（材料学专业论文）用于癌症靶向治疗的超微磁性载体粒子研究.pdf

摘要 本文主要研究以聚合物基共沉淀法( c o - p r e c i p i t a t i o nw i t hp o l y m e rm a t r i x ) 制备粒径小于l o o n m 、表面包覆聚合物材料且具有超顺磁特性的超微磁性载体粒 子( m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ，m n p s ) 。研究中就聚合物基共沉淀法各因素，包括 聚合物浓度、三价铁盐与二价铁盐配比、沉淀剂( n a o h ) 浓度、反应温度和搅 拌速度等，对制各工艺进行了优化，确定了稳定制备粒径超微且具有超顺磁特性 的磁性载体粒子的最佳制备条件。实验所制备的超微磁性载体粒子的粒径及其分 布、表面聚合物包裹情况，以及磁性能等分别由电子透射显微镜( t e m ) 、原子 力显微镜( a f m ) 、红外光谱( 取) 、x 射线光电子能谱( x p s ) 和v s m 法( v i b r a t i n g s a m p l e sm a g n e t o m e t e r , l d j 9 6 0 0 1 ) 进行了表征。 本文首先成功制各了具有广泛应用前景的葡聚糖磁性载体粒子，在此基础 上，为了开发一种全新的超微磁性载体系统，本文经过考察多种具有生物活性且 能与金属离子络合或螯合的高分子材料，最终选择了缓释能力突出，且水溶的 o 一羧甲基壳聚糖( o - c m c ) 为包裹的聚合物材料，并率先以聚合物基共沉淀法 制各了平均粒径为4 0 n m ，具有超顺磁特性的0 一羧甲基壳聚糖磁性载体粒子。同 类试验在国内外尚未有报道。 本文制备的超微磁性载体粒子在自建的外靶向模型中进行了定位性测试，测 试中主要考察了载液流速与磁场强度对载体粒子定位性能的影响，并通过计算机 对相关数据进行了回归处理，得到了载液流速、磁场强度与粒子聚集率之间关系 的回归方程，并以理论推导与实验证明相结合的方式得到了两种超微磁性载体粒 子的定位聚集条件，证明了两种载体粒子在体内血液微循环系统中稳定聚集的可 能性。 本文最后考察了制备的超微磁性载体粒子的载药性能，分别以过碘酸盐氧化 还原法和碳二亚胺法将所制备的两种超微磁性载体粒子与抗癌药物一甲氨喋呤 ( m i x ) 偶联，制得了甲氨喋呤一超微磁性载药粒子，并通过m r r 法对载药粒子 进行了体外细胞试验。结果证明，超微磁性载药粒子具有很好的抑制肿瘤细胞和 缓释药物的功效，而超微磁性载体粒子本身则具有良好的生物体内相容性。 关键词：聚合物基共沉淀法葡聚糖0 一羧甲基壳聚糖超微磁性载体粒子 a b s t r a c t t h eg o a lo ft h i ss t u d yw a st h ep r e p a r a t i o no fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ( m n p s ) a s d r u gd e l i v e r ys y s t e m sf o rc a n c e rt r e a t m e n t ，m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s w e r e p r e p a r e d b ya m e t h o do fc o - p r e c i p i t a t i o nw i t hp o l y m e rm a t r i x t h er a wm a t e r i a l sa r ef e r r i c c h l o r i d ea n df e r r o u sc h l o r i d e ，a n dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r ep r o v i d e db ya d d i n g s o d i u mh y d r o x i d et od e x t r a na q u e o u ss o l u t i o n a f t e rp r e c i p i t a t i o n , t h em a g n e t i c p r e c i p i t a t e w a s p u r i f i e d v i am e m b r a n e d i a l y s i s a n d h i g hs p e e dc e n t r i f u g a t i o n r e s p e c t i v e l y p r e c i p i t a t i o nw a sm a i n l ye f f e c t e dw i mt h ec o n c e n t r a t i o no fb a s ea n dm a t r i x ， f e ”f e ”m o lr a t e r e a c t i o n t e m p e r a t u r e a n d s t i r r i n g r a t e a l lt h ef a c t o r sw e r e i n v e s t i g a t e d a n dt h e t e c h n i q u e o f p r e p a r i n g t h e s m a l l e s t ( 10 0 n m ) m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s w a so p t i m i z e di nt h i s s t u d y d e x t r a nm a g n e t i cn a n o p a r t i c l c e sa n d o c a r b o x y m e t h y l a t e dc h i t o s a n ( o c m c ) m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s 埘t ht h es m a l l e s t a v e r a g ed i a m e t e r ( 8 0 ) a n ds h o w e da s u s t a i n r e l e a s eb e h a v i o ri as e v e r a ld a y s e s p e c i a l l ys u s t a i n - r e l e a s eb e h a v i o ro f t h em t x - o c m cm n pi sm o r eo b v i o u s 、w h i c h p r o v i d e d af o u n d a t i o nt ot h ea n i m a l e x p e r i m e n t a n de l i n i c a le x p e r i m e n t k e yw o r d s ：d m gd e l i v e r ys y s t e m ，c o - p r e c i p i t a t i o nw i t hp o l y m e rm a m x ， m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ，d e x t r a n ，0 - c a r b o x y m e t h y l a t e dc h i t o s a n 独创性声明 本入声明所星交的学位论文是本人在罾师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外。论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获樗鑫鲞叁茎或其他教育机构的学位或 证书飚使用过的材料。与我一囝工作鲍同志对本研究所做的经何贡献均已在论 文中依了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：签字舀期：年月鼯 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者宪全了解鑫邃盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫逮基釜可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数掇库进行棱 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和偌阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密嚣适用本授权说明) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月 联签字目期：年月目 第一章绪论 第一章绪论 1 1 前言 现在用于临床癌症治疗的最常用的方法是化学疗法( 化疗) 。化 学药物一般对延长晚期癌症患者的寿命有着显著的药理效果。但是， 化学药物在治疗过程中存在着许多不可预测的副面作用，尤其是其 对正常组织细胞的毒害，使得化疗的临床应用受到很大的限制。 系统化疗的主要问题在于：存在全身的药物再分布：药物 缺乏对病理部位的特异亲和性；用药达到很大剂量才能在靶部位 产生一个较高的局部浓度；因给药量大而对正常组织产生非特异 性的毒副作用 2 】。为了避免化学药物对正常组织的毒害，人们尝试 用局部化学疗法代替全身化学疗法。这样的话，不但可以减少药物 对正常细胞的毒副作用，而且可使药物只在肿瘤部分积聚，以形成 高浓度的药物环境，从而大大提高药效。药物靶向治疗可以有效解 决这些问题【3 】。于是，医药科学家们开始致力于开发一种癌症治疗 中普遍适用的局部药物投递系统。在此类课题的研究中，以磁性微 粒为载体的新型药物投递系统显示出了巨大的发展潜力。 磁性微粒具有磁响应性和微球特性，使其在生物、医学及其他 诸多领域有广阔的应用前景。早在五十年代，人们就注意到磁性凝 胶粒子在离子交换剂方面的应用，到七十年代才开始注意到它在生 物、医学方面的应用，七十年代末八十年代初，磁性微粒的制备得 到了初步的发展。近年来制备适应不同要求的磁性微粒已成为一个 很活跃的研究领域。尤其是用作药物载体的磁性微粒的合成发展很 快。 赋于微粒以磁性，要求将磁性物质结合于微粒中。目前在磁性微 粒合成方面主要使用无机磁性材料，其中磁性氧化铁应用最广。磁 性氧化铁与高分子间的结合方式主要为核壳式，一般以磁粒子组成 磁核，高分子在其表面形成壳；但是也有以微粒为核，磁性粒子沉 积在其表面形成壳的例子，或者夹心式结构等。核壳间结合力可以 是吸附，也可以是配位键或共价键等形式。磁性微粒的制备过程将 影响其形态、粒径分布、磁响应性和表面特性。 磁性微粒表面可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、d n a 或r n a 等， 因而在细胞生物学，分子生物学、免疫测定、医学等 领域得到广泛应用。磁性微粒用于癌症治疗最早始于2 0 世纪6 0 年 第一章绪论 代初。在此期间，磁性微粒作为药物投递系统在实验模拟阶段已初 见成效，但由于缺乏必要的动物实验和临床考察，并未引起太大的 重视。四十多年后，随着分子生物学技术的飞速发展和纳米技术研 究的深入，以纳米磁性材料为核心的药物投递系统不断在动物试验 和临床癌症研究中被采用，并且获得了前所未有的成功。 1 2 磁性载体粒子的概况介绍 磁性载体粒子是一种广泛应用于癌症治疗的磁性材料，医用磁性 载体粒子主要是由铁微粒( 或铁氧微粒) 和其它活性成分构成的超 微粒子1 4 】。其粒子本身具有生物相容性，并可体内降解。这些超微粒 子具有较强的药物承载能力，抗癌药物可通过一定的物理吸附作用 或化学键与其相连，形成“载体一药物”偶联体系。该体系经由动脉 或静脉注射进入体内，在外加磁场的引导下聚集到癌细胞组织处释 放药物，进行治疗，这样从根本上减少了药物对正常细胞组织的侵 害，降低了毒副作用。同时，在治疗中，药物又在载体粒子的控制 下集中释放，在肿瘤部位形成高浓度药物环境，进一步加强了药效。 由于载体粒子的传递动力来自于外加磁场，并在体内传输，所以 它们的磁化性质，分散性和凝聚度都是决定其功效的重要条件1 4 1 。通 常，我们通过在制备磁性载体粒子的过程中加入表面活性剂来确保 载体微粒( 在体液中) 能稳定传输而不凝结。又通过控制载体粒径 来改变磁粒磁化性质，制得高磁化率和高磁化饱和强度的载体微粒。 以前一般地认为，微粒直径小于0 1um ，其磁矩较小而相对面积较 大，这使得载体微粒在可提供的医用磁场力下，难以克服( 体液中 的) 流动阻力进行传递，但随着纳米技术和永磁体制造工艺的不断 成熟，目前使用的载体微粒粒径都在1 0 0 n m 以下。一般地还认为， 如果磁粒粒径太大，超过2hr n 时，磁性载体粒子在载液中几乎不能 形成稳定的分散相。如果仍然用导管注射到体内，会产生较强的机 体排抑现象”l 。所以，有效控制载体粒径是目前磁性载体粒子发展到 临床应用阶段的重要课题之一。同时，作为磁性载体粒子传输动力 的外加磁场，其提供的磁场力必须足以使载体微粒穿透毛细血管网 深入到靶组织中，从而克服肿瘤压力和抗药性对疗效的影响。 综上可见，这项新型的药物投递技术不仅运用了微生物学特性， 而且还利用了磁场力的物理作用，在癌症治疗中显然比单纯的使用 放化疗方法更为安全有效。 第一章绪论 1 2 1 磁性载体粒子的组成 磁性载体粒子一般由两部分组成，即磁性微粒和骨架材料。 通常应用的磁性物质有纯铁粉、羰基铁、磁铁矿、正铁酸盐等。 作为磁性药物微球所需的磁性氧化铁粒度越小越好。一般直径在1 0 3 0 n m 。1 9 7 9 年w i d d e r 首次详细叙述了含有盐酸阿霉素的、以f e 3 0 4 为磁粒的磁性白蛋白微球体的制做方法。我国学者王平康等对作为 微球磁粒的磁性物质作了较详细的研究，对纯铁粉、羰基铁、磁铁 矿、铁酸盐、铁铝合金、铁蛋白、r - f e 2 0 3 ，c o m n p 及b a f e l 2 0 19 等 2 0 种材料分别进行了编号筛选，最佳选用以氧化铁为基材的掺有 族元素的化合物，而且发现此种铁粒子具有粒径小、灵敏度高、毒 性低、磁场动作距离大、原料易得等优点。 作为骨架材料应具有一定的通透性以便药物的释出，而且要对 人体无毒，能被体内逐步降解清除。符合这些条件的骨架材料可分 为氨基酸聚合物类、聚多糖类及其它骨架材料。氨基酸聚合物类又 分为天然的和合成的两类，天然的氨基酸聚合物有白蛋白、明胶、 球蛋白、酶类。合成的氨基酸聚合物主要是多肽如聚赖氨酸、聚谷 氨酸等。其中自蛋白最常用。聚多糖骨架材料有：淀粉、葡聚糖、 聚甲壳糖、阿拉伯胶、西黄蔷胶、刺梧桐树胶、鹿角荣果胶、聚半 乳糖醛酸、印度树胶等。其它聚合物骨架材料还有：乙基纤维素、 聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯、聚丙烯酸、聚烷基氰基丙 烯酸、聚苯乙烯以及天然的细胞如红细胞等。 上述这些材料都具有定的通透性，对人体无毒性大部分在人 体组织内能被逐渐地溶解或消化同时把包裹的药物按一定速度逐 渐释出 2 1 。其中，本文结合实验要求及现况，重点考察了下面几种多 糖类骨架材料。 ( 1 ) 葡聚糖 葡聚糖为高分子葡萄糖聚合物，学名右旋糖苷。主要有以下特性 a 在强碱溶液中能与多种金属离子形成络合物； b 能和生理盐水配成与人体血液相似的溶液： c 有着较好的生物相容性和生物降解性； d 作为一种聚合度较高的高分子，作为基质材料承载药物， 可以有效的提高载药率； e 安全、无毒、无害。 第一章绪 论 因其胶体渗透压高，可将组织中的液体吸收入血，使血液稀释， 且有抗凝作用，因此是一种良好的改善微循环的药物，常用于冠心 病、心绞痛及一些微循环障碍的疾病【2 】。同时，由于它的扩容作用， 亦被用作血液增容剂或血液代用品的基质材料。早在上个世纪初， 葡聚糖己开始在食品，生化领域被大量运用。同时，它也是第一批 被用做骨架材料的多糖类物质。 ( 2 ) 壳聚糖及其衍生物概述 甲壳素，是地球上仅次于纤维素的最丰富的天然聚合物，主要 存在于蟹壳、虾壳等的甲壳中，学名聚( 卜4 ) 一2 - 氨基一2 一脱氧一 一d 葡聚糖。从结构上说甲壳素、壳聚糖与纤维素极其相似，即吡喃 糖环碳二位置上纤维素是羟基，甲壳素是n 一乙酰基，而壳聚糖是氨 基，其化学结构式分别为图卜l 所示： 士悸莓 纤缝素。d i q k ) 甲壳质：1 4 培乙魅氟 光聚糖，聚( 】，4 ) 2 i 氨基 蕃之- 胫氟- 口- d 葡萄糖；脱氧省凸葡萄糖 田l 纤维寮、甲壳质与凳聚糖的菇构简田 图1 - 2 1 a 纤维索、甲壳素、壳聚糖结构图 壳聚糖( c h i t o s g r l ) 是甲壳素的脱乙酰基产物，来源丰富，制备 简单，且具有很好的生物相容性，在体内能被溶菌酶等降解并代谢， 且其分解产物对人体健康无害。目前，利用壳聚糖制备缓释、控释 制剂已取得厂较好的效果，所制成的微球对特定器官组织的靶向性 及微球中药物的缓释性已成为近年来新剂型研究的热点。 壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多独特的物理化 学特性和生物功能。壳聚糖及其分解产物无毒性，具有生物相容性 和生物可降解性，有抗菌消炎，促进伤口愈合，抗酸，抗溃疡，降 血脂和降胆固醇等多种作用，同时还具有很强的凝血作用，经硫酸 化后，能转变成肝素类似物而起到抗凝血作用。肿瘤细胞具有比正 常细胞表面更多的负电荷，因此壳聚糖在酸性环境中对肿瘤细胞表 面具有选择性吸附和电中和作用。此外壳聚糖还具有直接抑制肿瘤 细胞的作用，通过活化免疫系统显示抗癌活性，与现有的抗癌药物 4 第一章绪论 台用可增强后者的抗癌效果。 壳聚糖在酸性条件下，是一种线性高分子电解质，其溶液具有 一定的粘度，溶液的浓度越高或分子量越大，粘度就越大。壳聚糖 因含有游离氨基，其氮原予上还有一对未结合的电子，使氨基里弱 碱性，能结合一个氢离子，从而使壳聚糖成为带正电荷的电解质。 壳聚糖的氨基属于一级氨基，氨基上的氢较活泼，在中性介质中壳 聚糖能与芳香醛或脂肪醛形成西佛碱( s c h i f f sb a s e ) 。壳聚糖可 用具有双官能团的醛或酸酐等交联，其交联产物不易溶解，溶胀也 小，性质较稳定。 在众多的壳聚糖衍生物中，羧甲基壳聚糖的研究较早，也最令 人注目。羧甲基壳聚糖是水溶性的，它们在日化、食品、造纸、制 药、化妆品等方面部有着各自重要的用途，这主要是因为羧甲基壳 聚糖具有如下优良性能： ( 1 ) 水溶性：取代度大于0 。6 的羧甲基壳聚糖易溶于水，取代度 愈高，水溶性愈好，其溶液的透明度也愈好。 ( 2 ) 保湿性：羧甲基壳聚糖上的羧基及胺基都是亲水基团，有着 较强的吸水性，0 2 5 的羧甲基壳聚糖溶液的吸湿度与2 0 的丙三醇 相当，溶液的粘度恒定。 ( 3 ) 成膜性：羧甲基壳聚糖有较好的成膜性，其膜具有光泽，透 明而柔韧，并有较好的透气性。 ( 4 ) 高分子性能：对胶体有稳定作用，有增稠及凝胶的作用和气 泡稳定作用。 ( 5 ) 安全无毒性：羧甲基壳聚糖安全、无毒、无害。 羧甲基壳聚糖有三种：o 一羧甲基壳聚糖，n 一羧甲基壳聚糖，n ， o 一羧甲基壳聚糖。壳聚糖在碱性介质中与一氯乙酸发生反应，取代 反应局限于c 6 的伯羟基，生成的产物为o 一羧甲基壳聚糖；壳聚糖与 二羟乙酸反应生成水溶性胶状亚胺( 希夫碱) ，然后用适当的还原剂 如氰基氢化物还原，则取代反应只发生在c 2 的伯胺上，生成n 一羧甲 基壳聚糖：壳聚糖在浓碱液中与一氯乙酸反应，适当控制反应条件， 则可以得到0 一羧甲基壳聚糖。o 一羧甲基壳聚糖是一种既含有氨基又 含有羧基的两性离解性分子，类似于氨基酸，可在较宽的p h 范围内 溶解，它的大分子链节上含有两个基团氨基和羧基，所以它既能像 酸一样饵离，也能像碱一样解离，其过程为： 第一章绪论 o h h o h h + 图1 2 1b 不同p h 值范围o 羧甲基壳聚糖状态图 在0 一羧甲基壳聚糖溶液中，当p h 2 1 时，o 一羧甲基壳聚糖接 受了质子，大分子链主要以正离子状态存在，电荷排斥效应增大， 大分子链更易伸展，与极性水分子离子的作用增强，利用0 一羧甲基 壳聚糖具有两性的特性，可以制备具有特殊性能的产品，从而为o 一 羧甲基壳聚糖的应用开辟了更新更广泛的领域妇1 。 1 2 2 磁性载体粒子的特性 磁性载体粒子主要有以下特性： ( 1 ) 磁效应性：具有磁性可使生物高分子微球在外加磁场作用下 方便地进行分离和磁性导向。当磁性四氧化三铁晶体直径小于3 0 n m 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强磁性，没有磁场时磁性很快消 失，从而生物高分子微球能够在磁场中不被永久磁化。 ( 2 ) 生物相容性：磁性微球在生物工程，特别是在生物医学工程 中应用，有一个重要方面就是要有生物相容性。多数生物高分子如 多聚糟、蛋白质类具有良好的生物相容性。 ( 3 ) 表面效应和体积效应：即比表面积效应。随着微球的细化， 其粒径达到微米级甚至纳米级时，比表面激增，微球宫能团密度及选 择性吸附能力变大，达到吸附平衡的时间大大缩短，粒子的稳定性 大大提高。 ( 4 ) 功能基特性：生物高分子有多种反应活性功能基团、如一o h 、 一c o o h 、一n h 2 ，可连接具有生物活性的物质 2 7 。 1 2 3 磁性载体粒子的分类 就目前国内外的研究现况来看，磁性载体粒子的结构可分为三 类。a ：核为聚合物，壳为无机物；b ：核、壳、壳三层结构，即内 核为聚合物，第二层为无机物，第三层为聚合物；c ：核为无机物， 壳为聚合物。各种不同的磁性微粒。因其结构不尽相同，故各有其 6 第一章绪论 各自的合成方法。 a 型磁性微粒可分为两类，即核为单一型聚合物的磁性微粒及核 为复合式的聚合物的磁性微粒。 ( 1 ) 核为单一型聚合物的磁性微粒 这种构型的磁性微粒目前有两种制各方法： 化学还原法。其关键便是将贵重金属的盐类接在带有功能基 因的微粒的表面上，然后将其还原为零价，接着将过渡族金属或稀 土金属用e f s ( 溶液无电镀) 法接在磁性微粒的表面制得核为聚合物、 壳为无机物的磁性微粒。 悬浮聚合法。悬浮法首先将单体、引发剂、无机物、水等通 过均化器分散均匀，然后在适当的条件下聚合。 ( 2 ) 核为复合型的磁性微粒 这种磁性微粒多用种子非均相方法制得。以这种方法制得的磁 性微粒具有一定的单分散性且稳定性较好。 b 型磁性微粒由于其第二层结构的不同，又可分为两种方法制备。 乳液聚合法。 活性聚合法其制备方法一般是先制造出种子。在加入y 成分 ( 一般为长链腊肪醇、长链烷烃等) 的情况下，用单体对品种溶 胀，然后在通氮条件下加热、加引发剂并多向搅拌的条件下， 进行长时间的活性膨胀聚合，再对制得的微球上的化学基团进 行还原或衍生化，并用水进行溶胀，用铁盐溶液进行浸润并抽 真空、碱化，最后包裹，制得强磁性、窄分布的磁性微粒。 就目前的研究状况来看，c 型微粒的制各一般有以下两条途径： 一是用天然高分子直接包埋磁性材料形成具有磁核的微粒。二 是在磁流体存在的条件下通过单体聚合形成磁性微粒。聚合方法有 乳液聚合、分散聚合、改性的悬浮聚合等”1 。 1 2 4 磁性载体粒子的制各方法 磁性微粒的制备方法主要有共沉淀法、溶胶凝胶法、水热法、 包埋法、单体聚合法、化学转化法、生物合成法、以及等离子气相 沉积法( p c v d ) 等。下面对这几种方法一一作以介绍。 1 ) 共沉淀法 共沉淀法是制备铁氧粒子的经典方法，是含多种阳离子的溶液 7 第一章绪 论 中加入沉淀剂后，所有离子完全沉淀的方法。该方法反应过程为： 2 f e 3 + + f e 2 + + 8 0 h 一f e 3 0 4 + 4 h 2 0 但传统方法沉淀出来的铁氧粒子性能单一，承载性能不佳。近年兴 起的聚合物基共沉淀法，利用高分子物质具有缠节性，利于包覆的 特点，制备了铁氧粒子一聚合物核壳结构的磁性载体，且高分子物质 的黏附性在制备中还可起到控制粒径的作用。这种方法制各的载体 粒子具有生物体内相容性好，承载能力强而灵活的特点。 2 1 溶胶凝胶法 此方法是通过醇盐水解、聚合，形成溶胶，再转变成凝胶。凝 胶在真空状态下低温干燥，得到疏松的干凝胶，干凝胶作高温煅烧 处理后，即得到纳米粉体。该方法可采用蒸馏或重结晶技术来保证 原料的纯度，整个工艺过程不引入杂质离子，有利于高纯材料的制 各，所得粉体粒径较小，且粒度分布窄。但它也有不足之处，如原 料价格高、有机溶剂的毒性以及在高温下作热处理时会使颗粒快速 团聚等。目前用溶胶一凝胶法已可制各很多氧化物的纳米级粉体。 3 ) 水热法 水热法是一种在密封的压力容器中，以水作为溶剂、粉体经溶 解和再结晶的制备材料的方法。相对于其他粉体制备方法，水热法 制备的粉体具有晶粒发育完整、粒度小、且分布均匀、颗粒团聚较 轻、可使用较为便宜的原料、易得到合适的化学计量物和晶形等优 点。尤其是水热法制备陶瓷粉体毋需高温煅烧处理，避免了煅烧过 程中晶粒的长大、缺陷形成和杂质引入，因此所制备的粉体具有较 高的烧结活性。 4 1 包埋法 包埋法是运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性粒子均匀悬浮 于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段制得磁性微 粒。磁性粒子表面与亲水性高分子之间存在一定的亲和力，所以若 把磁性粒子浸泡于这些高分子的溶液中，再经过乳化等处理过程， 就可以在磁性粒子表面形成高分子壳层。为了增加微球的稳定性， 可用交联剂交联高分子壳层等进行稳定化处理。天然高分子磁性微 球均采用这种方法制备。该法简单易行，但制得的磁性微球粒径难 8 第一章绪 论 于控制，形状不规则，在细胞分离等领域的应用受到限制。 5 1 单体聚合法 单体聚合法是先将磁性粒子、单体、引发剂、稳定剂等的混合 液通过均化器分散均匀，再在适当的条件下进行聚合以制备核一壳 式磁性微粒的方法。聚合方法主要有：悬浮聚合、分散聚合、乳液 聚合( 包括无皂乳液聚合，种子聚合) 等。因为很多有机单体疏水性很 强，难以与磁核的亲水表面紧密结合，所以往往要对磁微球表面进 行预处理，使其表面具有一定的疏水性，或者适当改变聚合体系的 有机组成，以利于聚合的进行。所制备的磁微球粒径分布范围宽， 难以形成均匀包裹的微粒。 6 1 化学转化法 化学转化法是指先合成均一的多孔有机聚合物微球，微球中含 有一c 1 、一c o h 、一n 0 2 、一o h 等官能团，均匀地分布于微球的表 面和孔洞中，然后将一定浓度的f e 2 + 和f e 3 十渗透到微球的内部与上 述基团作用而被固定，再升高p h 值使f e ”和f e 3 + 在孔中形成f e 3 0 4 。 此法操作简便，所制备的磁性微球粒径和磁性都具有高度的均一性， 但对聚合物微球的要求比较严格。 7 ) 生物合成法 自然界中存在些向磁微生物。如小螺菌细胞中铁含量极高， 为干燥菌体的3 8 ，比一般的微生物铁含量高1 0 0 倍。它们都是 单畴晶体，有超常磁性。向磁微生物在沿着地球磁力线移动时可以 在体内合成生物膜包被的超微磁粒体，如将其由向磁微生物中分离， 就可以大量地生产粒径均匀的天然磁微球。细菌磁性粒子具有形状 小、均匀、机体适应性好的特点。如果药物释放装置采用向磁性细 菌合成的磁性微粒，就可得到更好的治疗效果。另外细菌内的磁性 微粒为蛋白质和脂膜所包裹，利用这种膜可以使天然磁微球应用于 人造磁微球难以达到的药物释放、分离、计量等目的。目前向磁性 细菌尚处于基础研究阶段，有待于进一步研究。 8 ) 等离子气相沉积法( p c v d ) 它是纳米陶瓷粉体制备的常用方法之一，具有反应温度高、升 第一章绪 论 温和冷却速度快等特点。p c v d 法又可分为直流电弧等离子体法、高 频等离子体法和复合等离子体法。对于直流电弧等离子体法，由于 电极间电弧产生高温，在反应气体等离子化的同时，易因电极熔化 或蒸发而污染反应产物。高频等离子体法的主要缺点是能量利用率 低，产物质量稳定性较差。复合等离子体法则是将前两种方法合为 一体。它在产生直流电弧时不需电极，避免了由于电极物质熔化或 蒸发而在反应产物中引入杂质；同时，直流等离子体电弧束有能有 效地防止高频等离子火焰受原料的进入造成干扰，从而在提高产物 纯度制备效率的同时，提高了系统稳定性。 此外，人们还将一些新的方法用于制备磁微球。如用两种新型 声化学方法合成了磁性蛋白微球，一种以水为溶剂，另一种咀萘烷 为溶剂，并对其性质进行了讨论。张律辉利用辐射聚合制备了胺基、 羟基、羧基、醛基四种类型的磁性微球，并在免疫分析中得到了初 步应用 4 1 。 这些制备的磁性微粒具有高分子微粒的特性，可进行表面改性。 在制得的磁性微粒上，载体基体带有一o h ，一n h 2 ，一c o o h ，一 c o n h 2 等功能基团，易与酶或抗原、抗体等物质结合，标记和分离 许多生物材料。磁性微球与其它物质的结合方法主要有：碳二亚胺 缩合法、重氮盐偶联法、混合酸酐法、n 一羟基琥珀酰亚胺活化法、 复乳化法、超声乳化法、等电临界法、过碘酸盐氧化还原法、戊二 醛双功能交联法、环内酸法、硫氰酸衍生物法及0 一( 羧甲基) 羟 胺法等。根据标记物质结构的不同，实验中选择不同的标记方法 2 8 】。 下面主要对复乳化法、超声乳化法、等电临界法、过碘酸盐氧化还 原法这四种方法 17 作一下简单介绍。 1 ) 复乳化法 迄今为止，用聚交 ( p o l y l a c t i d e ，p l a ) 、聚乙交 ( p o l y g l y c o l i d e ，p l g ) 、乳酸一乙醇酸共聚物( p o l y l a e t i c c o g l y c o l i c a c i d ，p l g a ) 等聚 制备纳米微球几乎都采用此法 2 引。即将含抗原的 水溶性内相乳化分散于含p l g a 等载体材料的有机相中，形成一级 乳w o ；再将一级乳分散于p v a ( 聚乙烯醇) 水溶液，形成w o w 复乳； 室温搅拌挥去有机溶媒，水洗，收集微球，冻于r 3 0 。复乳化】是由 微囊化和囊壁固化两步组成的。在微囊化时，第一水相以水珠形式 分散于油相，通过机械搅拌器分散成油珠，其中包着第一水相，在 1 0 第一章绪论 p 1 u n o n i cf - 6 8 作为表面活性剂的作用下能较稳定地存在于第二水相 中。随着第二水相中的苯的挥发，囊壁随之固化：在第二水相中的 碳酸钠碱性条件下明胶和福尔马林固化而使磁性载药微粒定形。 2 ) 超声乳化法i j “ 用生物降解性乳酸一乙醇酸共聚物( p o l y l a c t i c c o g l y c o l i ca c i d ， p l g a ) 为载体，与所载药物按适当比例称取，加入二氯甲烷和丙酮 的混合溶剂使其溶解，配制一定浓度的聚乙烯醇( p v a ) 水溶液，用超 声乳化器p l g a 溶液分散在p v a 水溶液中，形成水包油型乳化液。 在不断搅拌下抽真空除去有机溶剂令微粒固化，超速离心分离后， 将微粒冷冻干燥。 3 ) 等电i 临界法 3 3 将一定浓度的0 一羧甲基甲壳胺( o c m c ) 于0 5 的表面活性剂 p l u r o n i cf 6 8 及一定量的药物混匀，加入等点电调节剂n h 4 0 h ，用 分光光度计控制体系至等电临界点，加入4 戊二醛水溶液，交联 1 h 后，加入反应中止剂。经产物超滤后冷冻干燥，4 冰箱保存备用。 4 ) 过碘酸赫氧化还原法 本方法是将葡聚糖( d e x ) t - 4 0 与氯化亚铁或氯化铁反应制成磁 性纳米粒子，称取一定量的该粒子，按反应需要的摩尔比加入高碘 酸钠进行醛化。可将研究药物与此磁性纳米微粒在合适条件下交联， 制成载药磁性纳米粒子，用做靶向给药。 1 2 5 磁性载体粒子的应用 磁性高分子微球具有高分子微球的一些性质，表面可结合各种 功能分子以满足不同要求。此外它还具有磁性，在磁场作用下可定 向运动到特定部位，或迅速从周围介质中分离出来。这些性能使其 具有极广阔的应用前景。 ( 1 ) 磁性高分子微球在靶向药物方面的应用 蛋白及其他一些高分子微球可以用做药物载体。从给药方式看， 可以分为被动送药和主动送药两种情况，前者主要依靠微球检径被 动地向特殊的组织器官送药：后者可利用在病灶处的外部磁场作用 下，磁性高分子微球的定向运动来实现。靶向药物输送体系的成功 第一章绪论 依放于三个因素：第一，药物载体在病灶部位的有效定域；第二， 载体中药物含量及其释放特征：第三，载体的生物相容性。磁性高 分子微球可以满足上述三个要求，是用作靶向药物载体的理想候选 者。此外，由于选取的高分子本身具有生物相容性，所以负载药物 和磁检的高分子微球是适合体内应用的。目前存在的问题是如何进 一步提高磁性高分子微球的含药量，以及如何防止药物的渗漏，在 这方面有待于进一步研究。 ( 2 ) 细胞分离与免疫分析 磁性高分子微球表面引接具有生物活性的专一性抗体，在外加 磁场作用下，利用抗体和细胞的特异性结合，可快速有效地将细胞 分离或检测细胞。细胞的分离技术可用于癌症的治疗。在异源骨髓 移植中，必须抑制强烈的异己排斥反应，这需要从异体骨髓中除去t 细胞。免疫分析在现代生物分析技术中是一种重要的方法，它对蛋 白质、抗原、抗体及细胞的定量分析发挥着巨大作用。利用磁性微 球结合的抗原或抗体行免疫分析，具有特异性高、分离快、重现性 好的特点”3 。 ( 3 ) 用于细胞表面标记 颗粒较小的磁性高分子微球与蛋白连接可用于细胞标记，从而 进行细胞和细胞亚群的鉴定、细胞表面标志和抗原以及受体分布的 研究。 ( 4 ) 在分子遗传学上的应用 一般来说，聚苯乙烯类的磁性微球只能吸附蛋白质，而对非蛋 白质无直接吸附作用，但借助亲和素一生物素系统，各种d n a 和r n a 分子以及片段，都可以与磁性微球结合。亲和素以某种方式( 物理吸 附或共价结合) 包被在磁性微球表面，生物素化的各种分子则很容易 固化在磁性微球上。由于亲和素一生物素之间高度的亲和力，以此 方式形成的磁性微球一d n a 极为稳定，可以耐受加热、酸碱、高浓度 的尿素和盐溶液，可在磁性微球上进行诸如解链、单模洗脱和杂交 等d n a 分子操作。近年来磁性微球在分子生物学领域的应用越来越 引入注目。 第一章绪论 1 2 6 磁性载体粒子的优点 超微载体微粒有诸多优点，制备超微载体微粒的技术也将越来 越完善，将来可在以下几方面对临床治疗带来益处，也为药学工作 者今后的努力确定了方向1 7 1 。 1 ) 解决v i 服易水解药物的给药途径 许多药物如一些抗菌素、多肽类药【l ”、蛋白类药、酶类药因 口服后易被胃酸破坏而只能注射给药，因此使这些药的应用受到了 限制。载药纳米微粒的出现，使这个问题可望得到解决。也许在不 远的将来青霉素这个经典的抗菌素可以口服而又重新发挥它的能 力；核苷酸也因能被口服而在异军突起的基因治疗中简化使用程序； 白蛋白1 2 叫可由需要补充蛋白的患者自行携带使用而无须注射。 2 ) 延长药物的体内半衰期 一些半衰期短的药物因需要每天重复给药次数较多，可能会因 患者的顺应性较差或无意识的漏服而影响治疗效果。有人设想用分 子生物学与纳米技术结合，预期可制成微小的直接包含药物工厂的 分子机器，在体内循环过程中，制造出治疗所需的药物，这种技术 比缓释的载药纳米微粒对人类健康又有了进一步的贡献，某些需长 期甚至终身用药物治疗的疾病如高血压糖尿病等的用药问题因此 会得到解决。 3 ) 更精确的靶向定位给药，减少药物不良反应 药物的作用部位直接影响到药物的治疗意义许多药物的体内 分布容积受其理化性质的影响无法令人满意，因而达不到治疗所期 望的部位，或者治疗部位的药物浓度远远低于血药浓度，由此使这 类药物虽然有较好的药理作用但因严重的不良反应造成使用受限。 磁性载药纳米微粒的出现为更好地发挥这类药的作用带来了新的希 望。解决了靶向定位的问题，肿瘤药可直接作用于肿瘤细胞而不影 响正常细胞的功能；心血管药可直接作用于需治疗的部位而不是通 过血液循环引起全身反应；发生在一些特殊的局部和器官如关节、 五官【2 1 , 2 2 、子宫等以前无法给药的疾病也会因此而得到治疗。 第一章绪论 4 ) 消除生物屏障对药物作用的影响 在我们的机体中存在许多天然的屏障，如血脑屏障、细胞生物膜 屏障等，这些屏障保护着我们的机体不受侵害，但也给一些疾病的 治疗带来了困难。载药微粒的发展必将会向这个方向进行【2 。随着 定位问题的解决及与细胞膜有较大亲和力的基质的发现，因载药纳 米微粒具有以前剂型所不具备的优点，可透过生物膜并穿透血脑屏 障 2 ”，届时一些有特效的药物可被输送到颅内治疗现在不得不手术 的疾病 25 】；可因在单核巨噬细胞中有较高药物浓度而大大增强抗菌 药物的作用；抗寄生虫药物也会直接作用于虫体内【26 】而不会对人产 生不良反应。 磁导向下磁性载体粒子的作用机理是在药物微球中加入具有磁 响应性的物质( 如f e 3 0 n ) ，再将磁性药物注入组织内，同时在肿瘤外 部施加有效强度和梯度的外磁场，使磁性药物固定于肿瘤组织内， 以达到治疗的目的。 该方法优点突出，主要表现在：( 1 ) 可以更有效的减少网状内皮 系统( r e s ) 的吸收。( 2 ) 磁性药物微球有缓慢释放作用，可以相应地 耐受较高的药物剂量，研究表明：应用磁性微球可使有效药物的化 疗指数增加1 0 1 0 0 倍 15 1 。( 3 ) 加速产生药效，提高疗效。( 4 ) 对 于体外磁场有相应的磁响应性。( 5 ) 在合适磁场存在的情况下，磁 性微球的大量聚集使血流减慢，从而提高了颗粒的滞留，有可能使 更多的载体血管外渗出发生。这样，微球起到了血管外药物贮存站 的作用。( 6 ) 更多的磁性微球制剂从肿瘤组织的血管内皮中渗出， 使药物在细胞或亚细胞水平发挥药理作用成为可能。( 7 ) 磁性药物 微球在正常组织中的浓度大大减少，从而减少了对正常组织细胞的 损伤【l6 1 。 1 2 7 磁性载体粒子的测定方法【3 4 l 1 ) 磁性载体粒子药物含量测定 精密称取样品3 0 m g ，加入适量溶解液或酶溶液，在3 7 恒温水 浴水解，过滤后取滤液用紫外分光光度计测定吸光度a 值，计算磁 性微球所含药物的量。注意不能加碱或酸，以防磁性药物微球中铁 粒子发生化学反应，干扰测定。 2 ) 磁性载体粒子含铁量的测定 精密称取样品1 0 m g ，在浓h n 0 3 及浓h c l 中加热，使微球完全 1 4 第一章绪论 溶解至溶液澄清，用原子吸收分光光度计测定吸光度，计算含铁量。 3 ) 磁性载体粒子外溶出度的测定 精密称取样品3 0 m g ，加入到5 m l 生理盐水中，3 7 条件下，在 六管崩解仪中以7 5r m i n 振动，定时吸取上清液，用紫外分光光度计 测定吸光度a 值，用标准曲线方程计算出药物溶出度，再计算累积 溶出百分比。 4 ) 磁性载体粒子形状、粒径及分布测定 用透射电镜或原子力显微镜观察磁性微球形状、大小、表面状 态并摄影。测定6 0 0 个微球粒径计算平均粒径z ，粒径分布用各粒径 范围内微球所占百分率( 厅) 表示： 步= ( n r z n r ) 1 0 0 其中认为n r 为粒径某大小范围的微球数。 1 3 磁性载体粒子的研究进展 k e n n e t hw i d d e r 和a n d r e ns e n y e i 于2 0 世纪8 0 年代率先提出了 磁性靶向载体材料的研究，并进行了大量的实验 5 1 。他们在一次实验 中利用外磁场来引导以铁和活性碳为主要原料的载体在动物体内定 向投递药物，并得到了期望的结果一药物几乎只在病灶周围富集。 在后期的实验中，他们又用具有更强穿透能力的滞留性铁磁微粒 ( d e m e n t i a li r o n m a g n e t s ) 代替了原来使用的氧化铁磁微粒( f e r r o u s o x i d em a g n e t s ) ，使磁靶向各方面性能都有所提高，引起了广泛 的关注【5j 。现在，作为生物和医用的纳米磁性材料，其制备工艺已较 为成熟，通常运用盐类溶液共沉淀或溶胶。凝胶法等湿法制各【“，也 有报道称可在聚乙烯吡啶等聚合物类基液中制备 7 1 。制得粒子一般具 有以下性质是很重要的：首先，这些粒子在溶液中是可悬浮的，这 样它们就可以被输送到生物和反应系统中；其次，这些粒予必须具 有定的生物活性、亲和性或反应活性来完成它们的作用。 1 3 1 磁性载体粒子的实验性研究进展 1 9 8 1 年w i d d e r 等对自制的阿霉素自蛋白磁性微球做了较全面的 离体研究。首先应用扫描电镜测量了磁性微球的大小( 平均直径约 1 5 h i l l ) ，接着对1 1 5 ，1 3 5 两种不同固化温度下制做的磁性微球 对阿霉素的离体释放量作了对比，结果是固化温度越高，磁性阿霉 素微球的药物缓释作用越好，也就是单位时间内释放的阿霉素越少。 第一章绪论 w i d d e r 进一步通过f is h e r 3 4 4 大鼠纤维肉瘤3 h 一尿嘧啶掺入抑制法对 不同温度下制做的载药磁微球的药物活性进行对比，结果是固化温 度越低，阿霉素活性越高。陈骐等对自制的磁性氟尿嘧啶微球做了 体外磁感应性实验。通过使磁性微球悬液流过加有外磁场的玻璃导 管来观察磁微球对外磁场的磁响应性。吴传斌等对明胶磁性微球的 形态和大小分布、磁性明胶微球在p h 7 4 的磷酸缓冲液中溶胀度的 测定及”c o 照射灭菌对磁微球的影响做了较详细的研究。 1 9 8 2 年w i d d e r 在“癌症化疗的实验方法”中较详细地叙述了磁 性微球在s d 大鼠的靶向性研究。将鼠尾分为4 部分，从尾尖起分别 为t 1 ，t 2 ，t 3 ，t 4 。以t 3 区作为靶段外加强磁场，从t 4 段尾动脉注入 磁性阿霉素微球( 磁微球应用1 2 5 i 标记) ，外磁场作用3 0 分钟后处死 大鼠分别测靶区及其它器官的放射性记数及阿霉素含量，结果发现 5 0 的磁性微球聚集在靶区t 3 。同时测定了t 3 区阿霉素含量，并指 出若用阿霉素溶液静脉给药达到此种靶区浓度，那么所需阿霉素溶 液的量是阿霉素微球所含药量的10 0 倍。在此基础上，g a l l o 等对药 物靶向性做了进一步的实验性研究，通过在大鼠尾动脉注射阿霉素 磁性微球及阿霉素溶液两组的对比，进一步有力说明了磁性阿霉素 微球有非常好的靶向性。此后g a l l o 等对磁性阿霉素微球在大鼠体内 的药物代谢动力学做了较详细的研究。1 9 9 3 年吴传斌等报导了9 9 t c 标记的明胶磁微球在家兔头颈部的靶向定位研究，1 9 9 4 年又报导了 磁性微球在狗肾动脉的定向栓塞实验研究，两组实验均说明磁性微 球的靶向性好。 此后，w i d d e r 等用自制的磁性阿霉素微球对荷y o s h i d a 肉瘤的 大鼠进行了磁场导向治疗，将肉瘤移植