（农产品加工及贮藏工程专业论文）高效液相色谱法测定枣中糖类物质.pdf

河北农业大学硕士论文 摘要 研究了快速测定枣中糖类物质高效液相色谱法。枣样品经过烘干和粉碎后，用9 5 的乙 醇提取，分为寡糖( 含单糖) 和多糖，寡糖直接进色谱柱测定，多糖经水解、中和、浓缩和 定容后，再进色谱柱测定。色谱泵为p 2 0 0 i i 高压恒流泵，检测器为w a t e r s4 5 0 示差折光检 测器，色谱柱为大连伊利特h y d e r s i r n h 2 ，柱温3 5 。c ，检测池温度3 5 ，流动相为乙腈： 乙酸乙酯：水= 6 0 ：2 5 ：1 5 ，流速0 6 m l m i n ，进样体积1 0ul 。结果表明，此方法测定各种 单糖的稳定性用相对标准偏差r s d 来表示，半乳糖3 1 9 ，果糖0 7 5 ，鼠李糖5 1 3 ，木 糖o 8 9 7 ，阿拉伯糖1 7 4 葡萄糖2 2 1 蔗糖2 3 4 ，甘露糖4 1 1 。测定各种单糖的 回收率为鼠李糖9 6 2 ，木糖9 9 3 ，阿拉伯糖9 7 0 ，果糖1 1 0 ，甘露糖9 7 5 ，葡萄糖 9 7o ，半乳糖1 1 0 ，蔗糖1 1 0 。用此方法测定的各种单糖的线性方程，鼠李糖 仁38 7 e 4 + 7 5 7 e 5 x , 相关系数0 9 9 5 ，木糖r _ 1 4 0 e 54 - 8 6 7 e 5 x , 相关系数0 9 9 6 ，阿拉 伯糖怍1 2 4 e 5 + 1 2 3 e 4 x ，相关系数0 9 9 1 ，果糖r - 2 7 8 e 4 + 7 2 0 e 5 x , 相关系数0 9 9 7 ， 甘露糖y _ - 1 9 8 e 4 + 9 7 7 e 5 儿相关系数o 9 9 9 ，葡萄糖p 17 5 e 4 + 6 1 5e - 5 x , 相关系数o 9 9 9 ， 半乳糖y - - i 9 1 e 4 + 4 1 0 e 5 x , 相关系数o ，9 9 9 ，蔗糖y _ - 5 6 i e - 5 + 6 6 0 e 一5 x , 相关系数0 9 9 9 。 用此方法测定半红期的冬枣中各种单糖和双糖含量，鼠李糖：7 5 5 m g g ；阿拉伯糖：90 9 m g g ： 果糖：2 1 2 m g 幢；葡萄糖：3 6 3 r a g g ；半乳糖：2 8 0 3 m g g ；双糖( 用蔗糖算) ：2 8 5 m g g 。测 定组成多糖的单糖含量，鼠李糖为：1 1 1 m g g ；阿拉伯糖：7 6 5 m g g ；果糖：3 6 6 1 m g g ；甘 露糖：7 1 4 m g g ；葡萄糖：1 9 9 m g g ；半乳糖：2 22 m g g 。用此方法对不同发育阶段冬枣和 小枣的糖类的变化进行动态分析，发现糖的含量随着生长期而变化，在幼果期、白熟期、半 红期和全红期的各种糖的变化比较明显。在幼果期，果糖、葡萄糖和半乳糖含量比较高，自 熟期以后寡糖含量增高，而果糖、葡萄糖和半乳糖的含量先减少，再升高。 关键词：枣；高效液相色谱：糖类：动态变化 独创性声明 本人弗翡所量突豹学接论文是本人在导j | i l i 攒导下进行的研究工作及取褥的研 究成栗糖我所袈，豫7 文中特剔搬；基_ 精陵和致谢的她方终，论文孛不包食其熟 入已疑发表或撰写过的轿究成槊，也不包含为获缮西：整垡逖丝绒其她教 育机构的举位藏证书而使绡遘豹材辩与我一蠲工作静瓣志对本臻究所傲靛任爨 贡献均已在论文中作了明确的说明并表承谢意 学位论文作者签名：起卿裤日期 沙啤彳月朋 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解立叠丝兰兰兰簇保臂、使用学位论文的规定 有权保鹭并向 搭阅本人授 文的复印件和磁盘允许论文被凝阅釉 位论文的全部或部分内容编入有* 数据 薅遴行捻索，可以妥照影印、缩印或 曩攒等复锻手段保存、汇编学位论文 ( 保密豹学像论文在解整盛适用本授投长) 学位论文作粼：耔( 书 导捧双 谨同 艘字日期：协t 弦舀月珀签字日期：二d t 终月淳咱 学位论文作者毕业后去向： 正传单位； 通讯地址： 电话： 邮绽： 河北农业大学硕士论文 文献综述 1 立题依据 枣( z i z p h u sj u j u b em i l l ) 是鼠李科枣属木本植物，枣果，又名红枣等。根据果实 的大小可分为大枣和小枣。它是我国特有的果品之一，自古被列为五果之一。目前大枣有 7 0 0 多个品种。如金丝小枣、婆婆枣、相枣、木枣、尖枣、骏枣、牙枣、龙枣、玲玲枣、灰 枣、【固铃、脆枣、大糖枣、酸枣、无核枣等。大枣在我国分布很广，集中产地在河北、河南、 山东、山西、陕谣等省。“。 枣果不仅是滋补佳品，而且也是一味传统的中药，具有补脾益胃、养心安神、缓和药 性等功效。主治脾虚食少，乏力便溏，妇人脏躁”。现代药理研究表明，它具有抗变态反 应、抗肿瘤、镇静、保肝、抗炎、抗衰老等多方面药理作用。这些功能的存在应归咎f 其 所含的特殊化学成分。研究表明，枣中含有糖类、蛋白质、多种维生素、膳食纤维素、脂肪、 微量元素、环核苷酸、生物碱、三萜酸、类黄酮等成分”。1 “，这些成分有些是人体新陈代谢 所必需的营养成分，有些则是具有生理调节作用的生物活性成分。因此，枣是我国特有的功 能性食品基料资源。 1 1 枣中的化学成分 枣为我国传统药食兼用果品。作为食品，丈枣含有人体所需的碳水化合物、蛋白质、脂 肪、多种氨基酸、维生素、微量元素、有机酸和粗纤维等”“，这些都是构成和参与人体生 命过程不可少的重要物质。 1 1 1 碳水化合物( c a r b o h y d r a t e ) 枣果中碳水化合物含量很高，鲜果中达2 6 3 6 ，干枣中高达6 0 ，其中包括葡萄糖、 果糖、低聚糖、多糖等“。不同的枣品种含糖量不一样。据文献报道”1 ，尖枣作为一个鲜食 品种，其总糖、还原糖、果糖含量及果糖占总糖的比例等项指标在被测9 个枣品种中均为最 高，而纤维素含量最低：婆婆枣中总糖含量最低，而纤维素、果胶含量最高；而同一品种的 枣，随着品质由优变劣，枣中糖的含量逐渐减少”8 3 。 1 1 2 蛋白质和氨基酸( p r o t e i na n da m i n oa c i d ) 大枣中含有蛋白质1 2 一3 3 ，人体所必需的2 4 种氨基酸中，枣含有1 7 种。据中国农 高效液相色潜法测定枣中糖类物质 业院蔬菜研究所对乐陵金丝小枣样品化验分析”，每百克果肉中含有天门冬氨酸0 3 毫克。 苏氮酸00 6 毫克、丝氨酸o 0 6 毫克、谷氨酸0 1 5 毫克、甘氨酸0 0 7 毫克、丙氨酸o 0 6 毫 克、颉氨酸o 0 7 毫克、蛋氨酸o 0 6 毫克、异亮丙氨酸o0 6 毫克、亮氨酸0 0 9 毫克、酪氨酸 o 0 6 毫克、苯丙氨酸o 0 6 毫克、赖氨酸o 0 7 毫克、组氨酸0 2 3 毫克、精氨酸0 0 6 毫克、脯 氦酸i7 8 毫克、胱氨酸00 5 毫克。 1 1 3 维生素( v i t a m i n ) 枣中含有丰富的维生素其中维生素c 的含量【9 _ l ”，每百克鲜果肉中约3 8 0 毫克6 0 0 毫克，比苹果、桃高1 0 0 倍左右，比橘子高7 1 0 倍，有天然维生素丸之称。酸枣的含量更 高，达1 0 0 0 毫克以上。 枣中的维生素a 、维生素b 、维生素d 的含量也很高，还含有维生素p 、硫胺素、胡萝 h 素等”。 1 1 4 微量元素( m i c r o e l e m e n t ) 人枣中含有钙、镁、钾、钠、磷、氯、硫、铁、硒等微量元素和矿物元素9 13 i ，每百克 鲜果约含有钙4 1 毫克、磷2 3 毫克，铁0 5 毫克。这些物质都是人体骨骼、血液及许多酶的 组成成分。因此，常食枣可以使体内无机盐得到平衡。 人枣又可以作为药物除了跟其含有的营养化学物质有关外，还含有其他的化学成分。 大枣性温，味甘、无毒。功用为补脾和胃，益气生津，调营养，解药毒。现在药理研究 表明，人枣还具有降低血清胆固醇、增加血清总蛋白及自蛋白、抗过敏、抑癌抗癌、镇静催 眠、降血压、增强心肌收缩力、调节免疫功能、强壮、保肝、镇咳等作用。大枣除了含有 些常见的营养物质外，还含有环磷酸腺苷、大枣苄甙、大枣催吐醇甙、芦丁等1 。6 i 。 l _ 1 5 环核苷酸 据有关资料报导【9 - 1 0 1 , 枣成熟果肉中环核苷酸含量达1 0 3 0 0 n m o l g ，是所有己测动植物材 料中最高的，为一般动植物材料环核苷酸含量的数千至数万倍。大枣中含有的环磷酸腺苷可 调节细胞的分裂增值，有利于肿瘤细胞向正常细胞转化。环磷酸腺苷还有扩张血管的作用， 可改善心肌的营养状况，增强心肌收缩力，有利于心脏的正常活动。环磷酸腺苷还是一种抗 过敏作剧的化学物，它使细胞膜变稳定，减少过敏性介质的释放，从而阻止过敏反应的发生。 1 1 6 其他物质 2 t 河北农业大学硕士论文 枣中含有三萜类化合物，据报道三萜类化合物对癌的抑制作用超过抗癌药物5 氟嘧啶。 枣中含有的三萜类化合物有山楂酸等“， 大枣中含有达玛烷型皂甙，有抗疲劳的作用，能增强人的耐力。大枣中的黄酮类化合物 有镇静、催眠和降血压作用。大枣中的乙基- d 呋喃葡萄糖甙衍生物对5 羟色胺和组织胺有 对抗作用”“。 枣是我国一大特色和优势资源，枣产业是河北省太行山区和沧州盐碱地区的支柱性产 业。然而，迄今枣的加工增值环节尚十分薄弱，尤其缺乏能突出枣果营养和独特食疗价值的 高附加值产品，这一现状己成为枣树生产再上新台阶和可持续发展的关键性制约因素。因 此，研究枣中营养成分，特别是含量极其丰富的糖类成分，就具有了至关重要的作用。对于 开发和利用枣资源具有重要的意义。 从枣的枝叶以及果实的质地特点可以推断，枣果实的多糖应该据有特殊的分子结构，而 且确有学者从枣果实中分离出非消化性单糖。用小鼠做的枣膳食纤维素调整肠道功效试验的 结果也说明，枣膳食纤维素确有明显的生理调节作用，因此可以认为，有必要继续对枣中多 糖的化学组成进行进一步研究。本研究拟以枣果为研究对象，建立高效液相色谱分析法，对 枣中多糖进行单糖组成的定性定量分析，初步掌握枣多糖组成和结构概况。 2 国内外对枣中糖类的研究现状 枣树是我国的特产果树，国外的研究报道比较少。国内对于枣中的维生素、蛋白质等的 研究比较多。对含量最大的成分糖类，目前基本局限于总糖和还原糖的测定。对于多糖 的研究是把多糖分解后，再进行总糖和还原糖的测定，或者对组成多糖的单糖进行定性分 析，没有对某种单糖进行定量分析的报道。 枣中糖类的含量极为丰富。据文献“1 报道，枣果中的糖包括葡萄糖、果糖、低聚糖、多 糖等。粗纤维平均为2 4 1 ，其中以河南灰枣最高，辽宁木枣最低”1 。总糖含量平均为6 0 3 6 ， 其中以陕西晋枣、河北沧州金丝小枣i 号最高，陕酲黑疙瘩枣最低。不同品种间各种营养成 分差异显著”l 。同一品种中，随着品质由优变劣，枣中糖的含量逐渐减少，酸的含量、纤维 素、果胶等含量逐渐增加。枣中果糖含量为1 4 3 5 ，占总糖的2 0 4 8 ，平均3 1 5 ，与 3 高效液相色潜法测定枣中糖类物质 蜂蜜中果糖含量接近“。 2 1 单糖的测定 食品中常见的单糖包括：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、 半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸和山梨糖醇等 1 7 - 1 8 】。 单糖类的测定有滴定法、比色法和色谱法”6 1 等。前者主要是利用还原糖的还原性来进 行滴定：比色法是利用还原糖与其他物质反应生成有颜色的物质，然后用分光光度计进行比 色测定。色谱法是利用色谱原理把各种糖类物质分开，然后用定的检测器测定含量。 2 1 1 滴定法 滴定法常见的有直接滴定法、高锰酸钾滴定法、萨氏法、碘量法和蓝一爱农法“”2 “等。 由于是利用氧化还原反应，酮糖和醛糖都具有一定的还原性，所以滴定法的选择性差，测定 的是总还原糖的含量，或总酮糖和总醛糖的含量，不能具体测定某种还原糖的含量。 2 1 2 比色法 比色法有3 ，5 二硝基水杨酸比色法和半胱氨酸一咔唑比色法“”。前者也是利用还原糖 的还原陛把3 ，5 一二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成氨基化合物。此化合物在过量的 氢氧化钠碱性溶液中显桔红色。后者是利用单糖与强酸反应生成糠醛或其衍生物，再与显色 剂半胱氮酸咔唑缩合成有色络合物。由于比色法也是利用还原糖的总体特征来测定，也没有 选择性，测定的也是总还原糖的含量或单糖的总量。 2 1 3 纸层析法 采闱新华中速滤纸( 2 0 c m x 2 9 c m ) ，上行层析，溶剂系统为正丁醇：冰醋酸：水( 4 ：l5 ： 5 ) 或醋酸乙酯：吡啶：水( 1 0 ：4 ：3 ) 。样品经过水解，用碳酸钡中和至中性，过滤后浓缩、 点样、展开、显色。显色剂为苯胺一邻苯二甲酸。根据比移值或与标准单糖作对照确定单糖 的种类。根据颜色的深浅进行定量分析，可以用薄层色谱进行定量测定。薄层色谱的缺点是 背景的影响太大“2 “。 21 4 气相色谱法 糖类分子间引力一般较强，挥发性弱，不能直接用气相色谱法进行分析，需要把糖制成 具有挥发性的衍生物，才能用气相色谱法测定。常见的衍生物有：三氯硅烷衍生物、三氟乙 酰衍生物、乙酰衍生物和甲基衍生物等。如：样品加入三氟醋酸1 0 0 ( 2 水解1 0 h ，过滤去除 4 河北农业大学硕士论文 杂质，减压挥发三氟醋酸至干，再加入蒸馏水熏复几次，直至最后去除三氟醋酸。然后进行 乙酰化处理，反应产物直接进行气相色谱分析。标准单糖如上处理。根据标准单糖与样品的 保留时间的比较，确定组成单糖的种类，并根据各峰面积计算出其摩尔比。此方法不适宜用 于乳糖“”，而且纯化和衍生操作麻烦。 2 1 5 高效液相色谱法 高效液相色谱法是样品经过适当的处理后，将糖类的水溶液进入色谱柱，用适当的流动 相洗脱在经过检测器进行分析。报道上测定单糖所用的检测器有红外检测器，电化学检测 器、示差折光检测器、光散射检测器和紫外检测器“”“。用紫外检测器时，单糖要进行衍生 化，再测定。由于枣中的单糖成分比较复杂，报道上用液相色谱法对枣中糖类的分析不能完 全分离单糖，一般限于定性分析，没有见过定量分析的报道。 2 1 6 离子色谱法 文献上有用离子色谱法测定单糖的含量“”，主要是根据糖是一种多羟基醛或酮的化合 物，具有弱酸性，当p h 在1 2 1 4 时，会发生解离，所以能被阴离子交换树脂保留，用p h 为1 2 或碱性更大的氢氧化钠溶液淋洗，可实现糖的分离，再以脉冲安培检测器检测，以峰 保留时间定性，以峰高或峰面积进行定量。 纸层析法、气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法都属于色谱法。纸层析法分辨率 低，分析时间长背景影响比较大，误差也大，定量分析比较困难。气相色谱法操作比较繁 琐，特别是衍生条件要求比较苛刻。离子色谱法测定糖类的灵敏度高，操作简单，但用脉冲 安培检测器的稳定性比较差。高效液相色谱法测定糖类比其他的方法简单，无须衍生化，测 定热不稳定的单糖和寡糖效果比较好，特别是测定多糖方面是其它方法不可比拟的。 2 2 枣多糖的分析 多耱是可以水解为2 0 个以上分子单糖的聚糖。多糖没有均一的聚合度，分子量具有一 个范围，常以混合物形式存在。多糖具有两种结构：一种是直链结构；一种是支链结构。由 相同的单糖组成的多糖称为均匀多糖如纤维素、直链淀粉以及支链淀粉，他们均是由d 吡 喃葡萄糖组成。具有两种或多种不同的单糖组成的多糖称为非均匀性多糖，或称为杂多糖。 多糖广泛分布于自然界，食品中多糖有淀粉、糖原、纤维素、半纤维素、果胶物质、亲水性 多糖胶和改性多糖等。有些学者把植物的非淀粉多糖加上木质素归为膳食纤维。中华人民共 5 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 和国药典已经将多糖的相对质量及其分布列入多糖药物的质量标准。”。 从水果中提取的多糖具有持水性强，保健作用明显的优点，是重要的膳食纤维素的资源。 目前国内已经从很多水果，如从龙眼、柑桔、葡萄中提取出特征性多糖”8 “1 。这些多糖大部 分在临床上应用，如云芝多糖k 、白山云芝多糖、银耳多糖、灵菌素、多抗甲素和香菇多糖 ：等。这些多糖一般都具有提高人体免疫力和抗肿瘤功效等。然而以枣为原料提取功能性 多糖的研究尚未见报道。多糖的分析研究是当今世界生命科学研究的前沿课题之一。研究发 现许多植物来源的多糖具有免疫调节、预防便秘、降低血脂、调节血糖、防癌等多方面的特 殊生理调节功能“2 ，以致许多学者建议，把植物多糖为主要成分的膳食纤维素作为人体的 第7 大营养素。 2 2 1 枣多糖的提取和分离 有文献报道。“对枣中多糖的提取，方法大致如下，先用水提取，再用9 5 的乙醇沉淀， 然后脱脂、去蛋白和脱色。此方法比较复杂。因此本试验将采用其它水果蔬菜里的多糖提取 方法1 “。方法大概如下，取一定量的枣粉，以9 5 的乙醇分几次进行提取，提取物是水溶 性糖类，可直接进行定量和定性分析。沉淀物进行水解处理，使多糖分解成单糖。 2 2 2 枣多糖的水解 对于不同的水果中的多糖，水解条件差异很大。因为酸水解条件( 如酸的种类) 对测定 结果影响明显且十分复杂。酸的强度、浓度不足、或水解温度过低，水解时间不足，都可因 水解不完全而产生负误差；但浓度过大，水解温度过高或水解时间过长，可能因纤维素部分 水解而产生正误差。可能因酸催化使水解的单糖脱水产生糠醛并重新聚合成褐胶糖”，而产 生负误差。因此本研究希望找出水解的最佳条件。 2 2 3 多糖的测定 一般来说多糖的测定有两种方式，一种是赢接测定多糖本身，一种利用组成多糖的单糖 的性质进行测定。前者需要多糖的纯品，对多糖进行测定，这在未定性多糖的结构之前很难 实现。所以一般是利用后者确定多糖的结构，再对多糖本身进行定量。 相对于蛋白质和核酸，多糖的一级结构非常复杂，一般是利用化学分析法对多糖进行水 解，然后再对组成多糖的单糖进行测定，由此来推测多糖的一级结构。高效液相色谱法是研 究组成多糖的单糖成分的有效手段之一。 6 河北农业大学硕士论文 2 3 高效液相色谱法在测定碳水化合物的应用 高效液相色谱法也称为高压液相色谱法或高速液相色谱法。它是在经典的液相色谱法的 基础上，引入了气相色谱法的理论，在技术上采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的 检测器而发展起来的快速分离分析技术，具有分离效率高、检出限低、操作自动化和应用范 嗣广的特点”7 1 。 色谱方法发展及优化指的是对f 复杂未知样品先初步确定其基本分离条件( 如模式、柱 子、流动相等) ，后对此方法进行优化，如流动相的多台阶多二元的智能优化以及多维色谱 技术的应用。从而使得在给定的柱系统和最佳的流动相梯度下，样品组分获得较好的分离， 分析时间最短，同时色谱峰分离度增加，检测灵敏度也相应地得到提高。 对于未知样品的优化是将未知样品转为已知样品，弄清样品组分的保留值规律，从而利 用计算机进行智能优化。 商效液相色谱法测定碳水化合物常用的色谱柱一般是用n h 2 色谱柱9 “，也见过其它色 谱柱的报道，如o d s 柱【9 7 】，但此柱对用水作流动相相对于不衍生的单糖和低聚糖来说，保 留时间很短，不利于分离，为了解决此问题一般是使糖苷或糖经过衍生物，但衍生和纯化过 程极其麻烦。还有其它色谱柱，如l i c l l r o s p h e rd i o l 、p a l 、s m p 和h p 8 7 等色谱柱，这 些色谱梓一般与电化学检测器配合使用来测定糖，据报道所测定的水果中的单糖种类也较 少。 测定碳水化合物的流动相一般用有定极性的流动相，报道上的流动相有乙酸乙酯和 水丙酮、乙酸乙酯和水，二氯甲烷和甲醇，甲醇和水【2 8 - 9 1 等。流动相的选择是色谱优化的 过程。对于枣中的糖类，由于糖的种类复杂，要选择合适的流动相。 测定碳水化合物的检测器有示差折光检测器、紫外检测器、荧光检测器、红外检测器和 电化学检测器等。若用紫外检测器和荧光检测器，由于糖本身在近紫外区没有吸收而且不产 生荧光，所以直接测定糖的含量不行，必须把糖进行衍生化”3 。红外检测器适合于对寡糖 的测定，对单糖的测定不太适合”。电化学检测器是利用流动相一溶质的物理性质的检测器， 容易受温度和流量的影响，以往的研究中有用极谱法检测器检测糖类，这种类型的检测器用 丁定肇分析是有困难的，因为峰面积随流动相、色谱柱、流速和电压而变化【9 7 1 。红外检测器 和电化学检测器目前应用比较少，用得比较多的检测器是示差折光检测器。但示差折光检测 7 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 器的灵敏度低，为了使示差折光检测器得到最高的灵敏度流动相和样品折光指数的差别应 尽可能大而且流动相的变化会影响折光值，不适合梯度洗脱装置。因此选择合适的流动相 是很是重要的，既要保证灵敏度，又要让待测的样品分开。 因此作者要用高效液相色谱法建立起一种快速测定枣中糖类物质的方法。用于测定枣中 某种糖类的含量。此方法对于评价枣的品质，开发具有功能性多糖的枣的产品具有重要的应 用价值。 3 目前存在和需要解决的问题 3 i 对于水果中单糖的测定只限于总糖和还原糖的测定，还没有一种能够准确地同时测 定各种单糖的方法。 3 2 在其它具有中药功能的食品中多糖研究的较多，而枣中糖类的研究较少，对枣中多 糖开发功能食品的可行性更没有见报道。 33 在以往的研究中一些学者对不同品种的总糖含量差异有过研究但对同一品种的各 种糖类变化没有见报道。 因此作者要用高效液相色谱法建立起一种简单、快捷、准确的方法来同时测定各种水果 中常见单糖，在建立高效液相色谱法测定糖类物质的方法基础上，进一步分析枣中糖类物质 的动态变化，从而为枣中糖类的利用选择一个最佳时期。对于组成多糖的单糖的测定，可为 推测多糖的一级结构判断开发功能性食品的可行性提供依据。也为枣品种的糖类成分评价提 供一个量化标准。 8 河北农业大学硕士论文 引言 多糖研究在全球已成为生命科学研究的前沿，国内外的一些专家学者都在努力合成一些 犬然的多糖。从水果中成功提取多糖是多糖研究的重大突破，对中国今后高科技开发水果产 品具有重要意义。目前国内已经多种水果中提取出特征性多糖，如龙眼多糖，黄芪多糖，灵 芝多糖等。而枣中多糖的研究很少见报道。据研究枣中多糖，具有一定的抗氧化性功效。由 于多糖的结构比较复杂，把多糖水解后再分析其单糖的组成，是研究多糖的一级结构的一种 有效手段。而对多糖水解后的单糖测定，一般只是定性分析，没有见过定量分析其组成多糖 的各种单糖的报道。 枣中多糖的研究的还比较少，相关报道也比较少，这与干枣中的糖类占6 0 以上不成比 例的。枣中的单糖文献上有：阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖，组成多糖的单糖有：鼠李糖、葡 萄糖、阿拉伯糖和半乳糖。由于这几种单糖属于5 碳和6 碳糖，结构比较相近，文献上有关 丁用高效液相色谱法分离测定单糖的方法，但一般都是分离测定其中的一种或两种糖，朱见 同时分离测定枣中这几种单糖成分报道。以往的文献报道的方法要么是用到些很少见的检 测器，要么就是所用的方法不能分开这几种糖。本文对枣中几种单糖和木糖用高效液相色谱 法同时进行分离测定，分离效果比较好，结果比较可靠。 9 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 l 实验部分 1 1 仪器 中国大连依利特高效液相色谱仪：由p 2 0 0i i 高压恒流泵，w a t e r s4 5 0 示差折光检测器， e c h r o m 9 8 色谱工作站，大连伊利特h y d e r s i rn i l 2 色谱柱等部分组成；8 0 0 型离心沉淀 器：u s c2 0 2 超声波清洗器，s z 一9 3 自动双重纯水蒸馏器，真空抽滤装置、旋转蒸发器r e - 3 2 a ， 二口烧瓶，温度计，真空烘干机，干燥器，c f b 高速万能粉碎机，电子电炉，恒温箱 1 2 试剂 葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、木糖、甘露糖为s i g m a 公司产品。 水为去离子三蒸水。乙酸乙酯、乙腈为北医大医药三公司的色谱纯产品。丙酮、盐酸为分析 纯。 1 3 实验条件 1 3 1 柱温：3 5 c 1 3 2 检测池温度：3 5 1 3 3 流动相：乙腈：乙酸乙酯：水= 6 0 ：2 5 ：1 5 ，超声脱气，经过0 4 5um 滤膜过滤。 1 3 4 流速：06 m l m i n 1 3 5 进样体积：1 0ul 1 4 样品来源 河北农业大学中国枣研究中心提供 1 5 样品处理 样品先去核，经过5 0 。c 真空烘干，置于干燥器里干燥冷却。用样品粉碎机把样品粉碎， 用乙醇提取枣粉，用离心机离心，过滤。滤液直接用色谱分析。滤渣用酸水解，然后中和、 过滤、浓缩，再溶解，后进样分析。 1 0 型型型翌丝生一 鲜枣+ 去核，干燥+ 研磨+ 乙醇浸泡( 提取 初级分离 地谱分离定性分析 1 , 6 实验方法 由下示差折光检测器和温控系统需要稳定的时间很长，在完成论文过程中检测器和温控 系统总是打开，每次实验前，先用流动相冲洗示差折光检测器的参比池和样品池，使两个池 子的流动相一致。然后对色谱泵和色谱柱用所选流动相冲洗平衡至柱压和检测器稳定，实验 结柬时用纯甲醇或乙腈冲洗泵和柱子。 商效液相色谱法测定枣中糖类物质 2 结果与讨论 2 1 流动相的确立 2 1 1 乙腈和水 在氨基柱上，文献上报道分析糖一般是采用乙腈和水作为流动相，比例范围为( 6 0 ：4 0 ) ( 9 0 ：1 0 ) ，温度4 0 c 以上。本实验发现在用乙腈和水作流动相，随着乙腈的浓度变大， 各个峰的保留时间变大，峰之间的距离变大，峰逐渐分开，也就是分离度变大。各个峰的面 积变小，影响灵敏度。但是不管采用什么比例都不能分离木糖峰和阿拉伯糖峰或葡萄糖峰和 半乳糖峰。色谱图如图1 所示，出峰顺序为鼠李糖，木糖，阿拉伯糖，果糖，甘露糖，葡萄 糖，半乳糖和蔗糖。 百 三 信 号 时间呻“吨日 图1 流动相为丙酮：乙酸乙酯：水= 7 0 ：2 0 ：1 0 的色谱图 i 、鼠李糖2 、木糖3 、阿拉伯糖4 、果糖5 、甘露糖6 、葡萄糖7 、半乳糖8 、蔗糖 如图2 所示，在此流动相下，分离各种单糖的效果不理想，木糖和阿拉伯糖的色谱峰重 霍，甘露糖和果糖、葡萄糖都有重叠，葡萄糖和半乳糖的色谱峰重叠严重。 2 1 2 乙酸乙酯、丙酮和水 文献也报道过用乙酸乙酯、丙酮和水作为流动相，本试验对此流动相的各种比例进行试 2 河北农业大学硕士论文 验，丙酮或水的比例变大，各个峰的保留时间变小，峰之间距离变小。在乙酸乙酯：丙酮： 水= 3 0 ：6 0 ：1 0 时能分开阿拉伯糖和果糖，但木糖和阿拉伯糖峰有部分重叠，葡萄糖和半乳糖 峰重叠严重。同时溶剂峰也影响鼠李糖的测定。各种糖的出峰顺序没有变化。此流动相的其 他比例都不能分开阿拉伯糖和果糖，以及葡萄糖和半乳糖。 2 1 3 甲醇和乙腈或甲醇、乙腈和水 本实验试着用甲醇和乙腈以及甲醇、乙腈和水作为流动相。当用甲醇和乙腈流动相时分 离效果很差，基本不能实现峰分开，而且峰形不好。甲醇、乙腈和水作流动相，峰形不好， 而且不能实现木糖和阿拉伯糖峰的分开，也不能分离葡萄糖和半乳糖。 2 1 4 乙腈、乙酸乙酯和水 本试验又对乙腈、乙酸乙酯和水流动相进行试验。最后发现乙腈：乙酸乙酯：水比例为 6 0 ：2 5 ：1 5 时，效果很好。此流动相比例为最佳比例。如果乙腈的浓度变大，会引起阿拉伯糖 的峰面积变小；水的浓度变大，峰之间靠近，分离度变4 1 ，造成分离困难。如用乙腈、丙酮 和水作为流动相，丙酮的洗脱能力要比乙酸乙酯强，在比例为：8 5 ：5 ：1 0 时，基本上能分 离木糖和阿拉伯糖，但葡萄糖和半乳糖重叠严重。 宇 三 信 号 2 1 5 乙酸乙酯、乙腈和水 图2 流动相为乙腈：乙酸乙酯：水= 6 0 ：2 5 ：1 5 的色谱图 壹塾堕塑鱼堕婆型塞! ! 笪耋塑堕 i 、鼠李糖2 、木糖3 、阿拉伯糖4 、果糖5 、甘露糖6 、葡萄糖7 、半乳糖8 、蔗糖 最后采用乙酸乙酯、乙腈和水作为本试验的流动相。比例为6 0 ：2 5 ：1 5 。各种糖的出峰顺 序为：鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。色谱图如图2 所 可i 。 如图2 所示，在乙腈：乙酸乙酯：水= 6 0 ：2 5 ：1 5 的流动相下，分离各种单糖的效果比 较好，基本能够把各种单糖的色谱峰分开。 2 2 水解条件的确立 文献上报道了用正交法确立水解条件，确立的条件是用硫酸作为水解酸，酸的浓度是 3 5 m o l l ，水解温度1 0 0 c ，水解9 0 m i n 。此方法适合用常量分析方法对总糖分析，不适合 用液相色谱法测定各种单糖，由于水解温度过高，容易造成部分单糖结构发生了变化，进液 相色谱测定时，有怪异峰出现如图3 ，用硫酸作为一种水解酸，酸性成分不容易去掉，用过 多的碱来中和也容易造成单糖的异构化，使峰形变化，不便于进样测定。本方法采用盐酸作 为水解酸，这样可以通过减压蒸馏掉一部分酸，再用少量的碱中和。选择水解为温度7 5 c ， 判断水解条件是否彻底，是看是否有二糖或二糖以上的峰出现，如图4 。用是否有在单糖峰 位置上有无其他峰出现来判断水解是否过分如图3 。 可 三 信 号 图3 过度水解的图谱 1 4 河北农业大学硕十论文 如图3 所示，色谱图上出现一个大的色谱峰，这是因水解过分，酸催化使水解的单糖脱 水产生糠醛类物质，这些物质出现在单糖的色谱峰周围，使色谱峰重叠。 蓦 信 号 时间m ” 图4 水解不彻底的图谱 如图4 所示，在色谱图的单糖峰后面，还有色谱峰出现，这是水解不彻底造成的。在酸 的作川f ，多糖水解变成寡糖，寡糖进一步水解成单糖，如果水解不彻底，就会有寡糖存在， 也就会在单糖峰后面留f 色谱峰。 芎 工 信 号 图5 水解时间1 8 0 r a i n ，温度7 5 c ，酸浓度为2 m o l l 的图谱 1 、鼠李糖2 、阿拉伯糖3 、果糖4 、葡萄糖5 、半乳糖 1 5 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 图5 色谱图就是既不水解过分，水解也比较充分的所得的色谱图，没有寡糖峰，也没有 出现怪异峰。 实验结果表明水解时间在1 8 0 m i n 温度在7 5 c ，没有出现二糖或以上的峰。而且没有出 现其它物质的峰。所以确定水解条件为7 5 度的水解温度，盐酸浓度为2 m o l l ，水解时间1 8 0 分钟。 2 3 柱温的确立 文献报道的柱温温度一般是在4 0 。c 或以上的温度，本试验发现在温度2 5 以上采用上 述流动相就能实现上面几种单糖的分离，如果温度低于2 5 。c 分离效果就变得不好，低于2 0 基本不能分开。最后确定柱温度为3 5 c ，检测器内部温度为4 0 c 。 2 4 提取条件确定 用9 5 的乙醇对枣粉进行提取。在提嵌瀣度为5 0 的条件下，作提取时间和提取次数 与提取量的关系的比较。做三组对照实验，每组实验的提取次数分别为l 、2 和3 次，每次 为l o o m l ，当提取次数为2 次或3 次时，合并所提取的提取液，减压浓缩定容后，直接用 色谱法测定。第一组实验的每次提取时间为l h ，结果如图6 。第二组的每次提取时间为2 h 结果如图7 ，第三组每次提取时间为3 h ，结果如图8 。 兰 暑 主 五 雩 捌 萋 提取动数 图6 每次提取时间为l h 1 6 拈柏皓筋侣如帖：g 河北农业大学硕士论文 如图6 所示，每次提取时间为1 h 时， 的量与下两组对照实验提取三次的量比较 至 g 垂 孽 v 肇 提取量随着提取次数变大而变大，而且提取三次 其提出的量要少，说明提取不充分。 提取目敲 图7 每次提取时间为2 h 如图7 所示，每次提取时间为2 h 时，提取1 次和2 次的量变化很大，提取2 次和3 次 的量基本不变，而且其提取量与下组对照实验的3 次提取量也基本一致，说明提取充分了。 如图8 所示，每次提取时间为3 h 时，提取2 次和3 次的提取量也基本没有变化，提取 越与每次提取时间为2 h 的2 次和3 次提取量比较也基本没有变化。 1 1 柏 。 碎1 薯，柏 _ 蠡 1 。 提取蘸 圈8 每次提取时间为3 h 1 7 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 因此可见每次提取时间2 h 和3 h 时，提取三次的提取量基本没有变化，说明用9 5 的乙 醇提取，每次1 0 0 m l ，每次2 h ，提取三次，基本能够把糖提取干净。因此最后以此条件为最 后的提取条件。 2 5 线性回归方程、线性范围和检出限 称取鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖，配置成标准溶 液浓度范围为0 5 0 m g m l 1 0 0 m g m l 。进样，按上述1 3 色谱条件进行测定。以峰面积积 分值( b v s ) 为纵坐标，对照品浓度( m g m l ) 为横坐标，绘制标准溶液曲线，计算回归方 程的回归系数及截距以3 倍信噪比的计算最低检测限。结果如下： 表1 各种单糖和蔗糖的回归方程、线性范围和检测限 如表1 所示，在线性范围之内，各种单糖的含量与峰面积有很好的线性关系。 2 6 精密度 精确称取鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖各2 0 m g ， 附水定容成1 0 0 m l ，配置成为2 0 m g m l 标准溶液浓度，精确吸取标准溶液1 0 0 i tl ，重复进 样n = 1 0 次，根据峰面积计算相对标准偏差( r s d ) 。求得相对标准偏差为： 、 乳糖3 1 9 ，果糖o 7 5 ，鼠李糖5 1 3 ，木糖0 8 9 7 ，阿拉伯糖1 7 4 葡萄 糖22 1 蔗糖2 3 4 ，甘露糖4 1 1 ，精密度良好。 2 7 回收率 精确称取1 0 0 0 9 的阜平大枣枣粉，加入标准样品5 0 m g 的上述糖的标准品，用1 0 0 、5 0 、 5 0 m l 的9 5 7 , 醇溶液提取，提取液在温度5 0 。c 下，浓缩成5 m l ，然后用水定容成5 0 o o m l 。 1 8 河北农业大学顾l 论文 进样测定，求得各种单糖的回收率如f 表。 表2 各种单糖和蔗糖的回收率 如表2 所示，各种单糖的回收率比较理想，说明用此液相色谱法测定上述单糖的准确 可靠。 3 样品的测定 3 1 大枣的测定 取5 0 0 9 的阜平犬枣( f 红) 枣粉置于三角瓶中，用3 0 0 m l 的9 5 7 u 醇分三次常温静 止2 4 小时提取，离心、过滤，收集滤液在旋转蒸发仪中浓缩至5 m l ，用水定容至5 0 0 0 m l ， 过滤进样。得到9 5 z 。醇溶液的提取物，此部分为单糖和双糖溶液。测的结果如下： 鼠李糖：7 5 5 m g g ；阿拉伯糖：9 0 9 m g g ：果糖：2 1 2 m g g ：葡萄糖：3 6 3 m g g ：半乳糖： 2 8 0 3 m e d g ：双糖( 用蔗糖算) ：2 8 5 m g g 。 把上述滤渣经烘干，然后称取1 0 0 0 9 ，放入5 0 m l 容量瓶中，然后加入1 0 m l 2 m o l h c l ， 7 5 。c 水浴3 h ，取出冷却后，浓缩，再定容至5 0 m l ，然后过滤进色谱柱分析。此溶液为多糖 的酸水解溶液。测的结果如下： 鼠李糖：1 1 1 m g g ：阿拉伯糖：7 6 5 r a g g ；果糖：3 6 6 1 m g g ；甘露糖：71 4 m g g ；葡萄 糖：1 99 m g g ；半乳糖：2 2 2 m g g 。 3 2 对相关的枣产品分析 河此农业大学枣中心主持的课题组所开发的枣产品有环核苷酸糖浆和膳食纤维，对这两 个产品分析。 i 9 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 取5 0 0 0 9 的环核苜酸糖浆，用浓度为9 5 和7 5 的乙醇溶液分级提取，每级所用乙 醇溶液体积为1 5 0 m l ，分三次提取。收集每一级提取液，浓缩，定容成5 0 0 0 m l 。得到9 5 乙醇溶液提取物和7 5 乙醇溶液提取物。进样测定。结果如表。 取1 0 0 0 9 的膳食纤维，用浓度为5 0 13 0 的乙醇溶液分级提取，每一级所用乙醇溶 液体积为1 5 0 m l ，分三次提取。收集每级提取液，浓缩，然后用酸水解，再浓缩定容成 5 00 0 m l 。得到5 0 乙醇溶液提取物和3 0 k , 醇溶液提取物。进样测定。结果如表。 3 3 枣中进糖类的动态分析： 对枣中糖类物质随生长期的变化进行动态分析。 称取5 0 0 0 克的不同采集时期的枣粉置于三角瓶，用3 0 0 m l 的9 5 7 - , 醇分三次提取， 每次提取时间2 个小时。提取温度5 0 度，离心、过滤，滤液浓缩后用水定容成5 0 0 0 m l ，得 到9 5 乙醇提取物，其中含有单糖和寡糖。 把用9 5 乙醇提取后，剩余的固体物进行烘干，得到含多糖的固体物质。 把用9 5 的乙醇提取后的剩余物质按2 2 的条件，用酸水解，然后浓缩、中和和定容， 得到多糖水解物。 3 3 1 金丝小枣的动态分析 将9 5 7 1 醇提取物，按1 3 的色谱条件，进行测定，以峰面积作纵坐标，金丝小枣的生 长时期为横坐标。结果如图8 所示。 如图8 所示，金丝小枣中果糖、葡萄糖和半乳糖随着生长期的变化而波动，从蕾到幼果 期，果糖、葡萄糖和半乳糖含量在升高。在幼果期达到最大值，然后又随着生长期变化含量 f 降。在白熟期，果糖、葡萄糖和半乳糖含量卜降，但有双糖出现。可能是有部分的果糖、 葡萄糖和半乳糖合成寡糖和多糖，而造成果糖、葡萄糖和半乳糖的含量降低。 2 0 河北农业大学硕t 论文 5 0 0 们4 0 0 3 0 0 醛 雾： 1 0 0 o o24 生长时期 图9 金丝小枣中各种单糖和双糖的峰面积与生长时期的关系 1 、蕾，6 月2 7 日：2 、花，6 月2 7 日；3 、幼果，7 月6 日；4 、幼果，7 月2 6 日 5 、幼果，8 月1 3 日；6 、幼果，8 月2 6 日；7 、白熟期，9 月8 日； 8 、半红，9 月1 6 日：9 、全红，9 月1 6 日 金丝小枣的单糖中鼠李糖和阿拉伯糖含量很低，在金丝小枣的前期未能检测出，到半红 和全红期才能检测出。 把用9 5 乙醇溶液提取后的剩余固体物质，烘干，称其质量。得到含多糖的固体物质。 以质鞋为纵坐标，以生长期为横坐标作图。结果如下图l o 。 如图1 0 所示，用9 5 提取后的剩余物质，随着生长期的变化含量也发生波动，在金丝 小枣生长早期，剩余物质的含量比较多，这部分大部分是纤维素，在2 2 所述的水解条件f 不能水解。在白熟期的剩余物质的含量相对少，这可能与白熟期出现寡糖有关，到半红和全 红，剩余的质量又上升，这是不溶于9 5 的乙醇的物质增加。可能是在2 2 所述的水解条件 f 能水解的多糖含量上升造成的。 2 l 高效液相色潜法测定枣中糖类物质 生长期 图l o 金丝小枣用9 5 乙醇提取后剩余的质量与生长时期的关系 生长期与图9 金丝小枣的生长期一致 把多糖水解物，用色谱法进行测定，以水解后的单糖含量为横坐标，以生长期为纵坐标。 所得的结果如图1 1 。 2 2 0 2 0 0 1 8 0 1 6 0 6 矗1 4 0 e 1 2 0 椰 托l o o 最 崔 5 0 4 0 2 0 生k 期 图1 1 金丝小枣水解后糖的含量与生长时期的关系 生长期与图9 小枣的生长期一致 拍 加 一6 ) 删 i ：1 8 农业大学硕士论文 如图1 1 所示，水解后的果糖、葡萄糖和半乳糖含量随着生长期的变化而变大，在白熟 期的含量变化更加明显，这与在白熟期出现寡糖有关。组成多糖的鼠李糖、阿拉伯糖和甘露 糖含量很低，在半红期前只能定性，不能够定量。 从图1 0 和图1 1 可以看出，在半红期，9 5 l 醇提取的剩余物质含量变大，而多糖水解 后的果糖、葡萄糖和半乳糖含量也变大，说明能水解的多糖含量增加。 因此可以推断，在小枣的生长期内，单糖、寡糖和多糖的含量变化很大。 3 3 2 冬枣的动态分析 将9 5 乙醇提取物，按1 3 的色谱条件，进行测定，以峰面积作纵坐标，冬枣的生长时 期为横坐标。结果如图1 2 所示。 4681 0 生长时期 图1 2 冬枣中各种单糖和寡糖的峰面积与生长时期的关系 i 、蕾，6 月2 7 日：2 、花，6 月2 7e | ；3 、幼果，7 月6e t ：4 、幼果，7 月2 6 日： 5 、幼果8 月1 3 日：6 、幼果，8 月2 6i j ；7 、幼果，9 月8 日；8 、幼果，9 月1 6 日； 9 、白熟，9 月2 6 日：1 0 、初红，1 0 月4 臼；1 1 、半红，1 0 月8 日；1 2 、全红，1 0 月8 日 如图1 2 所示，果糖、葡萄糖和半乳糖的含量随着生长期的变化发生波动，从蕾到幼果 单糖的含量增加，在8 月2 6 日的幼果期时，果糖、葡萄糖和半乳糖含量达到最大，然后又 f 降，到白熟期时，f 降到谷底，从初红时期又开始上升。在9 月8 日的幼果期，果糖、葡 萄糖和半乳糖含量开始下降，开始出现双糖，可能是跟部分果糖、葡萄糖和半乳糖合成双糖 啪 啪 栅 耋| | 暑 伽 。 镪蜜 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 有关。在9 月1 6 日的幼果期，出现三糖。在白熟期，开始出现四糖。二糖、三糖和四糖都 随着生长期的变化显上升趋势。 冬枣的单糖中鼠李糖和阿拉伯糖含量也很低，在冬枣的前期未能检测出，到半红和全红 期才能检测出。 把用9 5 醇溶液提取后的剩余固体物质，烘干，称其质量。得到含多糖的固体物质。以 质簧为纵坐标，以生长期为横坐标作图。结果如图1 3 所示。 如图1 3 所示，用乙醇提取后的剩余固体物质的含量也随着生长期的变化发生波动，在 冬枣早期，剩余物质的含量也很高，说明纤维素的含量很高。从蕾到幼果期，剩余固体的含 量降低，说明可