（发酵工程专业论文）人骨唾液酸蛋白非融合表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达.pdf

摘要 摘要 骨唾液酸蛋白( b o n es i a l o p r o t e i n ，b s p ) 是细胞外基质中的一种高度糖基化、 硫酸化和磷酸化的酸性糖蛋白，含有两个保守的聚谷氨酸富集区和位于c 一端的 保守的r g d 整合素结合序列。b s p 的组织分布具有局限性，仅在矿化的组织如骨、 牙齿以及钙化的软骨与骨间的界面中存在，主要由成骨细胞和破骨细胞表达和分 泌。b s p 被认为在矿化形成调节方面扮演重要的角色，此外近来又发现b s p 与肿 瘤骨转移和血管生成方面相关。因此，深入研究b s p 的功能有助于指导相关疾病 的诊断与治疗。 目前获得b s p 的途径有2 个，即直接从骨中提取和利用基因工程技术表达和 制备重组b s p 。本文报导了非融合的人b s p 在毕赤酵母g s l l 5 中的表达研究。 根据g e n e b a n k 中人b s p 基因的参考序列设计专一性引物，以已经构建的含 人b s p 全长c d n a 的p b h b s p 质粒为模板，p c r 扩增得到人b s p 基因，将人b s p 基 因序列经k o ni 和x h oi 双酶切后定向克隆至p p i c z a a 载体，得到重组表达载体 p p i c z a a h b s p 。在此基础上构建含有串联的两个表达盒重组表达载体 p p i c z a a 一2 x h b s p 。 通过电转化的方法将p p i c z a a h b s p 和p p l c z a a 一2 x h b s p 分别转入毕赤酵母 g s l l 5 中，筛选到转化子后，用p c r 鉴定表明上述两种重组质粒都分别整合到g s l l 5 基因组中，即表型为m u t + 。 甲醇诱导g s l l 5 p p i c z a a - h b s p 和g s l l 5 p p i c z a a 一2 x h b s p 工程菌，收集含有 分泌的r h b s p 上清。上清经s d s p a g e 检测发现在分子量介于4 3 - - 6 6 k d a 之间 出现一较宽条带，通过蛋白印迹实验证实此较宽的条带确为r h b s p 。 g s l 1 5 p p i c z a a h b s p 和g s l l 5 p p i c z a a 一2 x h b s p 两株工程细胞表达上清浓缩后的 蛋白样品总浓度分别为0 1 2 2 9 l 和0 1 3 2 9 l 。这两种转化子中r h b s p 的表达量并 无明显差异，推测主要原因是由于这两种转化子的基因组中表达盒的数量可能相 同。 本文首次成功构建串联的非融合的重组入骨唾液酸蛋白基因表达盒并在毕赤 酵母g s l l 5 成功进行r h b s p 的表达，为r h b s p 的制各提供了一条简捷途径，并有 助于深入研究b s p 的功能。 关键词：骨唾液酸蛋白；表达；毕赤酵母 m 华南理工大学硕士学位论文 a bs t r a c t b o n es i a l o p r o t e i n ( b s p ) ，c o n t a i n i n gt w oc o n s e r v e dr e g i o n se n r i c h e di ng l u t a m i c a c i da n dac o n s e r v e dc t e r m i n a lr g di n t e g r i n b i n d i n g s e q u e n c e ，w a s a h i g h l y g l y c o s y l a t e d ，t y r o s i n e s u l f a t e d ，s e r i n e p h o s p h o r y l a t e d a c i d i c g l y c o p r o t e i n i n e x t r a c e l l u l a rm a t r i xa n de x h i b i t e dar a t h e rr e s t r i c t e dp a t t e r no ft i s s u ed i s t r i b u t i o n b s p ， w h i c hw a sd e t e c t e dm a i n l yi nm i n e r a l i z e dt i s s u es u c ha sb o n ea n dd e n t i n ，a n da tt h e i n t e r f a c eo fc a l c i f y i n g c a r t i l a g e a n db o n e ，w a se x p r e s s e da n ds e c r e t e d m a i n l yb y o s t e o b l a s t sa n do s t e o c l a s t sa n dw a sb e l i e v e dt oh a v ei m p o r t a n tf u n c t i o n a lr o l e si nt h e r e g u l a t i o no f m i n e r a lf o r m a t i o n f u r t h e r m o r e ，i th a db e e nf o u n dt op l a yar o l ei nb o n e m e t a s t a s i so fc a n c e ra n d a n g i o g e n e s i sr e c e n t l y s od e e ps t u d i e so n f u n c t i o no fb s pc a n h e l pg u i d ed i a g n o s i sa n dt h e r a p yo f d i s e a s e sa s s o c i a t e dw i t hb s p t h e r ew e r et w ow a y sf o rt h ep r o d u c t i o no fb s pc u r r e n t l y o n ew a yw a st o e x t r a c td i r e c t l yb s pf r o mb o n ea n dt h eo t h e rw a st oe x p r e s sr e c o m b i n a n tb s p ( r b s p ) b y m e a n so f g e n ee n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y t h i sp a p e rr e p o r t e d a b o u tn o n - f u s i o n r e c o m b i n a n th u m a n b s p ( r h b s p ) e x p r e s s i o n i np i c h i ap a s t o r i sg s l1 5 g e n e s p e c i f i cp r i m e r s w e r e d e s i g n e da c c o r d i n g t oh u m a nb s pg e n e ( h b s p ) s e q u e n c e i ng e n e b a n k ，a n dh b s pw a s a m p l i f i e db yp c ru s i n gp b h b s pp l a s m i d c o n t a i n i n gf u l ll e n g t hh u m a n b s pe d n aa st e m p l a t e p p i c z n a h b s pw a sc o n s t r u c t e d b yc l o n i n go r i e n t a t i o n a l l yh b s pd i g e s t e db y 却ia n dx h o ii n t op p i c z a av e c t o r u p o n t h eb a s i so n p p i c z a a - h b s p ，p p i c z a a 一2 x h b s pc o n t a i n i n g t w o e x p r e s s i o n c a s s e t t e sw a sa l s oc o n s t r u c t e d t h ep p i c z a a - - h b s pa n dp p i c z a a - - 2 x h b s pw e r et r a n s f o r m e dt op i c h i ap a s t o r i s g s l1 5 b ye l e c t r o p o r a r t i o nr e s p e c t i v e l y t h e n g s l 1 5 p p i c z a a - h b s p a n d g s l 1 5 p p i c z a a - 2 x h b s p t r a n s f o r m a n t sw e r eg a i n e db ys e l e c t i o n t h et r a n s f o r m a n t s ， w h i c hw e r et e s t i f i e dt h a tr e c o m b i n a n tv e c t o r sh a di n t e g r a t e di n t ot h eg s l 1 5g e n o m e b yp c r ，w e r em u t + p h e n o t y p e e x p r e s s i o n o fr h b s pi ng s115 p p i c z a a - h b s pa n dg s115 p p i c z a a - - 2 x h b s p w e r ei n d u c e db ym e t h a n o l ，a n dt h es u p e r n a t a n t sc o n t a i n i n gt h es e c r e t e dr h b s pw e r e h a r v e s t e df o rs d s - p a g ea n a l y s i s ab r o a db a n db e t w e e n4 3 6 6 k d aw a sd e t e c t e di n s d s p a g e w e s t e r nb l o t t i n gv e r i f i e dt h a tt h eb r o a db a n dw a st h er h b s pi n d e e d a f t e r t h e p r o t e i n s w e r e c o n c e n t r a t e d ，w h i c h w a s e x p r e s s e db yi n d u c i n g g s l1 5 1 p p i c z a a h b s pa n dg s l1 5 p p i c z a a 一2 x h b s p ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft o t a lp r o t e i n sw e r e a b s t r a c t m e a s u r e d 。s h o w i n g0 1 2 2 9 l a n d 0 1 3 2 9 lr e s p e c t i v e l y t h e r e w a sn od i s t i n c t d i f f e r e n c eb e t w e e n t h e e x p r e s s i o n l e v e lo fg s l 1 5 p p i c z c t a - h b s p a n d g s l 1 5 p p i c z a a 2 x h b s p w cs p e c u l a t e dt h a tt h em a i nr e a s o nw a s t h a tt h en u m b e ro f e x p r e s s i o n c a s s e t t e si nt h e g e n o m e o fg s l 1 5 p p i c z c t a h b s p a n d g s l 1 5 p p i c z t t a 一2 x h b s p w e r et h es a m e i nc o n c l u s i o n ，t h en o n - f u s i o nr e c o m b i n a n th u m a nb s pw a se x p r e s s e de f f i c i e n t l y i np i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e mb yc o n s t r u c t i n gp p i c z a a 一2 x h b s pc o n t a i n i n gt w o t a n d e me x p r e s s i o nc a s s e t t e sf o rt h ef i r s tt i m e t h es t u d yp r o v i d e dac o n v e n i e n tw a y t o p r o d u c er h b s p ，w h i c h w a s h e l p f u l f o rd e e pr e s e a r c ho fb s pf u n c t i o n k e yw o r d s b o n es i a l o p r o t e i n ，e x p r e s s i o n ，p i c h i ap a s t o r i s v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究 所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：士m日期：o 牟年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密田。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：专亿 导师签名： 皂j k 日期：0 4 年6 月7 日 日期：。4 年6 月g 日 华南理工大学硕士学位论文 a o x b m g y b m m y b s a b s p c a m d a b d d h 2 0 e c m e d t a e p n i s h a h u v e c k b k d a m c s 1 n m u t n c o d p a g e p c r r b s p r g d r h b s p s d s t b s t e m e d t r i s 英文缩略词表 a l c o h o lo x i d a s e醇氧化酶基因 b u f f e r e dc o m p l e xg l y c e r o lm e d i u m一种酵母生长的缓冲液培 养基 b u f f e r e dc o m p l e xm e t h a n o lm e d i u m一种用于诱导的缓冲液培 养基 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 b o n es i a l o p r o t e i n骨唾液酸蛋白 c h i c k e nc h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n e鸡胚绒膜尿囊膜 3 3 一d i a m i n o b e n z i d i n e3 ，3 二氨基联苯胺 d o u b l e - - d i s t i l l e dw a t e r双蒸水 e x t r a c e l l u l a rm a t r i x细胞外基质 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e p p e n d o r fe p 管 h i s t i d i n e组氨酸 h y d r o x y a p a t i t e 羟基磷灰石 h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s 人脐静脉内皮细胞 k i l o b a s e s千碱基 k i l o d a l t o n千道尔顿 m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s多克隆位点 m i n u t e分钟 m e t h a n o lu t i l l z a t i o n甲醇利用型 n i t r o c e l l u l o s e硝酸纤维素 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p 0 1 y a c r y l a m i n eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r e c o m b i n a n tb o n es i a l o p r o t e i n重组骨唾液酸蛋白 a r g - - g l y - - a s p 精一甘一天冬氨酸三肽 r e c o m b i n a n th u m a nb o n es i a l o p r o t e i n重组人骨唾液酸蛋白 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 t r i sb u f f e r e ds a l i n et r i s 盐缓冲液 n ，n ，n ，n 一t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n l 四甲基乙二胺 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 英语缩略词表 y n b y p d y e a s tn i t r o g e nb a s e y e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s e 酵母基本氮源 含有酵母提取物、蛋白胨 和葡萄糖成分的培养基 第一章绪论 第一章绪论 1 1 骨唾液酸蛋白的研究现状 1 1 1 骨唾液酸蛋白的结构和理化性质 骨唾液酸蛋白( b o n es i a l o p r o t e i ni i ，简称b s p ) 是一种主要由成骨细胞和破骨 细胞分泌的糖基化、磷酸化和硫酸化的非胶原蛋白。1 9 7 2 年首次从牛骨中分离得 到分子量为2 3 k d a 的不完整b s p 蛋白f 1 。随后，f i s h e r 等人圆从胎牛骨中提取得 到分子量为7 0 k d a 一8 0 k d a 的完整b s p 蛋白。后来，将从牛骨中提取得到的b s p 再用离子交换层析法能得到两种不同的蛋白【3 】：b s pi ( 现称为骨桥蛋白， o s t e o p o n t i n s ，o p n ) 和b s p i i ( 现称为骨唾液酸蛋白，b s p ) ，b s p i 与b s pi i 的 区别在于两者所含的唾液酸含量、氨基酸组成以及磷酸化的程度存在差异。1 9 8 7 年f i s h e r 等人t 4 1 首次从人骨中分离得到o p n 与b s p 。人b s p 核心蛋白部分的分子 量约为3 3 3 4k d a ，然而由于翻译后的修饰作用，包括n 一和。一糖基化、硫酸化 和磷酸化导致整个成熟蛋白的分子量约为7 5 k d a ，即碳水化合物的分子量约占整 个蛋白的5 0 【5 】。也正因为如此，得到可用的b s p 蛋白晶体较为困难，难于用x 一射线衍射分析其结构。 哺乳动物b s p 基因序列分析结果显示，它是由3 1 0 多个氨基酸残基组成的分 泌蛋白，不含半胱氨酸残基，不同物种氨基酸残基的数目略有差异，n 一端都带有 一个含有十多个氨基酸残基的疏水信号序列。哺乳动物的b s p 基因序列具有高度 保守性，如图1 1 所示，人、牛、鼠b s p 其氨基酸同源性为5 9 。靠近n 端都含 有2 个高度保守的聚谷氨酸序列和r g d ( 精甘天冬氨酸) 三肽，含有n 一糖基化 和o 一糖基化位点以及磷酸化和硫酸化位点，而在蛋白的n 一端与c 一端邻近的序 列中富含酪氨酸残基。此外，b s p 富含唾液酸( n 一乙酰化的神经氨酸，位于糖链 的末端) 、谷氨酸、天冬氨酸。 基于b s p 一级序列来分析和预测其二级结构，其结果显示b s p 的氨基酸序列 中含有能形成大量n 螺旋和d 折叠的开放式弹性结构区域【6 】。然而核磁共振研究 的结果表明b s p 的部分肽段( 含有5 9 个氨基酸残基，其中包括有r g d 三肽) 表 现出松弛的开放式结构【7 】，而且对于翻译后修饰的全长b s p 进行核磁共振分析的 结果同样显示无q 螺旋和b 折叠的松散结构8 1 。相反，w u t t k e 9 1 等人在电子显微镜 下观察到人b s p 呈小球形并连有丝状结构，推测球状部分是蛋白缺乏聚糖的c 端结构，而丝状结构是蛋白质高度糖基化的n 一端结构。 入b s p 核心蛋白部分其等电点为3 9 ，提示其丰富的酸性基团可与羟基磷灰石 华南理工大学硕士学位论文 紧密结合【”。成熟b s p 糖蛋白上的磷酸、硫酸和唾液酸基团使其负电荷明显增加， 加之翻译后修饰程度方面的差异妨碍了常规蛋白染色技术( 考马斯亮蓝和银染 法) 。 翻译后修饰程度的差异造成不同来源的b s p 虽然其一级结构非常相似但在 s d s p a g e 的结果仍然呈现出多样性的特点。如在人胚胎肾细胞中表达的 h i s 6 m ，_ c b s p 在s d s p a g e 中呈现7 0 - - 8 0k d a 的弥散宽带，而从人骨中纯化的 b s p 在7 0k d a 处形成一清晰的条带，其他不同来源的重组b s p 其分子量则处于 4 0 一7 5 k d a 的范围内，而骨来源的b s p 分子量在4 0 一6 0 k d a 之间【。 1 6 0 b o v i n eb s pc d s h u m a nb s pc d s m u r l h eb s pc d s b o y i n eb s pc d s h u m a nb s pc d s m u r l n eb s pc d s b o v i n eb s pc d s h u m a nb s pc d s m u r l n eb s pc d s b o y i n eb s pc d s h u m a nb s pc d s m u r i n eb s pc d s b o v i n eb s pc i ) s h u m a nb s pc d s m e r i n eb s pc d s b o y i n eb s pc d s h u m a nb s p c d s m u r i + n eb s p c d s f i g i - 1a l i g n m e n to fb s p l i m i l l oa c i ds e q u e n c e s 1 1 2 骨唾液酸蛋白的生物学功能 1 1 2 1b s p 与整合素的结合 细胞与细胞间的相互作用或细胞与细胞外基质问的识别和粘附都是通过专一 性的膜蛋白受体介导而实现，这种膜受体称之为整合素。它是由一个位亚基和一 个b 亚基共价结合构成的异二聚体跨膜蛋白超家族。目前发现，1 7 种a 亚基和8 种b 亚基经不同组合的非共价作用可产生2 2 种类型的整合素。不同类型的细胞 表面存在大量的不同种类的整合素受体1 0 】。a 、b 亚基都是由较长的胞外区、单 个跨膜区和较短的胞质区三部分组成，胞外区能与细胞外基质( e c m ) 结合，使细胞 粘附于e c m ；胞质区则与细胞骨架蛋白结合】。整合素在细胞中具有双重的功能： 2 对 比 列序酸基氨 跚bi卜 图 蚴 砌嘲 第一章绪论 一是介导细胞与基质之间的识别和粘附，二是在胞外信号的转导、细胞的迁移、 增殖以及分化中起关键的作用 1 2 , 1 3 1 。 b s p 靠近c 一端存在r g d 三肽序列，该序列能通过与位于细胞表面的整合素受 体识别、结合从而介导细胞粘附和细胞迁移作用，因而也称为整合素结合序列。 然而r g d 三肽序列并不是b s p 独有的，它也存在于其他一些具有细胞粘附作用的 细胞外基质蛋白中，如纤维连接蛋白、骨桥蛋白、玻璃粘连蛋白等。 研究证明在b s p 的r g d 细胞识别序列通过与整合素家族中的叭p 3 和f l , v p 5 来识 别、介导细胞与细胞外基质的粘附作用1 3 1 4 , 1 5 , 1 6 1 7 。免疫组化分析显示在胎牛下颚 骨的成骨细胞培养模型中，v 1 3 3 与b s p 的表达不仅在时间上具有一致性，而且在 空间上也是临近的【l 。b s p 作为成骨细胞、破骨细胞、骨转移的肿瘤细胞上整合 素的配体并与之结合，在骨细胞分化、骨基质矿化及肿瘤细胞粘附、增殖和转移 中发挥作用“。 i i 2 2b s p 与骨代谢 骨的新陈代谢是通过骨组织细胞的代谢活动完成的，表现为旧骨不断被吸收， 新骨随之不断形成。骨的生长、修复或重建过程，称为成骨作用( o s t e o g e n e s i s ) 。 成骨过程中，成骨细胞先合成胶原和蛋白多糖等细胞问质成分，形成所谓“骨样 质”( o s t e o i d ) ，继后骨盐沉积于骨样质中，此过程称为钙化( c a l c i f i c a t i o n ) 。 原有f 日骨的溶解和消失称为骨的吸收( b o n er e s o r p t i o n ) 或溶骨作用 ( o s t e oy s i ) ，主要由破骨细胞引起，包括基质的水解和骨盐的溶解，后者又称 为脱钙_ ! s ( d e c a l c i f i e a t i o n ) 。 骨胞外基质主要由9 0 的胶原蛋白和1 0 的非胶原蛋白组成。b s p 约占非胶原 蛋白的1 2 1 5 。近年来，非胶原蛋自如骨唾液酸蛋白在骨代谢中的重要作用引起 研究者的重视。在患骨代谢疾病的病人体内，血清b s p 浓度大幅度增加，显示其 可作为骨代谢异常的诊断指标【1 ”。 b s p 的表达局限于矿化组织如骨和牙齿中，且主要在矿化作用发生的同期或前 期。b s p 表达的时间和空间的特点说明它在骨矿化中发挥重要作用 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 。高 表达b s p 的转基因鼠表现出骨折愈合速度加快，由此推断b s p 与早期骨的矿化沉 积有关【5 】。b s p 表达缺陷的小鼠在6 周龄时可观察到牙齿和骨骼的代谢异常，由此 可以推测b s p 与骨重建的合成代谢有关【9 】。b s p 在体外实验中表现出浓度依赖性的 促进整合素介导的矿化表丽破骨细胞的骨吸收作用阱】。 b s p 介导骨细胞与胞外基质的粘附，从而与骨细胞的分化、增殖有关。另外， b s p 能与羟基磷灰石( h a ) 结合，在h a 晶体形成中发挥作用。应用稳定态凝胶系 统进行体外试验，结果预示b s p 与骨矿化早期的羟基磷灰石晶核的形成有关【2 6 2 ”。 研究证明b s p 与羟基磷灰石( h a ) 有很高的亲和力，而且人工合成的谷氨酸同聚 物对于h a 同样具有成核作用，这表明b s p 的两个多聚谷氨酸区在h a 成核方面可 3 华南理丁大学硕士学位论文 能起着关键的作用n 2 引。在e c o l i 分段表达b s p 研究中发现，具有h a 成核活性的 主要是第一个谷氨酸富集区。而第二个谷氨酸富集区似乎需要翻译后加工修饰才 具有活性( 2 1 1 。t y e 等5 1 应用定点突变方法，将原核表达的全长鼠b s p 中聚谷氨酸序 列替换为聚天冬氨酸或聚丙氨酸来研究氨基酸残基的构象和电荷对于h a 成核方面 的影响。聚天冬氨酸与p o l y e 带相同电荷，而聚丙氨酸与p o l y e 一样都有形成 旺螺旋的倾向。结果发现2 个聚谷氨酸序列中任一个或二个均被聚天冬氨酸取代都 不改变h a 晶核形成活性，任何一个被聚丙氨酸取代也不改变h a 成核活性。但两 个都被聚丙氨酸取代时，r b s p 的h a 成核活性大大降低，由此认为该序列的电荷性 与其二级结构相比对于h a 成核似乎显得更为重要。 1 1 2 3b $ p 与肿瘤的骨转移 肿瘤转移( t u m o rm e t a s t a s i s ) 是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、 血管或体腔，移至靶组织或靶器官，生长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同 的肿瘤。 1 9 9 4 年b e l l a h c e n e 等人首次阐述了b s p 在人乳腺癌中的表达【2 ”，随后又在 其他一些肿瘤中有报道，如骨肉瘤 3 0 , 3 1 】、前列腺癌 3 2 , 3 3 1 和肺癌 1 等。尽管如此， 癌细胞中表达b s p 的机理仍不明确。b s p 的分布具有组织局限性，然而肿瘤中却能 检测到b s p 的表达，提示b s p 在肿瘤向骨转移过程中可能发挥作用。临床资料显 示乳腺癌病人的血清中b s p 含量增加预示着容易发生早期骨转移【3 s 3 鬯。手术前血 清b s p 升高的乳腺癌病人在术后发生骨转移的危险性高 ”。 具有明显侵袭转移特性的肿瘤细胞都具有稳定表达活化的鲥p 3 整合素的能 力，因而肿瘤细胞的转移活性与整合素的表达和激活直接相关【3 ”。b s p 上r g d 细 胞识别序列通过与整合素脚p 3 、帆p 5 识别，介导肿瘤细胞的粘附、迁移和分化 3 ”。 转移的肿瘤细胞具有侵入性，能避开免疫监视而存活。补体一直被认为在肿 瘤监视机制中发挥重要作用。补体的激活途径有三种：经典途径；替代途径；凝 集素途径。f e d a r k o 报道了重组b s p 和o p n 能保护鼠红白血病细胞免受人补体系统 的攻击，同样也能阻止人m c f 一7 乳腺癌细胞和u - 2 2 6 骨髓瘤细胞被豚鼠补体系统 攻击。在使用特定多肽和抗体阻断b s p 和o p n 对癌细胞的保护作用的实验中证实 了肿瘤细胞逃避监视的机制【4 。b s p 和o p n 首先与细胞表面受体a v b 3 结合，然后 与补体因子h 结合形成复合物，此复合物具有类似于膜辅因子蛋白( m c p ) 的活性， 能促进i 因子裂解c 3 b 蛋白，从而阻断了补体替代途径的溶细胞作用【4 。 1 1 2 4b s p 与血管生成 血管生成是指从已存在的血管中形成新的毛细赢管，这对于机体生长和组织 修复有重要意义。血管生成不仅依赖血管生成因子，也和皿管粘附分子有关。大 量的研究证实叭b 3 和嘶p 5 整合素受体在内皮细胞生物括性和血管生成方面有着 重要的作用m 。旺v b 3 受体在静止的血管中不表达，但在血管生成过程中出现表达 4 第一章绪论 升高现象h ”，表明生成血管的内皮细胞可能与一些细胞外基质配体发生作用。用 特定的抗整合素抗体或含r g d 多肽对整合素进行干扰，能诱导内皮细胞凋亡，并 中断毛细血管的生成过程【4 3 ，4 ”。由于a v 9 3 整合素的配体在血管生成中扮演重要角 色，因而推测b s p 与新血管生成有关，b e l l a h c e n e 等4 4 1 研究重组人b s p 对于人脐 静脉内皮细胞( h u v e c s ) 的粘附性和迁移性，结果发现重组的人b s p 能以浓度依 赖方式促进h u v e c s 的粘附性和趋化性迁移，而在鸡胚绒膜尿囊膜( c a m ) 实验中 观察到重组人b s p 和含r g d 的b s p 重组片段都能刺激血管生成。 1 1 3 骨唾液酸蛋白的表达调控 人b s p 基因位于第四号染色体长臂第二区的第一带与第五带之间 ( 4 q 2 1 4 q z 0 3 ，总长度不超过1 1 1k b 4 5 1 ，是一个单拷贝基因，由7 个外显子与6 个内含子组成，具有一个9 5 1 个碱基的开放读码框序列。 b s p 基因的表达局限在矿化组织中，而在非矿化组织中不表达，但在易发生骨 转移的癌细胞中表达，因而b s p 基因表达的调控不仅影响到成骨细胞的分化，也 影响到骨基质的矿化和肿瘤的转移。 b s p 的限制性表达提示在正常情况下该基因的表达受到抑制，可能与核小体结 合、核苷酸甲基化及依赖特殊转录因子等因素有关。分析b s p 启动子的序列显示 它含有维生素d 反应元件、反向t a t a 框和c c a a t 框、同源框结合位点、反向重 复序列、a p - 1 和a p 一2 反应元件、糖皮质激素反应元件以及转化生长因子b 激活元 件等4 ”。c b f a l 基因在成骨细胞分化和骨发育的过程中起着关键的作用 4 7 1 ，而在 b s p 启动子序列中存在具有功能的c b f a 共有m o t i f ，c b f a 能阻遏成骨细胞中b s p 启动子，抑制其活性【4 ”。 甲状旁腺素( p t h ) 通过调节血清钙而增加鼠骨肉瘤细胞中b s p 的表达。l o 8 m p t h 作用3 小时后，b s pm r n a 水平就增加了约3 8 倍，6 小时达最高水平( 约4 7 倍) 。结果表明p t h 是通过蛋白激酶途径而发挥作用的，由于与脑垂体特异性转录 因子( p i t 1 ) 相关的核蛋白能与b s p 启动子上的同源元件结合来抑制b s p 的转录， 而p t h 通过c a m p p k a 途径阻断p i t 一1 相关核蛋白活性从而促进b s p 基因表达 4 “。 成纤维细胞生长因子一2 ( f g f 2 ) 也能促进b s p 的表达。1 0n g m lf g f 2 作用于 鼠成骨细胞后能刺激b s p 的表达。3 小时后b s pm r n a 水平就增加了约2 6 倍，6 小时达最高水平( 约4 倍) ，目前通过瞬间转染实验已确定在b s p 基因上存在一个 f g f 反应元件，它位于n t s 一9 2 一8 5 ，即g g t g a g a a f 4 ”。 此外，在骨生长过程中具有促进成纤维细胞分化和骨基质形成的糖皮质激素 也与b s p 基因表达的诱导有关，体外实验中地塞米松可刺激b s p 的表达，而钙三 醇则抑制其表达【5 。 5 华南理工大学硕士学位论文 1 1 4 重组骨唾液酸蛋白的表达研究 利用基因工程技术表达重组b s p 对于研究b s p 的结构、功能及作用机制有重 要意义。目前b s p 在原核和真核细胞中的表达都已有报导。s t u b b s 等【7 】用质粒 p e t - 1 5 b 和p e t 一2 2 b 在ec o l lb l - 2 1 细胞实现了b s p 的胞内表达，但不能得到全 长的b s p ，只得到一些具有空间折叠的未修饰的b s p 片段。这些b s p 片段能与羟基 磷灰石( h a ) 结合，抑制h a 晶体的生长，但较天然b s p 分子的抑制能力要弱，说 明其h a 结合能力是与蛋白质一级结构直接相关的，而翻译后加工修饰对其活性也 有影响。 t y e 等在原核细胞中实现了鼠全长b s p 的表达【5 】，将天然b s p 与r b s p 进行活 性比较，发现r b s p 能形成h a 晶核活性的浓度约是天然b s p 的4 0 倍，尽管b s p 的 翻译后修饰在对形成晶核方面的影响尚不清楚，但是一般认为b s p 的翻译后修饰 能让蛋白稳定在一个特殊的构像状态下。同时，翻译后修饰的b s p 上的磷酸基团 可能提供了更高的电荷密度，有利于钙离子的积聚。 w u t t k e 等【9 1 用b s p 表达质粒转染人胚胎肾细胞，获得重组b s p 蛋白。与骨来 源的b s p 相比较，二者具有相似的二级结构，碳水化合物分析显示重组蛋白糖基 化程度较高，骨来源的b s p 与羟基磷灰石( h a ) 的亲和能力高于重组b s p ，这可能 与骨b s p 中寡聚糖上带有更多的n 一乙酰神经氨酸( n e u a c ) 有关。 虽然b s p 的转录后加工修饰对其活力的影响机制还不清楚，但在不同表达系 统中表达的b s p 可以进一步研究转录后加工修饰对b s p 活性的影响。此外在表达 b s p 时，采用定点突变技术或表达b s p 的部分肽段可以针对性地研究分子中发挥作 用的结构功能域。因此重组b s p 不仅提供了获得b s p 的途径，同时也为其结构与 功能的研究提供了新的思路。 1 1 5 骨唾液酸蛋白的糖基化分析 b s p 是一个大的糖化蛋白，大约含5 0 的碳水化合物，既有o 一糖链也有n 一糖链， 且糖链结构为复杂型。人b s p 具有4 个n 一糖基化位点( a s n x s e r t h r ) ，都靠近 蛋白质n 一端，经预测其5 3 个t h r 和s e r 残基中存在1 1 个潜在的0 一糖基化位点【9 1 。 w u t t k e 等【9 1 对在人胚胎肾细胞中表达的重组r b s p 进行了糖基化分析，碳水化 合物分析显示重组蛋白糖基化程度较高。通过m a l d i t o f 质谱仪分析，r b s p 的峰 形在4 0 7 5k d 之间，平均分子量为5 7k d ，而根据b s p 核心蛋白分子量为3 3 6k d a 推算r b s p 的糖化程度约为4 0 ；骨来源的b s p 的峰形在4 0 6 0k d ，平均分子量 为4 9k d ，其糖化程度略低，约为3 0 。 肽一n 一糖苷酶f ( p e p t i d e n g l y c o s i d a s ef ，p n g a s ef ) 几乎可以切断所有的天 冬酰胺残基上的n 一聚糖。以p n g a s ef 作用于r b s p ，其分子量减少了5k d ，作用 于骨来源b s p 后分子量减少了6k d 。而用内切糖苷酶h ( 只能切除高甘露糖型n 6 第一章绪论 一聚糖) 消化r b s p 并没有改变蛋白质大小，说明b s p 只含有复杂型n 一聚糖。b s p n 一 聚糖分析显示，复杂型糖结构中带有2 4 个天线，每个天线都带有1 4 个n e u a c ( n - 乙酰神经氨酸) 。骨b s p 中的n 一聚糖主要是三天线结构，而r b s p 是以四天线 结构为主。 b s p 的o 一聚糖分析显示：r b s p 具有8 个苏氨酸糖基化位点和8 种不同的类似 于粘蛋白的结构，其中核心1 衍生的o 一聚糖结构在骨b s p 和r b s p 中都存在，而且 这一结构也在肿瘤细胞的粘蛋白中有发现。这是否暗示着这样的一种结构与b s p 在肿瘤骨转移中的作用有关尚未可知。但糖链结构的研究为进一步研究癌细胞中 表达的b s p 与骨b s p 结构上的差异打下基础。 骨b s p 与羟磷灰石的亲和能力高于重组b s p ，这可能与骨b s p 中含有较多的 n 一乙酰神经氨酸而使得带有较多的电荷有关【9 】。b s p 的糖基化位点都能发生糖基 化，但不一定都被糖基化，所以象其它糖蛋白一样也存在糖基化位点的多样性。 1 2 毕赤酵母表达系统 自1 9 8 1 年h i t z e m a n 等首次应用酿酒酵母胞内表达人旺干扰素基因以来5 ”， 应用酵母这种低等真核生物表达外源基因越来越多，建成了多种基因的酵母表达 系统，成功地表达了多种蛋白。巴氏毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 属甲醇营养型 酵母，能以甲醇作为唯一的碳源与能源。该宿主系统已被证明是既可以用于分泌 表达，又可以胞内表达外源基因的一个比较理想的酵母表达系统。目前已有超过 4 0 0 种蛋白在毕赤酵母中表达5 胡。 1 2 1 毕赤酵母表达系统的优点 ( 1 ) 具有强有力的醇氧化酶基因( a o x l ) 基因启动子，可严格调控外源基因 的表达。 ( 2 ) 能高密度发酵培养，而且营养要求低，利于工业化放大生产。 ( 3 ) 自身分泌的蛋白非常少，使分泌的外源蛋白便于纯化。 ( 4 ) 外源基因通过整合型质粒进入毕赤酵母染色体基因组，结构稳定，不易 丢失。 ( 5 ) 自身含有亚细胞器结构，可对表达的蛋白进行翻译后的修饰如信号序列 的加工、蛋白的折叠、二硫键形成以及糖基化。 ( 6 ) 基因表达的产物既可在胞内积聚，又可分泌到胞外。 ( 7 ) 外源蛋白的表达量较高。 由于上述特点，一些外源蛋白在细菌、酿酒酵母或者杆状病毒中不能有效表 达，而在毕赤酵母中却能以活性形式成功表达5 3 1 。 7 华南理工大学硕士学能论文 1 2 2 外源蛋白的表达调控 甲