（发酵工程专业论文）杀虫抗生素产生菌gx29的选育、发酵优化及其产物的分离纯化研究.pdf

杀虫抗生素产生茵g x - 2 9 的选育、。发酵优化 及其产物的分离纯化研究 摘要 本文研究的杀虫抗生素产生菌g x - 2 9 是实验室自行分离得到的一株极 一 暗黄链霉菌( s t r e p t o m y c e s f u l v i s s i m u s ) ，其产物对卤虫和家蚕有很好的杀灭 作用，并对稻瘟菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 、 华丽曲霉( a s p e r g i l l u so r n a t u s ) 、粘红酵母( r h o d o t o r u l ag l u l i n i s ) 等具有较 强的抑制作用。本文以该菌株为诱变出发菌株，以枯草芽孢杆菌为初筛指 示菌，以卤虫为复筛指示虫，对该菌株进行了诱变育种；利用卤虫活性追 踪法，对其发酵培养基和发酵条件进行了优化；研究了活性物质的部分理 化性质，并对其分离纯化路线进行了探讨。研究的结果如下： 1 由出发菌株0 # ( 杀虫的半致死时间为2 6 4m i n ) ，依次进行紫外线 诱变、c o 诱变、微波诱变，每步筛选出的高产菌株用于下一步诱变处理。 - j 紫外线诱变获得菌株1 0 1 # ( 半致死时间2 2 6m i n ) ，o 诱变获得菌株2 0 2 # ( 半致死时间2 1 3m i n ) ，微波诱变获得菌株3 1 0 # ( 半致死时间1 9 2m i n ) 。 三种诱变方法中，紫外线诱变的诱变贡献率最高，达到5 2 7 8 ，其次微波 诱变，c o 诱变最小，仅到1 8 0 6 。 2 对3 1 0 # 菌株的摇瓶发酵培养基和培养条件进行了单因素和正交优 化实验，得出最优培养基组合为：可溶性淀粉1 6 ，葡萄糖0 3 ，酵母 粉o 4 ，k 2 h p 0 4o 1 ，n a c lo 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，f e s 0 40 0 0 1 ； 最优发酵条件组合为：温度为2 8 ，发酵时间为4 d ，发酵培养基初始p h 为7 4 ，摇床转速为1 5 0r m i n ，接种量为8 ，装液量为7 0 l l 2 5 0 i i l l ，种 龄为4 8 h 。在优化的条件下，3 1 0 # 发酵液的杀虫活性从原来的半致死时间为 1 9 2 m i n 减少为1 3 9 m i n ，缩短了5 3 m i n 。 3 对抗生素理化性质的研究发现，该物质是一种热稳定性较好( 经高 温灭菌处理仍保持较高的活性) ，在p h 6 o 一1 0 0 比较稳定，抗紫外线分解 一 较好，分子量 8 5 时，活性迅 速下降。 3 2 2 4 摇瓶装液量的优化 在发酵过程中，菌种生长和产物合成都要耗用大量的氧气。这就需要根据菌种的需 要来提供合适的氧气。但是并非溶氧越大越好，相反的，溶氧太大不但造成浪费，增加 成本，还会抑制产物的形成，降低产量。在实验室中，摇瓶发酵的溶氧变化主要是通过 调节摇床转速和改变装液量来实现。 1 9 21 8 e 垂1 7 献 鬃侣 15l 。- 一 3 05 07 01 1 0 装液量( m l ) 图3 - 7摇瓶装液量对活性的影响 f i g 3 - 7e f f e c to fh a s kl o a d i n go na c t i v i t yo fs t r a i n3 1 0 # 由图3 7 可知，当装液量为7 0 m l 2 5 0 i n l 时，活性最高，即杀虫半致死时间最短， 此时可理解为菌株的最适溶氧环境，在往后的实验中以此装液量进行。 打 弘 孔 坞 垢 挖 葺t重莒献舔升 彦每大毕硕士掌位论文杀虫抗生素产生菌甜之锣的选育、发酵优化及其产物的分离纯化研究 l o o 12 01 4 01 6 0 1 8 02 0 0 转速( r m i n ) ：= 一： 一= j 一一 图3 - 8 摇床转速对活性的影响 f i g 3 8 e f f e c to fs h a k i n g s p e e do na c t i v i t yo fs t r a i n3 1 0 4 从图3 8 中可知，转速在1 4 0 1 8 0 r m i n 时，发酵液的杀虫活性较好。转速过低时， 杀虫效果较差，这可能是溶氧量不足的问题；转速大于1 8 0r m i n 时，杀虫活性急剧下 降，可能是凶为转速过高时产尘较大的剪切力，影h 向菌体的鱼i 长。 3 2 2 5 种龄的优化 菌体的生长一般经历四个时期：调整期，对数生长期，平衡期和衰亡期。菌体在接 种初期，生长缓慢，需要一个调整适应过程：经过调整期后，菌体就进入，l 长旺盛期， 此时繁殖速度最快，数目急剧增多：经过旺盛期后，培养基中的营养被消耗，二氧化碳、 有机酸等有害物质逐渐增多，衰老细胞逐渐增多，细胞的繁殖速度与衰老速度处f 相对 平衡状态；随着有害产物进一步增多，酸碱度的变化，生长环境趋于恶化，蔺体进入了 衰亡期。 在发酵生产过程中，为了缩短菌种的适应期。我们一般把最适的种龄选在生命力旺 盛的对数生长期。而菌种过于年轻会延长适应期，出现泡沫多，菌丝结团等现象；菌种 太老会导致牛长能力过早衰退，彳i 利于产物的积累。为了选择合适的种龄，需对种龄进 行了优化，结果见图3 - 9 。 考一失莘硕士掌位论文杀虫抗生素产生菌删的选育、发酵俄化及其产物的分离纯化研究 o 詈 v 删 s 蛹 o2 44 87 2 1 约1 4 41 时间( h ) 图3 9 种龄对菌浓的影响 f i g 3 - 9 t h ee f f e c to fs t r a i na g eo ng r o w t ho fs t r a i n3 t 矿 由图3 9 可知，菌种在0 - 2 4 h 处于适应期；2 4 - 7 2 h 处于对数生长期；7 2 - 1 2 0 h 处 于平衡期；1 2 0 1 7 2 h 处于衰亡期。因此，我们选最适种龄为4 8 h 。 3 2 2 6 接种量的优化 发酵生产过程需要有大量健壮的菌体，合适的接种量能够快速地提供大量的菌体， 从而缩短生长过程的延滞期，缩短发酵周期，有利于提高发酵生产率，并且还有利于阻 止染菌的进一步发展，降低染菌几率。接种量过少，发酵周期长，可能导致菌体浓度过 低，发酵水平低；接种量过大，会把前期的代谢废物过多地带进发酵培养基中，影响菌 体生长代谢，导致菌体提前衰退，同时大量菌体的接入会造成营养物和溶氧的消耗过快 而不足，不利于生产。实验结果图3 - 1 0 表明，接种量为6 - 9 时，效果最佳。 石 e v 宣 誓 馘 旃 井 2 1 2 0 1 9 1 8 1 7 1 6 15l 。一 3691 21 5 接种量( ) 图3 1 0 接种量对活性的影响 f i g 3 1 0 e f f e c to ft r a n s f e rv o l u m eo fs e e dl i q u i do na c t i v i t yo fs t r a i n3 1 0 掌 考| 大警硕士掌位论文 杀虫抗生素产生苗皖卜刀的选育、发酵优化反其产物的分离纯化研究 3 2 2 7 培养条什的正交实验 根据上述单因素实验的结果，我们对p h 值、接种量、温度、摇床转速、发酵时间 等五个因子进行正交实验，每个因素4 个水平。正交试验表头设计见表3 - 3 ，试验结果 及数据处理见表3 - 4 。 表3 - 3 发酵条件正交表头设计l 1 6 ( 4 5 ) t a b l e3 - 3 t h ed e s i g no fo r t h o g o n a lt e s tf o rf e r m e n t a t i o nm e d i u ml 1 6 ( 4 5 ) 旁一大警硕士掌位论文杀虫抗生素产生曹6 ：r t 猡的选育，发醇优化及其产物的分离纯化研究 表3 - 4 正交实验结果 t a b 3 - 4t h er e s u l to fo n h o g o n a lt e s t 从表3 - 5 可知，有两种优化组合a 1 8 1 c 2 d 2 e 3 ( 或a l b l g 2 d 3 e j ) ，即温度为2 8 ( 2 ，发酵时 间为4 d ，发酵培养基初始p h 为7 4 ，摇床转速为1 5 0 ( 或1 6 0 ) r m i n ，接种量为8 。 由极差分析比较：r a r c r d r e r b 可以看出：各因素对3 1 矿菌株发酵产抗生素影响 的主次顺序是a c d e b 。即温度影响最大，其次为p h ，再次为摇床转速和接种量，最后为 发酵时间。 因为在正交实验中没有a 1 8 1 c 2 d 2 e 3 或a 1 8 1 c 2 d 3 e 3 这两种优化组合，因此，我们分别对 它进行了验证，三次重复试验的结果是：a l b l c 2 d e e 3 的平均半致死时间为( 1 4 o m i n 、 1 3 6 m i n 、1 4 i m i n ) 1 3 9 m i n ；a i b i c 2 d 3 e 3 的平均半致死时间为( 1 3 7 m i n 、1 3 5 m i n 、1 3 9 m i n ) 1 3 7 m i n 。从结果来看，a l b l c 2 d 3 e 3 比a l b l c 2 d 2 e 3 好一点，但是从生产成本来考虑，应选 则a 1 8 1 c 2 d 2 e 3 这一组合。 彦| 大学硕士掌位论文 杀虫抗生素产生曹g x - 2 9 的选育、发酵俄1 | ：及其产物的分离纯化研究 3 3 结论与讨论 抗生素是一种次级代谢产物，它的生产水平不仅取决于生产菌种自身的性能，而且 还要有合适的营养和环境条件。只有提供茵体生长繁殖合适的物质基础和生产条件，才 使菌种的生产能力充分表达出来。本章实验对菌体需要的碳源、氮源进行了筛选，在此 基础上对原有的培养基进行了正交设计优化。同时，对菌体的发酵生产条件，如培养温 度、p h 、装液量、摇床转速、接种量等，进行了单因素优化和正交设计优化。得到如下 结论： 1 最佳的培养基：可溶性淀粉1 6 ，葡萄糖0 3 ，酵母粉0 4 ，k 2 h p 0 40 1 ， n a c l0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 00 1 ，f e s 0 40 0 0 1 。经过培养基的优化，3 1 0 。发酵液的杀虫 活性从原来培养基的半致死时间为1 9 2 m i n 减少为1 7 3 m i n 。 2 最佳的培养条件：温度为2 8 。c ，发酵时间为4 d ，发酵培养基初始p h 为7 4 ，摇 床转速为1 5 0r m i n ，接种量为8 ，装液量为7 0 m l 2 5 0 i i l l ，种龄为4 8 h 。发酵液的杀 虫半致死时间为1 3 9 m i n 。 3 经过发酵培养基和发酵条件的优化，3 1 0 。发酵液的杀虫活性从原来培养条件的半 致死时问为1 9 2 m i n 减少为1 3 9 m i n ，缩短了5 3 m i n ，活性有了较大的提高。 需要指出的是，菌体的发酵生产受到很多因素的影响，我们在研究它们的影响时， 只能逐个去考察，往往忽略了各因素之间的交互作用，从而没能完全反映整个发酵系统。 另外，各因素的研究顺序对于最终的结果也可能会产生一定的影响。 彦又莘硕士掌位论文 杀虫抗生素产生曹g x - 2 9 的选育、发醇优化及其产物的分离纯化研究 第四章杀虫抗生素的初步分离提取 农用抗生素在发酵液中的含量一般 1 左右，其他大都是水和杂质，这些杂质主 要包括大量的细胞、菌体，未用完的培养基、核酸、多糖、蛋白质以及中间代谢产物等。 它们的存在不仅严重影响抗生素的质量，还会对抗生素的进一步分离提取带来很大的麻 烦，所以，必须采用适当的预处理。因不同的微生物产生的活性物质的化学结构和理化 性质各不相同，人们生产的目的也不同，对产物的纯度要求不一样，因此，所采用的分 离方法也就不同。但无论采用哪种方法都必须以明确该抗生素的理化性质为基础。 本试验拟在了解菌株3 1 矿的活性代谢产物的理化性质的基础上，探讨该抗生素的分 离提取工艺，以期分离得到较纯的活性物质，为其进一步的研究开发打下基础。 4 1 材料与方法 4 1 1 实验材料 4 1 1 1 菌种 出发菌种：极暗黄链霉菌3 1 旷，由极暗黄链霉菌g x - 2 9 经诱变筛选所得，本实验室 保存。 4 1 1 2 发酵培养基 可溶性淀粉1 6 ，葡萄糖0 3 ，酵母粉0 4 ，k z h p 0 4o 1 ，n a c l0 1 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，f e s 0 40 0 0 1 ，p h 为7 4 。2 8 c ，1 5 0 r r a i n ，培养4 d 。 4 1 1 3 主要仪器 b i o r a d2 1 1 0 型分布收集器( m a d ei nu s a ) ；h l - 2 s 型恒流泵( 上海青浦沪西仪器 厂) ；r e 5 2 a 型旋转蒸发器( 上海亚荣生化仪器厂) ；中空纤维超滤系统( p h a r m a c i a 公司) ；玻璃层析柱( 1 6x1 0 0 c m ，2 5x4 5 c m ) 旁一大莘硕士掌位论文 杀虫抗生素产生曹岔卜刀的选育，发醇优化及其产物的分离纯化研究 4 1 2 实验方法 4 1 2 1 发酵液的预处理 发酵液过滤除去菌体等大颗粒物质后，进行8 0 0 0 r r a i n 离心，最后用截留分子量为 3 0 0 0 d a 的中空纤维柱进行超滤处理，除去蛋白质和多糖等大分子物质，收集 3 0 0 0 d a 的滤液，冰箱保存备用。 4 1 2 2 活性测定方法 取l m l 待澳咀液进往卤虫生测试验观察卤虫的死亡情况，每处理设3 一个重复。本 一 一 。 章实验中，以处理液在1 5 m i n 内卤虫的致死率为活性指标。 4 1 2 3 理化性质的研究 通过不同处理，了解发酵液的热稳定性、酸碱稳定及紫外稳定性。 4 1 2 4 溶媒萃取 用不同有机溶剂：石油醚( 6 0 9 0 c ) 、氯仿、苯、乙酸乙酯、正丁醇，按与发酵 液比例为1 ：4 混合，室温下震荡2 h ，静置过夜。用卤虫分别测试萃取液和萃余液的活性。 4 1 2 5 离子交换法分离提取抗生素【8 7 1 4 1 2 5 1 树脂的预处理 本实验选用7 3 2 撑强酸性阳离子交换树脂来提取抗生素，其预处理方法如下： 1 ) 甲醇浸泡6 h ，以除去树脂生产过程中残余的有机溶剂和部分杂质。 2 ) 用1 n 盐酸缓慢流过树脂，用量约为强酸阳树脂体积的2 3 倍，每小时1 5 倍床 层体积流过。用水冲洗至中性。 3 ) 用1 nn a o h 流过树脂，用量约为强酸阳树脂体积的2 3 倍，每小时1 5 倍床层 体积流过。用水冲洗至中性。 4 ) 转型。n a + 型用3 倍树脂体积5 的n a c i 溶液流过树脂，流速与2 ) 相同。h + 型用3 倍树脂体积的1 n 盐酸流过树脂，流速与2 ) 相同。 5 ) 再生。按转型的方法处理，再生剂用量为树脂体积的3 4 倍。 4 1 2 5 2 最适吸附p h 的选择 分别吸取1 0 m l 不同p h ( 6 0 、7 0 、8 o 、9 o 、1 0 o ) 的发酵液加入预先装有5 m l 树 脂的5 0 m l 离心管中，静置吸附2 h ，以原液作为对照，测试废液的活性。 雳| 又警硕士掌位论文 杀虫抗生素产生曹e 卜羽的选育、发酵优化a 其产物的分离纯化研究 4 1 2 5 3 流速对吸附的影响 取一定的树脂装柱( 2 5x4 5 c m ) ，发酵处理液以不同的速度1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 m l m i n 进行吸附，取一定量流出废液，浓缩，测定活性。 4 1 2 5 4 洗脱剂浓度的选择 样品进样交换吸附完后，用不同浓度的n a c i 溶液( 0 1 、0 2 、0 3 、0 4 ) 进行洗脱，用分布收集器定时收集，每管约为5 m l 。用卤虫测试收集液的活性，以相应 的洗脱液作为对照。 _ 4 l 2 5 5 洗脱速度的选择一 样品进样交换吸附完后，用0 2 n a c i 洗脱液进行洗脱，用分布收集器定时收集， 每管约为3 m l ，测试不同洗脱速度下( 0 2 5 、0 5 0 、0 7 5 、1 0 m l m i n ) 收集液的活性。 4 1 2 6 凝胶层析处理 将经过阳离子交换树脂处理收集到的具有活性的部分，用4 - 5 倍9 5 的酒精进行沉 淀后，离心除去沉淀，真空蒸发浓缩。浓缩品进行葡聚糖凝胶柱层析分离。 葡聚糖凝胶柱的使用方法： 1 ) 预处理。称取s e p h a d e xg - 2 5 ( 5 0 - - 1 0 0 目) 约5 9 ，加入蒸馏水1 0 0 m l ，置室温下 1 2 h 进行溶胀。 2 ) 装柱。将柱垂直安装好，先加入1 3 柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀 边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时打开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必 须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用2 3 倍胶体积的蒸 馏水平衡后，即可加样品分离。 ： ： 一 3 ) ；b n 样。加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表 面相齐为止。然后，由柱的上端加样品，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后， 打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2 3 次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 4 ) 洗脱与收集。洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上 端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液速度为0 2 5 m l m i n 。用 分布收集器定时收集，每管约为3 m l ，共收集8 0 管，测试收集液的活性。 5 ) 凝胶的再生。凝胶柱使用一次后，用蒸馏水平衡后可继续使用。若使用数次后， 流速降低，就需要再生处理。用0 5 m o l ln a o h 0 5 m o l ln a c i 溶液浸泡，然后用蒸馏 水洗至中性备用。 考| 大莘硕士掌位论文杀虫抗生素产生酋彻的选育、发酵优化及其产物的分离纯化研究 4 2 结果与分析 4 2 1 杀虫抗生素理化性质实验 对于一个未知的天然化合物的提取分离，在分离前应先了解其理化性质，如热稳定 性，酸碱稳定性、溶解性和分子量的大小等，并初步确定活性物质属于那一大类，为其 进一步分离纯化提供科学依据。 4 2 1 1 抗生素热稳定性实验结果 一 将发酵液上清置于4 0 、6 0 、8 0 。、1 0 0 ( 2 的水浴中，分别保温3 0 r a i n ：另外， 于1 2 1 高压灭菌2 0 m i n ，待自然冷却后各取出l m l ，以原始发酵液为对照，重复三次， 分别测定不同温度处理的杀虫活性，结果见表4 1 。 表4 1温度对抗生素活性的影响 t a b 4 - 1i n f l u e n c eo ft e m p e r a t u r eo na c t i v i t yo f a n t i b i o t i c 如表4 1 所示，随着温度的升高，在1 5 m i n 内卤虫的死亡率逐渐降低，即杀虫活性 减弱。在4 0 8 0 时，活性变化很小；而在1 0 0 l 、1 2 1 下处理，活性急剧下降，这 说明活性物质在8 0 c 内短时间处理较稳定。值得注意的是，发酵上清液经高压蒸汽灭菌 ( 1 2 1 。c ) 后，仍保持较高活性。由此判断，抗生素是蛋白质的可能性较小。 4 2 1 2 抗生素p h 稳定性实验结果 发酵液上清用酸、碱溶液分别调至p h2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 ，1 0 0 ， 1 1 o 和1 2 0 ，测定不同p h 处理的发酵液的卤虫生测情况。对照处理采用发酵培养基， 分别测定不同p h 处理的发酵液的杀虫活性，实验结果见表4 - 2 。 表4 - 2p h 对抗生素活性的影响 t a b 4 - 2i n f l u e n c eo fp h0 i ia c t i v i t yo f a n t i b i o t i c 考大莘硕士掌位论文杀虫抗生素产生苗倒二乃的选育、发酵优化及其产物的分离纯化研究 表4 2 结果表明，活性物质在p h 6 0 - 9 0 内比较稳定。对照处理表明p h 6 0 - 1 0 0 时， 对卤虫的影响很小，但在p h 2 0 和p i l l 2 0 时，卤虫很快就死亡，说明卤虫不能耐受强 酸强碱环境。而在p h 3 - 5 及p i l l l 0 时，发酵液还具有一定的杀虫活性，但较原液都有 不同程度的下降，可能是因为发酵液中的活性物质发生了变化。 4 2 1 3 抗生素紫外稳定性实验 将发酵液暴晒于阳光底下，测试不同照射时间的发酵液的杀虫活性，以了解活性物 质的抗紫外线分解能力，实验结果见表4 - 3 。 表4 - 3 紫外线对抗生素活性的影响 t a b 4 - 3i n f l u e n c eo fu l t r a v i o l e to na c t i v i t yo fa n t i b i o t i c 表4 3 实验结果显示：杀虫活性随着照射时间的延长略有降低。紫外照射1 0 h 后， 发酵液的杀虫活性从原来的致死率为8 2 8 降至6 4 7 ，仅相差1 8 1 ，这说明其活性 物质具有一定的抗紫外线分解能力，这有利于该活性物质在农业上的应用。 4 2 1 4 抗生素的溶剂提取实验 用不同有机溶剂包括石油醚( 6 0o c 9 0 ) 、氯仿、苯、乙酸乙酯、正丁醇，每次用 5 0 m l 有机溶剂，分别提取5 0 m l 发酵液的上清三次，然后将有机相和水相分别合并进行 ：， 蒸馏浓缩，以除去有机溶剂。有机相浓缩物用少量乙醇溶解，水相浓缩物直接用水溶解， 然后稀释至原体积，以未处理的原液作为对照，测定不同溶剂处理的杀虫活性。结果见 表4 4 。 表4 4 不同溶剂对抗生素的萃取效果 t a b 4 - 4t h ee x t r a c t i n ge f f e c to fd i f f e r e n ts o l v e n to na n t i b i o t i c 窟j 大学硕士掌位论文 杀虫抗生素产生苗甜- 刀的选育、- 发醇优化反其产物的分离纯化研究 由表4 4 可以看出，各萃取液的杀虫活性很低，而萃余液保持的很高活性。这说明 用上述溶剂萃取，不能有效从发酵液中提取活性成分。溶剂法萃取一般遵循“相似相溶 原则：极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官 能团相似的彼此互溶。石油醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、正丁醇等都属于极性较低的溶剂， 用它们不能有效地从发酵液中提取活性物质，因此，可以初步确定该抗生素为极性较强 的水溶性化合物。 4 2 1 5 中空纤维超滤实验 中空纤维超滤法是采用- 二定截留分子量大小的过滤膜进行的，小于此截留分子量的 物质可以通过超滤膜，而大分子物质不能通过，从而把发酵液分为两部分，达到分离的 目的。发酵上清液经截留分子量为3 0 0 0 d a 的中空纤维超滤柱过滤后，分为 3 0 0 0 d a 的两部分液体，活性测试结果见表4 5 。 表钙抗生素的超滤效果 t a b 4 - 5t h ee f i e c to fu i t r a - f i l t r a t eo i la n t i b i o t i c 由表4 5 可知，发酵液经过超滤后， 3 0 0 0 d a 的收集液活性很低。因此，可以进一步确认杀虫活性物质是一分子量小于3 0 0 0 d a 的小 分子物质，而为大分子的蛋白质或多肽的可能性很小，这和高温处理的判断相一致。 4 2 2 阳离子交换树脂吸附 离子交换树脂吸附分离是利用吸附剂有选择地吸附其中的有效部分，除去无效部分 的分离方法，其吸附作用主要是通过表面吸附：表面电性或形成氢键等来实现。由前面 理化性质实验可知，活性物质是一类热稳定较好、分子量 3 0 0 0 d a 、极性较强的非脂溶 性小分子物质。因此，我们尝试阳离子交换树脂来吸附抗生素。 彦j 天謦硕士掌位论文杀虫抗生素产生曹删的选育、发醇优化及其产物的分离纯化研究 4 2 2 1 最适吸附p h 的选择 溶液的酸碱度会影响到抗生素的离子化程度，从而也就影响到树脂的吸附亲和力。 在抗生素分离纯化过程中，往往通过调节p h 值来提高吸附分离操作的效果【鼹】。为此， 我们研究了阳离子交换树脂在不同p h 下的吸附效果。所得结果如表4 - 6 。 表描p h 对吸附的影响 t a b 4 击t h ei n f l u e n c eo fp hf o ra b s o r p t i o n 表4 - 6 表明，在p h 6 0 7 0 时，废液的活性较低，说明在p h 值6 0 - 7 0 ，阳离子交换 树脂对活性成分的吸附量较高，而碱性条件不利于其吸附。 4 2 2 2 上样量的选择 为了选择合适的上样量，我们按树脂的百分含量为5 、1 0 、1 5 、2 0 对5 0 m l 的发酵液进行吸附试验。测试吸附废液的活性。结果如表4 _ 7 。 表钾上样量对吸附的影响 t a b 年- 7t h ei n f l u e n c eo ft h ev o l u m eo fs o l u t i o nf o ra b s o r p t i o n 当树脂的含量为发酵液的1 5 时，吸附废液的活性已经低至1 4 6 ，而2 0 树脂的 废液活性为1 3 9 。说明1 5 的树脂足以完全地吸附发酵液中的活性物质。 4 2 2 3 流速对吸附的影响 在离子交换吸附过程中，流速是一个重要的影响因素。当发酵液以较快流速通过树 脂柱时，溶液中活性物质很多未及时被吸附而随着溶液主体流出，从而影响吸附效果。 当发酵液以较慢流速通过树脂柱时，溶液中活性物质较为充分地与吸附剂接触，吸附效 果较好。但从本实验结果图4 1 来看，流速降到一定程度后，吸附效果很难进一步提高。 因此，考虑到实际操作需要，选择流速为2 0 m l m i n 。这样，既节约了时间，对吸附 效果影响又不是很大。 雳叠犬莘硕士学位论文杀虫抗生素产生苜甜二匆的选育、发酵优化反其产物的分离纯化研究 12345 流速( 札，嘲) 图4 - 1 流速对吸附的影响 f i g 4 - 1 t h ei n f l u e n c eo ff l o wr a t ef o ra b s o r p t i o n 4 2 2 4 洗脱剂浓度的选择 洗脱条件合适与否不仅影响洗脱收率，而且对组分的后继分离至关重要。由于还没 有充分的了解发酵液中的活性物质，我们采用温和的条件( n a c i 溶液) 来进行洗脱。 实验结果如图4 2 。 7 5r 7 0 装6 5 妻6 0 丽弱 5 0 o 20 3 浓度( ) 图4 2 洗脱液对洗脱的影响 f i g 4 2 t h ei n f l u e n c eo fe l u a n tf o re l u t i o n 由图4 2 知，在n a c ! 溶液为0 2 0 4 时，收集液的活性没有多大的变化，说明0 2 的n a c l 溶液可以充分地把活性物质从吸附树脂上洗脱下来。 4 2 2 5 洗脱速度的选择 与吸附过程类似，洗脱剂流速对解吸效果亦有较大影响。当洗脱剂流速较快时，洗 脱剂大量沿吸附剂宏观小球间空隙流出而未起到应有的洗脱作用，因而洗脱液中活性物 质浓度较低，杀虫活性不高。当洗脱剂流速较慢时，吸附剂内表面所吸附的抗生素能被 洗脱剂充分解吸出来，这样所得到的洗脱液，活性物质的含量较高，杀虫活性也较好。 的 柏 o x v 得u 献 者叠大学硕士掌位论文 杀虫抗生素产生曹岔r t 羽的选育、戋醇优化及其产物的分离纯化研究 蓁震匡霾 o 2 50 50 5l 速度( m l m i n ) 图4 3 洗脱速度对洗脱的影响 f i g 4 - 3 t h ei n f l u e n c eo ff l o wr a t ef o re l u t i o n 由图4 3 可以看出，洗脱剂流速越慢，解吸效果越好。从图看，速度为0 2 5 m l r a i n 和0 5 m l m i n 的洗脱效果相差不大。因此，我们可以选0 5 m l r a i n 作为洗脱速度。 将经过阳离子交换树脂处理的具有活性的部分收集液，用4 5 倍体积的9 5 酒精浸 泡过夜除去非醇溶性物质，然后进行蒸馏浓缩除去酒精，从而获得抗生素的粗制品，用 0 4 靴m 的滤膜过过滤，置4 c 冰箱保存备用或进一步分离。 4 2 3 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析法又称分子筛法，是根据待分离物质的大小和形状来进行分离和纯化 的。一般是大分子物质先流出来，小分子物质后流出来。它的优点是层析所用的凝胶属 于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行， 不需要有机溶剂，并且保持分离物质的天然活性。由前面实验我们已证实发酵液中的活 性物质分子量小于3 0 0 0 d a ，所以，我们选用g 笱葡聚糖凝胶进行分离处理。根据文献资 料，我们选用上样量为2 ( 样品为酒精沉淀后的粗制品) ，蒸馏水进行洗脱，洗脱速度 为0 2 5 m l m i n ，分部收集器收集，3 0 m l 管，连续收集8 0 管，用卤虫测试各管的活性， 将有活性的部分合并进行冷冻干燥处理，得到纯白色的粉末状物质，可作进一步精制时 使用。 o 装v 丹斌铺 雳| 大，擎硕士掌位论文杀虫抗生素产生苗g x - 2 9 的选x 、冀醇俄胞及其产物的分离纯北研究 经多次重复实验发现，活性成分主要集中在第4 8 5 3 管，活性测试结果如表4 - 8 。 表们凝胶过滤的效果 t a b 4 - 8t h er e s u l to fs e p a r a t i o nf o ra n t i b i o t i cb yg e lf i l t r a t i o n 3 4 4 抗生素检测波长的选择 取一定量经凝胶过滤层析处理的冻干物，配成一定浓度的溶液，于分光光度计上在 。 2 0 0 1 0 0 0 n m 之间进行扫描，得出各波长的o d 值。所得结果如图4 4 所示。 图“抗生素的全波长扫描图 f i g 4 - 4s p e c t r u mo f a n t i b i t i c 由图4 4 可以看出，该冻干物在2 0 0 3 0 0 n m 处有较强的吸收峰，在2 9 0 r i m 处有最大 的吸收峰。这种情况下，我们可选取2 9 0 h m 作为以后实验的检测波长。 4 2 5 抗生素的质谱解析 抗生素的质谱见图4 5 。从图，我们可以推断出该抗生素的分子量为1 0 8 1 。至于更 进一步的信息，有待于通过结合其它谱图和元素分析的方法，方能得到。 图钙抗生素的质谱( m a l d l - t o f ) f i g 4 - 5m a l d i - t o fm a s ss p e c t r u mo f a n t i b i o t i c 考| 大荦硕士掌位论文杀虫抗生素产生曹彻的选育、芸醇优化及其产物的分离纯化研究 4 3 结论与讨论 通过对抗生素理化性质的研究及分离条件的探索，得出以下结果： 1 ) 通过理化性质的研究，该物质是种热稳定性较好( 经高温灭菌处理仍保持较 高的活性) ，在p h 6 0 _ 1 0 0 比较稳定，抗紫外线分解较好，分子量 3 0 0 0 d a ，极性较强 的非脂溶性小分子物质。 2 ) 经过对阳离子交换树脂实验条件的摸索，得到离子交换分离的条件：调节样品 p h 6 0 7 0 时上阳离子交换树脂柱，流速为2 o m l r a i n ；上样量按树脂样品= 1 5 进 行；用0 2 的n a c l 溶液洗脱，洗脱速度为0 5 m l m i n 。 3 ) 通过g 坜葡聚糖凝胶过滤层析，条件为：上样量为2 ，蒸馏水洗脱，洗脱速度 为0 2 5 m 1 m i n ，我们最后得到了，纯度比较高的制品。 4 ) 经全波长扫描，确定抗生素的检测波长为2 9 0 n m ；经质谱分析，确定活性物质的 分子量为1 0 8 1 。 孝一大尊硕士掌位论文杀虫抗生素产生曹6 ：卜力的选育、发酵俄化及其产物的分离纯化研究 5 1 总结 第五章总结与展望 本文通过人工诱变的方法对实验室保藏的菌种g x - 2 9 进行了诱变育种，同时对其发 酵工艺条件进行了优化，并简单探讨了该抗生素可能存在的理化性质，以及对抗生素进 行了初步提取分离，得到的结果如下： 1 ) 出发菌株旷依次经过紫外线诱变、c o 诱变、微波诱变后，最后获得高产菌株 3 1 旷。使得杀虫活性由原来的半致死时间为2 6 4m i n ，减少为1 9 2r a i n ，比原来缩短了 7 2 m i n ，说明活性有了较大幅度的提高。 2 ) 对3 1 0 4 菌株的发酵工艺条件进行了优化，得出最优培养基组合为：可溶性淀粉 1 6 ，葡萄糖0 3 ，酵母粉0 4 ，k 2 h p 0 4o 1 ，n a c l0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ， f e s 0 40 0 0 1 1 最优发酵条件组合为：温度为2 8 ( 2 ，发酵时间为4 d ，发酵培养基初始 p h 为7 4 ，摇床转速为1 5 0r m i n ，接种量为8 ，装液量为7 0 m l l 2 5 0 m l ，种龄为4 8 h 。 在优化的条件下，3 1 0 4 发酵液的杀虫半致死时间仅为1 3 9 m i n ，活性有了较大的提高。 3 ) 经抗生素理化性质的研究，发现该物质是一种热稳定性较好( 经高温灭菌处理 仍保持较高的活性) ，在p h 6 0 - 1 0 0 比较稳定，抗紫外线分解较好，分子量 3 0 0 0 d a ，极 性较强的非脂溶性小分子物质。 4 ) 分离纯化路线的探讨：阳离子交换树脂的分离的条件：调节样品p h 6 0 - 7 0 ，吸 附流速为2 0 m l _ m i n ；上样量按树脂样品= 1 5 进行；用0 2 的n a c ! 溶液洗脱，洗 脱速度为0 5 m l m i n 。凝胶过滤层析的条件：上样量为胶床体积的2 ，蒸馏水洗脱， 洗脱速度为0 2 5 m l m i n 。 5 ) 经全波长扫描，确定抗生素的检测波长为2 9 0 n m ；经质谱分析，确定活性物质的 分子量为1 0 8 1 。 孝j 犬謦硕士掌位论文杀虫抗生素产生曹6 1 卜匆的选育、发酵优化及其产物的分离纯化研究 5 2 展望 本文研究的抗生素具有较高的杀虫活性和稳定性，可能是一高效的新型生物农药， 具有良好的开发前景，值得进一步研究。要进一步开发该抗生素，有如下工作亟待展开： 1 ) 利用各种现代波谱等分析方法对活性物质进行表征，以确定活性物质的结构。 2 ) 进一步优化其分离纯化工艺，提高提取收率。 3 ) 对活性物质的作用机理展开深入研究，对其安全性进行综合性评估，以便应用 于医学和农业。 者膏大乎硕士掌位论文杀虫抗生素产生曹岔r - 羽的选育、戋醇优化及其产物的分离纯化研究 参考文献 1 s t r a n d ，j f ， s o m eag r o m e t e o r o l o g i c a la s p e c t sa n dd i s e a s e sm a n a g e m e n tf o r t h e2 1 醴c e n t u r y ，a g r i c u lt u r a la n df o r e s tm e t e o r o l o g y ，2 0 0 0 ，10 3 ：7 3 8 2 2 c h a k r a b o r t ys ，t ie d e m a n nav ，t e n gp s c 1i m a t ec h a n g e ：p o t e n ti a li m p a c to n p l a n td i s e a s e s ，e n v i r o n m e n t ap o l l u t i o n ，2 0 0 0 ，1 0 8 ：3 1 7 3 2 6 3 b o m a nh g a n t i m i c r o b i 0 1p e p t i d e s m ：b a f f i n sl a n e ，c h i c h e s t e r ，u k ：j o h nw i l e y s o n sl t d ，1 9 9 4 4 l e n t e r e nv ，j o o pc ，ag r e e n h o u s ew i t h o u tp e s t i c i d e s ：f a c to rf a n t a s y ? c r o p p r o t e c ti o n ，2 0 0 0 ，1 9 ：3 7 5 3 8 4 5 r a s m u s s e nf b ，t h es c i e n c eo ft h et o t a le n v i r o n m e n t ，1 9 9 6 ，1 8 8s u p p l 1 ：4 5 6 0 6 s a m u e lg m ，g r a h a ma m ，b i o s y s t e m se n g i n e e r i n g ，2 0 0 3 ，8 4 ( 2 ) ：l1 9 1 2 5 7 杨泽敏，关故章，孙金才国生物农药的发展现状及对策安徽农业科 学，2 0 0 2 ，3 2 ( 3 ) ：5 5 6 5 5 8 ( 8 韩熹莱农药概论北京：北京农业大学出版社1 9 9 5 ，1 6 9 1 7 1 9 周启，王道本农用抗生素和微生物杀虫剂 m 中国农业出版社，1 9 9 5 ，5 ：5 7 1 0 沈寅初，张一宾生物农药 m 北京：化学工业出版社，2 0 0 0 ，1 1 1 1 万树青生物农药及实用技术 m 金盾出版社，2 0 0 3 ，3 1 2 胡庆堂，李佐虎微生物农药生产技术进展 j 生物工程进展，1 9 9 5 ，1 5 ( 4 ) ：2 9 3 1 1 3 侯慧，徐汉虹，林壁润，等防治植物病害的农用抗生素的研究及应用，河南农业科 学，2 0 0 3 ，1 1 ：2 8 3 1 1 4 上海农药研究所，井冈霉素，上海：上海科学技术出版社，1 9 7 9 1 5 f r e r ej t h em e c h a n i s mo f a c t i o n o fp e n i c i l l i na n do t h e rb e t al a c t a m a n t i b i o t i c s j jp h a r mb e l g ，1 9 8 8 ，4 3 ( 2 ) ：1 0 7 1 1 5 1 6 甘亚，吕丁抗真菌药物的作用机制 j 国外医药抗生素分册， 1 9 8 8 ，1 9 ( 6 ) ：4 6 0 4 6 5 1 7 徐铮，曹永兵，姜远英麦角甾醇生物合成途径中的抗真菌药物作用靶酶 j 国外 医药抗生素分册，2 0 0 1 ，2 2 ( 5 ) ：1 9 3 - 1 9 7 4 9 震j 大擎硕士掌位论文杀虫抗生素产生菌g x - 2 9 的选育、戋酵俄_ f | ：及其产物的分离纯1 匕研究 1 8 陈代杰微生物药物学 m 上海：华东理工大学出版社j1 9 9 9 ，2 7 7 4 3 3 1 9 张宏印，李电东博莱霉素作用机制研究进展 m 国外医药抗生素分册， 1 9 9 9 ，2 0 ( 6 ) ：2 6 6 2 6 9 2 0 d e k k e rj b a c t e r i a lp l a n td i s e a s ec o n t r o lf u n g i c i d e s j w o r l dr e v i e w o f p e s tc o n t r o l ，1 9 7 1 ，1 0 ：9 2 3 2 1 j o h n s o n ，e ta 1 u sp a t e n t5 3 5 6 8 0 9 ，1 9 9 4 2 2 k l h ，m o os u k ：k i m ，s a n gm o o n ；c h u ns o o nb a i ；c o n s t r u c t i o no fa s t a x a n t h i n o v e r p r o d u