（材料学专业论文）生物素亲和素自组装膜及其在生物传感器上的应用研究.pdf

摘要 由于生物素和亲和素间高度的特异性结合力、桥联作用以及多级放大作用， 且多数的蛋白质、酶、抗体、d n a 等可以较容易地生物素化，生物素化后并不降 低其活性，使其在生物学、分子生物学、生物化学、临床医学等领域广泛应用。 本文研究了生物素一亲和素自组装膜及基于该自组装膜的生物传感器在葡萄糖检 测和端粒酶活性检测的效果。 将生物素一亲和素系统和纳米金效应结合起来，以石英晶体微天平( q c m ) 为 手段，实时监测了生物素一亲和素系统固定葡萄糖氧化酶的一系列过程，探讨了 不同浓度亲和素、生物素标记酶对吸附的影响，生物素标记前后酶的吸附过程， 比较了纳米金修饰前后酶的固定效果。结果表明，通过生物素、亲和素间的特异 性结合力能够很好的固定化酶，金片表面修饰纳米会颗粒可使基片表面固定的酶 量提高l 倍以上。 制备了基于生物素一亲和素系统固定化葡萄糖氧化酶的生物传感器，通过循 环伏安曲线对电极进行了表征，讨论了酶的层数、溶液p h 值、离子强度、搅拌 速率、温度等各种实验条件对传感器性能的影响，测试了该传感器检测范围、灵 敏度及电极的稳定性。结果表明，应用生物素一亲和素系统固定化酶制备的生物 传感器有较大的电流响应及较好的灵敏度，本传感器能检测出0 5 m m 到4 0 m m 的 葡萄糖浓度，检测范围较广，传感器的响应时问仅为6 s 。 以b i o d a t p 作为聚合酶链式反应( p c r ) 底物，对端粒酶活性下p c r 扩增反 应的端粒d n a 进行生物素标记，分别用压电石英晶体生物传感器和表面等离子基 元共振生物传感器检测端粒酶活性，提出了新的检测端粒酶活性的方法。结果表 明，用生物传感器方法检测端粒酶活性快速方便，通过纳米微粒质量放大及增效 技术，提高了检测精度和灵敏度，缩短了响应时间，能够较好地分辨端粒酶的阴 性和阳性以及不同种类端粒酶的活性，降低了检测下限。 关键词：生物素一亲和素、自组装、生物传感器、葡萄糖氧化酶、端粒酶 a b t r a c t t h eb i o t i n a v i d i ns y s t e m ( b a s ) h a st h ee s p e c i a l a p p e t e n c y , g r e a tl i n ka n d a m p l i f i c a t o r yf u n c t i o n m e a n w h i l e ，m o s tp r o t e i n s ，e n z y m e s ，a n t i b o d i e sa n dd n a s c a nb el i n k e dw i t hb i o f i ne a s i l y , w h i c hd on o td e c r e a s et h e i ra c t i v i t i e s t h e r e f o r e ， b a sc a l lb ew i d e l yu s e di nt h ef i e l d so fb i o l o g y , m o l e c u l a rb i o l o g y , b i o c h e m i s t r ya n d m e d i c i n e i nt h i sp a p e r , t h es e l f - a s s e m b l yf i l mb a s e do nb a sw a sr e s e a r c h e d f u r t h e r m o r e ，t h eb i o s e n s o rb a s e dt h et e c h n o l o g yw a sa p p l i e dt ot e s tt h es 仃e n g t ho f g l u c o s ea n dt h ea c t i v i t yo f t e l o m e r a s e b a sa n dt h ee f f e c to fn a n o - a u 、r c e r ec o m b i n e di nt h ee x p e r i m e n t as e r i e so f p r o c e s s e so fg l u c o s eo x i d a s e ( g o x ) i m m o b i l i t yb a s eo nb a sw e r em o n i t o r e db y q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) t h ei m p a c t ss u c ha st h es 订e n g t ho fa v i d i na n d b i o - g o x ，t h ee f f e c to fb i o t i na n dt h em o d i f i c a t i 0 1 1o fn a n o - a u ，w e r ed i s c u s s e d t h e r e s u l t ss h o wt h a ti ti sb e n e f i c i a lt oi m m o b i l i z ee n z y m eb yb a sa n dt h ee n z y m eo f i m m o b i l i t yd o u b l e da f t e rr k 2 i l o - a um o d i f i c a t i o n t h eg o xb i o s e n s o rw a sp r e p a r e db a s e do nb a s t h ee l e c l r o d ew a sc h a r a c t e r e db y c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c t h ec o n d i t i o n ss u c ha st e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，i o n i c s t r e n g t ha n dl a y e r so fe n z y m e ，w h i c ha f f e c t e dt h es 仃e n g t ho fb i o s e n s o r se l t r e n t ， w e r es t u d i e d t h er a n g e ro fd e t e c t i n g ，t h es e n s i t i v i t ya n dt h es t a b i l i t yo fe l e c t r o d e s w e r et e s t e d n er e s u l t ss h o wt h a tt h eb i o s e n s o rh a saf a s tc u r r e n tr e s p o n s eo f6sa n d l i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g eo f5 0 x 1 0 。4t o4 0 1 0 - 3m i th a sa d v a n t a g e so fs e n s i t i v i t y a n dq u i c kr e s p o n s e b a s e do nb i o d a t p , t h et e l o m e r ed n ao fp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) u n d e r t h ea c t i v i t yo ft e l o m e r a s ew a sl a b e l e db yb i o t i n t h ea c t i v i t yw a se x a m i n e db yt h e b i o s e n s o r si n c l u d i n gq c ma n di a s y s ，w h i c hw a sa ni n n o v a t i v et e c h n i q u e t h er e s u l t s m e a nt h a ti ti sc o n v e n i e n tf o rd i a g n o s i n gt h ea c t i v i t yo ft e l o m e r a s et o a p p l yt h e b i o s e n s o r t h eb i o s e n s o rh a sab e n e f i c i a ls e n s i t i v i t ya n dt h ef a s tr e s p o n s et i m eb yt h e m o d i f i c a t i o no fr i b n o - a u i tc a nd i s t i n g u i s ht h ed i f f e r e n tt e l o m e r a s ew i t hv a r i e d a c t i v i t i e s i t sl i m i tf o rt e l o m e r a s ea c t i v i t yc a nb eo p t i m i z e d k e y w o r d s ：b i o t i n a v i d i ns y s t e m ，s e l f - a s s e m b l y , b i o s e n s o r ，g l u c o s eo x i d a s e ， t e l o m e r a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁壅盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：s 辜 签字日期：坷年月厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘连盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨生叁堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：甚 签字日期：扣f 年月f 日 导师签名： 签字目期：o r 年 1 月j 一日 天津大学硕士学位论文 11 生物传感器 第一章绪论 第一童绪论 1 1 1 生物传感器的概念及发展 生物传感器是一类特殊的化学传感器，它是以生物活性单元( 如酶、抗体、 核酸、细胞等) 作为生物敏感基儿，对目标被测物具有高度选择性的检测器。通 过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应 的程度用离散或连续的信号表达出来，从而得出被测物的浓度。生物传感器具有 选择性高，分析速度快，操作简易和仪器价格低廉等特点，而且可以进行在线甚 至活体分析，因此引起世界各国的极大关注。 最先问世的是酶电极生物传感器，1 9 6 2 年c l a r k 【1 等人首次提出把酶与电极 结合起来测底物的设想，在氧电极的基础上提出了研制葡萄糖生物传感器的设计 原理。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s p l 报道了酶的固定化技术，并研制出世界上第一 支葡萄糖酶电极，开创了生物传感器的历史。由于酶电极的寿命一般比较短，提 纯的酶价格也比较昂贵，而各种酶多数来自微生物或动植物组织，因此就自然地 启发人们研究酶电极的衍生物：微生物电极、细胞器电极、动植物组织电极以及 免疫电极等新型生物传感器，使生物传感器的类型大大增多。当今许多发达国家 都把生物传感器列为关键技术，给予特别的重视和支持。近十多年来已经研制出 一系列在环境监测，临床检验和生化分析等力面具有实用价值的生物传感器，可 以测定糖类、有机酸、蛋白质、抗原、抗体、d n a 、激素、生化需氧量以及某 些致癌物质等”j 。 11 2 生物传感器的分类 生物传感器一般可从以下3 个角度进行分类。 ( 1 ) 根据传感器输出信号的产生方式可分为二类，即催化型生物传感器和亲 和型生物传感器。前者利用生物催化剂的专一性和催化性或底物列它的抑制作 用，对其作用的底物进行检测。酶生物传感器是典型的催化型生物传感器，其反 应形式可用通式表示： s + r - s r _ p ( p 一生成物) 而亲和型生物传感器则利用牛物活性物质对底物的亲和或键合作用，如抗原 而亲和型生物传感器则利用生物活性物质对底物的亲和或键合作用，如抗原 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 生物传惑器 第一章绪论 1 1 1 生物传感器的概念及发展 生物传感器是一类特殊的化学传感器，它是以生物活性单元( 如酶、抗体、 核酸、细胞等) 作为生物敏感基元，对目标被测物具有高度选择性的检测器。通 过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应 的程度用离散或连续的信号表达出来，从而得出被测物的浓度。生物传感器具有 选择性高，分析速度快，操作简易和仪器价格低廉等特点，而且可以进行在线甚 至活体分析，因此引起世界各国的极大关注。 最先问世的是酶电极生物传感器，1 9 6 2 年c l a r k t l 等人首次提出把酶与电极 结合起来测底物的设想，在氧电极的基础上提出了研制葡萄糖生物传感器的设计 原理。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s l 2 】报道了酶的固定化技术，并研制出世界上第一 支葡萄糖酶电极，开创了生物传感器的历史。由于酶电极的寿命一般比较短，提 纯的酶价格也比较昂贵，而各种酶多数来自微生物或动植物组织，因此就自然地 启发人们研究酶电极的衍生物：微生物电极、细胞器电极、动植物组织电极以及 免疫电极等新型生物传感器，使生物传感器的类型大大增多。当今许多发达国家 都把生物传感器列为关键技术，给予特别的重视和支持。近十多年来已经研制出 系列在环境监测，临床检验和生化分析等方面具有实用价值的生物传感器，可 以测定糖类、有机酸、蛋白质、抗原、抗体、d n a 、激素、生化需氧量以及某 些致癌物质等i j j 。 1 1 2 生物传感器的分类 生物传感器一般可从以下3 个角度进行分类。 ( 1 ) 根据传感器输出信号的产生方式可分为二类，即催化型生物传感器和亲 和型生物传感器。前者利用生物催化剂的专一性和催化性或底物对它的抑制作 用，对其作用的底物进行检测。酶生物传感器是典型的催化型生物传感器，其反 应形式可用通式表示： s + r _ s r p f p _ 一生成物) 而亲和型生物传感器则利用生物活性物质对底物的亲和或键合作用，如抗原 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 与抗体间专一性识别及结合的性质来对抗原、半抗原或抗体进行检测，植物凝集 素对底物的键合作用和d n a 分子与蛋白质的相互作用也包括在其中。其反应形 式可用通式表示： s + r s r f s 一底物，r _ 一受体) 此外，还可将生物催化识别元件与受体作用识别元件结合作为敏感元件，如 酶一抗体( 或抗原) 等；还有利用核酸链间碱基序列互补特异性的生物传感器【4 l 。 ( 2 ) 如果根据分子识别元件上的敏感物质可分为酶传感器、微生物传感器、 组织传感器、基因传感器、免疫传感器等。其中酶电极传感器研究得较多，酶电 极是由固定化酶与离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电极组合而 成得生物传感器，因而具有酶的分子识别和选择催化功能，又有电化学电极响应 快、操作简单的特点，能快速测定试液中某一给定化合物的浓度。目前，酶电极 用于糖类、醇类、有机酸、氨基酸、激素等成分的测定。 ( 3 ) 根据生物传感器的信号转化器进行分类，则可分为电化学电极式、热敏 电阻式、半导体离子场效应晶体管式、表面等离子体谐振式、压电晶体式、表面 声波式和光纤式等。在本实验中研究的生物传感器有电化学电极式、压电晶体式 和表面等离子体共振生物传感器。 1 1 2 1 电化学电极生物传感器 电化学电极生物传感器分为电位式传感器和电流式传感器。电位式酶电极是 将酶促反应所引起的物质量的变化转变为电位信号输出，电位信号大小与底物浓 度的对数值成线性关系。所用的基础电极有p h 电极、气敏电极等，它影响着酶 电极的响应时间、检测下限等许多性能。电位型酶电极的适用范围不仅取决于底 物的溶解度，更重要的取决于基础电极的检测限，一般为1 0 r 4 1 0 m o l l 。电流 型酶电极是指将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应产生的电流， 在一定条件下，测得的电流信号与被测物浓度成线性关系。其基础电极可采用氧、 过氧化氢等电极，还可采用介体修饰的炭、铂、金等基础电极。 1 1 2 ，2 压电晶体式生物传感器 ( 1 ) 原理 压电晶体式生物传感器的转换器是基于石英晶体的压电效应。在一定方向上 施加机械力时石英晶体产生变形，就会引起它们内部正负电荷中心相对位移而产 生极化，从而导致其两个相对表面上出现符号相反的束缚电荷，当外力消失后， 又恢复到不带电状态。当外力发生变化时表面电荷极性随之改变，这种现象物理 学称为压电效应。 石英晶体微天平( q c m ) 是基于这种压电效应的一类生物传感器。石英晶体 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 上质量的变化反应在石英晶体的振荡频率上，当石英晶体上有物质吸附时，其振 荡频率降低，反之则升高。0 c m 基片的振荡频率变化f 与其吸附物质质量变化 am 的关系可用s a u e r b r e e y 公式计算口j ： f = - - 2 f 0 2 ( 口。u 。) 一“2 m a 其中：f 0 ：石英晶体的基本振动频率；p 。：石英的密度，2 6 5 1 0 3 k g m 3 ： p 。：石英晶片的剪切模量，2 9 5 1 0 ”p a a ：基片表面积，m 2 ；af 是物质吸附 前后石英晶体的频率变化；an l 是石英晶体上由于物质吸附而引起的质量变化。 ( 2 ) 特点和应用 压电石英晶体传感器具有仪器装置简单、成本低廉、灵敏度高、易自动化、 使用范围广等特点，可发展一类非标记的亲和型生物传感器检测方法【6 j 。压电晶 体式生物传感器在微生物免疫分析【7 、基因检测嘲、血液流变、药理研究以及环 境1 9 等科学领域具有重要应用价值和开发前景。压电免疫分析技术被认为是非标 记免疫分析的一个重要突破，并有可能部分地取代放射免疫分析技术：和流动注 射分析技术联用可以进行连续和重复检测，可实现对复杂样品地在线分析；压电 生物传感器还可直接用来监测生物反应的过程，用于反应动力学的研究。 1 1 2 3 表面等离子体共振生物传感器 ( 1 ) 原理 图1 i 表面等离子体谐振式生物传感器原理示意图 表面等离子体共振( s p r ) 是一种物理光学现象。表面等离子体( s p ) 是沿着金 属和电介质问界面传播的电磁波形成的。当平行表面的偏振光以称之为表面等离 子体共振角入射在界面上，发生衰减全反射时，入射光被耦合入表面等离子体内， 光能大量被吸收，在这个角度上由于表面等离子体共振引起界面反射光显著减 少。由于s p r 对金属表面电介质的折射率非常敏感，不同电介质其表面等离子 体共振角不同。同种电介质，其附在金属表面的量不同，则s p r 的响应强度不 同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体固定于 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 金属膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离 过程中，金属膜表面溶液的折射率发生变化，随即被s p r 生物传感器检测出来。 其原理示意图如图所示。目前已有许多不同型号的s p r 生物传感器商品化，例 如b 1 a e o r e 、1 a s y s 生物传感器等。 ( 2 ) 特点和应用 与传统的相互作用技术如超速离心、荧光法、热量测定法等相比，s p r 生物 传感器具有如下显著特点：( 1 ) 实时检测，能动态地监测生物分子相互作用的全 过程：( 2 ) 无需标记样品，保持了分子活性；( 3 ) 样品需要量极少，一般一个表面 仅需约1pg 蛋白配体；( 4 ) 检测过程方便快捷，灵敏度高；( 5 ) 应用范围非常广泛； ( 6 ) 高通量、高质量的分析数据；( 7 ) 能跟踪监控固定的配体的稳定性；( 8 ) 对复合 物的定量测定不干扰反应的平衡：( 9 ) 大多数情况下，不需对样品进行预处理；( 1 0 ) 由于s p r 基于对未穿透样品的反射光的测量，所以检测能在混浊的甚至不透明 的样品中进行。 s p r 生物传感器在生物分子相互作用、微生物检测、药物筛选、血液分析、 d n a 分析、抗体，抗原分析、临床诊断、食物检测及环境监控、膜生物学等领域 具有广泛应用。 1 1 3 生物传感器的特点 经典的分析技术，如高压液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 和质谱等，费时、 昂贵、要求对样品进行预浓缩，难以广泛应用。生物传感器作为一种新的检测手 段，与之相比有以下的优点： ( 1 ) 测定范围广泛。根据生物反应的特异性和多样性，理论上可制成测定所有生 物物质的传感器。 ( 2 ) 测定过程简单迅速。由于分子识别元件是由高选择性的生物材料构成，一般 就不需要样品的预处理，这样就将样品中的被测组分的分离和检测统一。 ( 3 ) 样品用量少，灵敏度商。由于生物敏感膜分子的高度特异性、灵敏性，故对 一些含量极低的检测对象也能准确地反应出来。 f 4 ) 检测时不需加入其它试剂，是一种准确的“无试剂”分析方法。 ( 5 ) 重复性好，将敏感材料固定化保证可以反复多次使用，有较好的稳定性。 ( 6 ) 响应快，体积小，可以实现连续在线检测。 ( 7 ) 可进入生物体内。如安放于静脉或动脉中的葡萄糖传感器能持续不断地监测 血糖含量，并将指令传给植入人体的胰岛素泵，控制胰岛素释放量。 ( 8 ) 成本低，传感器连同测定仪器的成本远低于大型分析仪器，便于普及。 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 4 生物传感器的应用 ( 1 ) 生物医学上的应用 生物传感器可实时监测生物大分子之间相互作用，动态观察抗原、抗体之间 结合与解离的平衡关系，可较准确地测定抗体的亲和力及识别抗原，有目的地筛 选各种具有最佳应用潜力的单克隆抗体，同时省时、省力、结果客观可靠。 用酶、免疫传感器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊 断提供依据。例如用酶传感器可以测定出运动员锻炼后血液中存在的乳酸水平或 糖尿病患者的葡萄糖水平。另外，生物传感器还可以预知疾病发作和检测细胞上 的有毒物质和药用物质。 利用生物工程技术生产药物时，将生物传感器用于生化反应的监视，可以迅 速获取各种数据，有效地加强生物工程产品的质量管理。生物传感器已在癌症药 物的研制方面发挥了重要作用。 ( 2 ) 环境监测中的应用 生物传感器在环境监测中应用较多的是水质分析，一个典型应用是测定生化 需氧量( b o d ) 。微生物传感器还可用于监测c o 。、n o ：、n 心、c - i , 之类的气体，在 大气污染监测方面也有较大的应用。用于农药和抗生素残留量的分析也是生物传 感器应用的一个重要方面。 ( 3 ) 食品分析中的应用 生物传感器可广泛用于食品工业生产中，如对食品原料、半成品和产品质量 的检测，发酵生产中的在线监测等。另外，生物传感器在测定鱼的鲜度方面也有 一定的应用。 ( 4 ) 军事上的应用 生物传感器由于具有高度特异性、灵敏性和快速地探测化学战剂和生物战剂 的特性，它将是最重要的一类化学战剂和生物战剂侦检器材。单克隆抗体的出现 及其与微电子学的联系使发展众多的小型、超敏感生物传感器成为可能，生物传 感器在军事上的前景将更为广阔。 1 2 自组装复合膜 随着生物传感器的研究的深入，人们希望在分子水平上设计和控制电极的结 构，而功能分子和生物分子组合体的出现，有可能提供新一代的电子元件。于是 超分子化学中的一个重要概念分子自组装被引入传感器的研究，为制备生物传感 器提供了新的途径。分子自组装膜技术具有方法简单；所得到的膜性能稳定，结 构高度有序；层间分子中心对准，可实现2 d 或3 d 有序的超晶格结构；可仿自 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 然生物膜；有机、无机分子以及大分子、小分子等都适用。因此，分子自组装复 合膜将成为研究传感器的重要的技术基础。 自组装膜( s a n s ) 是分子通过化学键或其它作用力自发吸附在固液或气 固界面上，形成热力学稳定和能量最低的有序膜。当有吸附分子存在时，局部已 形成的无序膜可以自我再生成更完善的有序体系。除在界面上的化学作用外，通 常在成膜分子之间还存在范德华力的作用，以使所形成的膜更加稳定。 1 2 1 自组装膜的组装方法 自组装膜的组装方法很多，基于自组装过程中成膜的推动力不同可以大致分 为以下几类：基于化学吸附的自组装技术、静电自组装膜技术、基于氢键的自组 装技术、基于配位键的自组装技术、基于分子识别的自组装技术。它们各具特点 又互为补充，在基础研究和实际应用中都发挥着重要作用i l 。 ( 1 ) 基于化学吸附的自组装技术 基于化学吸附的自组装膜的种类很多，它包括：脂肪酸单层膜、有机硅衍生 物单层膜、有机硫化合物单层膜、二硫酸化合物多层膜等。其中，利用含硫聚合 物在金、银等金属上的化学吸附是自组装膜的一种十分有效的方法。由于金属与 硫之间形成的是化学键，因此这种膜的牢国度和热稳定性都较好。这种方法也是 目前研究得最为深入的自组装体系，例如，m c c a r t h 等1 1 1 j 首先利用此方法得到聚 合物自组装单分子膜，1 9 9 3 年g r a i g e r 等【l2 】将含硫侧链的甲氧基乙基丙烯酸酯和 羟乙基丙烯酸酯共聚物配成氯仿溶液，在表面镀金的底物上也得到了单分子层。 ( 2 ) 静电自组装膜技术 静电自组装方法最初用于制备聚电解质多层复合薄膜 1 3 1 ，自组装过程如图 1 2 所示。该方法不仅具有对设备和原材料没有特殊的要求、方法简单、易于实 现以及可根据需求引入活性物质等优点，更重要的是可以对聚电解质多层累积纳 米复合薄膜结构实现分子尺寸范围内的一维控制。膜的形成动力是相反电荷组分 间的静电吸引力，而同种电荷的排斥力又使每一层的吸附量不至于无止境的增 加，而是在一定时间内达到饱和，正是这两种作用力确保复合膜稳定地成线性增 长1 1 ”。由于超分子静电自组装方法来修饰电极表面的操作方法简单，同时累积 膜所使用材料具有广泛的选择性，适用范围广等优点，因而被广泛用于制备聚电 解质纳米复合薄膜“s l 。染料、导电高分子、蛋白质以及核酸都被用来 制各纳米复合薄膜，并在分离、传感、催化等方面得到了广泛的应用。这些高分 子材料能与多种物质进行化学联接，并且不影响它的结构和亲和性，这样当高分 子结合到电极表面时，还可以与其它生物素化分子如酶、受体、抗体等结合1 2 0 】。 本课题组利用静电自组装膜制备的生物传感器具有较好的效果1 2 1 1 。 天津大学硕士学位论文第一章绪论 卜 图1 - 2 聚电解质多层纳米复合薄膜自组装过程 ( 3 ) 基于氢键的自组装技术 基于氢键的自组装技术是静电自组装技术的一个有益的补充，由于静电自组 装技术所用的溶剂的极性较大，通常为水，但是有相当一部分聚合物由于不含有 带电基团，不溶于水，所以不能通过自组装技术来制备复合膜。w a n g 等【2 2 1 选用 能溶于醇的聚丙烯酸( p a a ) 和聚4 一乙烯基吡啶( p v p ) 为模型化合物，基于 羧酸基团和吡啶基团间的强的氢键作用，成功地制备了p v p p a a 交替复合膜。 由于层状超薄膜中相邻层间氢键作用的强度小于静电作用，故基于氢键作用的自 组装膜的稳定性较差，但是合理利用氢键作用，也能获得性能较好的复合膜。 ( 4 ) 基于配位键的自组装技术 最早的基于配位键的是基于磷酸盐和金属离子之间的配位作用，由双磷酸盐 化合物与金属离子交替沉积而成。金属离子既可以是二价的，如c u 、z n 等，也 可以是四价的，如t i 、z r 、s n 等。特别是四价金属离子，它们与磷酸基团形成 的配合物稳定性极好，所以基于四价金属离子和二磷酸盐的交替自组装膜很容易 制备，稳定性也好。而二价金属离子与二磷酸盐形成的配合物稳定性差，基于二 价金属离子和二磷酸盐的自组装膜在制各过程中容易溶解在水溶液中，很难在水 中获得超薄膜。但用乙醇作溶剂时，则能获得二价金属离子与二磷酸盐的交替沉 积自组装膜。例如x i o n g 等 2 3j 利用聚苯乙烯磺酸( p s s ) 和聚4 一乙烯基吡啶( p v p ) 与铜离子的配位作用制备了超薄膜。 先基于配体和适当金属离子的配位作用，获得金属配合物，再用次金属配合 物作为构筑基元来制各自组装膜，是配位作用在层状组装中的另一种形式。 s c h u t t e 等阱i 用这种技术制备了含有金属离子的超薄膜。 ( 5 ) 基于分子识别的自组装技术 多数生物分子多层膜的制各是根据蛋白质和相应配体之间的特异性亲和作 用，如抗原一抗体以及生物素一亲和素间的相互作用。另外，抗原标记的酶和抗 体作用也可制得层数易控的酶多层膜，膜层中的酶分子仍保持其原有的活性，并 且改善了生物传感器中的酶分子的响应性能；或者用生物素标记酶，通过生物素 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 与亲和素间很强的结合性进行自组装，所得到的多层酶膜极其稳定，这是由于亲 和素分子在两层生物素标记的酶层之间起桥梁连接作用，使酶更牢固、有序地固 定，从而提高其传感响应。生物素标记的抗体与亲和素的交替组装可制备含抗体 的多层阵列，膜中的抗体仍保留其原有的亲和活性，位于多层膜外层的抗体分子 参与抗原的亲和反应。 1 2 2 自组装膜的特点 ( 1 ) 简便易得。当金或其它金属暴露在硫醇分子的溶液或气氛中，自组装膜便 可以自发地形成，它不需要绝氧、无水或真空等特殊环境，也不需要特殊仪器。 在金属上沉积形成单分子膜的第一个过程只需几秒到几分钟的时间。 ( 2 ) 取向有序。自组装膜是原位自发形成的，它的热力学稳定和能量最低。自 组装膜有较高的有序性和取向性，高的密度堆积和低的缺陷浓度等优点。 ( 3 ) 稳定可靠。原位自发形成，热力学稳定。由于自组装过程中所成键的强度， 自组装膜可以在真空中长时间暴露而不损坏，可以被几乎所有化学的或物理的表 征方法进行结构和性质分析。 ( 4 ) 性质多样。无论在组装分子的有机合成方面，还是自组装过程方面都有很 大的灵活性和方便性。选择和修饰组装分子中的官能团的范围很广，它不会破坏 自组装过程，也不会使自组装膜不稳定。自组装的分子可包括杂原子、芳香基团、 共轭不饱和链和其它的刚性结构、砜和酰胺等。 ( 5 ) 预期结构。无论基底材料形状如何，都可以形成均匀一致的、分子排列有 序的、高密堆积和低缺陷的覆盖层；同时可人为地通过有机合成来设计分子结构 和进行分子剪裁以期获得预期的、物理和化学性质优异的界面。 1 2 3 自组装膜的表征技术 自组装膜在制备过程中有许多因素对其产生影响，因此自组装膜需要进行认 真细致的表征，微观表征技术的不断进步直接带动自组装技术的发展和完善。目 前对自组装膜进行了许多表面分析方法的测试，较常用的技术有润湿接触角、椭 圆光度法【2 5 1 、表面等离子体共振( s p r ) 谱法、表面红外光谱( i r ) 2 6 1 、石英晶 体微天平( q c m ) 2 7 j 、表面增强拉曼光谱( s e r s ) 2 8 j 、x 射线吸收光谱、x 射 线光电子谱( x p s ) 1 2 9 、俄歇电子光谱( a e s ) 、程序控温解吸( t p d ) 、扫描电 子显微镜( s e m ) 口“、表面解吸质谱( s i m s ) 、激光解吸质谱( l d m s ) 、扫描 隧道显微镜( s t m ) 、原子力显微镜( a f m ) 、荧光光谱、压电方法和电化学技 术等等。 电化学技术是以带电相之间界面的性质与表征，界面上电荷传递及相关的过 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 程和现象为主要研究对象。电化学的诸方法已应用于自组装膜的研究，电容法、 阻抗法给出自组装膜的双电层结构，循环伏安法可获得自组装膜的表面覆盖度， 研究自组装膜对溶液中电活性物质传递的阻碍作用及对金属的防腐性，并通过研 究含电活性基团自组装膜的电化学性质来完善和发展电子转移理论，同时可以现 场给出自组装膜中缺陷的大小和形态分布。 扫描隧道显微镜( s t m ) 和原子力显微镜( a f m ) 的研究已经从超真空条 件扩展到了大气状态下、极性和非极性溶液中以及在电化学池中去研究实用的自 组装体系，并成为自组装膜研究中的常规技术之一，它具有许多突出优点：可以 分辨出单个原子：实时地得到在实空间中的三维图像，适合于自组装膜中的扩散 等动态过程的研究；可观察到自组装膜中单个原子层的局部表面结构，而不是整 个表面或体相的平均性质，因而可直接研究自组装膜的表面缺陷、表面重构和表 面吸附体的形态和位置以及吸附体引起的表面重构等；可在大气、常温等不同环 境下工作，不需要特别的制样技术，而且检测过程对样品无损伤，因此可获得自 组装膜本身的原位信息。另外，还可以应用扫描隧道显微镜和原子力显微镜技术 对自组装膜进行纳米级加工和分子识别研究。 其它分析方法在自组装膜的表征方面也有较多的应用。 1 2 4 自组装膜在生物传感器上的应用 随着传感技术的发展和传感器的广泛应用，对传感器的质量提出了越来越高 的要求。而对传感器的研究主要是如何提高器件的选择性、稳定性和可靠性。目 前对生物传感器的研究主要集中在两个方面：一是如何提高传感器的质量。敏感 膜或敏感材料决定了传感器的质量，而具有识别功能，特别是具有分子识别功能 的敏感膜或敏感材料是决定整个传感器质量的关键因素，将大大提高传感器的选 择性；一是敏感膜或敏感材料的设计与选择以及如何将其偶合于合适的换能系 统。分子自组装技术，可得到结构有序的，机械强度和稳定性好的敏感膜；可实 现具有分子识别功能的敏感膜；通过偶联层可实现敏感膜的固定化；可适用于有 机、无机分子，大分子、小分子( 关键在于分子头尾基功能团的设计以及附着基 底表面的处理) ；同时，由分子自组装形成的自组装膜对化学环境、热、外压和 时间稳定。因此，分子自组装应用于传感器具有技术优势，同时也提高了传感器 的质量和性能，为制备生物传感器提供了新的方法，已成为目前研究和应用的热 点。 天津大学硕士学位论文第一章绪论 1 3 生物素一亲和素系统及其在生物传感器中的应用 1 3 1 生物素一亲和素系统 图1 3 亲和素四个位点与生物素分子结合后示意图( a ) 、 亲和素结合生物素分子化学结构图( b ) 示意图( c ) 生物素( b i o t i n ) 又称辅酶r 或维生素h ，是生物体内广泛分布的一种羧化酶 的辅酶，其分子量为2 4 4 u ，生物素分子一端的羧基通过单一的生化反应能与很 多物质如：几乎所有的酶、蛋白质、抗体、d n a 等化学连接，这种连接不影响 生物素的闭合环脲基与亲和素的结合，而且不影响这类物质的生物活性。生物素 化的反应条件温和、简单，常用于生物素化的生物素有两种：生物素酰羟基琥珀 酸亚胺酯( n h s b i o t i n ) 、生物素酰胺基琥珀酸亚胺正乙酸酯( n h s l c b i o t i n ) 。亲和素( a v i d i n ) ，又称抗生物素蛋白或抗生物素，是从鸡蛋白清中提取 的一种糖蛋白，其分子量为6 8 k u ，等电点p h 约为l o 。它由四个相同的含1 2 8 个氨基酸亚基组成，亚基之间通过二硫键连接，亲和素的每一个亚基含有一个与 生物素结合的位点，并与生物素或其衍生物形成高度稳定的复合物 3 ”。( 见图1 - - 3 ) ，据报道，其亲和常数为1 0 ”m 。1 仅比一般的共价键低个数量级，比抗原 抗体反应高1 0 一】0 0 万倍，结合快，呈不可逆反应，而且在p h 、温度、有机溶剂 或变性剂较大的变化范围内均能稳定存在 3 “。由于亲和素生物素之间高度专一 和强烈的相互作用，亲和素一生物素已广泛用于很多领域：亲和层析 3 引、结合分 折 3 ”、放射免疫分折和治疗f 3 5 1 、药物导向等。 1 3 2 生物素一亲和素系统在生物传感器中的应用 13 21 生物素修饰电极 ( 1 ) 杰弗斯胺链连接 p a n t a n o 等 3 6 j 将s u l f o n h s b i o t i n 通过杰弗斯胺链共价固定在碳电极的表 天津大学硕士学位论文第一章绪论 面，然后他们用亲和素和生物素标记的谷氨酸脱氢酶处理生物素修饰的电极制成 碳纤维型传感器用来测定神经递质的传递。这种碳纤维型传感器响应较快 ( 3 0 0 m s ) ，检测限为o 5 m m 谷氨酸，检测线性范围为1 - 3 0 r a m 。 ( 2 ) 磷脂双分子层包被 s n e j d a r k o v o 等p 7 i 介绍了另一种用生物素修饰电极表面的方法，他们用n h s b i o t i n 修饰磷脂双分子层制成生物素化磷脂( b p l ) ，然后用b p l 包被电极，通 过生物素与链霉亲和素葡萄糖氧化酶( s g o x ) 相互作用，形成磷脂双分子层自组 膜，这种葡萄糖传感器的稳定性和重复性均较好，噪音较小。响应迅速。 ( 3 ) 聚合物修饰 b i r k e r t 等【38 利用氨基化的聚乙烯醇修饰在玻璃基片表面固定生物素，再通 过链亲和素、生物素标记抗体间相互作用制备了光学免疫生物传感器，能较好的 进行抗原的在线检测。l u o 等口9 】通过生物素亲和素的相互作用制成三种光纤传感 器用以检测青霉素g 、乙基丁酸盐、尿素。其方法是先将光纤末端硅烷化，然后 与丙烯酰胺、b i s 和a p m a 共聚。这样处理的光纤，其末端聚合物中含n h 2 基， 用n h s l c b i o t i n 使其生物素化，于是生物素被键合到光纤末端，然后将其浸入 亲和素溶液，此时生物素与亲和素键合，随后将其浸入含生物素、荧光素、酶的 反应器中，于是在光极表面形成生物素亲和素生物素化酶一发光剂组成的敏感 膜。通过酶催化底物转变为产物过程中引起体系p h 值的变化，使p h 敏感染料异 硫氰酸荧光素( f i t c ) 发光而得以检测。 ( 4 ) 电化学聚合 c o s n i e r 等【4 0 】通过电化学聚合的方法将吡咯修饰的生物素固定在电极表面， 然后通过生物素亲和素间的亲和力间接固定了生物素修饰的葡萄糖氧化酶，由于 聚吡咯是一种导电聚合物，因此根据此方法制备的生物传感器有较好的电流响 应，灵敏度为7 m a m - 1c m 。 1 3 2 2 亲和素修饰电极 ( 1 ) l b 膜 亲和素能通过疏水键作用强烈地吸附于疏水性表面，l e e 等 4 l 】首先将硬脂酸 制成l b 单分子层膜，用l b 膜包被金属氧化电极制成疏水性表面，由亲和素与 生物素化葡萄糖氧化酶组成的单层或多重复合物直接吸附于疏水性电极表面。但 是，基于l b 膜的葡萄糖传感器的长期稳定性不太令人满意，即使将电极贮存于 低温缓冲液中，制各后不几天，传感器的电流响应也很快逐渐衰减了。l b 膜在 电极表面较弱的粘附可能是这种传感器短命的重要原因。 ( 2 ) 交替沉积 h o s h i 等【4 2 1 报道了一种简易方法调节葡萄糖传感器输出电流的大小，这种方 天津大学硕士学位论文 第一章绪论 法建立在电极表面交智沉积亲和素单分子层和生物素化葡萄糖氧化酶。亲和素和 生物素化酶的交替沉积在电极表面形成一种有序的多分子层蛋白薄膜。因为亲和 素有四个生物素结合位点，而g o x 与大约5 1 个生物素残基连接，这样经交替沉 积所制得的传感器的电流响应将精密地依赖于沉积的g o x 单分子层数目。p a d e s t e 等【4 3 1 利用二茂铁与亲和素的配合物修饰电极，然后层层组装生物素标记葡萄糖 氧化酶年i - $ l 酸氧化酶制各了葡萄糖传感器和乳酸传感器，检测下限分别达到 l m m 和0 1 m m 。 f 3 ) 化学键固定 在a u 基片上通过硫醇进行预处理，然后用e d c 、n h s 活化后固定亲和素， 继而在将生物素标记大分子固定在基片表面。c a r u s o 等 4 4 1 通过此方法将生物素 标记d n a 固定在a u 片表面，用q c m 对其组装进行了表征，制备的d n a 传感 器具有较高的灵敏度。 1 4 研究课题的提出 由于亲和素和生物素间高度的特异性结合力、桥联作用以及多级放大作用， 且多数的蛋白质、酶、抗体、d n a 等可以较容易地生物素化，生物素化后并不降 低其活性，使其在生物学、分子生物学、生物化学、临床医学等领域广泛应用。 生物敏感膜是生物传感器中最关键的部位，而以往和简单吸附、涂层、聚合等常 规制膜不能完全控制分子的取向和排列，不易得到高度的有序膜，且稳定性较差， 灵敏度较低或响应较慢。生物素一亲和素独特的相互作用使其制备的传感器具有 许多优点，除灵敏度较高、响应快、重现性好、可反复活化、寿命较长、特异性 较高、抗干扰能力强外，在一定范围内敏感膜可制成有序排列的多分子层结构， 可方便地设计分子结构单元来赋予膜特定的功能。同时其制备工艺的每一步可分 开分别优化制备，然后通过亲和素生物素将其特异性连接，很容易制成酶免疫 传感器、d n a 、r n a 传感器、双酶或多酶生物传感器。本论文将研究生物素一 亲和素固定化酶的效果，并进一步制各成酶传感器，对其性能进行优化。同时探 索基于生物素一亲和素系统的d n a 传感器，通过纳米微粒质量放大及增效技术， 提高检测精度和灵敏度，缩短响应时间，将其用于检测肿瘤标志物端粒酶活性。 天津大学硕士学位论文第二章应用生物素一亲和素系统固定化酶及其纳米增效的研究 第二章应用生物素亲和素系统固定化酶及其纳米增效的研究 2 1 引言 酶的固定一直是生物传感器研究的关键环节，已有的固定化方法有包埋法、 物理吸附法、共价键合法、化