（发酵工程专业论文）固定化（酵母）细胞技术的研究.pdf

摘要 本项研究以酿酒酵母为固定化细胞的研究对象，在传统的固定化细胞技术的基础 上，较系统地研究了制备强度性能好、通透性好、传质阻力小的颗粒状固定化酵母细 胞的方法，并对所制各的固定化细胞的性能及发酵工艺进行了初步研究。 研究内容主要包括三部分：载体材料的优化；固定化细胞颗粒通透性的改善：固 定化酵母细胞发酵产酒条件的优化及性能的测定。 川单一载体制备的固定化细胞的强度，韧性等均不理想。添加填充物质可改善载 体的强度，但效果不明显。在采用混合载体制各固定化细胞后，颗粒强度有明显改善。 其中使用1 5 海藻酸钠：7 p v a 的混合载体材料可制各强度高、韧性好的小球状固定化细 胞颗粒。但所制得颗粒的通透性较差。本文研究了改善细胞通透性的两类方法：一类 是将载体细胞悬浮液滴入2 ( w w ) 氯化钙溶液中成型后，立即转入3 ( w w ) 的 硼酸无菌溶液中硬化2 4 h 的分阶段硬化方法，可以有效改善固定化细胞颗粒网格的紧 密程度，得到通透性好的固定化细胞颗粒。另一类方法是用p 0 4 。来处理固定化细胞的 通透性，其中将硬化好的固定化细胞颗粒在0 8 m o l 1 磷酸二氢钾的无菌溶液中处理2 4 h 的方法效果较好。 通过对固定化细胞增殖培养条件的优化得出：1 ：l 的麦芽汁与薯糖汁比例，体积 1 5 0 m l 的增殖液，在2 8 x 3 ，1 2 0 r m i n 的条件下活化2 4 h 较好。在发酵中的最佳产酒条 件为：1 5 ( v v ) 的固定化酵母细胞添加量，3 1 条件下发酵4 2 h 。对固定化酵母细胞 t i ；能进行的初步测试，得出经本研究方法制备的固定化酵母细胞产酒的最适p h 、温度范 比游离态酵母细胞的宽，对环境的抵抗能力较强。固定化酵母细胞可多批次的反复 发酵，颗粒强度及韧性保持较好，产酒率变化不大，细胞的稳定性较好。 关键词：固定化细胞，海藻酸钠，p v a ，载体，强度，通透性，酿酒酵母 s t u d y o i lt e c h n o l o g yo fi m m o b i l i z e dc e l l s ( y e a s t ) a b s t r a c t ：t h ed i s t i l l e r sy e a s tw a su s e di ni m m o b i l i z e dc e l lt e c h n o l o g yi nt h i sr e s e a r c hp r o j c o t o nt h eb a s i so f s t u d yo nt r a d i t i o n a li m m o b i l i z e dc e l lt e c h n o l o g y ，t h em e t h o do f p r e p a r i n gg r a n u l a r i m m o b i l i z e de e l lw i t h h i g hj n t e n s i t 3 ，p e r m e a b i l i t ya n d1 0 wm a s st r a n s f e rr e s i s t a n c ew a s r e s e a r c h e ds y s t e m a t i c a l l y t h ep e r f o r m a n c ea n df e r m e n tp r o c e s so f t h ep r e p a r e di m m o b i l i z e dc e l l w o r es t u d i e dp r e l i m i n a r i l y t h em a i nc o n t e n t so ft h i sr e s e a r c hi n c l u d e3s e c t i o n ：t h eo p t i m i z a t i o no fc a r r i e rm a t e r i a l s ，t h e m e l i o r a t i o no fp e r m e a b i l i t yo fi m m o b i l i z e de e l lg r a n u l e s ，t h eo p t i m i z a t i o no fc o n d i t i o n so f f e r m e n t a t i v em a k i n ga l c o h o ia n dt h em e a s u r eo fp e r f o r m a n c eo fi m m o b i l i z e dy e a s tc e l l t h ei n t e n s i t ya n dd u c t i l i t yo fi m m o b i l i z e dc e l lp r e p a r e db ys i n g l ec a r r i e rm a t e r i a lw e r en o t s a r i s f y i n g 1 1 1 ei n t e u s i t yo fc a r r i e rc o u l db ee n h a n c e db yi n t e r f u s i n gs o m eo t h e rm a t e r i a l s ，b u tt h e e f f e c t sw e r en o te v i d e n t a f i e rt h em i x e dc a r r i e r sh a du s e df o rp r e p a r i n gi m m o b i l i z e dc e l l t h e i n t e n s i t yo f g r a n u l e sw i m p r o v e dr e m a r k a b l y 1 1 1 eg r a n u l a ri m m o b i l i z e dc e l l sw i t hh i g hi n t e n s 时 a n dd u c t i l i t yc o u l db ep r e p a r e db yt h i sk i n do f m i x e dc a r r i e r sm a d eb ys o d i u ma l g i n a t ea n dp v a w i mt h er a t i oo f1 5t o7 t h e r ea r et w ok i n d so fm e t h o d sf o ra m e l i o r a t i n gt h ep e r m e a b i l i t yo f i m m o b i l i z e dc e l l s ：o n ei st h em e t h o do fr i g i d i f i c a t i o nb ys t a g e st h a ti sd r o p p i n gt h es u s p e n s i o n l i q u i do fc a r r i e rc e l l si n t ot h es o l u t i o no f2 ( w w ) c a c l 2t om o l d ，a n di m m e d i a t e l y t r a n s f e r r i n gi n t ot h es t e r i l es o l u t i o no f 3 ( w w ) b o r i ca c i dt or i g i d i f yf o r2 4 h ，w h i c hc a n a m e l i o r a t ee f f e c t i v e l yt h ed e g r e eo ft i g h tn o to fi m m o b i l i z e dc e l lg r a n u l e ，a n dg a i n e df a v o r a b l e p e r m e a b i l i t y t h eo t h e ro n ei su s i n gp 0 4 f o ri n c r e a s i n gt h ep e r m e a b i l i t yo fi m m o b i l i z e d c e l l s t h em e t h o do fd e a l i n gw i t hr i g i di m m o b i l i z e dc e l l sb y0 8 m o l 1k t t 2 p 0 4i ns t e r i l e s o l u t i o nf o r2 4 hh a v eb e t t e re f f e c t t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fm u l t i p l i c a t i o nc u l t u r eo fi m m o b i l i z e dc e l l si st h a t ：m a l tw o r ta n d p o t a t os o l u t i o nw i t ht h er a t i oo f1 ：1 c u l t i v a t i n gi n1 5 0 m ly e a s tm u l t i p l y i n gs o l u t i o na t 2 8 ，1 2 0 r m i nf o r2 4 h t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fm a d d i n ga l c o h o li s ：1 5 ( v v ) f i l l e rl e v e lo f t h ei m m o b i l i z e dy e a s tc e l l sa t3 i cf o r4 2h o u r t h eo p t i m u mr a n g eo ft h e t e m p e r a t u r ea n dp hf o rm a k i n ga l c o h o lo fi m m o b i l i z e dy e a s tc e l l si sw i d e rm ed i s s o c i a t e d y e a s tc e l l s t h ei m m o b i l i z e dy e a s tc e l l sc a nb ec o n t i n u a l l yf e r m e n t e dk e e p i n gt h e i n t e n s i t y , d u c t i l i t ya n dr a t i oo f m a k i n ga l c o h o ls t a b i l i z a t i o n k e yc o r d s ：i m m o b i l i z e dc e l l s ，s o d i u ma l g i n a t e ，p v a ，c a r r i e r i n t e n s i t y ，p e r m e a b i l i t y b r e w i n gy e a s t 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 第一章绪论 生物技术主要是利用生物催化剂将物料加工转化，为人类提供各类产品及服务的 技术。在近几十年来，生物催化剂由游离酶或游离细胞的研究重点逐步转向固定化酶或 幽定化细胞的应用上来，使固定化细胞技术的研究及应用得以重视和推广。固定化细胞 技术兼有游离细胞及固定化酶技术的特点和优点，制备方便，所以在科学研究和工业生 产中具有巨大潜力。 1 1 固定化细胞技术概况 固定化细胞是利用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，使其保 持活性并可反复使用的一种技术。固定化细胞技术自7 0 年代开始研究和应用以来，现 已发展到第三代。第一代以固定化死细胞为主，大部分是催化简单的单酶反应，如异构 酶、淀粉水解酶等。第二代以固定化增殖细胞为主，利用增殖细胞质中的多酶体系或整 个代谢系统来生产产品。如有机酸、酒精、啤酒、多肽等。第三代是将动植物细胞进行 固定化，从而克服了动、植物游离细胞大规模培养生长缓慢、目标物质产率低，对机械 作用敏感，需要支持物等的困难，提高了动植物细胞大规模培养、生产工业化的可能性， 拓展了应用前景“”。 固定化细胞与游离细胞、固定化酶相比有许多优点： ( 1 ) 作为“天然多酶反应器”可连续反复使用，既不需要分离、提纯酶，也不需 要辅酶的再生，酶的活性比较稳定。因此。非常适用于连续化操作和精确的自动化控制。 ( 2 ) 在发酵过程中固定化增殖细胞生长迅速、细胞浓度高、反应速度快，缩短了 小j “川j 舛。 ( 3 ) 抗酸、碱、温度变化性能较高，生产性能较稳定，操作易于控制。 ( 4 ) 利于产品的分离、提纯、后处理，简化了工艺操作，提高了生产效率。 但固定化细胞也存在一定的局限性，阻碍了固定化细胞技术的进一步的推广及应 用： ( 1 ) 固定化细胞的载体存在扩散限制作用，载体外壳的孔隙度大小会影响底物及 产物的通透性，造成物质的进出障碍和通气困难，限制了传质，降低产率。 ( 2 ) 有的固定化细胞颗粒强度较差，在反复利用过程中固定化颗粒会破裂、粉碎， 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 减少了固定化细胞反复利用的次数，影响其使用效果。 ( 3 ) 对于某些仅利用细胞内的某种酶的反应，会因细胞内多种酶的存在，产生不 需要的副产物，降低产率。 1 2 固定化细胞的方法 目前，固定化细胞的方法是以固定化酶的方法为基础，进行推广、应用的。一般认 为，较理想的固定化方法应该具有如下的特点： ( 1 ) 固定化操作简单易行： ( 2 ) 固定化所使用的载体材料为商业产品，便宜易得； ( 3 ) 固定化细胞的载体性能稳定，对细胞无毒性i ( 4 ) 固定化细胞具有良好的稳定性； ( 5 ) 细胞在载体中能均匀分布，有利于反应： ( 6 ) 能够控制固定化细胞颗粒的大小和颗粒外壳的孔隙度； ( 7 ) 固定化细胞载体传质阻力较低，对大分子底物自由进出的影响较小。 然而，从现有的固定化细胞方法和常用载体材料的使用情况来看，不能完全符合上 述要求，因此要对固定化方法进行改进，对载体材料的选择进行多方面综合考虑。 目前固定化细胞的方法主要有吸附法、包埋法两大类。 吸附法：包括物理吸附及离子吸附法两种方法，是通过静电吸引或利用载体对细 胞的浆羽i 札将细胞直接吸附在水不溶性载体上的一种固定化方法e 1 7 o 吸附法操作简单， 般只须将载体放在细胞悬浮液中搅拌或浸泡即可。常用载体主要有硅藻土、活性炭、 多孔砖、木屑、离子交换树脂、陶瓷、硅胶、高岭土、多孔玻璃、纤维素等。 吸附法操作简单、反应条件温和、对细胞无毒害作用，载体可反复利用。但对细 胞的吸附能力不强、细胞易脱落：受环境变化的影响大；其中的离子吸附法，还须考虑 载体和细胞的静电性，限制了载体选择及细胞固定化应用的范围。 包埋法；是用物理方法将细胞包裹在凝胶的网格结构中或包裹在半透性聚合薄膜 内，实现对细胞的固定化1 。常用凝胶载体有海藻酸钠、聚乙烯醇( p v a ) 、卡拉胶、 琼脂、聚丙烯酰胺、醋酸纤维、明胶等。 包埋法具有很多优点：( 1 ) 操作简单易行；( 2 ) 制备条件较温和；( 3 ) 包埋载体 种类较多，可根据细胞特性和要求选用不同的载体材料及包埋方法，以便更好地保持细 2 壅塑查堂! 竺堕星堡圭堑窒兰兰些笙茎 胞的活力；( 4 ) 包埋后固定化细胞的微环境适于细胞生长，能快速增殖，细胞能均匀地 分布在凝胶网格内；( 5 ) 可以包埋较多的细胞，短时间内获得较高细胞浓度和较高的反 应速度。 包埋法也存在一些局限性：( 1 ) 有些包埋载体材料形成的凝胶结构对高分子底物 的通透性较差，影响了传质效果；( 2 ) 有些载体材料形成的凝胶的传质效果虽较好，但 在使用过程中强度不高、受压易变形、破裂粉碎；( 3 ) 大多载体对细胞固定化时，仅能 形成块状或膜状的凝胶，而不能形成小球状或珠状的凝胶颗粒，这限制了装载固定化细 胞反应容器的选择及使用。 另外，在固定化酶的方法中还有共价结合法、交联法两种。但这两种方法在固定化 寸反应祭仆剧烈，所用材料毒性大，使细胞存活率低，所以在对活细胞的固定化中几乎 小使川这两利方法。 对上述固定化细胞的方法比较可知，包埋法是目前使用效果较好的、能适合多种微 生物细胞的固定化方法。 1 1 3 常用固定化细胞载体 一般理想的固定化细胞载体应具有如下特点：( 1 ) 对微生物无毒性，具有高的载体 活性，即固定化酶或微生物的活性回收率要高；( 2 ) 。材料容易获德，价格便宜；( 3 ) 操作制备方便，能适用于大规模生产；( 4 ) 性质稳定，传质性能好，有较高的强度，抗 压、抗变形能力强，能多次长期反复使用等。 目前在固定化细胞技术中常使用的载体材料，主要分为无机载体、有机载体材料两 大类。 1 3 1 无机载体材料 见机载体大多具有多孔结构，如多孔陶瓷、多孔玻璃、红砖碎粒、砂粒、活性炭 等。与微生物接触时，通过吸附作用和静电作用。来固定微生物。用此种材料固定细胞 具有操作简单易行；强度大：对微生物无毒性；不易被微生物分解、耐酸碱；成本低、 寿命长等特性。它一般用于固定化细胞技术中的吸附法。 1 3 2 有机载体材料 常用的有机载体材料有海藻酸钠、p v a 、卡拉胶、明胶、琼脂等。这些载体材料 在特定条件下能形成网状凝胶将细胞包埋于其中。 贵州大学2 0 0 5 属硕士研究生毕业论文 1 3 2 1 海藻酸钠 海藻酸钠是海藻酸的一价盐，海藻酸又名褐藻酸，主要是由l 一古罗糖醛酸和d 一甘露糖醛酸组成的有机聚合体，分子式为( c 6 h 8 0 6 ) n ，聚合度8 0 7 5 0 ，分子量1 4 0 0 0 1 2 3 0 0 0 ，成品为白色、乳白色、或淡黄色。 海藻酸的一价盐有海藻酸钠、海藻酸钾等，溶于水成粘稠状液体，它可与细胞及 酶共溶制成细胞悬浮液。海藻酸钠还与二价及二价以上盐类形成水不溶性、耐热的凝胶 或被膜，这样可以用二价离子( 如：钙离子、镁离子、锌离子等) 置换海藻酸钠中的一 价钠离子而形成相应的海藻酸盐凝胶，同时均匀地将细胞包埋于凝胶网格中。海藻酸钙 凝胶f 内成型速度较快，当一价海藻酸钠溶液滴入二价的盐溶液中时，可迅速形成小球状 或珠状凝胶颗粒。【司定化包埋时海藻酸钠溶液浓度越高粘度就越高，凝胶颗粒的强度就 越大，网格结构越紧密，这对凝胶内部与周围环境中物质交换的自由程度造成一定的影 响。 海藻酸钠对微生物安全、无毒性：不会被大多数微生物分解或作为底物利用；传 质阻力较小，热稳定性高，高温灭菌对它无影响。它是目前使用中较安全、适用范围较 广的载体材料，是传统上用包埋法制备固定化细胞首选载体。在很多文献中都提到了将 海藻酸钠的细胞悬浮液滴入c a c h 溶液中制备珠状的海藻酸钙凝胶颗粒的方法，在一些 生产应用中也有相关的尝试。 海藻酸钠在酸性水溶液中最难腐败，而在p h 为7 时最易腐败，在酸性或碱性条件 下加热，也会很快变质。另外，常用的海藻酸钙凝胶中的c a 2 + 易与p04 3 - 结合生成ca 。( po 。) ：，在使用过程中易使凝胶颗粒破损、软化，降低颗粒的强度，影响使用效果及 寿命。一定浓度的m 9 2 + 、k + 、n a + 等阳离子也会影响海藻酸钙凝胶在使用过程中的强 度。所以海藻酸钙凝胶强度的降低是使用海藻酸钠载体不可避免的主要问题。 1 3 2 2 卜托胶 卜拉胶也是常用的一种载体材料。它是从海藻( 主要有麒麟菜、耳实麒麟菜、角叉 菜等) 中提取出来的一种多糖。又名角叉菜胶，鹿角菜胶等。r e e s 等人根据卡拉胶的 化学组成与结构将卡拉胶分成7 种类型。在工业上主要生产和使用的是k 一卡拉胶、 一和l 一卡拉胶。多数工厂的产品是k 一卡拉胶和凡一卡拉胶的混合物，产品一般为灰 白或淡黄色粉末，无臭微带海藻味。商品卡拉胶的粘度大约为5 8 0 0 厘泊之间，一般 比琼脂的粘度高。商品卡拉胶在水中加热溶解冷却后就能形成半固体状的透明凝胶，所 形成的凝胶具有热可逆性，再次加热会溶解。当卡拉胶溶液遇到钾、铷、铯、钙、铵等 阳离子时，其凝固性会很大地提高。并在一定范围内，随着阳离子浓度增加其凝固性会 4 重型盔堂! ! ! ! 旦堡主堑塞生兰些笙茎 越高。干的卡拉胶粉末很稳定，长期放置不会降解，比果胶、海藻酸钠的稳定性强。他 在中性和碱性溶液中也很稳定，即使加热也不会水解。但在酸性溶液中，特别是在p h 低于4 以下时就较容易发生水解，大分子降为小分子，凝胶强度及粘度快速下降。 卡拉胶作为载体材料具有操作简单、半衰期长、抗压强度较高、凝固具有热可逆性 等优点，目前也逐步在研究与应用领域受到重视。w i j f f e l s 掣7 谰卡拉胶包埋反硝化菌， 在流化床中进行脱氨实验，固定化细胞填充率为1 1 1 时，脱氮率达9 0 以上。 1 3 2 3 聚乙烯醇 聚乙烯醇( p v a ) 是聚醋酸乙烯酯( p v a c ) 的水解产物，具有大量的强亲水性羟 j 。i ，溶j ：水的合成高分子材料，无毒安全，广泛用于生物医用材料。 分r 为： 一( c h c h 2 ) n c h c h 2 o do h i n ：】o o o 5 0 0 0 p v a 为白色或奶黄色粉末。p v a 纤维外观似棉花，在水中加热到8 0 度以上时才完 全溶解。一般情况下p v a 的醇解度越高、浓度越高、聚合度越大、水溶液粘度就越大。 p v a 水溶液经化学交联、或冷冻等处理后可以形成p v a 凝胶。在化学交联法中，常用 的凝固剂为硼酸、硼砂、硫酸铵等。所得的p v a 凝胶是一种含水量很高的橡胶弹性体， 力学强度接近天然橡胶，内部形成的网状或海绵状结构，网孔被“键合水”、“中间水”、 “自由水”占据，这种结构和生物组织结构类似，适于被固定在其中的细胞的正常生存。 所以，p v a 作为包埋法制备的固定化细胞的载体具有操作较简单方便，所形成的凝胶 网格结构适于细胞生长、对细胞无毒性、无损伤，网格结构牢固，抗压强度高、弹性强 等优点，是目前较佳的载体材料。在很多研究和应用中都提出了用p v a 为载体材料制 备膜状固定化细胞。 1 3 2 4 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺是由单体一丙烯酰胺和双体一交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂的作用下 聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶稳定性好，受p h 和温度变化影响小，不会溶于很多有机溶 剂，属于非离子型的，没有吸附和电渗作用，可通过改变浓度及交联度较广范围地改变 孔径。丙烯酰胺的百分比越小，凝胶孔径越大，大分子物进出的阻力就越小。其抗压强 度好，弹性好、透明，但聚丙烯酰胺凝胶在形成过程中对细胞有一定的毒性，故影响了 聚丙烯酰胺作为载体材料的实用性。 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 1 3 2 5 明胶 明胶是一种从骨、生皮、肌腱、膜等动物组织的生胶质( 胶原) 中提取出来的蛋白 质。它没有固定的结构和固定的分子量。在商品明胶中分子量较大的为5 5 0 0 0 。其实验 式为： c o o h n h 2 _ 上卜_ h r 。 ( r 为巨分子) 由实验式知，明胶含有羟基和氨基，是两性分子，是蛋白质，存在等电点，其粘 度、投而张力等性质受p h 影响较大。干明胶基本上是无色无味，或略带淡黄色、无挥 发悱、透i 琏伽的非晶体物质。明胶在热水中溶解，其水溶液的分子空间结构是由许多 饷，m q 莱性小脱则形状的蛇形链所构成。水溶液具有粘性，当温度冷却到1 5 度以下时， 能形成紧密的块状凝胶，当凝胶浓度为1 0 时，其抗压强度较强载荷达2 k g c m 2 。 所以，利用明胶包埋细胞时需考虑p h 值、温度、细胞种类等因素，以免造成明 胶的分解、变性、变软、被微生物作为底物利用等不利情况的发生。 以上几种载体材料各有特点，其中研究和应用得较多的为海藻酸钠、p v a 、卡拉 胶三种。 1 3 3 载体对固定化细胞的影响 固定化载体的各种性质，如形状、大小、表面积、成分、荷电性质及其微环境对固 定化细胞中酶系的活力及代谢作用有较显著的影响。所以，要制备出高质量的固定化细 胞首先要选择好载体材料。 载体的形状会影响固定化细胞在体系中的传质效果。不同的载体材料及方法可制备 出不同形状的固定化细胞，海藻酸钠溶液中引入二价离子如：钙离子、锌离子等，卡拉 胶溶液引入钾离子等都可形成珠状凝胶颗粒。p v a 凝胶在多数情况下成型较慢，形状 多为块状、膜状或不规则状，基本上不能形成颗粒状凝胶。明胶、聚丙烯酰胺也只能形 成块状。将两种载体混合使用如p 、，a 一海藻酸钠，p v a 一卡拉胶等混合载体也可形成珠 状凝胶。固定化细胞的形状会影响其使用效果及容器的选择。不规则形状及块状的固定 化细胞在反应容器中易磨损，特别是柱状反应器内易受压变形、物流流动受阻。但珠状 或小球状就可克服这些缺点，在反应器中可为流化状态创造基本条件，并且圆形颗粒表 面积大，与物质交换面积大，生产效率较高。而膜状凝胶限制了反应器使用的类型、形 状和功能。所以，在固定化细胞的形状方面，制备小球状或珠状的固定化细胞颗粒具有 6 量州夫学2 0 0 5 蜃砥害研宽生毕业伦文 很好的发展潜力，可获得更好的生产效果。 固定化细胞的大小会直接决定颗粒的比表面积，颗粒小，比表面积相应就大，传质 条件越好。但直径太小，会增大液体流动时的阻力，也会降低生产效率。利用不同凝胶 颗粒的成型器具，可制备不同大小的颗粒。用包埋法制备固定化细胞，实验室常用无菌 针头挤压滴入凝固剂制备成型，颗粒的大小除与针头大小有关外，还受载体液粘度影响， 粘度越大，颗粒越大；反之，粘度越小，流速越快，形成的颗粒越小。一般情况凝胶颗 粒直径大多为1 3 1 n m 。如果采用高压喷射法可制得小于0 5 m m 的颗粒。利用两相法， 将载体液与细胞悬浮液混合后加入醋酸丁酯等有机溶液，通过搅拌分散后形成珠状颗 粒，所形成的珠状颗粒大小与针头成型法相差不大，但大小不均匀，个别颗粒直径较大。 将细胞固定化，虽然对细胞内酶系有一定的保护作用，减少外界污染对细胞的影响， 可提高细胞的抗菌、适应环境变化的能力( 一般会使最适温度、p h 的范围变宽) 。但也 会改变细胞周围的微环境，已有文献报道m 1 载体会引起细胞代谢发生一些变化。有人 提出这些变化是因为载体改变了膜的通透性，使得细胞内的代谢过程受到影响。 另外，在载体的选择和使用中，需考虑某些载体成分及制各条件对细胞具有一定 的毒性。载体本身具有一定的静电吸附能力，也会对细胞的包埋产生一定的影响。 所以，在看到固定化细胞的优点的同时，也应注意载体包埋对细胞的影响，把握 好制各条件及载体选择，以保证固定化细胞更好的性能。 1 4 固定化细胞技术的研究现状 目前各国都把固定化细胞研究的部分成果很快地运用于工业生产过程中，而且其应 用范围远远超出食品加工、轻化工业和制药工业，现己扩展到化学分析、环境保护、能 源开发等领域。可以预见，不久的将来，由固定化细胞所构成的，具有高效、低耗、无 公害、长寿命、安全、自动和连续化等优点的生物反应器将逐渐代替与传统的发酵工艺 和有机合成工艺相关的设备n 2 。5 。2 1 豇1 7 1 。但固定化细胞基础研究工作还有待进一 步深入。 以海藻酸盐、琼脂等为代表的天然高分子凝胶材料虽然具有成本低廉、操作简单、 对生物无毒、传质性能好的特点，但强度低、特别是在某些产气的发酵过程中，凝胶因 强度低而受力破裂，在遇到某些离子时会使凝胶颗粒软化、脱落。为了克服这些不足， 海洪、顾缪等用聚乙烯亚胺溶液来处理海藻酸钙凝胶，中野b 2 1 用硫酸铝将固定成 7 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 型后的海藻酸钙凝胶中的钙离子置换，段俊英哼1 等通过加入不饱和脂肪酸及改变c a c l 2 浓度等均有效地提高了凝胶颗粒的强度，改善了固定化细胞稳定性。张家书、李宁等人 啪1 提出在海藻酸钠中加入0 6 的a i ：0 3 或加入1 6 的s i 0 2 。翁庆北、纪黔生等人o ” 提出在海藻酸钠中添加麸皮来改善海藻酸钙凝胶的强度皆起到一定的效果。对于琼脂， 它化学性质稳定，但强度低、通透性差，需添加聚丙烯酰胺一类聚合物可加强琼脂强度。 王叔亭】报道了两相成珠法制备琼脂珠，对其通透性有很好改善。 以聚乙烯醇( p v a ) 为代表的合成高分子凝胶材料一般比天然高分子载体材料的强度 好，但其凝胶网格结构较紧密，传质性能较差，在对细胞包埋时会影响其活性。在多数 情况f ，凝胶成型较慢且只能形成块状或膜状。为此，围绕p v a 的改性有很多报道，p v a 凝胶常川硼酸等化学交联法及冷冻法来制备汹1 ，其抗压强度高、弹性、韧性好、价格 低廉、易得，对生物的毒性较小，是通用的固定化载体之一。邓元修、袁明雄等人嚏3 提出使用p v a 包埋酵母细胞；粱金钟、王建华等人h 引用p v a 包埋酵母制备固定化细 胞膜都收到了良好的生产效果。 也有很多文献提出将p v a 和其他载体材料混合使用来提高凝胶的强度、成型速度 及传质效果。吴恩方、陈九武阱1 将海藻酸钠和p v a 混合使用制备小球状的水凝胶颗 粒，提高了凝胶的强度。童群义、陈坚等人睢踟将p v a 与卡拉胶混合使用制备粒状、强 度大、性能稳定的固定化细胞颗粒。 也有人正研究使用新型的合成高分子载体材料，如黄亮使用了n a c s 和 p d m d a a c 两种新材料制备了新型的凝胶，并对微生物的发酵及生物相容性，传质效 果进行了研究。 虽然前人对固定化技术做了大量研究工作，研究主要集中在将现有的固定化细胞 技术应用到不同生物产品的生产中，但对于固定化细胞本身所存在的不足仍缺乏较深入 的研究，如：使用常规方法大部分高分子合成载体材料难以制成小球状凝胶颗粒，限制 了反应器的选用；在多次重复使用过程中的固定化细胞颗粒强度降低问题：凝胶颗粒网 格结构过于紧密导致的通透性差、传质阻力大、在发酵产气时颗粒易充气膨胀的问题等。 1 5 本项研究的目的和主要内容 本研究项目立足于当前常用的固定化细胞包埋法，进一步对其中存在的固定化细 胞颗粒抗压强度差、韧性、弹性差、载体外壳对传质的影响大、通透性差等问题进行了 8 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 较深入的研究，找出了一种操作简单、适于大规模生产、成本低廉、适用范围广，能制 备抗压强度高、弹性韧性好、通透性传质效果好的颗粒状凝胶的固定化包埋法，为固定 化细胞反应器规模化生产提供了理论依据和实验数据。 本研究项目以酿酒酵母为固定化对象，在酵母的生理、生化性能较熟悉的基础上， 有针对性地研究、解决包埋法中存在的凝胶颗粒在长期使用过程中强度变低及细胞包埋 后颗粒外壳的传质效果差、通透性差的两大难题。而且对于酿酒酵母的使用，可通过发 酵过程中酵母产生大量的c 0 2 气体在固定化细胞颗粒中的积累情况，来反映凝胶颗粒 的通透、传质效果。颗粒的通透性差，扩散效果不好，c 0 2 气体会积累在颗粒内，颗粒 “皮低| 卜 会破裂，颗粒强度、韧性较好时颗粒会膨胀，所以以酵母细胞作为包埋对象， 川i | j j ! l 、筒他地皿现对固定化细胞颗粒通透性、传质效果改善的效果。 小j ：! ；l 研究卜要分为三大部分： ( 1 ) 载体材料的优化。1 ) 对常用的单种载体材料的固定化包埋性能的初步研究。 2 ) 混合载体( 海藻酸钠和p v a 、p v a 和卡拉胶、海藻酸钠和魔芋精粉等) 包埋效果的 研究。( 2 ) p v a 一海藻酸钠混合载体固定化细胞通透性及传质效果的改善。针对p v a 一海藻酸钠混合载体制得的凝胶颗粒网格结构较紧密，载体通透性较差，对传质影响较 大，在发酵过程中颗粒因产c t h 而膨胀等问题，本项研究创新地对凝胶硬化的方式及 其相关因素进行了研究；利用k h 2 p 0 4 溶液漫饱固化后的凝胶颗粒以及在发酵液中添加 i ( h ：p 0 。两种方式来使混合凝胶中的海藻酸钙凝胶强度变低，凝胶结构局部破损、脱落的 方式来降低其紧密的网格结构，增加颗粒的通透性。 ( 3 ) 对海藻酸钠一p v a 混合载体包埋的固定化酵母细胞的相关参数( 发酵温度、时 n u 、f i i l 定化细胞的添加量等) 进行优化研究：对固定化细胞、游离细胞的最适p h 、温 度范围进行比较：对固定化细胞反复多次使用的效果进行了测定。 研究内容和主要路线详见下图，图1 1 。 一。 1 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一i k采斟埠班罅蠡“擎噶套韩k著乍 _ _ 。_ 。- _ - - - - - _ - - - _ - _ - - _ _ - _ _ _ - 。_ _ - _ - 。_ _ - - 糖 8 戢 剃 丑 靛 捌 仅 k采斟埠班罅蠡“擎噶套韩k著乍 匝雕曝繇蠹随雉昱跃摩愀确盆皿铎幡ii匝 k采斟埠班罅蠡“擎噶套韩k著乍 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 第二章载体材料的选用与优化 2 1 实验材料和方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 菌种 酿酒酵母2 1 0 9 # ，由贵州轻工研究所提供。 2 i i 2 培养肚及制餐方法 删培乔慨竹：1 0 0 b 。麦芽汁中加入2 的琼脂制得。 n # j ：扩人j 膏黔j ：1 0 0 b x 麦芽汁，p h = 4 。 固定化酵母埔妣培养基：将1 0 0 b x 麦芽汁与1 4 0 b x 马铃薯糖液按1 ：1 的比例混合制 得。其中马铃薯糖液的制备方法是：将马铃薯粉按1 ：3 5 的比例加入7 0 。c 的水中搅拌均 匀，并按量加入b f 7 6 5 8 液化酶，加热到9 0 9 3 c 维持5 1 0 m i n 后，再继续加热煮沸 l 小时，使其充分液化，并补足水分，然后冷却到6 0 1 2 ，将p h 调节到4 o 4 5 ，加入 糖化酶维持3 0 4 5 m i n ，最后配成1 4 0 b x 备用。 发酵培养基： 在1 4 0 b x 马铃薯糖液中添加0 5 0 8 ( v r 0 硫酸铵，p h = 4 5 。 2 1 1 3 载体材料及其凝固剂 海藻酸钠( 化学级) ：粘度( 1 水溶液，2 0 c ) 三0 0 2 p a s ( 2 0 c p ) ，上海化学试剂 站分装； 聚乙烯醇( p v a ) ( 化学级) ：平均聚合度为1 7 5 0 - a ：5 0 ，参与醋酸根s 0 1 3 ，天津 市科密欧化学试剂开发中心： 卡拉胶：凝胶强度；， 6 0 0 9 c m 2 ，粘度一 3 0 r n p a s ，酸碱度7 0 8 0 ，珠海市新纪元多 哪i 变有限公司 咧胶：上海化学试剂站分装； 魔芋精粉：含葡萄甘露聚糖6 8 7 4 ，贵州雷山县乡镇企业局魔芋食品厂提供； 无水氯化钙( 分析纯) ：广东汕头市西陇化工厂； 硼酸( 分析纯) 、氯化钾( 分析纯) 、磷酸二氢钾( 分析纯) 、硫酸锌( 分析纯) 、 硫酸铝( 分析纯) ：重庆川江化学试剂厂。 量州夫攀2 0 0 5 届觋尘研究生毕业伦文 2 1 1 4 主要仪器及设备 洁净工作台：s w - i a i f d ，上海博逊实业有限公司医疗设备厂； 立式压力蒸汽灭菌器：y x q - l s s o s i ，上海博逊实业有限公司医疗设备厂； 显微镜：x s p 2 a n ，j n o e c ： 振荡培养箱：l r h - 2 5 0 - z 微电脑控制，广东省医疗嚣城厂； 电热恒温水浴锅：3 7 1 0 0 x 2 ，天津市泰斯特仪器有限公司： 台式离心机：t d l 9 0 - - 2 b ，山海安亭科学仪器厂制造； 电子精密天平：肌5 2 0 ，奥豪斯国际贸易( 上海) 有限公司； 酸度讣：p h s 一2 5 ，上海伟业仪器厂； 小锈例l u 热蒸馏水器：1 0 1 h ，上海博逊实业有限公司医疗设备厂： 一i 描i ur 盟微镜：醐 y 一1 0 0 0 b ： 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 固定化细胞制备方法 酵母菌悬液的制备： 将一环培养成熟的斜面种子接种于1 0 m l 液态的酵母扩大培养基中，2 8 c 下培养 2 4 h ，再扩大到1 0 0 m l 液态扩大培养基中，2 8 ，1 2 0 r r a i n 条件下振荡培养2 4 h 。培养 液离心沉降后用生理盐水洗涤菌体，最后加入无菌水制得一定浓度的菌悬液。通过血球 计数法计得酵母总数为5 1 0 1 0 。个毫升。 固定化操作过程： 用蒸馏水配置一定浓度的载体溶液，在高压灭菌锅中用1 2 l 灭菌2 0 r a i n ，冷却到 3 0 - - 4 0 y 2 后。按一定眈俪将载体溶液和菡器液混合。充分搅拌均匀后用1 0 # 钎头挤压 滴入经灭菌的凝固荆溶液中进行制粒( 形成直径为2 3 m m 的珠状颗粒) ，硬化2 4 小 时( 不同的载体材料对应不同的凝固剂，具体情况见表2 1 ) 。再用无菌水洗涤2 3 次 后转入固定化酵母细胞增殖培养液中，于2 8 x 2 ，1 2 0 r r a i n 条件下振荡培养2 4 h 后， 转入2 0 0 m l 的灭菌后的马铃薯糖液中，发酵产酒。整个操作过程用图2 1 表示。 1 4 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 表2 1 载体材料与凝固剂f 可的对应关系 载体凝固剂 海藻酸钠 p 、，a 海藻酸钠+ p v a 卡拉胶 c a c h 、z n s 0 4 、a 3 ( s 0 4 ) 3 溶液 硼酸溶液 c a c h 溶液 c a c l 2 + 硼酸溶液 k c i 溶液 图2 1 周定化细胞制备流程 2 1 2 2 固定化细胞性能测试方法 产酒量：利用常压蒸馏法蒸馏酒精，酒精计测定酒度( v v ) 2 。每次实验制备 两个对照样，在同等情况下产酒，最后取平均值为实验结果。 固定化细胞颗粒的强度特征：在本文中主要表现为抗压强度、颗粒韧性和弹性。由 于直径为2 3 m m 的颗粒太小，不便于用仪器来定量地测定其相关强度性能，所以采 用了定性描述的方法。颗粒抗压强度的描述采用手指施加一定压力压捏颗粒，以颗粒破 裂程度为定性判别依据；弹性的好坏阻凝胶颗粒从定高度落下，其反弹高度为依据； 韧性是将凝胶颗粒用手指将之压变形，颗粒的延展程度为依据。各强度特征间的对比关 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 系用“+ ”的多少来表示，具体见表2 2 。 表2 2 凝胶颗粒强度特征的对比关系 差 较差 一般较强 强 抗压强度 - l + + + + + + + + + + + 弹性 + + + + + + + + + + + 韧性 + + + + + + + + + + + 2 2 实验结果与分析 为i 筛选仑适的载体材料，本实验对常用的几种载体材料进行了单种载体和混合 拽仆利料f n , 。i l 定化川胞制备，比较其制粒效果( 制备难度、固定化细胞的强度及形状) ， 选j 7 ，效粜较好的城体使用方案。 2 2 1 常_ h 单种载体材料的研究 2 2 1 1 单种载体材料的初选 用海藻酸钠、p v a 、卡拉胶、明胶等常用的载体材料来制备固定化细胞，从其制 各的难易程度、凝胶的成型情况、凝胶的强度特性方面来考察载体的基本性能，其具体 情况可见表2 3 。 表2 3 单种载体材料制各特性 凝胶制各难易程度 载体材料成型情况颗粒强度特征 及凝固方法，条件 容易，用c a c l 2 溶液固化 小球状凝胶颗 抗压强度较大，但易受 海藻酸钠 粒 p 0 4 3 - 的影响变脆、变粉 较容易。先用c a c h 溶液固不规则球状凝抗压强度差，容易破裂。 海藻酸钠化，再用a 1 3 + 置换c e + 制各胶颗粒 海藻酸铝凝胶 较容易，先用c a c l 2 溶液固 小球状凝胶颗 抗压强度一般，韧性差 化，再用z n 2 + 置换c a 2 + $ j 备粒 海藻酸钠 海藻酸锌凝胶 较容易，需要饱和硼酸溶液块状凝胶，需用 韧性极强、弹性一般 p v a固化，或采用冷冻法成型。剪刀剪成小块 使用 1 6 贵州大学2 0 0 5 届硕士研究生毕业论文 难，用k c l 溶液固化制得， 不规则的球状抗压强度一般，易脆， 但卡拉胶在t 4 0 c 时极易凝 凝胶颗粒在p h 4 时易分解 卡拉胶 固成块状，故制各固定化颗 粒时需要保温操作。 难，在t 4 0 c 时，易凝固成块状凝胶，需用韧性低，脆性强，抗压 琼脂 块状，需保温操作剪刀剪成小块强度一般 使用 易，不需固化液，但在碱性块状凝胶，需用抗压强度、韧性较强 魔芋精粉条件下才能形成凝胶。剪刀剪成小块 使用 | | i 太2 3 知，海藻酸钠的二价盐的凝胶及p v a 的凝胶的制备较容易，适于大批量 f 俐j l 】箭：对j ：凝胶的成型，仅有海藻酸钠及卡拉胶两种载体在一定的凝固剂中才能形成 小球状珊胶颗粒但执压强度、韧性欠佳；p v a 和魔芋精粉所得凝胶抗压强度、韧性 较好，仅能制得块状凝胶，需用小刀切割成小块使用。由此可见从常用的载体材料中不 可能选出三项特性都较好的载体。综合比较，海藻酸钠的使用效果较好，但凝胶强度尚 需增强，因此对海藻酸钙凝胶进行进一步研究，探讨增强其凝胶强度的方法。 2 2 1 2 对海藻酸钠载体强度的改善 许多文献眩3 3 0 1 提出在海藻酸钠中添加类似骨架作用的物质如：变性淀粉、麸皮、 高岭土等来增强海藻酸钙凝胶的强度。实验研究了海藻酸钠中添加填充骨料对凝胶强度 的影响。实验中海藻酸钠的浓度为2 ( w w ) ，添加a 1 2 0 3 、麸皮等填充