（发酵工程专业论文）微生物转化l苯丙氨酸生成2苯乙醇的研究.pdf

摘要 摘要 2 苯乙醇( 2 苯基乙醇) 是最重要的香味物质之一，具有玫瑰特有的香气，广泛应 用于食品、糖果、饮料、香料、化妆品等行业。随着人们越来越关心健康与和营养，崇 尚“绿色”、“天然”，美国和欧盟等纷纷对化学食品添加剂的使用进行了严格的限制规定， 天然2 苯乙醇的需求量越来越大。从玫瑰花中提取的天然2 苯乙醇价格昂贵，生产量少， 成本高，原料受多方因素限制，不能满足人们日益增长的需求。利用微生物转化法生产 天然2 苯乙醇具有周期短、成本价格低、可获得天然等同产品等优点，是具有发展前途 的替代方法之一。 本论文以酵母细胞微生物转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙醇为进行了研究，主要研究内 容包括：摇瓶发酵培养条件的优化；酿酒酵母的细胞固定化及其反复分批生物转化；两 相体系生物转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙醇。 首先从酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母和中国克鲁维酵母这三种被报道用于转化l - 苯丙氨酸生成2 苯乙醇的最多的菌种中筛选出转化能力最强的酿酒酵母作为后面的实 验菌种。研究了酿酒酵母转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙醇的液体发酵的营养条件，确定了 蔗糖为该转化菌株的最佳碳源，最佳液体培养基条件( g l ) ：蔗糖4 0 ，l 苯丙氨酸7 ，磷 酸氢二钠o 5 ，y n b1 8 。蔗糖和l 苯丙氨酸对转化发酵的影响较大，其次为磷酸氢二 钠和y n b 。由于培养基成分y n b 的添加使得发酵培养基中硫酸镁含量达到要求，继续 添加反而会使2 苯乙醇产量降低，因此本实验发酵培养基中不添加硫酸镁。实验得出了 微生物转化2 苯乙醇生产2 苯乙醇适宜的摇瓶条件为：种子培养时间为2 4 h ，接种量6 ， 优化培养基初始p h 为4 0 ，装液量为5 0 m l 2 5 0 m l ，在3 0 时于转速1 0 0 r m i n 的往复 式摇床上培养，在此条件下发酵4 8 h 后，发酵液中2 苯乙醇含量可达到2 o g l ，比优化 前( 1 5 9 l ) 提高了3 3 3 3 。 分别用角叉胶、海藻酸钠、明胶这3 种不同载体进行包埋法固定化细胞的试验。经 比较，就强度和2 苯乙醇的生成而言，采用海藻酸钙包埋法均优于其它包埋法，且该操 作条件简单，容易控制固定化胶珠小球的大小，而明胶凝固后需要切块。因此，选用海 藻酸钠作为载体，进行固定化细胞的条件实验。然后采用海藻酸钙包埋法对酿酒酵母细 胞进行了固定化研究，确定固定化条件为海藻酸钠4 o ，细胞量2 0 ，硬化用c a 2 + 浓 度0 1 m o l l 。通过对固定化细胞性质的研究发现，其最佳反应p h3 。5 ，比游离细胞( p h 4 0 ) 偏移了o 5 ，最佳反应温度3 0 ，最佳反应时间4 8 h ，与游离细胞一致。游离细胞和固 定化细胞在各p h 下都较稳定。固定化细胞保藏的酶活半衰期超过1 0 d ，在贮存前5 d 内， 固定化细胞的转化能力没有明显下降，其贮存稳定性较好。而游离细胞贮存稳定性较差， 其转化能力随贮存时间直线下降，其酶活半衰期不足5 d 。对固定化细胞的反复分批生物 转化进行了研究，以4 8 h 作为一个周期，固定化细胞使用的半衰期约为5 次，比游离细 胞多2 次。 为了解决2 苯乙醇的产物抑制问题，对两相体系微生物转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙 醇进行了研究。对庚烷、辛烷、壬烷和油酸等这集中常见的有机溶剂进行了比较。结果 摘要 表明，油酸不但具有合适的底物和产物的分配，而且生物相容性好，其它的几种溶剂都 不能同时具备这两个条件。然后研究了水油酸两相体系微生物转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙醇的条件，有机溶剂油酸与水的相体积比为1 ：1 为宜，最佳温度为3 0 ，最佳p h 为 4 0 ，最佳装液量为2 0 m l 2 5 0 m l 。在优化反应条件下，4 8 h 后，水有机溶剂两相体系中 酿酒酵母转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙醇的浓度可达3 o g l ，比水相体系2 o g l 高5 0 。 关键词：酵母，微生物转化，l 苯丙氨酸，2 苯乙醇 i i a b s t r a c t a b s t r a c t a so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc o m p o n e n t so fn a t u r a lf l a v o r s ，2 - p h e n y l e t h a n o li sw i d e l y u s e di nf o o d s ，b e v e r a g e sa n dp e r f u m e si n d u s t r i e s n a t u r a l2 - p h e n y l e t h a n o le x t r a c t e df r o m r o s ef e a t u r e sb o t hah i g hp r i c ea n dal i m i t e ds u p p l y t h ei n c r e a s i n gc o n c e mf o rh e a l t h n u t r i t i o na n dt h el i m i to fc h e m i s t r yf o o da d d i t i v ei nu n i t e ds t a t e sa n de u r o p e a nu n i o n s t i m u l a t eaw o r l d w i d ed e m a n df o rn a t u r a l2 p h e n y l e t h a n 0 1 b i o t r a n s f o r m a t i o ni sa n a l t e m a t i v eo re q u i v a l e n tt e c h n o l o g yt og e tn a t u r a l2 - p h e n y l e t h a n 0 1 n a t u r a ll p h e n y l a l a n i n e i sa v a i l a b l ea n de c o n o m i c a ls u b s t r a t ef o rt h e2 - p h e n y l e t h a r l o lp r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，t h e b i o c o n v e r s i o no fl p h e n y l a l a n i n et o2 - p h e n y l e t h a n o lb e c o m e sm o r ea n dm o r ea t t r a c t i v e t h ep a p e rf o c u s e do nt h eb i o t r a n s f o r m a t i o no fl - p h e n y l a l a n i n et o2 - p h e n y l e t h a n o lb y m i c r o o r g a n i s m s t h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nw i t hf r e ea n di m m o b i l i z e dc e l l si ss t u d i e d t h e nt h ep r o d u c t i o no f2 - p h e n y l a l c o h o lf r o ml p h e n y l a l a n i n eb ym i c r o b i a lc o n v e r s i o ni n a q u e o u s o r g a n i cs o l v e n tb i p h a s i cs y s t e mw a ss t u d i e d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e , k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u sa n dk l u y v e r o m y c e ss i n e n s i sw e r e r e p o r t e dt ob et h r e eo ft h eb e s ts t r a i n sw h i c hc o u l dp r o d u c e dm o r e2 p h e n y l e t h a n o lt h a n o t h e r s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew a st h eb e s ts t r a i nw h i c hh a d b i g g e rc a p a c i t yt ot r a n s f o r ml - p h e n y l a l a n i n et o2 - p h e n y l e t h a n o la m o n g t h et h r e es t a i n st e s t e d t h ec o n d i t i o n so fl i q u i df e r m e n t a t i o no f2 。p h e n y l e t h a n 0 1w e r es t u d i e d i ts h o w e dt h a tt h e e f f e c to fs i n g l ef a c t o r s ，s u c ha sc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，g r o w t hf a c t o r sa n di n o r g a n i c s a l t so nt h ep r o d u c t i o no f2 - p h e n y l e t h a n 0 1 t h r o u g ho r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m u mm e d i u m c o m p o s i t i o nh a db e e no b t a i n e d i tw a s4 0 9 ls u c r o s e ，7 e d ll - p h e n y l a l a n i n e ，o 5 9 ln a 2 h p 0 4 ， 1 8g ly e a s tn i t r o g e nb a s e ( w i t h o u ta m i n oa c i da n da m m o n i u ms u l f a t e ) t h eo p t i m u m s h a k i n gc u l t u r ec o n d i t i o nw a sa sf o l l o w s ：2 4h o u r ss t r a i na g e 6 i n o c u l a t i o nq u a l i t y , i n i t i a l p h4 0 ，5 0 m lm e d i u mi n2 5 0 m ls h a k i n gf l a s k ，3 0 ，1 0 0 r m i ns h a k i n gs p e e d ，4 8 h o u r s i n c u b a t i o n u n d e rt h i s c o n d i t i o n ，p r o d u c t i v i t yo f2 - p h e n y l e t h a n o lw a s2 o g r e ，w h i c h i n c r e a s e da b o u t3 3 3 t h a nt h a ti no r i g i n a lm e d i u m t h ec e l l so fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew e r ee n t r a p p e di n t oc a l c i u ma l g i n a t e t h e i m m o b i l i z e dc o n d i t i o n sw e r ea l g i n a t e4 o 。c e l l s2 0 ，c 酽+ 0 1 m o l l t h eo p t i m u mp hf o r f r e ea n di m m o b i l i z e dc e l l sw e r e4 0a n d3 5 ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r e f o rf r e ea n di m m o b i l i z e dc e l l sw a s30 t h ep hs t a b i l i t i e so ff r e ec e l l sa n di m m o b i l i z e dc e l l s w e r eg o o da ta l lp hl e v e l s f o rs t o r a g es t a b i l i t y , t h eh a l f - l i f eo ff r e ec e l l sw a sl e s st h a n5d a y s a n dt h eh a l f - l i f eo fi m m o b i l i z e dc e l l sw a sm o r et h a n10d a y s 。 m i c r o b i a lc o n v e r s i o no fl p h e n y l a l a n i n et o2 p h e n y l a l c o h 0 1w i t hy e a s tw a sp e r f o r m e d i na na q u e o u s o r g a n i cs o l v e n tb i p h a s i cs y s t e m s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eh a dm o r ep o t e n t i a l t ot r a n s f o r ml p h e n y l a l a n i n et o2 p h e n y l a l c o h o lt h a nk l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s t h er e s u l t s o ft h es o l v e n ts c r e e n i n gi n d i c a t e dt h a to l e i ca c i dw a st h eb e s ts o l v e n tw h i c hc a ne x t r a c t 2 - p h e n y l a l c o h o le f f i c i e n t l y t h eo p t i m u mv a l u e so fv o l u m er a t i oo fo r g a n i cp h a s et oa q u e o u s p h a s e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，p ha n dl i q u i dv o l u m ew e r e1 ：1 ，3 0 c ，4 0a n d2 0 m l 2 5 0 m l ， r e s p e c t i v e l y u n d e ra b o v eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ec o n t e n to f2 一p h e n y l e t h a n o lr e a c h e d3 o g l 4 8 hl a t e r , w h i c hi n c r e a s e da b o u t5 0 t h a nt h a ti nm o n o p h a s i ca q u e o u ss y s t e m k e y w o r d s ：y e a s t s ，m i c r o b i a lc o n v e r s i o n ，l p h e n y l a l a n i n e ，2 - p h e n y l e t h a n o l i i i 独创 生声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 翟! 堇一日 期： 盘盈：乏：圭 关于论文使用授权的说明 一本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：堕) 圣 导师签名：銎垡蛰 日 期：o 一盘仝、矿 第一章绪论 第一章绪论 1 - 1 生物催化 生物催化作为生物技术的重要组成部分，不仅已在工业，还在农业、医药、食品等 方面得到广泛应用，在解决当代资源、能源、环保等多种问题方面起着举足轻重的作用， 新兴的生物催化产业已成为当前优先发展的高科技领域之一。作为生物技术的重要组成 部分，生物催化不但受到生物科学、化学化工科技工作者的重视，也日益受到广大工农 业、医疗保健、能源环境等众多工作者的重视，已逐渐成为对国民经济起着重要作用的 产业技术。近2 0 年来，随着酶学、酶工程与基因工程技术的发展，生物催化得以迅速 发展。 由于生物催化所需条件温和、反应产物单纯，是一个与环境友善的绿色化学过程， 因此生物催化不但经济效益明显，而且对环境及社会发展，对绿色化工产业的建立都有 重要的战略意义。上世纪九十年代起生物催化成为许多有机化学家和医药、化学公司关 注的研究领域，并在一些产品的生产中成功地实现了产业化。当前世界各化学公司如德 国巴沙夫( b a s f ) 、美国杜邦( d u p o n t ) 在生物催化产业化方面都纷纷开展了研究。 “生物催化”技术与产业表明，它将传统的化学化工原理与现代生物技术完美地融为 一体，具有条件温和、高效专一、环境友好等鲜明特征，生物催化技术符合“绿色化工” 要求，同时也有明显的经济效益和社会效益，已引起了人们广泛的兴趣和很高的期望。 现已公认，生物催化产业具有相当大的市场潜力，发展非常迅猛，应用前景很好，生物 催化技术被认为是工业可持续发展最有希望的技术。 食品香精香料是现代加工食品香味的重要来源，对于人们对食品香味美的追求具有 重要作用。食品香精的使用对食品是必要的和有益的，在食品工业生产中发挥着难以估 量的作用。一些食品诱人的香味完全或主要是由食品香精提供的，如软饮料、冰糕、冰 淇淋、果冻、糖果、方便面调料等。一些加工食品由于加工工艺、加工时间等的限制， 香味往往不足、或香味不足、或香味特征性不强，加入食品香精后使其香味得到补充、 加强和改善，如罐头食品、香肠、肉制品、仿肉植物蛋白制品、膨化制品、烘焙食品等。 从健康的角度来说，食品的绝对安全性越来越普遍地以“天然的”来鉴别，这就使得 食品香精香料也趋向于“天然食品香精香料”。统计资料表明，市场，特别是北美和欧洲 市场对天然食品香精香料的需求越来越多，近年来欧洲所消费的食品香精约有6 0 是天 然食品香精香料，北美约为4 0 。至上世纪9 0 年代以来，北美的天然食品香精每年的 增长速度约为2 0 ，对天然食品香精香料需求最高的是软饮料、糖果、乳制品和肉制品 等行业。但作为第二大香味料的2 苯乙醇的天然产品则严重不足。 食品添加剂的绿色制造是现代食品工业的前沿领域与核心技术之一。微生物发酵或 转化生产的食品添加剂，符合天然安全要求。生物催化方法常温常压，节约资源能源， 环境友好，是一种绿色制造新工艺。在这种追求天然的背景下，我们有必要针对目前这 种重要的食用香料等食品添加剂进行研究。 江南大学硕士学位论文 1 22 苯乙醇概况 1 2 12 苯乙醇产品的简介 2 - 苯乙醇( 2 - p h e n y l e t h a n 0 1 ) ，也称p - 苯乙醇、2 苯基乙醇，化学名称为2 苯基乙醇 ( 2 - p h e n y le t h y la l c o h o l ，p e a ) ，分子式为c s h l 0 0 ，分子量为1 2 2 1 6 ，结构式如下： o h 2 - 苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰气味的芳香醇，自然存在于许多植物的精油中， 如风信子、茉莉、茶叶、黄兰、水仙和百合等的精油；2 苯乙醇也是一些发酵食品，如 面包、葡萄酒、苹果酒、干酪和酱油的自然风味物质【l 】。 2 一苯乙醇常温下是具有玫瑰香气的无色液体。沸点2 1 9 5 - 2 2 1 。熔点2 5 8 。相 对密度1 0 2 3 5 ( 2 5 4 。c ) 。折射率n d ( 2 0 c ) i 5 1 7 9 。粘度( 2 5 ) 7 5 8 m p a s o 闪点1 0 2 2 。 溶于乙醇、乙醚、甘油，略溶于水，微溶于矿油。 本品对鼠类有刺激和麻醉作用，对大鼠、小鼠和小白鼠的急性口服l d 5 0 分别为1 7 0 0 、 8 0 0 及4 0 0 m g k g 。但美国允许用于食品中，欧洲以2 m g k g 浓度用于人造香精，刺激和过 敏试验对人是阴性的。 1 2 2 2 苯乙醇的用途 2 一苯乙醇香气轻柔甜和，它的玫瑰芳香气味颇受人们欢迎，使得2 苯乙醇在食品、 化妆品、烟草和日化用品中有着广泛的应用，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分， 而且具有协合及增效作用，是多种香型配方所需的组分【2 1 。 2 - 苯乙醇是使用量仅次于香兰素的第二大香料成分，可用于玫瑰、焦糖、蜂蜜以及 其它果香型食品香精及各种酒用香精和烟用香精的配制，它是玫瑰和其它植物风味中不 可缺少的物质；对碱的稳定使得它能专门地用于肥皂香料中；少量的2 苯乙醇用作食品 添加剂，添加到软饮料、糖果、饼干中增加其香味。 2 - 苯乙醇也是生产其衍生物的不可缺少的原料，它的酯尤其是乙酸苯乙酯，也是一 种有很高价值的香料。 在医药上，2 苯乙醇也是传统的抑菌剂。 1 2 3 2 - 苹乙醇的市场状况 目前，全球的2 苯乙醇的年产量近万吨，基本上都是采用廉价的化工原料化学合成 方法生产，仅有很少一部分从玫瑰中提取。据人估计，目前天然2 苯乙醇的年产量为0 5 吨。化学合成的2 - 苯乙醇市场价格约为3 5 $ k g ，而天然2 苯乙醇价格却高达1 ，0 0 0 $ k g 3 1 。 从玫瑰或其它精油中提取的2 苯乙醇价格昂贵，远远不能满足市场的需要。 随着各国对食品安全的重视和加强管理，今年来各国商标法对加工食品的某些限制 性规定日益明确，例如在澳大利亚悉尼的街头、日本东京的超市，你都会在食品包装的 突出位置看到“天然”、“含天然香料”、“无添加化学合成品”、“无添加化学调味品”之类 2 第一章绪论 的字样，其目的显然是为了迎合消费者对“天然”食品的需要。由于人们对化学合成的食 品添加剂具有某种抵触甚至恐惧的心理，为了安全和健康的需要，他们宁愿选择价格昂 贵的天然产品。 国际上天然2 苯乙醇主要是以微生物发酵法转化l 苯丙氨酸生产，主要集中在法国、 德国、日本等发达国家，而我国目前只有一两家生产天然2 苯乙醇的厂家，所以我国需 要加强在这方面的研究。 1 32 苯乙醇生产技术概况与研究进展 1 3 1 2 苹乙醇的化学合成 从1 8 7 6 年发现2 苯乙醇以来，已有多种化学合成方法报道。目前主要生产方法有苯一 环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢、法【4 1 。 v 盥旷删煦9 渊州 图1 - 1 苯一环氧乙烷合成法 f i g 1 - 1f r i e d e l - c r a f tr e a c t i o nf o r2 - p h e n y l e t h a n o ls y n t h e s i s 受 一一g p + 护r 一 一垡旷。h 图1 - 2 氧化苯乙烯加氢法 f i g 1 - 2s t y r e n eo x i d er e d u c t i o nf o r2 - p h e n y l e t h a n o ls y n t h e s i s 国际市场上苯环氧乙烷合成法产品占4 0 ，氧化苯乙烯加氢法产品占6 0 。苯环 氧乙烷合成法产品所含微量杂质不同，香气差异较大，大多不能用于香料。国内主要采 用氧化苯乙烯加氢法，而苯环氧乙烷合成法生产的2 苯乙醇产品质量尚未达到标准。化 学合成方法生产的2 苯乙醇，常含有不良气味的副产物，如联二苯，p 氯代乙苯，氯乙 醇等，这些杂质难以用蒸馏、精馏、重结晶等物理方法去除，因而产物的纯化是一个非 常突出的问题。不同质量等级的2 苯乙醇有不同的用途，只有经过较高成本的纯化后， 2 苯乙醇产品才能达到食用和日用香料的质量标准。 1 3 2 微生物转化法生产2 苯乙醇 许多发酵食品，如面包、葡萄酒、苹果酒、啤酒、黄酒、干酪、酱油和乌龙茶等都 带有芬芳的香味，香味物质都是由酵母在发酵过程中自然形成。在发酵过程中，大多数 酵母菌能产生杂醇油，而2 苯乙醇是杂醇油的重要组成部分，也是决定发酵食品品质的 一个关键因素。例如，清酒中2 苯乙醇浓度为2 0 - - 一7 0 m g l ，黄酒中高于1 0 0 m g l 。酵母 细胞可以从头开始合成，也可以通过氨基酸分解途径将l 苯丙氨酸转化为2 苯乙醇。 1 3 2 1 合成2 苯乙醇的代谢途径 a 从头合成途径 在一些酵母细胞中，2 苯乙醇可以通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径从头合成【5 j 。 即经过莽草酸途径形成分枝酸后，分枝酸在变位酶作用下，转变成预苯酸，经过脱水、 脱羧后形成苯丙酮酸；苯丙酮酸脱羧产生苯乙醛；苯乙醛脱氢便生成2 苯乙醇；代谢途 3 江南大学硕士学位论文 径见如图1 - 3 。 艘薅尊式丙酮馥 争舜暖赤磐糖 的哆椭a 蛔 i 嘲自”h 纠- | 炯p 蛔惦 f e e d l b 硪i n h i b i l i a i l 一_ 莠1 4 分j 反馈抑恻+ 壤j f | 暇l k k 诅越一 - - 一转氯穗一 。! 巨 反内棱醴- 3 - 囊己= 馥- t c a 新翻弘喃螂i 瞒协3 ，i c 铂耐i p l 噼 矗氯酸。尿纛簟氍鳆素骏+ 乙氍乙敷 聃柚h 嘲的挚哦妇暗f w + 曲啦 图i - 32 苯乙醇的合成途径 芟剩希谂径 勘啪曲阳帅 肉桂黛违签 c 班啦眦弘幽硼拳 嘲乳动锄缓艟中 矗b 瞳暇矗t 垃勰幽 f i g 1 - 3b i o s y n t h e s i so f 2 - p h e n y l e t h a n o l b 艾氏途径 在哺乳动物细胞中，l 苯丙氨酸分解转变为酪氨酸，酪氨酸再经过尿黑酸降解为延 胡索酸和乙酰乙酸。而在微生物细胞中，l 苯丙氨酸的分解代谢可能存在几种途径。其 中之一是肉桂酸途径，降解过程的第一步是苯丙氨酸脱去氨基产生反式肉桂酸，如在掷 孢酵母( s p o r o b o l o m y c e sf o s e u s ) 和黏红酵母( r h o d o t o r u l ag l u t i n & ) 细胞中。对于把氨基酸 仅作为氮源利用的微生物来说，肉桂酸已没有进一步降解的必要；而对于能够利用氨基 酸作为碳源的微生物，肉桂酸则经过原儿茶酸进一步降解为3 酮基乙二酸，3 酮基乙二 酸最终进入到t c a 循环中1 6 j 。 在微生物细胞中，l 苯丙氨酸分解的另一条途径是通过氨基酸的转氨作用生成苯丙 酮酸，或在脱羧酶作用下形成苯乙胺，再脱羧或胺氧化形成苯乙醛，进而生成2 苯乙醇， 代谢途径见图1 3 。这个途径首先是由e h r l i c h 在1 9 0 7 年发现，后来便以他的名字命名，酿 酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的l 苯丙氨酸具体代谢途径见文献【7 1 。 在酵母细胞中，2 苯乙醇合成走哪一条途径取决于培养基中氮源的种类，只有当l 一 苯丙氨酸作唯一氮源存在时，艾氏途径才能占优势。如果环境中有其它更容易利用的氮 源存在，即使在较高的l 苯丙氨酸浓度条件下，l 苯丙氨酸仍有一部分通过其它途径被 代谢，如通过肉桂酸途径降解为3 酮基乙二酸而进入t c a 循环，而且这个降解途径不能 完全被抑制，所以任何条件下，l 苯丙氨酸不能完全转化为2 苯乙醇【8 j 。 4 第一章绪论 1 3 2 2 合成2 苯乙醇的微生物 多种酵母具有从头合成2 苯乙醇的能力，如马克斯克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e s m a r x i a n u s ) 发酵5 d ，可产生浓度为4 0 0 m g l 的2 - 苯乙醇【9 1 ；发酵毕赤酵母( p i c h i a f e r m e n t a n s ) 发酵1 6 h ，可形成浓度为5 0 5 5 m g l 的2 一苯乙醇【1 0 】。此外，还有酸酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sv i n i ) 、产朊球拟酵母( t o r u l o p s i su t i l i s ) 、芽枝状枝霉( c l a d o s p o r i u m c l a d o s p o r i o i d e s ) 、乳酸克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e sl a c t i s ) 、酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 、异常汉逊酵母( h a n s e n u l aa n o m a l a ) 等，都能在生长过程中从头合成一定量的 2 苯乙醇【1 1 1 。 不少真菌也具有从头合成或转化l 苯丙氨酸为2 苯乙醇的能力，如火木层孔菌 ( p h e l l i n u si g n i a r i u s ) 、平滑层孔菌( 户l a e v i g at u s ) 、杨木层孑l 菌( pt r e m u l a e ) 、安息香薄皮 孔菌( 1 s c h n o d e r mab e n z o i n u m ) 、帚状地霉( g e o t r i c h u mp e n i c i l l a t u m ) 、猴头菌( h e r i c i u m e r i n a c e u s ) 、硬黑孔菌i g r o p o r u sd u r u s ) 和黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 等，但合成或转化能 力相对较低1 3 ，l 引。 1 3 2 3 生物转化法生成2 苯乙醇的研究进展 19 8 5 年r o d o p u l o 等人用s a c c h a r o m y c e sv i n i 和t o r ut o p s i su t i l i s 发酵葡萄汁，7 d 后产出 1 2 m g l2 苯乙醇【1 3 j 。 19 9 3 年j i a n g 用k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s 发酵5 d 后产出7 2 m g l2 - 苯乙醇【1 4 】。 19 9 5 年f a b r e 等人用k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s 发酵5 d 后生产4 0 0 m g l2 苯乙酣”】。 19 9 4 年a l b e r t a z z i 等人用k l o e c k e r as a t u r n u sc b s5 7 61 和h a n s e n u l aa n o m a l ac b s1 1o 在含2 ll - 苯丙氨酸而不含其它氮源的培养基中发酵2 4 h 后得到1 7 9 l2 苯乙醇；相同条 件下他们用s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a en c y c7 3 9 得到1 5 9 l2 苯乙醇【l 引。 2 0 0 0 年h u a n g 等人用p i c h i af e r m e n t a n sl - 5 在含有2 9 ll - 苯丙氨酸的培养基中发酵 1 6 h 后产出4 5 3 m g l2 苯乙醇【l o 】。 2 0 0 1 年s t a r k 等人用s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg i v2 0 0 9 在含有6 9 ll 苯丙氨酸的培 养基中发酵4 8 h 后产出2 3 5 9 l2 苯乙醇【8 】。 2 0 0 2 年s t a r k 等人以油醇为萃取剂，用s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 进行两相补料分批 培养，2 苯乙醇的产量可达到1 2 6 e j l t l 。7 1 。 2 0 0 3 年e t s c h m a n n 等人用k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u sc b s6 0 0 以油醇作萃取剂进行 两相发酵，摇瓶中2 苯乙醇可达3 9 l 。培养工艺优化后，产量可达5 6 9 l t l l 】。 国内报道的微生物法生产2 苯乙醇的单位只有华宝香化科技发展有限公司，并且申 请了酵母发酵烟草加工副产物生产2 苯乙醇的专利【l 引。 1 3 3 原位产物转移技术在2 - 苯乙醇生产中的应用 与其它醇类物质一样，高浓度2 苯乙醇对微生物细胞有一定的毒性。此外，酵母在 发酵中自身也会产生大量的乙醇，而且乙醇和2 苯乙醇联合作用产生的毒性比它们各自 产生的毒性作用累加要高。所以在要求达到高产量生产2 苯乙醇工艺过程中，必须考虑 2 苯乙醇和乙醇对酵母的毒性【l9 1 。 要克服2 苯乙醇和乙醇对酵母细胞的毒性，可以借鉴高浓度乙醇发酵技术。从菌种 江南大学硕士学位论文 角度考虑，不同的酵母菌或同种不同菌株对2 苯乙醇的耐受性不同，例如，浓度为2 0 e d l 的2 苯乙醇就能完全抑制马克斯克鲁维酵母的生长，而对于酿酒酵母，达到相同的抑制 效果时，2 苯乙醇浓度需4 og l 以上【2 8 】。因而可以选育耐高浓度2 苯乙醇和乙醇的酵母 菌株作为生产菌种，或采用克拉布特里( c r a b t r e e ) 阴性酵母，如马克斯克鲁维酵母和异常 汉逊酵母；从发酵工艺角度考虑，一方面控制葡萄糖浓度可以阻止克拉布特里阳性酵母 产生乙醇，如采用补料分批发酵【3 j ；另一方面则是开发一种从发酵培养基中连续回收2 一 苯乙醇技术，即原位产物分离技术( i ns i t up r o d u c tr e m o v a l ，简称i s p r ) ，已知用于2 苯乙 醇的产物原位转移技术见表1 1 。 ， 表1 1 用于2 苯乙醇的产物原位转移技术 t a b l e1 - 1i ns i t up r o d u c tr e m o v a lt e c h n i q u e sf o r2 - p h e n y l e t h a n o l 有机漤刑 发醇液 发酵液 图1 4 摇瓶和发酵罐生产2 苯乙醇的原位分离技术示意图 f i g 1 4i ns i t up r o d u c tr e m o v a la ts h a k ef l a s ka n db i o r e a c t o rs c a l e 液液萃取就是在水相的发酵培养基中加入水不溶性的有机溶剂，2 苯乙醇溶解到有 机溶剂中，发酵液中的2 苯乙醇浓度降低，从而降低对酵母细胞的毒害作用，有利于l - 苯丙氨酸向2 苯乙醇转化反应的进行，图1 4 是e t s c h m a n n 设计的i s p r - v 艺简刚2 0 1 。采用 i s p r 技术发酵，2 苯乙醇的转化率可以大幅度提高，如采用i s p r i 艺，酿酒酵母转化生 成的2 苯乙醇浓度可达1 2 6g l ，而分批补料发酵只能达到3 8 l 【2 。 1 3 4 发酵液中2 苯乙醇提取研究情况 目前，关于2 苯乙醇提取方法的文献报道较少，资料中探讨比较多的主要是有机溶 剂萃取法、吸附分离法、超临界萃取法和全蒸发法等【2 2 】。常用的是有机溶剂法，常用有 机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮等，由于乙醇毒性低、易回收利用，所以在大量提取时，一 般采用一定浓度的乙醇进行提取。 1 3 5 发展趋势 6 第一章绪论 在当今生物技术迅速发展并转化为商品的时代，生物化工产业的发展十分迅猛，据 有关方面预测，未来将有2 0 3 0 的化学工艺工程会被生物技术所取代。同时，随着石油 等非可再生资源日益减少、世界人口和环境压力的增加，应用现代生物技术改造和替代 传统化工工艺的趋势越来越引起人们的重视，为传统技术或常规技术所不能解决的重大 问题带来新的曙光。微生物转化法制备2 苯乙醇顺应了这一潮流，而人们对天然添加剂 的青睐，促成了天然2 苯乙醇的高价格，这些原因使得微生物转化法生成2 苯乙醇成为 一个颇有吸引力的研究课题。 1 4 本课题的研究意义 虽然过去2 一苯乙醇的生产一直使用传统的化学合成方法，生产技术成熟，产品价格 低廉。但随着时间的推移，人们生活水平不断的提高，消费者越来越关注食品的安全性 问题，越来越追求“天然”、“绿色”的食品，对化学合成的食品添加剂产生抵触情绪，意 识到化学合成品可能对身体健康带来的副作用；另一方面，不少国家开始制定更为严格 的食品法规，开始强调食品安全的重要性；而能够符合“天然”要求的2 苯乙醇一直是通 过从植物中提取而得到的，由于受到植物原料来源、地域以及气候等因素的影响，产量 一直很难提高，只占世界2 苯乙醇市场年销量的0 2 ，价格昂贵，不能满足人们日益增 长的需求。这三方面的原因使香料工业对利用其它的天然资源来生产天然2 苯乙醇，这 种普遍趋势已经在许多文章中被提到。欧美的立法机构认可采用生物活细胞或其中的组 成部分( 例如酶系) 所生产的物质为天然产物。这样一来，利用微生物细胞转化生产2 苯乙醇就成为很有前途的替代方法。 与传统的化学合成法和植物提取法相比，微生物转化法具有如下优点： 1 】其产品的有害物质含量比化学合成法低，绿色环保； 2 】可大规模生产； 【3 生产周期短，不受季节影响： 4 】反应条件温和； 5 】成本比植物提取法低。 无疑，天然2 一苯乙醇的市场潜力是巨大的，而采用微生物转化法来生产天然2 苯乙 醇越来越成为研究者关注的热点。对此投入力量进行研发，会给国家带来巨大的经济效 益，同时有益于提高人民的生活水平。 1 5 本课题的研究任务 1 5 1 技术路线 1 5 2 本课题的主要研究内容 ( 1 ) 摇瓶发酵培养条件的优化 7 江南大学硕士学位论文 ( 2 ) 酿酒酵母的细胞固定化及其反复分批生物转化研究 ( 3 ) 两相体系生物转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙醇 第二章摇瓶发酵培养条件的优化 第二章摇瓶发酵培养条件的优化 2 1 前言 微生物需要从环境吸取营养物质，以提供能量，调节新陈代谢并合成细胞物质， 从而使得菌体总量增加，并使细胞数目逐步增多。营养物质的组成以及微生物所处环境 条件的变化，不仅会影响微生物的生长及其生存状态，而且将在很大程度上影响代谢产 物以及各代谢途径中酶系的生成与活性。 其中，培养基的组成和摇瓶培养条件是实验室研究的主要内容。培养基是人工配 制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质原料，同时培养基也为 微生物等提供除营养以外的其它生长所需的环境条件。培养基的组成和配比是否恰当对 微生物的生长、产物的合成、提取工艺的选择、产品的产量和质量都有很大的影响，培 养基组成要符合一些基本需要：必须含有作为合成细胞组成的原料；满足一般生化反应 的基本条件，如碳源，氮源，无机盐及生长因素；一定的p h 条件2 3 。2 6 1 。摇瓶发酵培养 条件的优化是发酵产品从实验室研究到工业化生产过程中必须进行的工作。本章结合前 人实验结果【i i , 1 7 , 2 1 】，主要就发酵培养基组成作了详细的研究，并确立了较好的培养基组 成和摇瓶发酵条件。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 试剂与原材料 l 苯丙氨酸医药级江苏华邦生化科技有限公司 2 苯乙醇标样实验试剂 昆山绿洲香料有限公司 硫酸镁分析纯国药集团上海化学试剂有限公司 磷酸氢二钠分析纯国药集团上海化学试剂有限公司 无氨基酵母氮碱( y n b )生化试剂上海生工生物技术发展有限公司 甲醇色谱纯江苏汉邦科技有限公司 酵母膏生化试剂国药集团上海化学试剂有限公司 蛋白胨生化试剂国药集团上海化学试剂有限公司 葡萄糖分析纯国药集团上海化学试剂有限公司 蔗糖分析纯国药集团上海化学试剂有限公司 麦芽糖分析纯国药集团上海化学试剂有限公司