（发酵工程专业论文）γ聚谷氨酸发酵及提取工艺研究.pdf

。， ，夕 at h e s i ss u b m i t t e df o rt h e a p p l i c a t i o n o f t h em a s t e r sd e g r e eo fe n g i n e e r i n g s t u d y o nt h ef e r m e nt a t i o na n de x t r a c t i o n t e c h n o l o g yo fp o l y y g ulu a mi ca c i d 一一 一 一 candidate：li w e n j i n g s p e c i a l t y ： s u p e r v i s o r ： s h a n d o n gi n s t i t u t e 呻 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名：盔壑亟 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：查童叠 日期： 2 年左月彪日 导师签名： ) 山东轻t 业学院硕上学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i 第1 章绪论1 1 1 引言l 1 2 ) ，聚谷氨酸的结构与性质1 1 2 1r 聚谷氨酸的结构。1 1 2 2 ) ，聚谷氨酸的性质。2 1 3 ) ，聚谷氨酸的生产方法3 1 3 1 化学合成法3 1 3 2 酶转化法3 1 3 3 提取法3 1 3 4 微生物发酵法4 1 4 ) ，聚谷氨酸的国内外研究现状4 目录 1 7 课题的主要研究内容。1 7 1 7 1 菌株l 5 3 6 产产聚谷氨酸发酵条件的优化1 7 1 7 2 产聚谷氨酸提取工艺的研究1 7 1 7 3 】，聚谷氨酸的结构表征1 7 1 7 4 ) ，聚谷氨酸应用的初步探讨1 7 第2 章菌株l 5 3 6 产产聚谷氨酸发酵条件的研究19 2 1 引言19 2 2 材料与方法。1 9 2 2 1 实验菌种1 9 2 2 2 主要仪器l9 2 2 3 培养基2 0 2 2 4 主要试剂2 0 2 2 5 培养方法2 0 2 2 6 单因素条件优化2 0 2 2 7 响应面培养条件优化2 0 2 2 8 发酵液粘度的测定方法2 2 2 2 9 发酵液中谷氨酸浓度测定2 2 2 2 1 0 发酵产物的提取方法2 2 2 2 1 1y - p g a 含量的测定2 2 2 2 1 2 生物量测定2 3 2 3 结果与讨论2 3 2 3 1 发酵液粘度与p p g a 产量的关系2 3 2 3 2 发酵培养基单因素条件优化2 3 2 3 3 菌株l 5 3 6 产产p g a 最适培养基的确定3 0 2 3 4 菌株l 5 3 6 生长曲线的测定3 6 2 3 5 培养条件的优化3 6 2 3 1 6 菌株l 5 3 6 的发酵进程曲线3 9 2 4 本章小结3 9 第3 章) ，聚谷氨酸提取工艺的研究4 1 3 1 引言4 1 3 2 材料与方法4 1 3 2 1 菌种4 1 1 1 0 ， 山东轻t 业学院硕士学位论文 3 2 2 主要仪器4 1 3 2 3 主要试剂4 l 3 2 4 培养基和培养方法4 l 3 2 5 发酵液粘度的测定方法4 2 3 2 6 发酵液中谷氨酸浓度测定。4 2 3 2 7 发酵液p h 值测定4 2 3 3 结果与分析4 2 3 3 1y - p g a 水解条件的确定4 2 3 3 2 乙醇添加量对7 - p g a 回收效果的影响4 4 3 3 3 二次沉淀时溶解水的用量对y - p g a 收率的影响。4 4 3 3 4p h 对产聚谷氨酸回收效果的影响4 5 3 3 5 分离纯化的流程。4 7 3 4 本章小结4 8 第4 章y 聚谷氨酸结构表征及应用一4 9 4 1 引言4 9 4 2 材料与方法4 9 4 2 1 菌种4 9 4 2 2 主要仪器4 9 4 2 3 主要试剂4 9 4 2 4y - p g a 的盐酸水解法5 0 4 2 5 硫酸苯酚法测多糖含量的测定5 0 4 2 6b r a d f o r d 法蛋白含量的测定5 0 4 2 7 灰分的测定5 l 4 2 8 纸层析分析。5 1 4 2 9 紫外扫描分析5 l 4 2 1o 红外光谱分析5 2 4 2 1 1 絮凝活性测定方法5 2 4 2 1 2 蔬菜保鲜实验5 2 4 2 1 3 土壤保水实验5 2 4 3 结果与分析5 2 4 3 1y - p g a 定性定量和结构表征分析5 2 4 3 27 - p g a 用作生物絮凝剂5 6 i i i 目录 4 3 3y - p g a 用作保水材料5 9 4 4 本章小结6 2 第5 章结论与展望6 3 5 1 结论6 3 5 2 展望6 4 参考文献6 5 致谢7 5 攻读硕士期间发表的论文7 7 - i v 山东轻工业学院硕十学位论文 摘要 ) ，一聚谷氨酸( p o l y - 7 g l u t a m i ca c i d ；y - p g a ) 是以l 、d 型谷氨酸为单体通过) ， 酰胺键聚合而成的一种均聚氨基酸聚合物，可以通过微生物发酵生产获得。由于 其具有良好的生物相容性、生物降解性、水溶性、无毒害无污染等优点，可作为 生物絮凝剂、重金属吸收剂、保水剂、高吸水性树脂、食品添加剂、药物载体、 药物缓释剂等广泛应用于环境、食品、化妆品、医药领域中，具有广阔的应用前 景。本课题对y - p g a 产生菌的发酵条件优化、y - p g a 提取纯化和结构表征以及 7 - p g a 的初步应用进行了研究。主要研究结果如下： 通过对培养基组分进行单因素实验和响应面实验分析，确定了菌株l 5 3 6 的最 佳发酵培养基组成为( l ) ：氯化钠1 5 、豆粕5 3 、柠檬酸钠1 6 、谷氨酸钠4 0 、氯 化铵4 6 、磷酸氢二钾0 6 2 5 、硫酸镁1 2 5 、硫酸锰0 3 5 、氯化钙0 2 。通过对接种 量、发酵温度、初始p h 值、溶氧量等培养条件的考察，获得了菌株l 5 3 6 的较优 培养条件：接种量3 ( v v ) ，发酵温度3 7 ，初始p h 值p h 7 0 ，摇瓶装液量 3 5 m l 2 5 0 m l 三角瓶，摇床转速2 0 0 r m i n ，发酵时间4 8 h 左右。菌株l 5 3 6 在最佳 培养基和较优培养条件下培养，发酵液的y - p g a 产量可达2 5 8 l l ，比优化前提 高了约1 5 倍。 对y - p g a 不同的水解方法进行比较，确定采用盐酸水解法，其最适水解时间 为2 4 h 。研究乙醇法提取y - p g a ，确定乙醇的最适添加量为2 倍体积，考察p h 值 对发酵液的粘度和y - p g a 提取的影响，最终确定7 - p g a 的最佳提取路线。 纯化样品经氨基酸分析仪分析纯度可达8 8 6 。纯化的y - p g a 样品经纸层析、 紫外扫描和红外光谱扫描等方法进行初步分析，结果表明：? - p g a 样品是由谷氨 酸单体聚合而成且其在2 1 5 n m 处吸收值达到最大，在2 6 0 n m 2 8 0 n m 处没有明显的 吸收峰，表明其没有典型的肽键结构。对照日本明治制药株式会社的y - p g a 标准 品红外图谱，y - p g a 样品与标准品的特征吸收峰基本吻合，经图谱解析可以初步 确定纯化样品为) ，聚谷氨酸。 以高岭土悬浊液为絮凝介质，研究了菌株l 5 3 6 产y - p g a 的絮凝特性。结果表 明：在中性p h 范围内、投加量为1 2 l 时，对高岭土的絮凝率达最大。f e 2 + 、c a s + 、 c u 2 + 、f e 3 + 、a 1 3 + 均能不同程度地提高y - p g a 对高岭土的絮凝活性。其中，c a 2 + 的助 凝效果最为显著，其最佳助凝浓度为0 0 9 m o l l 。另外，菌株l 5 3 6 产? - p g a 对于 活性炭、c a ( o h ) 2 也表现出较强的絮凝活性。另外，7 - p g a 对于水果蔬菜的保鲜和 土壤的保水具有一定的作用。 关键词：y 聚谷氨酸；解淀粉芽孢杆菌；纯化；生物絮凝剂 t t 山东轻t 业学院硕上学位论文 a b s t r a c t p o l y - y - g l u t a m i ca c i dw a sac o m p o u n do fe q u a lp o l ya m i n oa c i dt h a tc o n s i s to fl - a n dd g l u t a m i ca c i d st h r o u g hy - g l u t a m y lb o n d s o w i n gt oi t se x c e l l e n tc h a r a c t e r s i n c l u d i n gb i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a b i l i t y , n o n t o x i c i t ya n dn o n - p o l l u t i o n ，y - p g ah a s b e e nu s e di nm a n ya r e a ss u c ha se n v i r o n m e n t ，f o o d ，c o s m e t i c sa n dp h a r m a c e u t i c a l y - p g aa n di t sd e r i v a t i v e sh a daw i d e l ya p p l i c a t i o n si n c l u d i n gb e i n gu s e da sh e a v ym e t a l a b s o r b e r , b i o f l o c c u l a n t ，s u p e r a b s o r b e n t p o l y m e r s ，f o o da d d i t i v e ，d r u gc a r r i e r , s u s t a i n e d - r e l e a s em a t e r i a la n ds oo n t h ep a p e rc o n c e n t r a t e do nt h eo p t i m i z a t i o no ft h e s t r a i nl 5 3 6 sc u l t u r em e d i u ma n dc o n d i t i o n s ，t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f y - p g a a n dt h ei n i t i a la p p l i c a t i o no fy - p g a m a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： b ys i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t sa n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , t h ec u l t u r e m e d i u ma n dc o n d i t i o n so ft h es t r a i nl 5 3 6o u t p u t i n gy - p g aw e r eo p t i m i z e d t h e o p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ( l ) ：n a c l15 ，s o y b e a nf l o u r5 3 ，s o d i u m c i t r a t e16 ，s o d i u mg l u t a m a t e4 0 ，n i - 1 4 c 14 6 ，k 2 h p 0 40 6 2 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0 1 2 5 ， m n s 0 4 。h 2 00 3 5 ，c a c l 2 2 h 2 00 2 ，i n o c u l a t i o na m o u n t3 ( 啪，t e m p e r a t u r e3 7 ， i n i t i a lp h7 0 ，b r o t h sv o l u m ei ns h a k ef l a s k3 5 m l 2 5 0 m l ，r o t a t i o ns p e e do fr o c k i n g b e d2 0 0 r m i na n dc u l t u r et i m e4 8 h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n ，t h ey i e l do fy - p g aw a s 2 5 8 1 l ，i n c r e a s e df o ra b o u t1 5t i m e sm o r et h a nb e f o r e c o m p a r e dt h ed i f f e r e n tm e t h o d so fh y d r o l y s i so fy - p g a ，t h eh y d r o c h l o r i ca c i d h y d r o l y s i sw a sa d o p t e sa n dt h eo p t i m u mh y d r o l y s i st i m ew a s2 4 h t h eo p t i m u me t h a n o l c o n c e n t r a t i o nw a s2t i m e st h a nt h ev o l u m eo ff e r m e n t a t i o nb r o t h t h ee f f e c to fp ho n t h ev i s c o s i t yo ff e r m e n t a t i o nb r o t ha n de x t r a c t i o no fy - p g aw a ss t u d i e d u l t i m a t e l y , t h e b e s tr o u t eo fe x t r a c t i o no fy - p g aw a sd e t e r m i n e d t h ec o n c e n t r a t i o no fp u r e ) , - p g aw a s8 8 6 b ya m i n oa c i da n a l y z e r s b yp a p e r c h r o m a t o g r a p h y , u va n di r , t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fy - p g aw a sa n a l y z e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ep o l y m e rw a so n l yc o m p o s e do fg l u t a m i ca c i d t h e r ew a sa na b s o r p t i o n p e a ka t2 15 n mb yt h eu vs c a n n i n g t h ep u r i f i e dy - p g ab a s i c a l l yc o i n c i d e n t e dw i t ht h a t o ft h es t a n d a r dy - p g ap r e p a r e db ym e i j ip h a r m a c e u t i c a lc o ，l t dt h r o u g ht h ei r c h r o m a t o g r a p h i ti n d i c a t e dt h ep o l y m e rw a sy - p g a f l o c c u l a t i n gc o n d i t i o n so f7 - p g ap r o d u c e db yb a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n sl 5 3 6 w e r ei n v e s t i g a t e d t h ef o c c u l a t i n ga c t i v i t yg o th i g h e s ta tt h ey - p g ac o n c e n t r a t i o no f 1 2 la n d i nt h en e u t r a lp h t h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yw a ss y n e r g i s t i c a l l ys i m u l a t e db y t h ea d d i t i o no fc a t i o n s ，c a 十w a st h eo p t i m u mc a t i o nt h a t r e m a r k a b l yp r o m o t e dt h e f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mf l o c c u l a t i o nc o n d i t i o n sw e r e c a c l 2o f0 0 9 m o l l y - p g ah a dah i g h f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y t os o m eo r g a n i ca n d i n o r g a n i cs u s p e n s i o n i na d d i t i o n , y - p g ac a nb eu s e dt o k e e p i n gt h ef r u i t sa n d v e g e t a b l e sf r e s ha n di n c r e a s e dt h es o i lm o i s t u r e k e y w o r d s ：y - p g a ，b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ，p u r i f i e a t i o n ，b i o f l o c c u l 龇l t h 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 引言 在当今社会，高分子材料在人们生活和国民经济的各个领域都起着不可或缺 的作用，然而随着高分子材料的广泛应用，其对环境造成的负面影响也越来越不 容忽视。在人口、资源、能源、环境危机影响下，寻找到一种环境友好的新型生 物高分子材料已经刻不容缓。新型生物高分子材料不会产生传统化学合成高分子 产生的高污染问题，且不依赖于石油资源，符合可持续发展的战略要求。 均聚氨基酸( h o m o g e n e o u sp o l y a m i n oa c i d ) 是指同一种氨基酸单体由化学法 或微生物法合成的一类高分子聚合物【l 】。例如产聚谷氨酸、p 一聚赖氨酸、聚鸟氨 酸、聚天冬氨酸等。均聚氨基酸具有许多优越的特性：( 1 ) 聚氨基酸呈多价态离子， 与细胞和组织有良好的相容性，可以代替非致病性病毒作为基因治疗的载体。( 2 ) 聚合氨基酸衍生物有明显的压电效应，天然型聚l 一氨基酸和聚d 一氨基酸的立体结 构分别为右旋螺旋体和左旋螺旋体，其对于相同的剪切力来说电极化方向相反。 ( 3 ) 抗有机溶剂腐蚀、耐热、抗逆行性好。( 4 ) 均聚氨基酸作为一种生物大分子具 有良好的消化吸收性、组织亲和性，能促进细胞生长和组织修复。 ) ，- 聚谷氨酸( p o l y - y g l u t a m i ca c i d ：y - p g a ) 是一种通过微生物合成的均聚氨基 酸化合物，具有生物可降解性、生物相容性、可食用、对人体和环境无毒害等优 点。因此，) ，聚谷氨酸广泛应用于药物工业、食品工业、化妆品工业及污水处理中， 是一种应用前景非常广范的新型高分子材料【2 】。 1 2r 聚谷氨酸的结构与性质 1 2 1r 聚谷氨酸的结构 y 聚谷氨酸是一种通过微生物合成的均聚氨基酸化合物，是一种水溶性的新型 生物高分子材料，是由l 谷氨酸( l g l u ) 、d 谷氨酸( d g l u ) 单体通过酰胺键 聚合而成的一种多肽分子，通常是由5 0 0 5 0 0 0 个左右的谷氨酸单体组成，相对分 子质量在1 0 0 1 0 0 0 k d 之间，其结构式如图1 1 所示。 c i o o h 0 ，il i 十州n c h 2 一c h 2 一c h 2 一c 一宁 图1 1 】，聚谷氨酸的结构式 f i g 1 1s t r u c t u r eo f ) , - p g a 第1 章绪论 y - p g a 是一种不寻常的阴离子异形肽，目前的初步研究认为它的基本骨架是 由y - 酰胺键连接而成的直链纤维分子，没有典型的肽链结构，也不是一种环状多 肽，链之间存在大量氢键。杨革等【3 】研究表明了y - p g a 是仅螺旋和伊折叠含量都 较多的生物大分子，y - p g a 形成的宏观结构为非晶态，其链分子排列取向大致与 7 - p g a 轴平行，不过排列的规则性较差，结合较为松弛。对y - p g a 进行动态粘弹 性分析，结果显示在y - p g a 的固态粘弹曲线上有6 个损失峰，从低温到高温依次 为) ，、仍、卢l 、6 t i - 1 2 0 、a 2 、a l 松弛区域，表示y - p g a 的无定形区域为相当复杂的不 均匀结构。 y - p g a 在水溶液中的构象与其立体化学结构、离子强度、浓度和溶液p h 有关 1 4 , 5 , 6 , 7 】。b o r b 6 1 y 掣8 1 研究了溶剂对y - p g a 构象的影响，结果发现y - p g a 在水溶液 中是无规则卷曲的，而在甲酸中是伊片层结构，在二甲基亚砜( d i m e t h y l s u l f o x i d e ， d m s o ) q 丁是a 螺旋。c r e s c e n z i 等【9 】发现地衣芽孢杆菌产生的y - p g a 在低浓度时是 a 螺旋构型，在高浓度时是伊片层结构；在低离子浓度下是a 螺旋和伊片层结构， 在高离子浓度下是伊片层结构为主；在低p h 时是a 螺旋构型，在中性偏碱性时是 伊片层结构，在高p h 时呈伸展状。 1 2 2r 聚谷氨酸的性质 对y - p g a 进行热行为分析，结果表明其脆点温度t b 为6 0 ，粘流温度t f 为 5 7 5 6 ，玻璃化温度k 为5 4 8 2 ，分解温度t d 为1 4 1 3 4 ，聚合物为非晶态。 根据滴定量测定游离酸型y - p g a ，得到p k a 为2 2 7 ，该值与谷氨酸的a 一羧基的p k a 表1 1 不同生物合成的y - p g a 分子大小和立体化学组成【1 0 】 t a b k m 0 1 刚一砷m 如冀慧蚤f o m 撕0 n 甜产眦州啦 产生y - p g a 的生物 分子量含量( ) 体 d 对映体l 对映体 b a c i l l u s 3 0 - - 一5 0 万l o 1 0 00 - 9 0 l i c h e n i f o r m i s b s u b t i l i s ( n a t t o )l 1 0 0 万5 0 - - - 8 02 0 - 5 0 b s u b t i l i s 1 0 0 万6 0 7 03 0 4 0 ( c h u n g k o o k j a n g ) b m e g a t e r i u n 2 0 万 5 05 0 b a n t h r a c i s 1 0 00 b h a l o d u r a n s l 万l 万5 千0 1 0 0 n a t r i a l b aa e g p t i a c a 100万0 1 0 0 2 山东轻l t 业学院硕士学位论文 3 千2 万5 千0 1 0 0 不同菌株和不同发酵工艺获得的y - p g a 不仅分子量不同，在光学异构体即d 型和l 型谷氨酸的比例上也存在较大的差异。表1 1 列出了几种主要的y - p g a 产 生菌合成的y - p g a 在分子大小和立体结构组成上的情况。据报道，d 型氨基酸已 经广泛应用于激素、抗生素、活性多肽的合成和化学杀虫剂等方面【l l 】，研究? - p g a 中l 和d 谷氨酸的组成、变化和影响因素是很有意义的。 1 3r 聚谷氨酸的生产方法 y - p g a 的生产方法包矧1 2 】：化学合成法、酶转化法、提取法和微生物发酵法。 1 3 1 化学合成法 化学合成法可以分为传统的肽合成法和二聚体缩聚法两类。传统的肽合成法 是将p g a 的前体即谷氨酸逐个连接或采用片段组合形成多肽，整个过程一般包括 基团的保护、活化、偶联和脱保护等。该法合成的p g a 为仅p g a ，为不成环聚合， 由于其合成路线复杂、步骤较多、副产物多、收率低且需要光电等有毒气体，故 很大程度上限制了该法的应用【1 3 】。 二聚体缩聚法【1 4 】是通过生成的谷氨酸二聚体在n ，n 一二甲基甲酞胺中反应得到 聚谷氨酸甲基酯，经碱性水解后最终得到) ，p g a 。 由于方法的局限性，化学方法合成的a p g a 分子量比较小，若提高产物分子量 必将大大降低产率，故该法的工业应用价值不大。但对于) ，p g a 结构和功能关系的 了解、y - p g a 合成酶反应机制的分析及) ，p g a 实际应用修饰技术的发展等具有一定 的指导意义。 1 3 2 酶转化法 酶转化法通常采用一步酶促反应【1 5 】，这就避免了全合成途径中复杂的反馈调 节作用，解除了) i p g a 合成的反馈阻遏作用，从而使) ，p g a 积累到较高的浓度。酶 转化法中的关键酶是广泛存在于各类微生物体内的谷氨酸转肽酶。利用该酶的高 效行和专一性，以谷氨酸为单体通过该法可以得到高浓度产物，且杂质含量低， 利于产物的分离纯化。 酶转化法由于工艺路线简单、生产周期短，容易实现大规模生产，但是采用 酶转化法合成的y - p g a 分子量小，而且谷氨酸转肽酶在微生物菌体中的含量和活力 都较低，这就大大制约了该法在实际生产中的应用。 1 3 3 提取法 提取法是指用乙醇将日本传统食品纳豆中的y - p g a 分离提取出来，早期日本 生产y - p g a 大多采用该法。后来，也有人将该法应用范围扩大到含有) r p g a 的枯草 3 第1 章绪论 芽孢杆菌和纳豆杆菌。由于纳豆或菌体中的y p g a 含量低且不稳定，副产物果聚糖 的存在使得提取工艺复杂，因此采用提取法制备的) ，p g a 产量低且成本高，不利于 工业化生产。 1 3 4 微生物发酵法 自1 9 4 2 年b o v a m i c k 等人发现芽孢杆菌能够在培养基中积累) ，p g a 以烈1 6 】，对 于利用微生物法合成y p g a 的研究就十分活跃。与前面三种方法相比，微生物发酵 法生产) ，p g a 具有培养条件温和、生产过程容易控制、生产周期较短、7 - p g a 产量 高且分子量适宜、提取率高、环境友好等优点，已经成为国内外学者和专家关注 和研究的热点，并逐步取代前面三种方法成为研究和生产】，p g a 的主要途径。 微生物发酵法生产) ，p g a 仍然是当前最具有工业化前景的y p g a 生产方法。但 由于微生物的y - p g a 合成代谢途径较为复杂，发酵液黏度较高，给产物的分离纯化 带来极大的不便，且目f i i y - p g a 的产率较低等问题，因此，微生物发酵法生产) ，p g a 仍未实现大规模生产应用。 1 4r 聚谷氨酸的国内外研究现状 1 4 1 r 聚谷氨酸的生产菌株 目前发现的y - p g a 生产菌株主要是芽孢杆菌属，包括枯草芽孢杆菌 s u b t i l i s ) 1 6 ，1 7 1 8 ，1 9 2 0 1 、炭疽芽孢杆菌佃a n t h r a c i s ) 、地衣芽孢杆菌 p 1 i c h e n i f o r m i s ) 2 1 1 、短小芽孢杆菌( b b r e v i s ) 、耐热芽孢杆菌但t h e r m o t o l e r a n t ) 2 2 2 3 1 和解淀粉芽孢杆菌旧a n m l o l i q u e f a c i e n s ) t 2 4 1 。根据培养基中是否提供l 谷氨酸，可将 菌株分为两大类：一类为需要在培养基中添 j n l 谷氨酸前体的l 谷氨酸依赖型，包 括b s u b t i l i si f o3 3 3 5 e 17 1 、b s u b t i l i sa t c c9 9 4 5 a 2 1 1 、b s u b t i l i s ( n a t t o ) m r 1 4 1 19 1 、 b s u b t i l i sf - 2 0 1 2 3 1 、b s u b t i l i s ( c h u n g k o o k j a n g ) 2 5 】和曰a n t h r a c i s 等。另一类为不需要 在培养基中添) j n l 谷氨酸前体的l 谷氨酸非依赖型，包括b 1 i c h e n i f o 删西a 3 5 唧j 、 b s u b t i l i s1 a m 4 1 1 9 , 2 6 、b 1 i c h e n i f o r m i ss 17 3 t 2 7 1 、b s u b t i l i s v a r p o l y g l u t a m i c u n 和 b s u b t i l i s5 e 等。谷氨酸并不作为前体物质参与到) ，p g a 的合成中，仅对于从柠檬酸 合成) ，p g a 的过程起调控作用【1 9 】。由于该类菌不需要在培养基中添加大量谷氨酸， 可显著降低生产成本，但由于这类菌较少且) ，p g a 产量较低，故目前主要研究l 谷氨酸依赖型的菌株。 1 4 2 f - 聚谷氨酸发酵工艺 ( 1 ) 培养基组成对y - p g a 合成的影响 y - p g a 的合成，分子量的大小及y - p g a 分子中l 广和d 一型谷氨酸的比例都与培 养基的组成密切相关。y - p g a 的发酵生产一般采用合成培养基，其中l 广谷氨酸和 碳源对7 - p g a 生产是必须的，均衡的碳氮比可以促进y - p g a 的合成。碳源主要有 4 山东轻工业学院硕十学位论文 甘油、葡萄糖、柠檬酸、谷氨酸、蔗糖等，菌种不同，对碳源的要求也不同。k o 等【2 8 】利用b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa t c c9 9 4 5 a 生产y - p g a 时，认为葡萄糖对细胞生 长效果最好；而葡萄糖、甘油混合加上l 谷氨酸则会大大提高y - p g a 的产量。氮 源一般采用如氯化铵、硫酸铵等的无机氮源，采用有机氮源会增大副产物的生成 量，为? - p g a 的提取纯化带来不便。i t o 等【2 6 】研究表明氯化铵是b a c i l l u ss u b t i l i s t a m 4 合成y - p g a 的最佳碳源。o g a w a 等【l9 】采用大豆浆作为氮源，b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sa t c c9 9 4 5 a 发酵生产y - p g a 的产量最高可达3 5 l 。利用统计试验法 ( s e m ) 对b a c i l l u sl i c h e n f o r m i sc c r c1 2 8 2 6 菌株摇瓶发酵实验研究发现【2 9 】：对 y - p g a 产量影响最为显著的因素依次为谷氨酸、柠檬酸、甘油，通过响应面方法 确定柠檬酸、谷氨酸和甘油浓度为2 4 5 0 ，5 7 。2 0 ，1 5 7 1 1 l 时，菌株y - p g a 的生 产能力比优化前提高了将近4 倍。 培养基中添加的金属离子的种类和浓度对y - p g a 的合成也有着重要的影响。 r i c h a r d 掣3 0 】首先发现某些金属离子对b a c i l l u ss u b t i l l i s 的y - p g a 合成非常重要， m n 2 + 、m 9 2 + 、c 、c e + 和f e 3 + 等金属离子对枯草芽孢杆菌的生产是必须的。低浓 度的m n 2 + 利于菌体的生产，继续提高m n 2 + 的浓度可以提高发酵液中y - p g a 的产量。 c e + 的浓度不仅影响菌体细胞的活性，它的存在还有利于菌体内多肽的合成。m g + 和m n 2 + 可能对于l - 和d 多肽合成酶系的影响十分显著【3 1 】，从而控制着合成的 ? - p g a 中l 和d 型谷氨酸的比例。杨革等【3 2 】研究表明d 谷氨酸的含量随m n 2 + 离 子浓度的增加而不断增加，当m n 2 + 离子的浓度达到0 1 3g l 一时，组成y - p g a 中的 谷氨酸基本上为d 谷氨酸。金属离子的浓度对y - p g a 的分子量大小也起着调控作 用【3 3 1 ，增大金属离子的浓度还可以起到消泡作用。 ( 2 ) 发酵工艺对y - p g a 合成的影响 微生物的生产和产物的合成都有其最适p h ，超出该范围，不仅微生物的生长 受到抑制，产物的产量也会降低。供氧对于好氧菌来说，影响极其重要，若不能 提供足够的溶解氧，就会抑制菌体的生长和产物的合成。c r o w w i c k 等【3 4 】研究了p h 、 供氧对b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa t c c9 9 4 5 a 分批发酵生产y - p g a 的影响。p h 值影响 着细胞生长、y - p g a 的合成、分子质量和空间结构等；提高溶解氧可以提高生物 量和y - p g a 产量，通入纯氧或高含氧的空气也可改善氧传递效率。杨革【3 5 】研究了 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa t c c9 9 4 5 a 生产y - p g a 的生产条件，也对? - p g a 进行了结 构表征分析和流变性能分析。在采用5 l 发酵罐进行分批发酵时，控制p h 6 5 ，培 养温度3 7 ，搅拌转速8 0 0 r m i n ，通气量1 1 7 v v m ，发酵6 4 h ，? - p g a 的产量和生 产强度分别为3 4 6 l l 和0 5 4 1 9 l h ，分子量能够达到2 4 3 ，0 0 0 。r i c h a r d 等【3 2 】研究 了b a c i l l u ss u b t i l l i s 发酵生产y - p g a 过程中的体积传氧速率( k l a ) 、菌体好氧速率 ( o u r ) 、嫡值( q 0 2 ) 和发酵液的流变特性，结果发现：从对数后期或稳定前期开始， y - p g a 发酵液为非牛顿假塑性流体：发酵液变粘之前的对数早期是耗氧最大的时 5 第1 章绪论 期。在稳定期y - p g a 达到最大时发酵液粘度也达到最大值，此时菌体好氧速率最 低。 1 4 3y - 聚谷氨酸的提取 微生物发酵法生产y - p g a 的提取方法主要有：化学沉淀法、有机溶剂沉淀法 和膜分离沉淀法【3 6 】。 ( 1 ) 化学沉淀法 化学沉淀法是指去除发酵液中的菌体后，向上清液中加入饱和c u s 0 4 、n a c l 溶液沉淀得到y - p g a ，然后用水溶解y - p g a ，透析除盐后经冷冻干燥得到最终产 物。具体步骤见图1 2 。 土 加入2 5 倍乙醇 p 搿 上p5h8倍i周乙罕醇8o，加入 心1 搿黼 上 加入饱和硫酸铜 上水150洗m11后5装入 i + 上清液 l + 沉淀 i 水洗后，2 0 0 m l 蒸 馏水溶解 h 2 s 处理 水洗后，蒸馏水溶 解，冷冻干燥 h p g a 产品 图1 2 化学沉淀法和有机溶剂沉淀法【3 6 1 f i g1 2t h ec h e m i c a lp r e c i p i t a t i o na n do r g a n i cs o l v e n tp r