r e ei c en u c l e i ，c f n ) 的形式自发分泌到培养基中( 如eh e r b i c o l a 草生欧文氏菌， 但它产生的冰核蛋白主要分布在矫膜上) 1 7 ；i n a z 基因经克隆后，在大肠杆菌表达有的 结合在内膜上；有的则以包含体的形式存在。k a j a v a 和l i n d o w l 7 1 从全新的角度推测了 i n p s 的三维结构如图1 2 所示，t 他们提出1 n p s 的二级结构是由b 链构成的类似于冰晶的 2 第一章前言 结构，反向平行的b 链通过彼此的侧链结合在起，形成类似棱柱的三维结构，而i n p s 的n 和c 末端结构域是球形的，被中心高度重复的冰品状结构连接起来。此外i 4 p s 的 中心高度重复区域由于缺少非极性氨基酸残基，不能形成疏水中心，这样i n p s 在溶液中 也可能没有固定的三维结构。所以有关1 n p $ 的三维结构目前也只是推测，要真正弄清楚 其实际的结构形态还需做进一步的研究工作。 图1 2 冰核活性蛋白三维结构模型图 f i g 1 2a s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o nt h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r a lm o d e lo fi n p s 根据l9 9 1 年t u r n e r 和k o z l l o f f 的研究报导1 8 1 ，冰核活性细菌表达的强冰核活性物质， 仅仅靠细菌的冰核活性蛋白成分是不够的。实验发现了磷脂酰肌醇、磷脂为冰核蛋白复 合物的主要成分，而且是必要成分。到9 0 年代，i n a 基因的克隆工作有了一定的进展， 实现了以包含体形式的ea n a t l o si n 1 0 的i n a a 基罔在ec o l i 中大量表达，并经2 t r i t o n x 一1 0 0 抽提四次，以不溶性沉淀的形式得以纯化，分子量为1 3 0 k d a ，在5 c 以上保持冰 核活性i ”，甚至在脂类等膜组分缺乏时还有冰核活性，但活性与天然蛋白差的多。而p s y r # t g a e $ 2 0 3 的i n a z 基因在c o l i 中大量表达的冰核活性蛋白，只有在1 3 2 才有冰核 活性。基因工程的实验结果显示，以包台体的形式获取的冰核活性物质，其冰核活性得 到了较好地保留。陈庆森等人l ”1 采用差速离心法分离出有活性的冰核活性蛋白组分，经 过s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，冰核活性蛋白是以一种高保真的4 8 肽的单体形 式装配而成的多聚体，这一结果与w a t a b e 和a r a i l t 9 1 所获得的结果是一致的。既然冰核 活性蛋白是一种膜蛋白，那么它是怎么结合到膜上，叹是怎样与水分子作用的，长期以 来科学家不断对此问题进行研究探讨。根据k a j a v a 、和l i n d o w 提出的i n p s 结构模型【1 “， 冰核活性蛋白很可能是通过高度重复的4 8 肽残基单位相互衔接，形成扁平聚合物排列在 第一章前言 细胞膜的表面，i n p s 的结构与冰晶分子结构很相似，很可能就是这种特性在i n p $ 发挥成 冰核活性上起着决定性的作用，冰核活性蛋白与水分子结合后迅速使得水分子三维结构 发生变化形成冰晶，而n 一和c 末端则可能是蛋白与膜及蛋白间结合的关键因素。有关蛋 白是如何结合到膜上以及它与水分子作用的过程目前尚不清楚。 3 冰核活性蛋白的诱导表达 h i r a n o 【l2 | 研究表明，利用相同的条件培养不同的p s e u d o m o n a s v - i n g a u 菌株所得到 的发酵结果是不一样的。m i c h e l e i ”1 研究报道：在培养基中某些营养因子的缺乏可以诱 导冰核活性细菌表达较高的冰核活性，对于p s e u d o 埘o n a ss y r i n g a e y l 的培养条件研究发 现；山梨醇是最佳的c 源，在c 源缺乏，c 源和p 源，c 源和n 源，尤其是c 源、n 源和 p 源的联合缺乏的条件下并不能诱导冰核活性细菌表达出高活性的蛋白。培养基中的n 源和一些微量元素是冰核活性细菌生长所必需的i “1 。1 9 9 2 年，l a w l e s s 1 5 1 通过化学计算 限制培养基中n 源的含量，利用液体培养基培养p s e u d o m o n a ss y l i n g a e 获得了较高的冰 核活性，并申请了专利。中国林业科学研究院晁龙军i m 】等人研究发现，如果用化学合成 的培养基培养冰核活性细菌，通过化学计算限定培养基中n 源的用量，可以在一5 获得 最大量的冰核活性蛋白，但是无机氮没有有机氮利于丁香假单胞菌( p s e u d o m o n a s s v r i n g a e ) 生长。所以冰核活性细菌发酵必须解决生物量和生物活性之间的矛盾，以便 可以在高产量的条件下使细菌保持较高的冰核活性。除了培养基中的c 源、n 源、p 源的 含量可以影响冰核活性细菌的发酵情况，还有许多的因素也可以影响冰核活性细菌的发 酵情况。w a t a n a b e 等1 1 7 i 研究报道：用热水抽提的方法从菜籽中得到一种物质，经鉴定是 4 一羟基一3 一硝基苯乙酸。如果用微量的这种物质加到黄单胞菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s i n x c 1 ) 的培养基中则会大大的提高细菌的冰核活性。w a t a n a b e 等1 ”i 研究还发现，在 培养黄单胞菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i si n x c 1 ) 的时候在培养基中加入适量的乳酸可 以有效的抑制黄单胞菌在发酵过程中产生黄原胶，从而在不影响细菌冰核活性的前提f 提高细菌发酵所得的生物量。l i n d o w l l 9 1 总结报道：用玻璃器皿来培养冰核活性细菌可以 提高冰核活性细菌中有活性的细菌所占的比例，也可以提高冰核活性细菌作用的温度。 p o o l e y 和b r o w n l 2 0 1 两个人均研究报道过，用固体培养基培养冰核活性细菌比用液体培养 基培养所测得的冰核活性要高，用化学限制培养基培养p s e u d o m o n a ss y r f n g a e ，在培养到 对数期的中后期时可以获得较高的冰核活性。1 9 9 2 年，美国已经成功的利用了变温的技 术实现了冰核细菌的发酵生产，并申请了专利i ”l 。另外，在低温诱导冰核活性细菌表达 冰核活性的过程中，降温的快慢对于诱导所得冰核活性的大小也有很大的影响。m i c h e l e i l 3 4 第一章前言 研究发现，在3 2 * 0 下培养p s e u d o m o n a s ，y r i n g a e t l 至对数生长期，只得到三型冰核，将 其降温到1 8 c 对细菌的冰核活性进行诱导，如果在一小时内将温度降低到1 8 所获得的 冰核活性要比在四小时内降温至1 8 所获得的冰核活性高。当冰核活性细菌处在旺盛生 长阶段时，用低温诱导冰核活性细菌表达冰核活性所得的效果并不很好，只有当细菌处 在对数生长期的后期或稳定生长期前期对其进行低温诱导才可以获得令人满意的冰核活 性。张耀东等1 2 1 对3 种冰核活性细菌进行培养条件的研究发现，培养基的种类对菌体收 获量和成冰活性影响最为显著，培养基中含甘油或蔗糖组分能提高冰核活性。培养基的 组成进一步细分为c 、n 、p 、s 的营养水平，其中一定程度的磷饥饿可诱导冰核活性蛋 白的表达：其次是培养温度，一般培养温度约为1 8 2 5 ，在7 一2 范围内测定 冰核活性，测定温度越低成冰核能力越强1 2 2 。本实验室研究证实了e r w i n i ah e r b i c o l a 菌 株经3 2 培养后再转至1 5 培养数小时可诱导一型冰核活性蛋白的大量产生，另外研究 发现并证实了在单温培养和双温培养中，低温均是1 n a 细菌产生应激反应的必要条件1 2 3 1 。 此外，一些外界条件也可以改变冰核活性细菌的冰核活性：适量的丝裂霉素c ( m i t e m y c i n c ) 、萘啶酮酸以及紫外线照射可促进r n a 细菌冰核活性蛋白的合成? ，但是过量的紫外 线照射可破坏细菌的冰核活性甚至完全杀死冰核活性细菌：陈庆森等人1 2 3 i 在研究抗菌素 对冰核活性细菌生长及表达冰核活性蛋白的影响中发现，一些抗菌素如氯霉素、土霉素 和链霉素，钴6 0 射线辐射等都能杀死菌体，但并不会完全破坏其冰核活性。 适于冰核细菌菌种保存的方法主要有真空冷冻干燥和灭菌水于2 09 c 冷冻保藏1 2 ，这 两种方法对冰核活性细菌的存活力和冰核活性的影响较小。保存温度越高对菌株的冰核 活性影响越大，如在3 70 | c 时保存2 4 h 的菌体，其冰核活性全部丧失。采用l i n d o w l f 2 5 1 改 进的v a l i 小液滴冻结法2 6 1 定量定性测定冰核活性细菌的冰核活性，若细菌浓度为5 x 1 0 2 5 1 0 8 个m ! ，影响它的冰核活性的主要因素有培养基的种类、培养湿度、菌体浓度及 菌种的保藏方法等几个因素。但如何诱导冰核细菌高水平表达冰榜活性蛋白，确定冰核 活性细菌表达此完整蛋白复合物的条件和生理环境，尚需做进一步的研究工作。 ( 二) 细胞固定化的研究及相应的生物反应器 凡是限制在一定的空间范围内并能连续使用的细胞都称为固定化细胞1 2 ”。固定化细 胞的研究和应用始于本世纪7 0 年代，随后得到了快速发展，这是由于其具有以下优点：( 1 ) 固定化细胞可以连续使用或重复使用。( 2 ) 在连续操作的培养过程中，可以采用高稀释率 而不会将细胞洗出。( 3 ) 在生扬反应器中维持高缅胞密度，从而提高产物的生产能力。( 4 ) 可以连续地从反应器中移去有毒代谢物或具有抑制作用的产物。( 5 ) 可p a 简化产物的提取 第一章前言 和纯化工作 2 8 , 2 9 i 。( 6 ) 与天然细胞相比，固定化细胞增加了对酸碱、熟等的稳定性。( 7 ) 细胞透性：在某些情况下固定化可以改善细胞透性22 1 。在固定化过程中，固定化细胞的 活力将受到载体性能，交联剂用量，载体与细胞的比例，以及温度，d h 值等因素的影响。 将细胞包裹于凝胶晶格或聚合物半透膜微胶囊中的方法称为包埋法。细胞被包埋后 应该不再扩散到周围介质中去而水却可以自由扩散。常用的晶格形包埋的载体有：海藻 酸盐、k 角叉菜、琼脂、三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等。各式各样的新型固定化介 质不断被开发出来，比如壳聚糖、k k s 、多孔玻璃、p v a 等，它们一般各有优缺点，应 用于不同条件，适于不同需要”1 。下面是一些简介： ( 1 )聚丙烯酰胺凝胶包埋法：使单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂存 在情况下聚合成聚丙烯酰胺，在聚合过程中预先将细胞悬液和单体溶液混匀，则聚合后 微生物细胞能被截留于凝胶的细微格子里1 3 。 ( 2 )琼脂凝胶包埋法：将细胞悬浮液和琼脂溶液混合，滴入比重为1 的甲苯一四氯乙 烯混合液中，制成琼脂球。此法的机械强度虽比聚丙烯酰胺凝胶差，但它无毒性，操作 也比较简便【3 0 】。 ( 3 )胶囊法：把菌悬液分散到含有表面活性剂、阴离子运转促进剂、膜强化剂中形成 乳化液，此时菌被一层液态膜所包围，构成了具有液态膜胶囊的固相细胞【”i ( 4 )海藻酸盐是d 一甘露糖醛酸和1 古罗糖醛酸通过1 ，4 键连接而成( 结构特征见图 1 3 ) 。它是一种嵌段共聚物，其有关嵌段分别为：甘露糖醛酸嵌段、古罗糖醛酸嵌段以及 甘露糖醛酸古罗糖醛酸嵌段。海藻酸盐包埋细胞的一般方法：先将海藻酸盐溶于水中， 使其具有一定的黏度，然后加入一定量的细胞菌体，并且充分搅拌，使其分散均匀。通 过注射器或毛细管将菌体悬浮液逐滴注入台有离子的溶液中，由于离子转移的胶凝作用， 海藻酸盐液滴便形成珠状的固定化颗粒。用海藻酸盐做固定化载体有两个缺点，其一是 在高浓度的电解质溶液中，固定化颗粒变得不稳定，其二是c a 2 + 等多价离子在磷酸缓冲 液中会沉淀，固定化颗粒的强度将降低，最后重新溶解【2 7 】。 海藻酸盐的结构特征为 一( m m ) 。一( g g ) 。一( m g ) 。 其中：m = d - 甘露糖醛酸；g = l - 古罗糖醛酸 图1 3 海藻酸盐的化学结构 f i g 1 3c h e m i c a l s t r u c t u r eo f a i g i n a t e ( 5 ) p v a - 海藻酸盐共固定化法：p v a ( 聚乙烯醇) 是一种新型的固定化细胞介质， 具有固定化温度低、强度高、化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点，但 6 第一。章前言 也具有与硬化剂反应速度慢、不易成球等缺点，而其与海藻酸盐进行共固定化基本可以 克服这些缺点。p v a 与硼酸的反应原理为： - - 一c 咚_ 中h ；l q 丑一产一；! + 牌一 6 ho n ( - - c h t 一, c h c h i c h ) 。 占占 、丑 i o h 图1 4p v a 与硼酸的反应原理 f i g1 4e l e m e n t so f t h er e a c t i o no f p v a a n d b o r i c a c i d ( 6 ) 固定蛋白粉法：将菌体细胞用有机溶剂处理制成活性蛋白粉后有利于增加其通透 性，提高操作性，然后再进行固定化，但同时可能造成冰核活性下降( 2 ”。 ( 7 )k 角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化舍物。在钾离子存在f ，它能立即 发生胶凝作用。由此形成的固定化颗粒能在磷酸缓冲液或其他电解质溶液中使用，但高 浓度的钠离子可以导致凝胶颗粒机械强度明显下降”】。 ( 8 壳聚糖的包埋方法：壳聚糖是一种具有广泛应用价值的新材料，其用途涉及众多 领域和部门。从虾蛄壳中提取壳聚糖作为载体，以一氯乙酸或三氯乙酸为交联剂进行包 埋f 3 2 j 。 ( 9 ) 多孔玻璃的包埋方法：这种方法具有介质强度高的优点。 ( 1 0 ) 复合包埋法：将两种或若干种载体进行复合包埋制备新型微胶囊，常见的有壳壤 糖+ 海藻酸钠复合微胶囊1 3 3 1 、p v a s b q 复合微胶囊等i ! 1 4 l ， 全细胞固定化虽较固定化酶具有很多优点，但也有蛋白质或其它细胞成分易渗漏到 转化液中和比活力低等缺点。克服这些缺点根据不同的情况可采用不同的固定化技术 b ”。比较采用聚丙烯酰胺、卡拉胶、明胶固定化重组基因工程菌的结果发现：聚丙烯酰 胺包埋的回收率高、半衰期长 3 6 3 , 由于聚丙烯酰胺有毒性，采用聚乙烯醇固定菇用硼酸 处理，有利于防止菌体渗漏，提高其稳定性旧，而用卡拉胶固定菌体，可提高转化率3 ”。 b r u n k e 等人采用固定化p , p u t i d a k t 2 4 4 2 ：t n 5 0 1 截留二价汞，比较陶瓷、多孔玻璃和海藻 酸钙作载体的结果发现：陶瓷和多孔玻璃的化学稳定性较好，而海藻酸钙的化学稳定性 差3 9 。o s p i n a 等用琼脂糖固定e c o | i j m l o l ( p p a l 0 2 ) ，再用戊二醛交联细胞发现：固定化 颗粒越大，则有效系数越低；细胞浓度越高，比活越高，有效系数越低1 4 0 3 b i r b a u m 等人研究认为，- z 胶粒在反应器中所占体积越大( 即胶粒越多) ，生产目的产物 7 第一章前言 的能力越强。在较低接种量的情况下，产量随着胶粒数量的增加而增加。在胶粒数量过 多时，从胶粒中游离出的细胞也会相应增加。显而易见，若要提高反应器的体积产量， 就必须采用高浓度的固定化胶粒“”。 常见的理想生化反应器按照操作方式不同可分为间歇操作搅拌槽式反应器( b s t r ) 、 连续操作搅拌槽式反应器( c s t r ) 、连续操作管式反应器( c p f r ) 、半间歇操作搅拌槽 式反应器( s c s t r ) 等多种类型；按照生物催化剂在反应器中的分布方式，可分为生物 团块反应器和生物膜反应器两大类；如果按固相催化剂的运动状态来分类，又可 为填 充床、流化床生物转盘等多种形式反应器；如果按反应体系的相态来分类，可分为均相 和非均相两大类【4 “。b h u g a l o o v i a l 等人对v 4 1 菌进行了三种方法研究：游离细胞的连续 培养、在活塞流反应器中海藻酸钙珠固定和膜反应器中固定，通过对系统中细菌素的浓 度的比较，活塞流反应器中的生产速率高达1 0 5 单位i l h 一，而游离细胞系统中仅为2 8 1 0 3 单位l l h ，膜反应器中由于生成的细菌素无法透过膜而难以进行反应f 4 ”。可见，使用一 种合适的反应器可以大大提高反应速率。在冷冻浓缩方面，利用固定化细菌来浓缩果汁 所使用的设备( 浓缩反应器) 要实现大量水的去除，且要保持被浓缩物料不损失，因此 该类型反应器设计制造是不同于常规反应器的形式，这种反应器经查新在国内外还未见 报道。 ( 三) 关于果汁和风味 随着科学技术的不断发展，人民正走向科学的生活方式，追求和崇尚自然，所以软 饮料市场出现了需求观念上的改变：一是主导饮料市场的品种从可乐型向无色饮料转向： 二是果昧型向果汁型转向，特别是用天然水果加工而成，且具营养和生理功效；三是从 单一型向多样化转向；四是功能单一型向健康疗效型转向，使加工科技含量的要求越来 越高，天然状态下具生理活性的保持的越天然越好。果汁有“液体水果”的美名，由于 色、香、味俱佳，营养价值高，已成为风蜚全球的保健饮料，这是人类全天候追求高质 量生活方式和享受高质量、高品昧、具保健功能的果汁和浓缩果汁的目标，也是饮料工 业未来发展的必由之路。目前，由于消费者对果汁的产品质量的要求越来越高；另外， 由于生产量和市场需求的急剧增长，又出现了包装、贮藏、运输和销售等许多新问题和 新技术。这样就造成果汁的加工生产曰益趋向于生产浓缩产品，因为浓缩后的果汁体积 小，可溶性物质含量达到6 5 6 8 ，可节约包装和运输费用，能克服果实采收后和品 种所造成的成分上的差异，使产品质量能够达到一定的质量要求和标准；浓缩后的果汁， 由于提高了糖度和酸度，可在不加任何防腐剂的情况下能使果汁产品长期保藏，因此， 第谭前言 浓缩果汁也是人们所推崇的果汁生产的重要产品1 4 ”。 果汁的风味，包括味感和嗅感两方面。其味感成分大致相同，均以甜味和酸味为主 体。甜味物质主要是单糖，如葡萄糖、果糖等；酸味物质主要是有机酸。不同果汁的风 味，主要是由于其嗅感成分的不同而形成。果汁的香气成分较为单纯，大多具有天然清 香或浓郁芳香气味【4 5 i 。柑橘类水果果汁香气成分中的酯类主要有：由丁酸、异丁酸、己 酸、2 一甲基丁酸及二乙基碳酸形成的乙酯，由丁酸、己酸形成的甲酯；醛类主要有：乙 醛、2 辛烯醛、2 。己烯醛、3 一乙氧基己醛等：醇类则主要是己醇和芳樟醇【4 ”。构成苹果 汁香气的化合物达2 5 0 种以上，其中醇类、酯类、醛类是特征嗅感的主要成分。如日本 产的红玉苹果，香气以丁醇、3 一甲基丁醇、己醇等醇类为主。不同品种苹果间的香气差 别，不仅是嗅感物种类不同，更重要的是各组分的含量比例不一样f 4 ”。草莓汁的香气中 有一种独特的甜味，而且香气非常容易变化。如在磨碎的草莓浆中发现( 2 e ) 一己烯醛是 主要的香气成分，但在朱磨碎的草莓中并不存在，在加热或冷冻后的草莓浆中含量也极 微。这种香气的不稳定性给研究工作带来极大困难。至今，已知草莓香气中的化台物有 3 0 0 种以上，但哪些是特征成分尚未搞清1 4 “。 ( 四) 冰核细菌应用于食品及冷冻浓缩技术的研究进展 关于冰核细菌用于食品在国内已有。定研究。中国农业科学院赵廷昌等与华南农业 大学胡卓炎等合作申请的国家自然科学基金项目“冰核细菌在食品：i ：= 业中的应用”研究 了冰核细菌x c a m p e s t r i s 细胞对螯油、大豆诲、蔗糖、车廿橘汁、梨汁和苹果汁等食品的 过冷却点的影响，结果表明x c a m p e s t r i s 细胞可以提高样品的过冷却点，并指出冰核细 菌应用于食品冷冻浓缩可以提高样品固收率，改善食品质地，保持食品的芳香组分和营 养成分以及可以降低能源消耗和费用 4 6 , 4 7 i 。固定化冰核活性细胞制备方法在所查到的国 内文献中未见报道。 关于冰核细菌用于食品冷冻浓缩在f 虱j i - 已有一定研究，但大多数停留在添加游离冰 核细菌的研究。添加进冰核细菌后，食物中大量水在靠近冰点的零下温度中冻结h ”。室 温下细菌的冰核活性很稳定，不必冷却到冰点冰核就存在【”。应用烈a 细胞冷冻浓缩技 术，可以将鸡蛋清浓缩，而且浓缩后的产品有很好的成泡沫性冰核细菌可以大幅度提高 过冷点，如w a t a n a b e 研究了蛋清中有和没有i n a 细菌时的冷冻过程，有细胞的蛋清大 约在3 冻结，没有细胞的要过冷到一1 8 【”i 。1 n a 细胞冷冻浓缩的新鲜牛奶在加压后形 成了很光滑的奶胶”1 ；通过相似的技术，还得到了没有失去原始风味的柠檬汁p ”：还可 以制造出未加热的草莓果浆，质地与传统产品相似，但风味和颜色更好1 5 2 j 。冷冻过程中， 第一奄前言 某些化合物如果变得过饱和或变成易溶物晶体可以作为沉淀除去。应用冷冻浓缩大豆酱 汁可以将半以上的盐作为共溶物晶体h 2 0 2 n a c i 形式提取出去，风味物质得到保留， 各种游离氨基酸除了色氨酸外都浓缩了14 到1 8 倍1 5 ”。l i 等对食品中主要成分糖类、 蛋白质和脂类分别采用了蔗糖、鸡蛋清和红花油为代表物，添加游离的i n a 细胞 p s y r i n g a e 或者e h e r b i c o l a 后，对其水溶液进行了冷冻浓缩，发现它们的冻结温度大大 提高了1 5 4 i 。m i c h i k o 等1 5 5 1 将p s y r i n g a e 加入鲑鱼肉中做冷冻实验，达冻结终点时，处理 组比不处理组的浓缩时间缩短了3 3 。 w a t a n a b e 等对冰核细菌的固定化做了初步研究1 5 ，他们试用了两种方法，一种是将 i n a 细胞悬液放入玻璃纸试管中，试管放入，5 的水中，冰晶体在管的四周生长，在半 透膜中的固定化可以避免i n a 细胞进入周围的样品中；另一种是把海藻酸钙冰核胶放置 到盛有待浓缩物质的圆形反应器的壁上，冰只围绕凝胶形成，向圆形反应器的中心生长， 别处没有冰的形成。但以上这些研究既没有对比不同的固定化方法的性能优劣，也没有 探讨制各海藻酸钙凝胶的最佳组分，更没有设计反应装置而应用于工业化生产。 将冰核活性细菌应用于食品的冷冻浓缩中不仅可以促进冰晶的形成，还可以解决食 品黏度大时固液分离效率低的难题，现已成为冷冻浓缩技术当前研究的热点，这也是该 技术将来研究的方向之一。国外有关理论与应用均己见报道，冰核活性细菌细胞和它们 的活性成分在食品中的应用能提高成核温度，能改善冷冻食品的质量，增加冻结速率和 产生损失小的冰晶，缩短冻结时间和导致节省能源。但国内在该领域起步较晚。在食品 工业应用，细菌冰核必须是卫生、环境安全、无毒性、无致病性并且风味可口。为了满 足这些需要，研究应集中在【5 7j ：( 1 ) 从菌体中分离纯化冰核活性蛋白，如无细胞制品或 细胞外产品，都应较容易被食品安全管理部门所接受。这就涉及如何提高冰核活性细菌 表达水平，然后纯化浓缩到活性形式，提高安全性。( 2 ) 食品级冰核微生物的分离物例 如x c a m p e s t r i s 和提高它的冰核活性可能是解决问题的途径。据报道冰核细菌 x c a m p e s t r i s 是一个食品级的冰核活性微生物，日本m i n i s t r y o f h e a l t ha n dw e l f a r e 己批准 高压灭活了的x c a m p e s t r i s 【n c 1 细胞可直接用于食品制备，做有关这一菌株的研究就可 以省去解除其安全性的问题，从而节约了人力物力，使冰核细菌的应用前景更加广阔。 ( 3 ) 另一种可能的方法是克隆冰核基因并导入食品级微生物如l a c t o b a c i l h u s 或酵母中。 二、选题依据及意义 ( 一) 常规的浓缩分离过程中存在的问题 ( 1 )有些生物活性物质和细胞不耐高温，无法加热蒸发分离。果汁浓缩过程中高温蒸 1 0 第一章前言 ( 2 ) ( 3 ) ( 二) ( 1 ) ( 2 ) ( 三) ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) 发不可避免造成风味物质大量损失，并可促进其褐交。 蒸发浓缩消耗大量热能和动力资源，成本较高。蒸发浓缩根据真空蒸发温度要求， 其汽化热随温度的提高而降低，7 3 时为5 5 5 6 k c a l k g ，6 8 时为5 5 82 k c a l k g ， 6 4 。c 时为5 6 0 6 k c a l k g ，6 04 c 时为5 6 85 k c a i k g ，而冷冻结晶或冷冻浓缩的结晶热 仅8 0 k c a l k g ，即冷冻法去水能耗约为蒸发法的l 7 。蒸发法每小时除水1 0 m 3 ，单 效耗蒸汽约1 2 m 3 ，双效约7 2 m 3 ，三效约4 8 m 3 。以目前蒸汽价格y 9 0 m 3 计算， 分别为y 1 0 8 0 ，￥6 4 8 ，￥4 3 2 。而冷冻法仅需1 0 0 0 0 8 0 = 8 0 0 0 0 0 k c a l ，按照制冷 量，耗电量= 2 5 0 计算，折合电耗4 0 0 k w h ，以￥06 5 k w h 计算，仅为￥2 6 0 。 常规冷冻浓缩虽然理论上耗能较低，但需要昂贵的大型深冷设备，实际生产成本 高于蒸发浓缩，而且由于冰晶夹带等技术难题难以解决，因此不如蒸发浓缩应用 普遍。 冰核活性细菌在食品加工( 特别是在冷冻浓缩) 中的特殊优势 成本优势：冰核活性细菌的应用可以大大提高操作温度。如栗一个冷冻加工厂可 以在一3 0 。c 而不是在4 0 。c 下运行，这个工厂在5 0 0 0 k w 下运行，这两个温度下的 负载差异将是5 0 0 0 1 6 9 5 0 0 0 i8 9 = 3 1 3 k w ，按照每千瓦时￥o6 5 计算，那么每 年节约1 2 6 9 5 万元人民币。 改善晶型：研究表明f 】，冰核活性细菌有利于促进体积较大的冰晶形成，从而 减少夹带损失。 重点要解决的问题及研究目标 将冰核活性细菌应用到果汁的冷冻浓缩中，要解决的主要技术关键是： 研究高水平表达冰核活性蛋白的冰核活性细菌的发酵工艺条件。 研究并选择用于固定化的最佳载体，达到固定化后细胞渗漏小，机械性能稳定， 半衰期长，工艺操作简单的制备方法。 通过该技术获得某种果汁的浓缩汁。 研究目标：初步优化出一套实验室规模的固定化冰核细菌冷冻浓缩某种果汁 的方法。 ( 四) 课题研究的创新点 经中国农业科学院科技文献信息中心查新( 报告编号2 0 0 1 0 1 0 0 7 0 0 4 1 0 ) ，本 研究的新颖性有： 第一章前言 ( 1 )能有效提高冰晶生成速度的冰核活性细菌应用于果汁的冷冻浓缩技术中； ( 2 )用于果汁冷冻浓缩的冰核活性细菌固定化技术研究。 ( 五) 本课题研究的重要意义 ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) 将冰核细菌应用于食品的冷冻浓缩中，是生物技术在食品科学和食品工业中的一 项独特的应用，可能在冷冻浓缩的技术发展方面产生突破性的进展。主要理由是： 冰核活性细菌及其活性成分可提高被冻结物料的过冷点，缩短冷冻时间，从而节 省大量能源例。 冰核活性细菌及其活性成分在较高的温度下可迅速促进冰晶的生长，形成较大尺 寸的冰晶，可使分离操作所需费用及因冰晶夹带所引起的溶质的损失减少，解除 了冷冻过程中冰水分离的难题。而降低了生产成本，从而解决物料黏度高的情况下 难以生成大的冰晶、固液分离效率低等技术难题，为其早日实现产业化生产带来 希望【6 0 l 。 4 另外，建立这样一种操作体系平台还会对其它物料( 如基因工程产品、高生物效 价物质的提制等) 的冷冻浓缩产生技术上的重大改善和突破。常规的冷冻结构是 冰晶无序形成和全向生长的状态，产生海绵状的各向同质的机械特性，而利用冰 核活性细菌及其活性成分的冷冻则可导致各向非同质结构的形成，完全解除了冷 冻过程中对物料组织细胞结构的破坏作用1 6 ”。 在生产浓缩果汁的基础上，对其所产生的下脚料( 果皮、果囊等不溶性纤维质) 进行综合利用，利用现代超微粉碎技术生产可食纤维，从而提高生产效益和附加 值。 第二章材料与方法 第二章材料与方法 、实验材料与设备 ( 一) 实验菌种和培养基 1 实验菌种 x a n t h o m o n a s a m p e l i n a t s 2 0 6 ，( 简称2 0 6 ) 本实验室从天津地区蔬菜表面分离。菌种 的主要特征为在肉汤培养基平板上菌落为黄色，杆状，革兰氏