（发酵工程专业论文）含离子液体的介质中酶促氨基酸酯不对称水解反应的研究.pdf

摘要 摘要 离子液体替代有机溶剂作为绿色反应介质用于生物催化是近年来才兴起的一 个全新领域。作为一种新颖的极性溶剂，离子液体具有可忽略的蒸汽压、高( 热、 化学) 稳定性及对环境友好等有机溶剂不可比拟的优越性，此外，离子液体的极性、 疏水性、粘度及溶解性( 与其它溶剂相混溶性) 等均可通过改变或适当修饰其阳 离子和或阴离子来调节。研究结果表明，许多酶在含离子液体的介质中比在含有 机溶剂的介质中具有更高的活性、选择性及稳定性。含离子液体介质中的生物催 化反应具有巨大的开发潜力及广阔的应用前景。然而，现有的相关研究主要集中 在探讨含离子液体介质中酶催化某一反应的可能性，通过对比研究离子液体和其 他介质中的酶反应以揭示离子液体中酶催化特性的研究报道甚少。基于以上情况， 本论文对比研究了在含不同离子液体或有机溶剂的反应介质中，不同酶催化不同 结构的外消旋氨基酸酯的不对称水解反应，探讨了离子液体对酶促氨基酸酯不对 称水解反应的影响规律，揭示了含离子液体介质中酶的催化特性，并以此为基础， 创立可用于高效制备对映体纯苯甘氨酸的生物催化体系。 反应体系中离子液体b m i m b f 4 ( 1 一丁基一3 一甲基眯唑四氟硼酸盐) 浓度对木 瓜蛋自酶促氨基酸酯不对称水解反应有显著影响。随着b m i m b f 4 浓度的增大， 木瓜蛋白酶促苯甘氨酸甲酯( d ，l p g m e ) 不对称水解反应的初速度不断降低。 另一方面，当b m i m b f 4 浓度从2 5 ( v v ) 增至8 0 ( v v ) 时，反应的对映体 选择性随b m i m b f 4 浓度的增加而显著提高( e 值由2 增至1 0 i ) ；当b m i m 1 3 f 4 浓度超过8 0 ( v v ) 时，对映体选择性随b m i m b f 4 浓度的增大而降低。以4 一 氯苯丙氨酸乙酯、蛋氨酸乙酯和口苯丙氨酸甲酯为底物时，b m i m b f 4 浓度对木 瓜蛋白酶促水解反应的初速度及对映体选择性的影响与其对该酶促d ，l p g m e 水 解反应的影响相似。与有机溶剂( 异丙醇、乙腈、丙酮和叔丁醇) 一缓冲液混合介 质及磷酸缓冲液相比，木瓜蛋白酶在b m i m b f 4 - 缓冲液混合介质中催化以上4 种 氨基酸酯( 苯甘氨酸甲酯、4 氯苯丙氨酸乙酯、口苯丙氨酸甲酯和蛋氨酸乙酯) 不对称水解反应初速度较低，仅为磷酸缓冲液中相应值的5 0 、6 4 、5 2 和3 8 ；但对映体选择性明显提高，对映体选择比( e 值) 分别为磷酸缓冲液中相应 值的5 0 、3 9 、1 3 及2 6 倍。b m i m b f 4 对木瓜蛋白酶促氨基酸酯不对称水解反应 的影响规律相似，但影响幅度因底物结构的不同而异。b m i m b f 4 对酶促氨基酸 酯不对称水解反应的影响还因酶种类的不同迥然而异。木瓜蛋白酶在含 b m i m b f 4 的介质中催化d ，l p g m e 不对称水解反应的初速度低于含有机溶剂的 介质及磷酸缓冲液中的相应值，但对映体选择性高于上述介质中的相应值；碱性 蛋白酶在b m i m b f 4 一缓冲液混合介质中催化d ，l p g m e 不对称水解反应的初速度 华南理_ t 大学硕士学位论文 低f 有机溶剂一缓冲液混合介质及磷酸缓冲液中的相应值，且b m i m b f 。对反应对 映体选择性的影响较小：脂肪酶n o v o z y m4 3 5 在含2 0 ( v v ) b m i m - b f 4 的磷酸 缓冲液中催化d ，l p g m e 不对称水解反应的初速度及对映体选择性均高于含有机 溶剂的介质及磷酸缓冲液中的相应值。离子液体对酶促氨基酸酯不对称水解反应 的影响还因其种类的不同而异。在含b m i m c 1 或b m i m - b r 离子液体的介质中， 酶促d ，l p g m e 不对称水解反应的活性及对映体选择性均较低。 脂肪酶n o v o z y m4 3 5 在含2 0 ( v v ) b m i m b f 4 的磷酸缓冲液体系中能高效 催化苯甘氨酸甲酯不对称水解反应，其反应初速度及对映体选择性均受诸多因素 的影响。该反应的最适底物浓度、缓冲液p h 值、振荡速度和反应温度分别为8 0 m m o l l 、8 0 、1 5 0r m i n 和2 5 3 0 ，在此条件下，酶反应初速度和对映体选择 比( e 值) 分别为2 4 3m m o l l m i n 和3 8 ，反应6 0m i n ，转化率为5 3 0 ，残留 底物的e 一值为9 3 8 。在减压条件下进行该反应，反应初速度及e 值分别提高 至2 6 4m m o l l m i n 和4 3 。该反应符合米氏方程，其表观动力学参数k 。和。 分别为3 7 7m m o l l 和3 5 8m m o l l m i n ；反应的表观活化能e 。为3 9 1 8k j m o l 。 本论文的研究在丰富酶学基础理论知识、奠定离子液体应用于生物催化与生 物转化的理论基础的同时，也提供了制备对映体纯非天然化合物的行之有效的新 途径。 关键词：酶；离子液体；l 一丁基3 甲基咪唑四氟硼酸盐；不对称水解；苯甘氨酸 a b s t r a c t a b s t r a c t i o n i cl i q u i d s ( i l s ) r e p l a c i n go r g a n i cs o l v e n t sa sg r e e nr e a c t i o nm e d i af o r b i o c a t a l y s i sh a sb e e nan o v e lf i e l di nr e c e n ty e a r s a san e wt y p eo fp o l a rs o l v e n t s ， i l sh a v eal o to fs p e c i a lc h a r a c t e r i s t i c sp r e f e r a b l et ot h o s eo fo r g a n i cs o l v e n t s ，s u c h a sn e g l i g i b l e v a p o u rp r e s s u r e ，h i g h ( c h e m i c a la n dt h e r m a l ) s t a b i l i t y a n db e i n g e n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l y m o r e o v e r ，t h ep o l a r i t y ，h y d r o p h o b i c i t y ，v i s c o s i t y a n d s o l v e n tm i s c i b i l i t yo fi l sc a nb ec o n t r o l l e db ya p p r o p r i a t em o d i f i c a t i o no ft h ec a t i o n a n d o ra n i o n i n v e s t i g a t i o n sh a v es h o w nt h a tm a n ye n z y m e sd i s p l a yh i g h e ra c t i v i t y ， s e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t yi ni l c o n t a i n i n gs y s t e m sc o m p a r e dt o t h o s ei n o r g a n i c s o l v e n t c o n t a i n i n gs y s t e m s a c c o r d i n g l y ，b i o c a t a l y t i cr e a c t i o n s i ni l c o n t a i n i n g s y s t e m se x h i b i tg r e a td e v e l o p m e n t a lp o t e n t i a l a n dw i l lf i n dw i d ea p p l i c a t i o n s h o w e v e r ，m o s to ft h ep r e s e n ts t u d i e si nt h i sf i e l dw e r ef o c u s e do nt h ee x p l o r a t i o no f t h ep o s s i b i l i t yo fac e r t a i nr e a c t i o ni ni l c o n t a i n i n gs y s t e m s ，a n dt h e r eh a v eb e e nf e w r e p o r t sa b o u tt h ec h a r a c t e r i z a t i o no fe n z y m e si n i l sv i ac o m p a r i s o nb e t w e e nt h e e n z y m a t i cr e a c t i o n si ni l sa n di no t h e rm e d i a t h e r e f o r e ，c o m p a r a t i v es t u d yw a s m a d eo fa s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fv a r i o u ss u b s t r a t e sc a t a l y z e db yd i f f e r e n te n z y m e s i nm e d i ac o n t a i n i n gd i f f e r e n ti l so ro r g a n i cs o l v e n t si nt h i sd i s s e r t a t i o n t h ee f f e c t s o fi l so ne n z y m a t i ca s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fa m i n oa c i de s t e r sw e r ee x a m i n e da n d e n z y m a t i cp e r f o r m a n c e si nm e d i aw i t hi l sw e r ec h a r a c t e r i z e d a d d i t i o n a l l y ，an o v e l b i o c a t a l y t i c r e a c t i o ns y s t e mu s e df o rh i g h l ye f f i c i e n tp r e p a r a t i o no fe n a n t i o p u r e p h e n y l g l y c i n eh a sb e e nw e l le s t a b l i s h e d c o n c e n t r a t i o no fi lb m i m b f 4 ( 1 一b u t y l - 3 m e t h y l i m i d a z o l i u mt e t r a f i u o r o b o r a t e ) i nt h er e a c t i o n s y s t e m i n f l u e n c e dm a r k e d l yt h ep a p a i n c a t a l y z e da s y m m e t r i c h y d r o l y s i so fa m i n oa c i d e s t e r s t h ei n i t i a lr a t eo fp a p a i n - m e d i a t e da s y m m e t r i c h y d r o l y s i s o fd ，l p h e n y l g l y c i n em e t h y le s t e r ( d ，l - p g m e ) d e c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s i n gi lb m i m b f 4c o n t e n t o nt h eo t h e rh a n d ，t h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h e r e a c t i o nw e n tu 口r e m a r k a b l yw i t ht h ei n c r e a s ej ni lb m i m t b f 4c o n t e n tf r o m2 5 ( v v ) u pt o8 0 ( v v ) ( ev a l u ei n c r e a s e df r o m 2t o 1 叭) ，a n df u r t h e ri n c r e a s ei ni l c o n c e n t r a t i o nl e dt oad r o pi nt h ee n a n “o s e l e c t i v i t y w i t hd ，l 一4 一c h l o r o - p h e n y l a l a n i n e e t h y le s t e r ，d ，l 印- p h e n y l a l a n i n em e t h y le s t e ra n dd ，l m e t h i o n i n ee t h y le s t e rb e i n g s u b s t r a t e s t h ee f f e e to fi lb m i m b f 4c o n c e n t r a t i o no nt h ei n i t i a lr a t ea n d e n a n t i o s e l e c t i v “yw a ss i m i l a rt ot h ec a s ew i t hd ，l p g m e c o m p a r e dt oo r g a n i c i l l 华南理工大学硕士学位论文 s o l v e n t ( 2 - p r o p a n o l ，a c e t o n i t r i l e ，a c e t o n ea n dt e r t b u t a n 0 1 ) - b u f f e rc o s o l v e n tm i x t u r e s a n dp h o s p h a t eb u f f e r ，ar e m a r k a b l ee n h a n c e m e n ti nt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t y ( ev a l u e ) o f p a p a i n m e d i a t e da s y m m e t r i ch y d r o l y s i s o ft h ea b o v ef o u ra m i n oa c i de s t e r s ( d ，l p h e n y l g l y c i n em e t h y le s t e r ，d ，l - 4 - c h l o r o - p h e n y l a l a n i n ee t h y l e s t e r ， d ，l - p p h e n y l a l a n i n em e t h y l e s t e ra n dd ，l m e t h i o n i n e e t h y le s t e r l w a so b s e r v e d u s i n gb m i m b f 4 一b u f f e rc o s o l v e n tm i x t u r ea st h er e a c t i o nm e d i u m ，w h i c hw e r e5 0 ， 3 9 ，13a n d2 6t i m e sh i g h e rt h a nt h o s ei np h o s p h a t eb u f f e r ，t h o u g hw i t hl o w e ri n i t i a l r a t e ，w h i c hw e r eo n l y5 0 ，6 4 ，5 2 a n d38 o ft h o s ei np h o s p h a t eb u f f e r t h e t e n d e n c yo fi lb m i m b f 4e f f e c to nt h ea s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fa m i n oa c i de s t e r s c a t a l y z e db yp a p a i nw a ss i m i l a rb u tv a r i e dw i t hv a r i o u ss u b s t r a t e si nd e g r e e h o w b m i m b f 4a f f e c t st h ee n z y m a t i ca s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fa m i n oa c i de s t e r sa l s o d e p e n d o nt h e e n z y m eu s e d t h ei n i t i a l r a t eo fp a p a i n m e d i a t e da s y m m e t r i c h y d r o l y s i s o fd ，l p g m ew a sl o w e ri nt h ei lb m i m b f 4 - c o n t a i n i n gs y s t e mt h a n t h o s ei no r g a n i cs o l v e n t c o n t a i n i n gs y s t e m so rp h o s p h a t eb u f f e r ，b u tw i t ht h eh i g h e s t e n a n t i o s e l e c t i v i t y t h ea s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fd ，l p g m em e d i a t e db ya l c a l a s e p r o c e e d e dw i t h l o w e ri n i t i a lr a t e c o m p a r e dt ot h o s ei no r g a n i cs o l v e n t c o n t a i n i n g s y s t e m so rp h o s p h a t eb u f f e r ，a n dl i t t l e e f f e c to fb m i m b f 4o nt h ee n a n t i o s e l e c t i v “y o ft h er e a c t i o nw a so b s e r v e d c o m p a r e dt oo r g a n i cs o l v e n t - c o n t a i n i n gs y s t e m so r p h o s p h a t eb u f f e r ，n o v o z y m4 3 5 一m e d i a t e da s y m m e t r i ch y d r o l y s i s o fd ，l p g m e p e r f o r m e dw i t hh i g h e ri n i t i a l r a t ea n de n a n t i o s e l e c t i v i t yi nb m i m b f 4 一c o n t a i n i n g s y s t e m a l s o ，t h ee f f e c to fi lo nt h ee n z y m a t i ca s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fa m i n oa c i d e s t e r sv a r i e dw i t hi l s w h e nt h ee n z y m a t i ca s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fd ，l p g m e p e r f o r m e di nt h em e d i ac o n t a i n i n gi lb m i m c 1o rb m i m b r ，e n z y m e sd i s p l a y e d m u c hl o w e ra c t i v i t ya n de n a n t i o s e l e c t i v i t y e f f i c i e n ta s y m m e t r i ch y d r o l y s i so fd l p g m ec a t a l y z e db yn o v o z y m4 35c o u l d b ep e r f o r m e di nt h ep h o s p h a t eb u f f e ro f2 0 ( v v ) b m i m b f 4 m a n yf a c t o r ss h o w e d e f f e c to nt h ei n i t i a lr a t ea n de n a n t i o s e l e c t i v i t y t h eo p t i m a ls u b s t r a t ec o n c e n t r a t e ， b u f f e rp h s h a k i n gr a t ea n dt e m p e r a t u r ew e r e8 0m m o l l ，8 0 ，15 0r m i na n d2 5 3 0 。c 。r e s p e c t i v e l y u n d e rw h i c ht h ei n i t i a lr a t ea n de n a n t i o m e r i cr a t i o ( ev a l u e ) o ft h e r e a c t i o nw e r e2 4 3m m o l l - m i na n d3 8 ，r e s p e c t i v e l y a f t e rar e a c t i o nt i m eo f6 0m i n ， e n a n t i o m e r i ce x c e s s ( p e 1o f t h er e s i d u a ls u b s t r a t e so f 9 3 8 a ts u b s t r a t ec o n v e r s i o n o f5 3 o c o u l db ea c h i e v e d w h e nt h er e a c t i o nw a sc a r r i e do u ti nr e d u c e dp r e s s u r e ， t h ei n i t i a lr a t ea n dev a l u ew e n tu dt o2 6 4m m o l l - m i na n d4 3 ，r e s p e c t i v e l y t h e r e a c t i o na e c o r d d e dw i t hm i c h a e l i s - m e n t e ne q u a t i o na n dt h ea p p a r e n tk i n e t i c p a r a m e t e r sk ma n d a xw e r e3 7 7m m o l l 和3 5 8m m o l l m i n ，r e s p e c t i v e l y a n d t h ea c t i v a t i o ne n e r g ye af o r t h er e a c t i o nw a s3 9 1 8k j t 0 0 1 t h i ss t u d yn o to n l ye n r i c h e so u rk n o w l e d g eo ff u n d a m e n t a le n z y m o l o g ya n d e s t a b l i s h e st h et h e o r yo fa p p l y i n gi l st ob i o c a t a l y s i sa n db i o t r a n s f o r m a t i o n ，b u ta l s o p r o v i d e san o v e la n de f f i c i e n tr o u t ef o rt h ep r e p a r a t i o no fe n a n t i o p u r eu n n a t u r a l c o m p o u n d s k e y w o r d s ：e n z y m e ；i o n i cl i q u i d ； l b u t y l 一3 一m e t h y l i m i d a z o l i u m t e t r a f l u o r o b o r a t e ： a s y m m e t r i ch y d r o l y s i s ；p h e n y l g l y c i n e v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 词羽睦 日期：如盯年6 月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名： 导师签名： 日期：加r 年6 月弓日 日期：埘年月j 日 第一章绪论 1 1 离子液体 第一章绪论 离子液体( i o n i cl i q u i d ) 是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的、在室 温或较低温( 1 0 0 ) 下呈液念的盐类，通常称为室温离子液体( r o o m t e m p e r a t u r e i o n i cl i q u i d ) i t 。其作为一种新颖的极性溶剂，具有可忽略的蒸汽压、非挥发性、 高( 热、化学) 稳定性及对环境友好等特性，故称之为绿色溶剂( g r e e ns o l v e n t s ) 。 离子液体的极性、疏水性及溶解性( 与其它溶剂相混溶性) 等均可通过改变或适 当修饰其阳离子和或阴离子来调节，故又称之为“设计溶剂”( d e s i g n e d s o l v e n t s ) 【2 1 。 近年来，溶剂工程的一个重大发展就是利用离子液体替代传统的有机溶剂作 为绿色反应介质应用于生物催化过程1 3 - 一1 。2 0 0 0 年，c u l l 等【5 1 首次报道了 r h o d o c o c c u sr 3 1 2 细胞在离子液体b m i m p f 6 ( 】- 丁基3 甲基咪唑六氟磷酸盐) 水双相体系中催化1 ，3 。二氰基苯水解生成3 氰基苯酰胺，并发现离子液体 b m i m p f 6 对微生物细胞的毒性远远小于有机溶剂甲苯。e r b e l d i n g e r 等t q 成功地将 离子液体b m i m p f 6 ( 含5 的水) 用于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的合成，研究结果 表明嗜热菌蛋白酶在b m i m p f 6 中不仅具有较高的催化活性，而且具有极高的稳 定性。随后，有关离子液体中酶催化反应的报道日渐增多。研究结果表明，许多 酶在离子液体中具有较高的活性、( 立体、区域) 选择性及稳定性1 7 4 1 。离子液体 巾的生物催化已成为一个崭新的研究领域，其为溶剂工程应用于生物催化过程提 供了新的可能和机遇，已成为当今生物催化研究的热点，显示出相当诱人的应用 自u 景。 1 1 1 离子液体的分类 离子液体由有机阳离子和无机或有机阴离子构成，通过其阳离子阴离子的不 同组合，可以设计出不同的离子液体。常见的离子液体的阳离子有1 ，3 二烷基取 代的咪哗阳离子( ，- 二烷基取代的咪唑阳离子) 、n 烷基取代的吡啶阳离子及烷 基季铵阳离子，其中以1 , 3 二烷基取代的咪唑阳离子构成的离子液体最为稳定。 构成离子液体的阴离子主要分为两大类：一类是a 1 c 1 3 ( a 1 b r 3 ) 型，如b m i m ( 1 丁基3 甲基咪唑基) c i a 1 c 1 3 。此类离子液体虽然具有许多优点，但其对水 极其敏感，遇水则分解成腐蚀性的h c l ，且其在空气中不稳定，这限制了它们的 广泛应用。另一类是非a 1 c 1 3 ( a i b r 3 ) 型。1 9 9 2 年，w i l k e s 领导的研究小组合成了 华南理工人学硕士学位论文 系列由咪哗阳离子与b f n 、p f 6 - 阴离子构成的对水和空气都很稳定的离子液体 m j ；随后，人们合成了许多由不同有机阳离子和无机阴离子构成的离子液体m ，。 此类离子液体被称为新离子液体，它们不仅具有不同于a i c l ，类离子液体的性质， 并且非常稳定。迄今，作为绿色溶剂用于生物催化的离子液体主要是由1 ，3 一二烷 基取代的咪唑阳离子、烷基取代的吡啶阳离子及烷基季铵等阳离子与不同阴离 子组成的离子液体( 表1 1 ) 。 表1 1 常用于生物催化中的离子液体 t a b l e1 - 1i o n i cl i q u i d so f t e nu s e di nb i o e a t a l y s i s a l k y - 3 一m c t h y l i m i d a z o l i u mc a t i o n s1 - a k y l p y r i d i n i u mc a t i o n s a i 姆l a m m o n j u mc a t i o n s 旷 、吣x 吣多一曲 a b b r e v i a t i o nrx r l r 4 曲二- x 。 i ， m m i mm e s 0 4c h 3 c h 3 0 s 0 3e p y t f a hc 2 h 5 c f 3 c o ： e t n h 3 n 0 3c 2 h sh hhn 0 3 e m i mb f 4 c 2 也 b f 4b m p y b f 4c h 3h c 4 h 9b r e m i m if 2 n c 2 h 5 ( c f a s o z ) 2 n e m i me t s 0 4 c 2 h 5c 2 h so s 0 3 b m i mp f 6 * c 4 h 9p f 6 b m i m b f 4n - c 4 h 9b f 4 b m l mt f o n - c 4 h 9 c f 3 s 0 3 b m i mt f ：nn - c 4 h 9 ( c f 3 s 0 2 ) 2 n b m i m m e s o qn - c 4 h 9c h ，o s 0 3 b m i m e t s 0 4”一c 4 h qc 2 h 5o s 0 3 b m i mn 0 3一c 4 h 0n 0 3 b m i m c ih - c 4 h 9 c i b m i ml a c t a t e 月- c h qc h 3 c h ( o h ) c o o h m i m p f 6n - c 6 h op f 6 o m l mb f 4n - c 8 h l7b f 4 o m l mp f 6 c s h t7p f 6 m o e m i mb f 4c h j o c 2 h 4b r 2 第一章绪论 1 1 2 离子液体的优点 离子液体作为绿色溶剂己广泛地应用于化学过程( 萃取、化学催化) ，并取得 了令人满意的结果。近年来，离子液体应用于生物催化已成为研究热点之一。离 子液体之所以受到人们的青睐主要是因为其与传统的有机溶剂相比，具有如下突 出的优点】： 1 1 。2 1 非挥发性离子液体具有可忽略的蒸汽压，可用于真空体系中进行反应， 在线分离易挥发性的产物。在此过程中生物催化剂不仅不失活，而且还可循环利 用。既能减少因挥发而导致的环境污染问题，又降低了生产成本。 i 1 2 2 良好的溶解性能离子液体能很好地溶解许多有机物、无机物和聚合物等 物质m ，包括强极性物质( 如氨基酸及其衍生物、碳水化合物) 和弱极性物质( 如 苯、甲苯) 。对于难溶于有机溶剂的化合物进行在水溶液中受热力学限制的合成反 应来说，离子液体是最适的反应介质。 1 1 2 3 液态温度范围大大部分离子液体在3 0 0 时仍能保持液体状态。因此 离子液体是那些因温度过高而不能在有机溶剂中进行的反应之良好介质。 1 1 2 4 “设计溶剂”离子液体的溶剂特性( 极性、疏水性、粘度和溶解性) 均可 通过改变或适当修饰其阳离子和或阴离子来调节 8 a 9 - 2 0 】，因此，可根据实际需求， 设计具有理想溶剂特性的离子液体。 1 1 2 5 利于( 生物) 催化剂的回收重复利用将离子液体与超临界二氧化碳形 成的双相体系用于生物催化，可实现难挥发性产物的在线分离，并且生物催化剂 在此两相体系中具有很高的稳定性。 1 2 酶在离子液体中的催化特性 1 2 1 酶的活性 酶在离子液体中的活性因酶的种类、离子液体的种类和浓度的不同而异。1 9 8 4 年，m a g n u s o n 等【2 l 】发现来源于大肠杆菌( e c o l i ) 的碱性磷酸酯酶在含e t n h 3 n 0 3 ( 乙胺硝酸盐) 离子液体的水溶液中仍具有催化活性，研究结果表明，酶在含较 低浓度离子液体的介质中具有较高的活性，当离子液体浓度为1 0o 6 ( v v ) 时， 华南理工大学硕士学位论文 酶的活性达到最大值；当离子液体浓度较高时，酶明显失活，但将反应介质稀释 至离r 液体浓度为1 0 ( v v ) 时，酶的活性可完全恢复；当离子液体的浓度高 达8 0 ( v v ) 时，酶将不可逆失活。同样，已变性的溶菌酶在5 ( v v ) e t n h 3 n o ， 的水溶液中能恢复活性，这表明了离子液体可作为溶菌酶的复性剂【2 2 1 。随后，有 关脂肪酶、蛋白酶、氧化还原酶及醇腈酶在离子液体中仍具有较高催化活性的报 道相继出现”r 2 6 1 。通常酶在含b f 4 。、p f 6 - 和t f 2 n 等阴离子的离予液体中具有活 性，而在含c i 。、n 0 3 一、c f 3 s 0 3 一、c f 3 c o o 和c h 3 c o o 等阴离子的离子液体中较 易失活，这可能与离子液体的阴离子之氨键碱性有关2 7 1 。阴离子上负电荷越分敝， 氢键碱性就越低，则酶越稳定，酶活越高。由于b f 4 阴离子中负电荷分散在四个 氟原子上，p f s 阴离子中负电荷分散在6 个氟原子上，t f 2 n 一阴离子中负电荷分散 在5 个原子上，这样较低的氢键碱性将减小其对酶分子内部氢键的影响，冈此， 酶表现出较高的活性。a n d e r s o n 等m i 发现酶在氢键碱性较高的b m i m c i 离子液体 中失活，这与以上理论相一致。在离子液体b m i m n 0 3 、b m l m c h 3 c h ( o h ) c o o 、 b m i m - e t s 0 4 、e t n h 3 n 0 3 中，脂肪酶c a l b ( c a n 讲d aa n t a r c t i c al i p a s eb ) 没有 催化活性，但用水将离子液体稀释5 0 倍后，酶表现出一定的催化活性【2 9 ，。 1 2 2 酶的选择性 酶在有机溶剂中的刚性结构会导致其选择性的改变 3 0 - 3 2 。与有机溶剂相似， 离子液体也可通过其阴阳离子与酶分子活性位点的相互作用，影响酶分子的构象， 改变其结构的刚性，同时通过影响底物的溶剂化及底物和产物在反应体系中的分 配，显著地影响酶的选择性1 7 1 。例如脂肪酶c a l b ( c a n 西d aa n t a r c t i c al i p a s eb ) 和p c l ( p s e u d o m o n a sc e p a c i a l i p a s e ) 在离子液体( 如e m i m b f 4 ( 1 乙基3 甲基昧 唑四氟硼酸盐) 、b m i m p f 6 ) 中催化手性醇转酯反应的对映体选择性远远高于在 有机溶剂( 如四氢呋喃、甲苯) 中的对映体选择性1 。又如脂肪酶( a l c a l i g e n e ss p 1 i p a s e ) 在有机溶刹甲基叔丁基醚中具有活性，但未表现出对映体选择性，然而其 在离子液体o m i m b f 。或b m i m t f o 中不仅具有较高的活性。而且还呈现出颇高 的对映体选择性m 】。离子液体不仅可提高酶的对映体选择性，而且还能改变酶的 底物选择性，拓展酶的底物谱。如枯草杆菌蛋白酶a l c a l a s e ( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m s p r o t e a s e ) 在乙腈的水溶液中不能催化丝氮酸甲酯及4 氯苯丙氨酸乙酯的水解，但 在离子液体e p y t f a ( n - 乙基吡啶三氟乙酸盐) ( 1 5 ，v v ) 的水溶液中，上述水 解反应能顺利进行，并产生较高对映体纯度的氨基酸【3 5 】。k i m 等m 】研究酶促葡糖 苷酰化反应时，发现脂肪酶c a l b 在离子液体b m i m p f 6 和m o e m i m p f e ( 1 一甲 氧基乙基3 甲基咪唑六氟磷酸盐) 中的区域选择性明显高于以有机溶剂四氢呋喃 和氯仿为介质的对应值。同样，与在四氢呋喃中相比，脂肪酶p c l 在离子液体 4 第一章绪论 b m i m p f 6 中催化3 , 4 ，6 o 乙酰- d 己烯糖水解和醇解的区域选择性大大提高i 。 i 2 3 酶的稳定性 许多酶在离子液体中比在水或有机溶剂中具有更高的稳定性。如在1 2 0 下， 脂肪酶c a l b 在b m i m t f 2 n 离子液体中连续作用4h 后活性为初始活性的6 5 以上，固定化脂肪酶n o v o z y m4 3 5 在1 5 0 下于b m i m t f 2 n 超临界二氧化碳体 系巾连续使用1 0h 后，其活性几乎未下降，而在此高温下，脂肪酶在有机溶剂中 迅速变性失活1 3 8 。a 胰凝乳蛋白酶在b m i m p f 6 离子液体中的稳定性是其在1 丙 醇中稳定性的1 7 倍，当有底物存在时，其在离子液体中的半衰期能延长2 0 0 倍m ，。 这是因为在离子液体中酶分子结构变得更为刚性，并且离子液体在酶分子周围形 成一层保护膜或者将酶包裹于其中，使酶不易受到变性因素的影响而失活。 1 3 离子液体中的生物催化与生物转化 近年来，离子液体替代挥发性有机溶剂作为绿色反应介质，已成功地用于生 物催化与生物转化。在许多情况下，离子液体中酶催化活性、( 立体、区域) 选择 性和稳定性同传统的有机介质相比，得到了显著的提高。因此，其在酶催化方面 表现出诱人的应用前景，有关的研究进展迅速。迄今，离子液体作为反应介质应 用于生物催化与生物转化的研究主要有如下几个方面。 1 3 1 离子液体中酶促水解反应 水解酶( h y d r o l a s e s ) 是最常用的生物催化剂，占生物催化反应用酶的6 5 ， 它们能水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物、腈等化合物，其中酯酶、 脂肪酶和蛋白酶是不对称合成中最常用的水解酶。 脂肪酶( l i p a s e ，e c3 1 1 _ 3 ，甘油酯水解酶) 也称甘油三酯水解酶，是一种 缝氨酸型水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中。不同来源的脂肪酶， 其氨基酸残基的数量从2 7 0 到6 4 1 个不等，且疏水性氨基酸残基比亲水性氨基酸 残基多。虽然这些脂肪酶的氨基酸序列大不相同，但都具有一个共同的结构特点， 即a p 折叠结构：含有伊折叠的核和被6 t 一螺旋包围并指向酶的活性中心的三元复 合物，这个复合物为含a s p h i s