（生理学专业论文）短暂反复缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究.pdf

删姗删洲洲删册 y 19 0 0 5 2 1 附表- 2 2 讨论- 2 4 结论”- 一”“”一”一一”2 8 参考文献2 9 综述缺血预处理的保护作用机制研究进展3 1 致谢3 9 个人简历4 0 中文摘要 缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护 作用及其机制研究 摘要 血再灌注损伤( r e n a l i s c h e m i 砒i 印e r 凡s i o n 埘u 巧，r j 脚) 病理生理现象，在缺血性急性肾损伤的病理过程中起重要 素参与的复杂病理过程。缺血预处理( i s c h e m i c i p c ) 指组织器官遭受反复短暂缺血后，可在后续的长期 ，使缺血损伤减轻。研究发现，i p c 对心、肝和小肠等许 多器官均具有保护作用，但其作用机制尚未完全阐明。短暂反复i p c 是否 对对砒具有保护作用，目前少有报道。因此，探讨短暂反复i p c 对r j 脚 的保护作用及其机制，对r i 瓜i 的防治具有十分重要的意义。本实验旨在 应用生理，生化，放射免疫及免疫组化等方法观察短暂反复i p c 对嗍 的作用，并探讨其可能的作用机制。 方法：成年健康雄性s d 大鼠4 0 只，体重1 5 0 1 8 0 9 ，在1 8 2 2 。度实 验室安静饲养两日后动物随机分为5 组，即： l 假手术组( s h 锄) 2 缺血再灌注组( i r ) 3 五分钟缺血预处理一次+ 缺血再灌注( 1 + i r ) 4 五分钟缺血预处理二次+ 缺血再灌注( 2 + i 瓜) 5 五分钟缺血预处理三次+ 缺血再灌注( 3 + i 瓜) 各组动物经l 戊巴妥钠腹腔麻醉，开腹，暴露双侧肾动、静脉。假 手术组，只开腹不夹闭双侧肾动、静脉；豫组，夹闭双侧肾动、静脉4 5 m i n 松夹再灌；1 + i 瓜、2 + i 瓜和3 + 胀各组则分别夹闭双侧肾动、静脉 五分钟再灌五分钟一次，两次和三次( i p c ) 后再行夹闭双侧肾动、静脉 4 5m i n ，松夹再灌后，逐层缝合腹膜，腹壁肌肉和皮肤。2 4 小时后取血及 双侧肾脏测定血清肌酐( s c r ) 、尿素氮( b u n ) 、肾组织丙二醛( m d a ) 、 一氧化氮( n o ) 、一氧化氮合酶( i n o s ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 、内 皮素( e t ) 以及肾组织h o 1 的表达。 中文摘要 结果： l 大鼠r 嘲后，光镜所见：s h 锄组肾组织无明显异常；i r 组肾组织损伤 加重，表现为肾小管上皮细胞浑浊肿胀、坏死、管腔扩张，间质变宽、 水肿、有大量炎细胞浸润。l + 豫组、2 + 倦和3 + i 瓜各组肾小管损伤程度均 较i 瓜组明显减轻，间质炎细胞明显减少，水肿明显减轻。其中以3 + i 瓜 组损伤程度减轻的最为显著。 2 大鼠删后，豫组肾功能明显下降，b u n 和s c r 均明显高于s h a i i l ( p o 0 1 ) ；与i r 组相比，1 + 豫、2 + i 瓜和3 + 汰各组b u n 和s c r 均明显降低 ( p 0 0 5 o 0 1 ) ，其中以3 + i 瓜组降低程度最为显著。 3 大鼠r i r i 后，i r 组m d a 含量较s h 锄组显著升高；s o d 活力则较s h 锄组明 显降低( p o 0 1 ) ；与i r 组相比，1 + 豫、2 + 豫和3 + i r 各组s o d 活力均 明显增加，而m d a 含量则明显降低( p o 0 5 o 0 1 ) ，其中以3 + i 瓜组m d a 含量降低的最为显著。 4 大鼠舢后，i 瓜组n o 和i n o s 含量均明显高于s h 锄组( p o 0 1 ) ；与 i r 组相比，l + i 瓜、2 + i 瓜和3 + i 瓜各组n o 含量均明显增加( p o 0 5 o 0 1 ) ， 而i n o s 含量则明显降低( p o 0 5 o 0 1 ) 。 5 大鼠删后，i r 组e t 含量明显高于s h 锄组( p o 0 1 ) ；与i r 组相比， 1 + 非、2 + 班l 和3 + 汰各组e t 含量则显著减低( p o 0 5 o 0 1 ) ，其中以3 + i 瓜 组降低的最为显著。 6 大鼠删后，肾组织h o 1 免疫组化显示：s h a m 组肾小管上皮细胞内 h o 1 表达不明显，i 瓜组肾小管上皮细胞内h o 1 表达较s h 锄组明显增加， 与i r 组相比，1 + i 瓜、2 + 根和3 + 胀各组肾小管上皮细胞内h o 1 表达均明 显增加，其中以3 + i r 组h o 1 表达增加的最为明显。 结论： 1 删后，肾功能和肾小管上皮细胞明显受损。删大鼠b u n 、s c r 、 m d a 、i n o s 含量均较s h 锄组明显增加，s o d 活力则较s h a m 组明显降低， 肾组织e t 含量明显增加，肾小管上皮细胞内h o 1 免疫反应阳性颗粒表达 增加。 2 短暂反复i p c 可显著减轻r i 瓜i 大鼠肾组织损伤，降低b u n 、s c r 和m d a 含量，增加肾组织s o d 活力。表明短暂反复i p c 可以减轻删大鼠肾组织 损伤，改善肾功能。 中文摘要 3 短暂反复i p c 能明显降低肾组织i n o s 含量，增加n o 含量，降低肾组织e t 含量，增加肾小管上皮细胞内h o 1 免疫反应阳性颗粒的表达。表明短暂 反复i p c 减轻删大鼠肾组织损伤的机制可能与增加n o 含量、降低e t 含 量以及上调肾脏h o 1 的表达有关。 关键词：肾脏；缺血再灌注损伤；缺血预处理；e t ；h o 1 英文摘要 一一一一- _ _ - _ _ _ _ _ 一 s t u d yo fp r o t e c t i v ee f f e c to f b r i e fa n dr e p e a t e di s c h e m i c p r e c o n d i t i o n i n g o nr e n a li s c h e m i a r e p e r f u s i o ni i i j u r yi nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e ： r e n a li s c h e m i a - r e p e m l s i o n 埘u 巧( 删) i sac o m m o n p a t h o p h y s i o l o g i c p h e n o m e n o n a n di ti sa c o m p l e x a n d i m p o r t 姐t d a t h 0 - p r o c e s s w i mm a n yf a c t o r s洫 a c u t ei s c h e m i a蝎u i s c h e m i c p r e c o n d i t i o l l i n g ( i p c ) r e f ；e r st 0m et i s s u e sa n do 唱a n si i l e x t e n d e di s c h e m i a c a ng e tp r o t e c t i o na f t e rb r i e f 觚dr 印e a t e di s c h e m i a ，s om a t t or e d l l c ei s c h e m i c 蛐u r y s o m es t u d ys h o wt t l a ti p ch a sap r o t e c t i v ee 肫c to nc 删i a c ，l i v e r ， s m a u 证t e s t h l e ，a l l dm a i l y o t h e r o 晤a n sb u t “sm e c h 姐i s m i sn o t 血l l y u n d e r s t o o d h o w e v w h 如e r 晰e fa n dr e p e a t e di p ch a s ap r o t e c t i v ee 毹c t o nl 己i r ji ss t i l lu m m o 、釉t h e r e f o r e ，t oe x p l o r eb r i e fa n dr 印e a t e di p co n r i 瓜i 甜l di t sm e c h 粕i s m ，t h ei u r jp r e v e n t i o ni so fg r e a ts i g n i f i c a 1 l c e t h e p r e s e n t 咖d y0 b s e r v e dm ep r o t e c t i v ee 骶c t sa i l de x p l o r e dm e c h a n i s m so f b r i e fa n dr e p e a t e di p co n 删t | 啪u 曲u s e o f p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n d i i i m m n n o m s t o l o g i c a lm e t h o d s m e t h o d ：f o 啊m a l es p r a g l l e d a w l c yr a t sw e i 曲通gb e _ 时e e nl5 0 9t 0 18 0 9w e r cd i v i d e dn o 如eg r o u p s 瑚d o l i l l ya r e r 似od a y sf e e d i l l g i 1 1 l8 2 2 l a b o r a t o ( i f 8o ne a c h 孵) u p ) ：( 1 ) 妣l m - o p e r 撕o ng r o u p ( s h a m ) ；( 2 ) i s c h e m i a r 印e m s i o ng r o u p r ) ；( 3 ) o n et i m e o ff 沁em i m i t e si s c h e m i c p r e c o n d i t i o n h l gg r o u p ( 1 + 诹) ；( 4 ) 觚ot i m e so ff i v em m t e si s c h e m i c p r e c o n d i t i o l l i i l gg r o u p ( 2 + i r ) ；( 5 ) n 鹏e 缸e so f 乱el n i n u t e s i s c h e m i c p r e c o n m t i o 血g 缪0 1 l p ( 3 + i r ) ；1 飞ea n i m a l sw e r ca n e s m e t i z e d w i t l l1 p e n t o b a r b i t a ls o d i u m ，也eb i l a t e r a lr e n a la r t e 搿a i l dv e i nw e r ec l 锄p e df o r4 5 l i l i n u t e sf o l l o w e db yr e n o wi ni i 己g r o u p t h er a t si i lm es h 锄g r o u pw e r e 骶a t e di d e n t i c a l l ye x c 印tf o rt l l ec l a n l p i i l g t h er a t si n 也el + i i t ，2 + 班a n d 3 + i 瓜删w e r ec l 锄叩e db i l a ：t e r a lr 吼a la r t e 巧a n dv e i 芏lf o r5m i n l i t e s 孤d r c f l o w e df o r5 m i m l t e s0 n et n e ，t 、ot i m ea l l dn l r e et i m er e s p e c t i v e l y ，a n d t l l a i l l eb i l a t e r a lr e n a la i t e d ra i l dv e i i lw e r ec l 锄p e df o r4 5m i r m t e sf o l l o w e d 英文摘要 b yr e f l o w2 4h o u r s a r e rr 印e r 如s i o n ，e a c h1 a y e ro p e n e do fa b d o m e nw a s c l o s e dw i t l ls u t u r e ，m c l u d i n gm e p e r i t o n e u m ，a b d o m i n a lw a l lm u s c l ea n ds k i l l a r e r2 4h o u r so fr 印e r 如s i o n ，t h eb l o o ds a m p l e sw e r et a l ( e nf o rd e t e c t i n g c o n t e n t so fs e m mc r e a t i n i i l e ( s c r ) ，b l o o du r e ai l i t r o g e n ( b 切d a r e rb l o o d w a st a k e n ，b o ms i d eo fb d n e yw e r ee x c i s e df o ro b s e n r i n gr e n a lh i s t o l o g i c a l e x 锄i n a t i o n ，t l l ec o n t e n to fm a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) ，a c t i v 时o fs u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) ， c o n t e i l to fn i t co x i d e ( n o ) ，i n d u c i b l en i t r i co x i d e s y i 曲a s e ( i n o s ) ，c o n t e n to fe t 1a n d 1 ee x p r e s s i o no fh o 1 r e s u i t s ： la f t e r 壬对，t l l er e n a lt i l b u l e 印i t h e l i a lc e l l ss h o w e ds i g i l so fd a m a g ei nl 恨 g r o u pr a t s ，e s p e c i a l l yp r o x i m a lc o n v o l u t e dt u b u l ei ni rg r o u pr a t s ，w h i c hm e l 啪e no ft u b u l ei se n l 甜g e e d ；a l s o 也e r ea r es o m ec a s ti i l m a n ym er e n a l t u b u l e s c b r o m a t i nw a si o c a l 娩e di l lm ec e l ln u c l e u sp e 邱h e r y t h ed e g r e eo f r e n a lt i s s u ei n j u 巧w e r es i g n i f i c a n t l ym i t i g a t e di i lm e1 + i r ，2 + i ra n d3 + i 瓜g r o u pr a t sc o m p a r e dw i m 豫g r o u pr a t s a m o n gt h e m ，3 + i rg r o u p 眺 w e r em em o s ts i g n i f i c a n t l ym i t i g a t e di i lt h ed e g r e eo fr e n a l t i s s u ei 1 1 j u 巧 2a r e r l u ，m ec o n t e n t so fs c ra 1 1 db u nw e r es i 弘i f i c a n t l yi n c r e a s e di i l 豫 乎o u pr a t sm a n m a to f s h a m 罂o u pr a t sa r e r2 4h o u r so fr e p e r m s i o n0 o o1 ) ； c o m p a r e dw i mm ei 瓜g r o u p sm t s ， c o i l t e n t so fs c ra n db u nw e r e s i 伊i f i c a n t l yl o w e rh l1 + i 】k2 + 己a n d3 + i 瓜g r 0 1 叩r a t s ( p o 0 5 o 0 1 ) a m o n gt l l e m ，t h el n o s ts i g n i f i c a l l t l yl o w e r o f s c ra i l db u nw a si n 也e3 + i r 静? o u pr a t s 3a r e r 删，a c t i v i t i e so fs o dw e r es i g n i f i c a i l t l yd e c r e a s e dq o o 1 ) a i l dm e c o n t e n t sm d aw e r es i 嘶f i c 觚t l y i 1 1 c r e a s e d ( p o o1 ) 通帐g r o l u pr a t s ； c o m p a r e dw i mi i 乏g r o u pr a t s ，m ea c t i v i t i e s o fs o dw e r es i g i l i f i c a n t l y i n c r e a s e d ( p o o1 ) a i l d 廿l ec o n t e n t so fm d a w e r es i g l l i f i c a i l _ t l yd e c r e a s e d ( p o 0 1 ) i l ll + i 瓜，2 + i 瓜a l l d3 + i 瓜g r o 印r a t sr e s p e c t i v e l y ( p o 0 5 o 0 1 ) 4 觚e r 则对，n oa n di n o sw e r cs i g i l i f i c 删ym r e a s e di i l 胀g r o u p 挑 m a l lt l l a to fs h 锄伊o u pr a t s ( p o 0 1 ) ；c o m p a r e dw i mm ei 瓜g r o u pr a t s ， c o n t e n t so fn ow e r es i g n i f i c a n t l yi i l c r e a s e dq o o1 ) a i l di n o sw e r e d e c r e a s e d ( p o 0 1 ) i i l1 + i 瓜，2 + 班己a 1 1 d3 + i 瓜g r 0 1 叩r a t sr e s p e c t i v e l y 5 英文摘要 ( p o 0 5 o 0 1 ) 5 舭rr j 脚，也ec o n t e n t so f e tw e r es i g n i f i c 锄l yi n c r e a s e dm 娘铲o u pr a t s t h a nm a to fs h a m 野o u pr a t s c o m p a r e dw i m 班己g r o u pr a t s ，t l l ec o n t e n t so f e tw e r es i g n i f i c 孤t l yd e c r e a s e di nl + 胀，2 + 汰a l l d3 + 胀g r o u pr a t s r e s p e c t i v e l y ( p o 0 5 o 0 1 ) 6a r e rr i 】灶，m ee x p r e s s i o no fh o 1w a ss i g n i f i c 舭t l yu p r a g u l a t e di ni r g r o u pr a t s c o m p a r e dw i t h 弧g r o u pr a t s ，m ee x p r e s s i o no fh 0 - 1w a s m a r k e d l yi n c r e a s e di i ll + i 瓜，2 + 胀a i l d3 + 倦g r o u pr a t sr e s p e c t i v e l y ( p o 0 5 o o1 ) b u t n oe x p r e s s i o n 试s h 锄g r o u pr a t s c o n c l u s i o n ： 1a f t e rr 【i u ，r e n a l 缸n c t i o ni ss i g n i f i c a n t l yd 撇a g e da n d 吐l er e n a lt u b u l e e p i m e l i a lc e l l ss h o w e ds i g i l sd 锄a g e i ti sf o u n d 也a ts c r ，b u n ，m d aa l l d i n o sa r ei n c r e a s e d ，也ea c t i v i 够o fs o di sd e c r e a s e d 协i ， r 萨o u pr a t s t h e c o n t e n t so f e ta l l dm ee x p r e s s i o no f h o 一1a r ei n c r e a s e di l l 倦跏r a t s 2b r i e fa n dr 印e a t e di p cc a nd e c r e a s et l l es c r ，b u n ，m d aa i l di n c r e a s e dm e a c t i v i 母o fs o d i ti s 砌i c a t e dt h a tb r i e fa n dr e p e a t e di p cc a l lr e d u c e d r e n a lt i s s u e 蝎u r y 觚di m p r o v e dr e n a l 缸n c t i o ni i lr i 瓜ir a t s 3b r i e fa n dr e p e a t e di p cc a j ld e c r e a s et l l ec o n t e n t so fi n o sa i l de t ，i i l c r e a u s e d m ec o n t e n t so fn o ，a i l dm i t i g a t e d 王己i 】阻i ti sa l s ou p r e g u l a t e de x p r e s s i o no f h o li nt l l et l 出u l e 印i m e l i a lc e l l s t h er e s u l t si i l d i c a t e dt 1 1 a tm ep r o t e c t i v e e 行e c t so fm e fa n dr 印e a t e di p ct o 嗍m a yb er e l a t e dt o 妣r e a s em e c o n t e n t so fn o ，r e d u c em ec o n t e n t so fe ta l l du p r e g u l a t e de x p r e s s i o no f h o 1i nt h er e n a lt i s s l l e k e yw o r d s ：r n a l ；i s c h e m i a - r e p e r 如t i o n蜘u 巧； i s c h e m i c p r e c o n d i t i o n 访g ；e t ；h o l 6 b u n s o d m d a n o n o s i n o s c g m p e t p d e b l o o du r e an i 们g e n s u p e r o x i d ed i s i l l u t a s e m a l o n a l d d d e n i t r i co x i d e n i t r i co x i d es t b a s e h l d u c i b l en i t r i co x i d es v n m a s e c y c l i cg u a n o s i i l em o n o p h o s p h a t e e n d o m e l i i l p h o s p h o d i e s t e r a s e n ) 肾缺血再灌注损伤 缺血再灌注 缺血预处理 血红素氧合酶1 氧自由基 血清肌酐 血尿素氮 超氧化物歧化酶 丙二醛 一氧化氮 一氧化氮合酶 诱生型一氧化氮合酶 环磷酸鸟苷 内皮素 磷酸二酯酶 7 研究论文 短暂反复缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护 作用及其机制研究 - k 刖吾 缺血预处理也称缺血预适应( i s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i i l g ，i p c ) ，其概 念的提出最早来源于心肌缺血的研究，研究发现，心肌遭受一次或几次反 复的短暂缺血再灌注后，表达出一种对随后而来的长时间缺血损伤抵抗能 力的增强。动物实验中短暂反复结扎犬的冠状动脉左旋支后，心肌梗死范 围比一次结扎该动脉左旋支4 0 m i n 减少了7 5 n 。此后，许多学者对此进 行了大量的实验研究，他们指出i p c 具有比任何保护性药物都强的心肌保 护作用，是组织细胞对抗缺血再灌注( i s c h e m i ar 印e 向s i o n ，i 瓜) 损伤 最有效的内源性自身保护机制晗1 。1 9 9 3 年y e l l o n 等首次将i p c 用于体外循 环下冠状旁路移植术( c a g b ) 中，发现i p c 能明显对抗心肌a t p 含量的下降， 加速心脏功能的恢复，从而首次证明了i p c 对人类缺血心脏具有保护作用。 后续研究发现i p c 不仅可以保护缺血再灌注损伤的心肌，也可以保护肝脏、 小肠和肺等组织器官的i r 损伤。因此，i p c 对重要器官的保护作用日益受 到人们的关注。i p c 对i r 损伤的保护作用在时间上分为两个阶段，早期保 护作用产生在预缺血后3h 内，而延迟保护作用则产生在预缺血后2 4 7 2h 之间，但其确切的保护机制目前尚未完全阐明， 肾缺血再灌注损伤( r e i l a li s c h 锄i ar 印e r f i l s i o n 埘u 埘砒) 是急性肾 功能衰竭( a c u t er e n a lf a i l u r e ，触心) 的重要损伤环节。a r f 是临床常见危 重病症，预后险恶，死亡率极高，但如能采取及时有效的预防措施，a r f 也是极少数能够逆转的危重病症之一。尽管国内外诸多学者在r i r i 的 发病机制及防治方面做了大量的研究工作，但有关短暂反复i p c 对r i r i 的作用却鲜有报道。本研究旨在观察短暂反复i p c 对大鼠r i r i 的作用并探 讨其作用机制，为r i r i 的防治提供一定的实验依据。 研究论文 材料与方法 剂 北京博奥森生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 酶一1 热休克蛋白北京博奥森生物技术有限公司 剂盒 试剂盒 考马斯亮兰试剂盒 一氧化氮试剂盒 超氧化物歧化酶试剂盒 丙二醛试剂盒 一氧化氮合酶试剂盒 中性树胶 内皮素e t 放免试剂盒 1 2 仪器 h w l 电热恒温水温箱 l x j _ i i 离心机 g p r 低温低速离心机 e w 一3 0 0 0 a 电子天平 7 2 1 分光光度计 s n 一61 0 5y 放射免疫计数器 p m 一1 0 a 光学显微镜 超低温冰箱 水浴振荡器 电热保温干燥箱 切片机a s 一3 2 5 北京博奥森生物技术有限公司 南京建成生物制品公司 南京建成生物制品公司 南京建成生物制品公司 南京建成生物制品公司 南京建成生物制品公司 南京建成生物制品公司 南京建成生物制品公司 北京博奥森生物技术有限公司 北京普尔生物技术有限公司 北京医疗设备厂 上海医用仪器分析厂 美国b e c l 【i i l a n 公司 沈阳天平仪器厂 北京第三分析仪器厂 上海日环光电仪器有限公司 日本o l y m p u s 日本三洋公司 哈尔滨东联电子有限公司 重庆实验设备厂 英国姗顿公司， 研究论文 1 3 主要溶液的配制 1 3 1o 3 t r i t o n 工作液 3 0 t r i t o n 工作液o 3 m l 加入p h = 7 4p b s9 9 7 m 1 稀释到o 3 。 于4 保存。 1 3 2o 1 m 1 冻干粉h o l 抗体稀释液 取o 1 m lt r i t o n 工作液加入到冻干粉抗体中混匀，得到o 1 m 1 抗 体的浓缩液，同时再加入p h = 7 4 p b s 溶液稀释，于4 保存。 1 3 3 o o lmp b s ( p h 7 4 ) o 2n a h 2 p 0 49 5m 1 ，o 2n a 2 h p 0 44 0 5m l ，n a c l8 7 g ，力口水 至1 0 0 0m 1 。 1 3 43 去离子水 甲醇1 8 0m 1 加入3 0 过氧化氢液2 0 m 1 于4 保存。 1 3 5o 0 1 柠檬酸钠液 柠檬酸三钠3 9 加入柠檬酸o 4 9 再加入蒸馏水l o o o m l 即可。 1 3 6 考马斯亮蓝染色液 o 2g 考马斯亮蓝p 2 5 0 ，甲醇9 0m 1 ，冰醋酸2 0m l ，蒸馏水9 0 m l 至2 0 0m l ，4 保存。 1 3 7 考马斯亮蓝洗脱液 甲醛5 0m l ，冰醋酸5 0m 1 ，加蒸馏水至5 0 0m 1 ，4 保存。 1 3 87 0 乙醇液 7 0 乙醇7 0m 1 加入蒸馏水3 0 m l 既可。? 1 3 94 甲醛液 a ：1 0 0 0 m l 蒸馏水加入5 8 0 9 9 氢二钠再加入5 9 3 9 二氢钠，放入 广口瓶内摇匀。b ：6 0 9 多聚甲醛加入7 5 0 9 蒸馏水加热到沸腾后加入一 片氢氧化钠溶解后，冷却然后滤纸过滤。从a 中取7 5 0 m l ，再从b 中取 7 5 0 m 1 混合，即为4 甲醛液。 1 4 实验动物 成年健康雄性s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠4 0 只，体重1 5 0 1 8 0 9 ， 由河北省实验动物中心提供。 2 实验方法 2 1 实验分组 l o 研究论文 在1 8 2 2 实验室安静饲养两日后动物随机分为5 组( n = 8 ) ： 1 1 假手术组( s h a m ) 1 2 缺血再灌注组( i r ) 1 3 五分钟缺血预处理一次+ 缺血再灌注组( 1 + i r ) 1 4 五分钟缺血预处理二次+ 缺血再灌注组( 2 + i r ) 1 5 五分钟缺血预处理三次+ 缺血再灌注组( 3 + i r ) 2 实验程序 动物经l 戊巴妥钠腹腔麻醉，开腹，暴露双侧肾动、静脉，i r 组 闭双侧肾动、静脉4 5 分钟后松夹再灌；s h 锄只开腹不夹闭双侧肾动、 脉；1 + i r 组夹闭双侧肾动、静脉缺血五分钟再灌五分钟后，夹闭双侧 动、静脉4 5m i n 后松夹再灌；2 + i r 组反复夹闭双侧肾动、静脉缺血 分钟再灌五分钟两次后，夹闭双侧肾动、静脉4 5m i n 后松夹再灌；3 + i r 反复夹闭双侧肾动、静脉缺血五分钟，再灌五分钟三次后，夹闭双侧肾 、静脉4 5 分钟后松夹再灌。再灌后逐层缝合腹膜，腹壁肌肉和皮肤。 灌后2 4 小时取血及双侧肾脏，测定血清肌酐( s c r ) 、尿素氮( b u n ) 、 肾组织丙二醛( m d a ) 、一氧化氮( n o ) 、一氧化氮合酶( i n o s ) 、超氧 化物歧化酶( s o d ) 。放射免疫检测肾组织e t 含量，免疫组化观察肾组 织h o 1 的表达。留取相同部位肾组织观察病理形态学变化。 2 3 生化学检测 2 3 1s c r 测定( 苦味酸法) 原理：采用c r e a t i n i n er e a g e n tk i t ，应用s c r 测定试剂盒检测再灌 后2 4 小时s c r 含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。 2 3 2b u n 含量测定( o p a 法) 原理：在酸性环境下，其尿素在催化剂的作用下，与显色剂反应，底 物生成蓝色化合物，尿素含量与其颜色的深浅成正比，在5 l o n l l l 比色测定， 即可计算b u n 含量。严格按照试剂盒说明书进行操作。 2 4 肾组织匀浆制备 过程：制备肾组织匀浆前先除去肾组织血液，再用滤纸吸干，再用电 子称准确称重。将干净、干燥的匀浆管放置于冰水混合物中，再将肾组织 块放于匀浆管壶腹部，再用小剪刀或玻璃棒尽快的将肾组织捣碎，然后按 l ：9 ( w ) 比例加入冰生理盐水，将肾组织充分匀浆后，再将匀浆移入 2 4 4 肾组织s o d 活性测定( 黄嘌呤氧化酶法) 原理：就是通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由 基( 0 2 ) ，再氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用 可见分光光度计测其吸光度。当被测样品中含有s o d 时，则对超氧阴离子 自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色是测定管的吸 光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的s o d 活力。测定具体方法按试剂盒说明书进行。 2 4 5 肾组织i n o s 测定 原理：n o s 催化l 雄与分子氧反应生成n o ，n o 与亲和性物质生 成有色化合物，在5 3 0 n m 波长下测定吸光度，根据吸光度的大小计算出 i n o s 活性。严格按照试剂盒说明书进行操作。 2 5 组织标本的处理 2 5 1 艇染色病理切片的制备 过程：取各组大鼠同一部位肾脏，再用1 0 福尔马林固定，之后用不 同浓度乙醇脱水，再用石蜡包埋肾组织，连续用切片机切片8 一l o 张断面 研究论文 ( 厚约4pm ) ，然后放入水浴箱中展片，待肾组织充分舒展后，再用 片捞取肾组织。按以下步骤染色： 步骤：二甲苯脱蜡一不同浓度酒精水化一自来水洗卜2m i n 一苏木精 染色5 8m i n 一自来水洗3 5m i n 一1 盐酸酒精2 0 一3 0s 一自来水洗3 5 m i n 1 氨水2 0 一3 0s 一自来水洗4 8m i n 一伊红染色卜2m i n 一不同浓度 酒精脱水一二甲苯透明一中性树胶封片一光镜下观察肾脏病理变化 2 5 2 肾组织e t 测定( 放射免疫法) 原理：利用液相竞争抑制原理，采用非平衡法对样品进行测定。先将 待测样品或标准与限量的抗血清加在一起反应一段时间后，再加入标记抗 原进行竞争性结合反应，反应完全后，加入免役分离剂，分离出抗原一抗 体复合物的放射性( b ) ，计算各标准管的结合率( b b o ) 。作出标准曲 线，查出样品浓度。按试剂盒操作。 2 5 3 肾组织h o 1 表达( 免疫组化) 采用s a b c 法对肾组织石蜡切片进行免疫组织化学染色，染色程序按 s a b c 法操作常规行肾组织石蜡切片，切片厚4um ，操作按试剂盒说明书 进行。具体步骤如下： 过程：石蜡切片一蒸馏水和p b s 各冲洗5 m i n 一3 的h 。0 2 室温孵育 1 0 m i n 灭活内源性过氧化物酶_ p b s 冲洗5 m i n l o 的正常山羊血清3 7 封闭3 0 m i n 一滴加l ：5 0 稀释的一抗，4 过夜一p b s 冲洗5 m i n 3 次一 滴加1 ：1 0 0 稀释的二抗，3 7 孵育3 0 m i n p b s 冲洗5 m i n 3 次一辣根过 氧化物酶标记的链酶卵白素，3 7 孵育3 0 m i n p b s 冲洗5 m i n 3 次一d a b 显色一蒸馏水冲洗，终止显色一苏木素复染一梯度脱水，二甲苯透明，中 性树胶封片 h o 1 表达：肾小管细胞胞浆和髓质的集合管细胞胞浆及髓袢的上皮 细胞内呈棕黄色颗粒者为h o 1 表达阳性，不着色者为阴性。 2 6 统计学处理 各组实验数据以均数标准差( x s ) 表示，采用s p s s1 3 o 统计 软件进行方差分析和t 检验。以p 0 0 5 表示有差异，以p o o l 表示有 显著性差异。 研究论文 结果 1 短暂反复i p c 对大鼠肾组织形态学变化的影响 肉眼观：s h 锄组，肾组织色泽正常，外观无水肿；i 瓜组肾脏肿涨， 表面有出血点，肾皮质颜色苍白，髓质淤血。与淑组相比，1 + 倦、2 + i 瓜 和3 + i r 组肾脏肿胀和淤血程度依次减轻。 光镜下，s h 锄肾组织无明显异常；i 瓜组2 4h 再灌后肾脏组织损伤明 显加重，主要表现为肾小管上皮细胞浑浊肿胀、坏死、肾小管管腔明显扩 张，出现空泡，间质变宽、水肿、有大量炎细胞侵润。1 + 昧组、2 + 根 和3 + i 瓜组肾小管管腔扩张较汰组依次减小，间质较i r 组依次变窄，炎 细胞依次变少，水肿依次减轻，空泡明显减轻。其中以3 + i r 组损伤减轻 的程度最为明显。 ( f i g 1 ) 。 2 短暂反复i p c 对大鼠b u n 和s c r 的影响 i 瓜组大鼠肾功能明显受损，2 4 小时再灌后b u n 和s c r 均显著高于 s h a m 组( 尸 o 0 1 ) 。与i 瓜组相比，l + l 瓜组、2 + i 瓜和3 + i 瓜组b u n 和 s c r 均逐次显著减低( p o 0 5 o 0 1 ) 。( t a b 1 ，f i g 2 ) 。 3 短暂反复i p c 对大鼠肾组织s o d 活性的影响 恻后，倦组s o d 活性较s h 锄组显著降低( p o 0 1 ) ：与豫 组相比，1 + i 瓜组、2 + 豫和3 + 根组s o d 活性均明显增加( 尸 o 0 5 o 0 1 ) ， 其中以3 + i r 组s o d 活性增加的最为明显。( t a b 2 ，f 培3 ) 。 4 短暂反复i p c 对大鼠肾组织m d a 含量的影响 r i 瓜i 后，胀组m d a 含量较s h 锄组明显升高( p o 0 1 ) ；与垛组 相比，l + i r 组、2 + i r 和3 + i r 组肋a 含量均明显降低( p o 0 5 o 0 1 ) ， 其中以3 + i r 组降低的最为明显。( t a b 2 ，f 喀3 ) 。 5 短暂反复i p c 对大鼠肾组l ； n o 及i n o s 含量影响 r i r i 后，豫组n o 及i n o s 含量与s h 锄组相比均明显增加( p o 0 1 ) 。l + i r 组、2 + i r 和3 + i r 组n o 含量与i r 组相比均逐次增加( p o 0 5 o 0 1 ) ；i n o s 含量则比诹组逐次下降( p o 0 5 o 0 1 ) 。( t a b 3 ， f i g 4 ) 。 6 短暂反复i p c 对大鼠肾组织e t 含量的影响 研究论文 ，肾组织e t 放射