（发酵工程专业论文）木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及其特异性抗体的制备.pdf

摘要摘要术瓜凝乳蛋白酶( c h y m o p a p a i n ) 是番术瓜乳汁中的一种半胱氨酸蛋白酶，员有凝瓤和蛋囱水解能力。其最主要的用途是治疗鼷椎间擞突出癜，此外还可用于r hm 蓬的鉴定、肿瘸的辅渤治疗、消炎、细胞分离以及睥酒的澄清和奶酪的制造等。由予番木瓜乳汁中的几种半虢氨酸蛋自酶具有相似的缩构、性质和底物特异性，木瓜凝乳蛋白酶的特异性检测和高纯度分离纯化都存在一定的困难。为了更好地迸孳亍本瓜凝乳蛋自酶的检测释分离纯化，本课题进行了该酶多克隆抗体和单克隆抗体的制备研究。鬟s i g m a 公司的本瓜凝巍蛋自酶免疫薪话兰大耳兔，经检测达到理想效价看，收集血液，分离抗血清。采用免疫双扩散法对抗血清的特异性进行分析，结果表明，抗敷清中除了含有本瓜凝氍蛋白酶的抗体羚，还含有少最木瓜蚕白酶的抗体。先将抗血清用木瓜蛋白酶中和，褥用免疫双扩散和免疫印迹法进行特异性分毒厅，缝巢表臻，中秘爱静抗盎清不髯含有本瓜蛋自酶魏抗体，是本鹰凝乳蛋鑫酶的特异性抗血清。e l i s a 法测得其效价为1 0 。特异性抗血清能检测重组木瓜凝乳蛋叁酶。抗m 清与抗原的免疫双扩散实验融表明购自s i g m a 公司的木瓜凝乳蛋白酶并非纯酶。为了制冬特异性单克隆获钵，需分离裹纯度懿本暴凝乳蛋鑫酶。在进行木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化前，本课题先进行了层析介质和洗脱缓冲波懿选撵。逶过淡脱效果於毙较，选择m a c r o p r e p 鼍l i g hss u p p o r t 俸星掇介质，p h 5 0 的醋酸钠缓冲液作洗脱缓冲液。先经( n h 4 ) 2 s 0 4 盐柝，从本瓜蛋白酶炭合酶中获得木瓜凝乳蛋白酶粗酶，再经两次离子交换层析，分离得到木瓜凝乳蛋白酶。采用s d s p a g e 电泳和免疫双扩散分孝斤其纯度，结果表明，分离的本瓜凝乳蛋黩薅是麓纯度黪，达到了制螯单克隆抗体的标准。用分离纯化的木瓜凝乳蛋囱酶制备单克隧抗体。待免疫的b a l b c 小鼠的虫清达至9 毽想效价后，取其脾细胞与骨黼瘤细胞s p 2 o 相融合，再经过3 次皿克隆，筛选得到3 株阳性杂交瘸细胞。双抗夹心e l i s a 的结果表明，单抗嗣多抗都是本瓜凝乳蛋臼酶的抗体；间接e l i s a 韵结果表蹋，单抗不和木瓜蛋自酶反应，对术瓜凝乳蛋白酶有较高的特异性。关键词术瓜凝乳蛋白酶；多克隆抗体；分离纯化；单克隆抗体a b s t r a c tc h y m o p a p a i ni so n eo fc y s t e i n ep r o t e i n a s e sf o u n di nt h el a t e xo fc a r i c ap a p a y a ，w h i c hh a sm i l kc l o t t i n ga n dp r o t e o l y t i ca c t i v i t i e s c h y m o p a p a i nh a sw i d ea p p l i c a t i o n s ，s u c ha st h e r a p yo fl u m b a rd i s cp r o t u s i o n ，i d e n t i f i c a t i o no fr hb l o o dt y p e ，a c c e s s o r yt h e r a p yo fc a n c e r ，t r e a t m e n to fi n f l a m m a t o r yd i s e a s e ，c e l ls e p a r a t i o n ，b e e rc l a r i 6 c a t i o na n dc h e e s em a n u f a c t u r e a st h es e v e r a lc y s t e i n ep r o t e i n a s e si nt h el a t e xo fc a r i c ap a p a y ah a v er e s e m b l es t r u c t u r e ，c h a r a c t e r sa n ds p e c i f i c i t yo fs u b s t r a t e ，i ti sd i f f i c u l tt os p e c i f i c a l l yd e t e r m i n ea n dp u r e l ys e p a r a t ec h y m o p a p a i n i no r d e rt od e t e r m i n ea n ds e p a r a t ec h y m o p a p a i nm o r ec o n v e n i e n t l y ，w ep r e p a r e dt h ep o l y c l o n a la n t i b o d ya n dm o n o c l o n a la n t i b o d yo fc h y m o p a p a i n n e wz e a lr a b b i t sw e r ei m m u n i z e dw i t hc h y m o p a p a i no fs i g m a b l o o dw a sc o l l e c t e da n da n t i s e r u mw a ss e p a r a t e dw h e ns e r u mg o tp e r f e c tt i t r e d o u b l ei m m u n o d i f f u s i o nt e s tw a su s e dt oi d e n t i f yt h es p e c i f i c i t yo fa n t i s e r u m ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e r ei sal i t t l ea n t i b o d yo fp a p a i ni na n t i s e r u mi na d d i t i o nt ot h a to fc h y m o p a p a i n ，a f t e rc o u n t e r a c t e dw i t hp a p a i n ，a n t i s e r u mw a si d e n t i f i e db yd o u b l ei m m u n o d i f f u s i o nt e s t t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e r ei sn oa n t i b o d yo fp a p a i ni nt h ea n t i s e r u ma n dt h ea n t i s e r u mi ss p e c i f i ct oc h y m o p a p a i n t h et i t r eo fc o u n t e r a c t e da n t i s e r u mi s10 g o tf r o me l i s a t h es p e c i f i ca n t i r e s u mo fc h y m o p a p a i nc a nd e t e c tt h ee x i s t e n c eo fr e c o m b i n ee h y m o p a p a i n i tw a sp r o v e dt h a tc h y m o p a p a i no fs i g m ai si m p u r eb yt h ed o u b l ei m m u n o d i f f u s i o nt e s to fa n t i s e r u ma n da n t i g e ni nt h ep r o c e s so fp r e p a r i n ga n t i s e r u m ，s oi ti sn e c e s s a r yt os e p a r a t ep u r ec h y m o p a p a i nt op r e p a r em o n o c l o n a la n t i b o d y b e f o r et h es e p a r a t i o no fc h y m o p a p a i n ，w em a d et h es e l e c t i o no fe x c h a n g em e d i u ma n de l u t i n gb u f f e r b yc o m p a r i n gt h ee l u t i o ne f f e c t ，w es e l e c t e dm a c r o p r e ph i g hss u p p o r ta se x c h a n g em e d i u ma n dp h 5 0s o d i u ma c e t a t eb u f f e ra se l u t i n gb u f f e r a tf i r s t ，( n h 4 ) 2 s 0 4w a su s e dt os a l to u tc r u d ec h y m o p a p a i n a f t e rt w ot i m e so fi o ne x c h a n g e s ，c h y m o p a p a i nw a sg o t t e n s d s p a g ea n dd o u b l ei m m u n o d i f f u s i o nt e s tw e r eu s e dt oa n a l y s et h ep u r i t yo fc h y m o p a p a i n ，w h i c hi n d i c a t e dt h es e p a r a t e dc h y m o p a p a i ni sp u r ee n o u g ht op r e p a r em o n o c l o n a la n t i b o d y t h em o n o c l o n a la n t i b o d yw a sp r e p a r e dw i t ht h es e p a r a t e dc h y m o p a p a i n t h ei i摘要s p l e n i cc e l l so fb a l b cm i c ew e r ef u s e dw i t ht u m o u rc e l ls p 2 0w h e ni t ss e r u mg o tp e r f e c tt i t r e a f t e rt h r e et i m e so fs u b c l o n i n g ，t h r e em a s c u l i n eh y b r i d o m aw e r ed e t e r m i n e d i tw a sp r o v e db ye l i s at h a tb o t hp o l y c l o n a la n t i b o d ya n dm o n o c l o n a la n t i b o d ya r ea n t i b o d yo fc h y m o p a p a i n ，a n dt h a tm o n o c l o n a la n t i b o d y ，w h i c hi ss p e c i f i ct oc h y m o a p a i n ，d o n tr e a c tw i t hp a p a i n k e y w o r d ：c h y m o p a p a i n ，p o l y c l o n a la n t i b o d y , p u r i f i c a t i o n ，m o n o c l o n a la n t i b o d yi i i华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：乏兼现日期：卅。弓年厂月占日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密囱。( 请在以上相应方框内打“4 ”)作者签名：谦豸日期：伽。弓年，月占日导师签名：l 釜螂日期：年月日第一章绪论第一章绪论 。 器本黧秘本滚蛋自酶复合酶本瓜凝乳爨自酶是蚕木瓜乳汁中的一种半胱氮酸蛋自酶，在木瓜蛋岛酶复合酶中肖较高的含量，和复合酶中其德三种半胱氨酸强白酶凝有相似的结构和性璇。为了受全面、系统地介绍木瓜凝乳骚自酶，本论文先介绍一下番术瓜、本瓜蛋囊酶复合酶和其他几种半胱氨酸蛋白酶。1 ， 。l 番木瓜番木瓜魑器木瓜科植物番木瓜( c a r i e a p a p a y l ) 的果实，盛产于高温潮湿熬热带秘亚热豢建区。在我瓣，番本燕分蠢广，别名多，懿广嚣、广系、云素、福建和台湾等地均有栽培，又名石瓜、万寿果、乳瓜、番瓜、木东瓜等眦，3 1 。鸯本瓜藿棼丰塞，成熟瓣本瓜怒色、蛰、嗦蝣佳戆承巢，其窍“岭瘫票王”之称；未成熟的番木瓜既可以作蔬菜，又可以作药用。近代药学耱l 瞄庆褥究表明，番本瓜性平、昧苗、无毒，具鸯瀵食健霹、滋$ b催乳、舒筋通络、驱胀、强心和消肿之功效，可用于治疗脾胃虚弱、食欲不振、乳汁稀少、风澡关节疼痛、肢体麻本和十二指肠溃疡等疾病 1 卫】。从番木瓜中提取的蛋自酶可助器白消化，并可弓 起缀织胺释放，娥长凝曲l 时间 4 1 。从番木瓜中提取一种生物碱，具有抗癌作用，将其注入瘿组织，能使癌肿明显缩小5 1 。番木瓜经酵母发酵可潮成一种天然健康食晶补充剂b i o o n o r m a l i z e r ( b n ) ，b n 舆有清除自由基、抗脂质过氧化作用，对缺觚性脑梗塞和衰老所产生的氧化损害具有保护作用嘲。在我国，特别是岭南地区，番术瓜资源极其丰富。但其资源调查还仅限于谯狡、嚣微及瑾化指标，即使在这凡个方面，研究落不多，从面限铡了番术瓜韵进一步开发。建立一种新的、准确的撩定番木瓜的方法，对大规模开展番木瓜的资源谲套有着投蒺重要静终霜。1 。1 2 木瓜蛋白酶复合酶在番木瓜树的果实、树干、根和种子等部位广泛存在着木瓜缀白酶擞，其中果实浆滚中的含量最为丰室；随着骜木娠鲍成熟，嶷色浆滚越来越少，羧毖一般从未成熟番木瓜中收集乳汁，制备术瓜蛋白酶复合酶阶】。收集未成熟番木瓜的自色浆液，调p h 至9 0 ，蹇去不漆性甥质，秀经酸酸铵赫析和蘑结晶，得到木瓜蛋融酶粗酶，即木瓜蛋白酶复合酶1 1 。术瓜蛋自酶粗酶华南理工大学工学硕士学位论文为白色或乳白色的粉末，具有刺激性气味。目前已发现，木瓜蛋白酶复合酶中有四种半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶( p a p a i ne c3 4 2 2 2 1 、木瓜凝乳蛋白酶( c h y m o p a p a i n ，e c3 4 2 2 6 ) 、甘氨酰肽链内切酶( g l y c y le n d o p e p t i d a s e ，e c3 4 2 2 2 5 ) 和木瓜蛋白酶q ( c a r i c a i n ，e c3 4 2 2 3 0 ) 【8 】。此外，复合酶中还含有大量的溶菌酶( l y s o z y m e ，e c3 2 1 1 7 ) 9 1 。现在，绝大多数领域广泛使用的木瓜蛋白酶是指木瓜蛋白酶粗品。精制纯化的木瓜蛋白酶因其价格高，对大多数要求不高的工业用途来说并没有多大意义，只有在医药工业中才得到少量使用。食品工业是木瓜蛋白酶使用量最大的领域之一。如在啤酒生产中，加入木瓜蛋白酶，能改善口感，提高啤酒的品质，延长啤酒的有效储存期【l 。在肉类加工中，木瓜蛋白酶是最好的肉类嫩化剂。用木瓜蛋白酶处理过的肉片嫩香可口，而且还可提高人对肉类蛋白的吸收能力，增加营养。在美国，几乎全部的木瓜蛋白酶用于肉类的加工；在法国，大约一半的木瓜蛋白酶用于鱼类的加工。此外，在饼干生产中加入适量的木瓜蛋白酶，能使生产的饼干更加薄脆。在日化工业中，木瓜蛋自酶可用于生产含酶化妆品和含酶牙膏。特别是用木瓜蛋白酶制成的一种减肥香皂，在目前国内市场上非常畅销，它能增强和改善皮肤表皮细胞的新陈代谢，使皮肤具有良好的弹性【3 。木瓜蛋白酶在医药上可用作驱除肠内寄生虫的药物；还可用来处理坏死组织、消炎、止痛和治疗湿疹等u l “。此外木瓜蛋白酶复合酶还可用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业。在国外，木瓜蛋白酶已被广泛应用于食品、化工、酒类酿造等生产工艺中。但在我国，木瓜蛋白酶的应用基础研究还很少，应用范围还很窄，而且利用率低，造成木瓜蛋白酶资源的极大浪费。目前，将木瓜蛋白酶用作啤酒澄清剂和洗涤剂的开发研究正越来越受到重视。1 1 3 四种半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶复合酶中的四种半胱氨酸蛋白酶同属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶家族( p a p a i nf a m i l y ) ，具有相似的结构和性质( 见表1 1 ) 。四神半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有很赢的同源性，甘氨酰肽内切酶与木瓜凝乳蛋白酶的同源性最高，达7 0 【1 2 1 ；木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶q 与木瓜凝乳蛋白酶的同源性也分别达到5 8 和6 7 ；这四种酶相同的氨基酸序列多位于肽链的n 端和c 端。活性部位、与活性相关的氨基酸残基以及参与二硫键结合的c v s三者的相似使四种酶形成了全局性的结构相似f ”】。研究表明，木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶q 三种酶具有较宽的底物特异性，而甘氨酰肽链内切酶只能切割甘氨酰肽键，对偶氮酪蛋白、第一章绪论b z a r g n h p h n 0 2 和其他木瓜蛋白酶类的合成底物均无活性，对蛋白质的活性也很有限。这主要是因为，其他三种酶的s 1 特异性口袋中高度保守性的g l y l5 6 和g l y l 9 8 ，在甘氨酰肽链内切酶中被g l u 和a r g 置换。此外，此酶对鸡蛋源的抑半胱氨酸蛋白酶的蛋白不敏感，这在植物半胱氨酸蛋白酶中是唯一的1 1 4 - 1 6 1 。由四种酶的等电点可以验证，最容易从木瓜蛋白酶复合酶中分离的是木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶q ，最难分离的是甘氨酰肽链内切酶。由于甘氨酰肽链内切酶常和木瓜凝乳蛋白酶中混杂在一起，而且具有较窄的底物特异性，所以在很长一段时间内被认为是木瓜凝乳蛋白酶的一个亚型，在众多研究中被忽视 1 7 】。表卜l 四种半胱氨酸蛋白酶的比较t a b l e l 一1c o m p a r i s o no ff o u rc y s t e i n ep r o t e ir l a s e s木瓜蛋白酶木瓜凝乳木瓜蛋白酶qg l y c y l量自堕! 竺塑! ! ! i 望! 里鱼! 望! 旦堕! ! ! !系统命名e c 3 4 2 2 2e c 3 4 2 2 6e c 3 4 2 2 3 0e c 3 4 2 2 2 5氨基酸个数2 1 2氨基酸同源性+5 8 等电点 18 , 1 9 】活性巯基数目( m o l m 0 1 分子)占乳汁中可溶蛋白的百分l l 2 0 19 5 515 2 1 8 或2 2 72 1 616 7 1 0 1 1 0 61 1 4214 5 2 0 测得x 衍射结构时间旧2 1 ，2 2 1 ( 年) 1 9 6 21 9 9 61 9 9 11 9 9 5+ 与木瓜凝乳蛋白酶相比木瓜蛋白酶，是四种酶中最早被发现和研究的一种酶，1 9 6 2 年d r e n t h 等就测得了木瓜蛋白酶的x 一衍射结构。在木瓜凝乳蛋白酶的结构性质研究中，一般以此酶作为参照。但国内的文献和商品用名中的“木瓜蛋白酶”一般是指从番木瓜乳汁中提取的木瓜蛋白酶复合酶。尽管木瓜凝乳蛋白酶是番木瓜乳汁中含量最高、药用价值最大的一种酶，但由于其类型复杂，是四种半胱氨酸蛋白酶中最后一种获得x 衍射的酶。有关木瓜64甜加m，列华南理工大学工学硕士学位论文凝乳蛋白酶的结构、性质和应用等，下面将作详细介绍。1 2 木瓜凝乳蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶是j a n s e n 等【2 3 】于1 9 4 1 年首先发现，并根据其凝乳能力与蛋白水解能力之比是木瓜蛋白酶的二倍的特点而命名的。该酶最主要的用途是治疗腰椎间盘突出症，此外，还可用于r h 血型的鉴定、辅助肿瘤治疗、消炎、啤酒澄清和奶酪制造等方面 2 4 , 2 5 】。1 2 1 木瓜凝乳蛋白酶的分类1 9 6 7 年，k u n i m i t s u 等 2 6 , 2 7 1 用离子交换柱分离木瓜凝乳蛋白酶时，根据洗脱的先后顺序把木瓜凝乳蛋白酶分为两类一a 类和b 类。这两种类型具有同样的免疫学性质和相似的氨基酸序列，都有一个必需和一个非必需硫醇基团，但是二者的双质子态反应和酯底物是不同的2 8 3 1 】。b 类与双质子态探针反应的二级速度常数k 与p h 的关系曲线与其他半胱氨酸蛋白酶的类似；而在a 类的p h k 曲线中，低p h 对应的钟形曲线的顶部消失。p h k 曲线的不同及某些p h 对应k 值的不同是鉴别二者的简单而有效的方法。即使木瓜凝乳蛋白酶的多种亚型被发现后，这种a 、b 分类法仍然被沿用 3 2 , 3 3 】。1 2 2 木瓜凝乳蛋白酶的结构木瓜凝乳蛋白酶有9 种不同的多肽链，6 种由2 1 8 个氨基酸组成，3 种由2 2 7个氨基酸组成。在这9 种多肽链中，只有亚型i i 、亚型i 和亚型v 中个别位点的氨基酸与其他亚型的不同，甚至有几种多肽链的氨基酸序列完全相同。与其他三种半胱氨酸蛋白酶类似，木瓜凝乳蛋白酶肽链的n 一末端有信号肽段和肽原段。信号肽指导木瓜凝乳蛋白酶向番木瓜乳汁中分泌；肽原段不仅可以辅助酶肽链的折叠，还可作为木瓜凝乳蛋白酶的抑制剂，防止木瓜凝乳蛋白酶不合时宜地分解植物体内的其他蛋白 3 4 3 9 】。木瓜凝乳蛋白酶的多肽链折叠后，形成大小相当形状不同的两个域一l 域和r 一域。l 一域主要是a 一螺旋结构，由残基1 0 1 1 l 、2 1 1 2 1 8 构成；r 域主要是反向平行的p - 折叠结构，由残基1 9 、1 1 2 2 1 0 构成。活性部位位于两结构域的接触面上，活性中心的c y s 2 5 位于l 一域内由2 4 4 2 残基构成的伍一螺旋的始端。木瓜凝乳蛋白酶比木瓜蛋白酶多出的4 个残基( 1 6 9 位1 7 2 位) 位于连接两个反平行8 折叠的环上。见图1 1 。木瓜蛋白酶c 端结构域为全a ，n 端结构域为全1 3 ，属于a + 1 3 类4 0 】；而木瓜凝乳蛋白酶属于a 佃类。木瓜凝乳蛋白酶的二级结构中含有更多的0 【螺旋和b 折叠，并且二级结构的折叠方式与木瓜蛋白酶的也不相同【4 1 1 。4第一章绪论木瓜凝乳蛋白酶共有8 个半胱氨酸残基，其中c y s l l 7 是其特有的，以活性巯基的形式存在，另外7 个残基与其他三种酶一样，c y s l 5 3 和c y s 2 0 4 、c y s 5 9箭头：1 3 折叠螺旋带：a 螺旋图1 1 木瓜凝乳蛋白酶的结构f i g 1 - 1s t r u c t u r eo fc h y m o p a p a i n和c y s 6 4 、c y s 2 2 和c y s 6 3 形成3 个二硫键，c y s 2 5 以活性巯基形式存在38 1 。根据这一特点，1 9 8 4 年l a s z l o 1 8 1 又将木瓜凝乳蛋白酶定义为木瓜蛋白酶复合酶中所有含双巯基( c y s - 2 5 和c y s 一1 1 7 ) 的巯基蛋白酶。见图1 - 2 。图1 - 2 木瓜凝乳蛋白酶的折叠方式f i g 1 2s h e e tm o d eo fc h y m o p a p a i n位于非必需活性位点的c y s l l 7 与位于活性位点的c y s 2 5 在序列位置上相距较远，且不处于同一区域，因此不可能发生相互作用，不能形成分子内二硫键。根据木瓜蛋白酶的三维模型，c y s l l 7 很可能在分子表面，外露使之易于被完全而；耋查塞玉盔兰三璧堡圭耋筵墼圣不可逆地氧化 4 2 】。照然n 端的氨基酸序猁使c y s l l 7 与c y s 2 5 的活泼住相似，但键生试裁受翳予与羚露豹c y s t l 7 键合。舆有催化功能的c y s 2 5 和保守的g l y 2 3 和g t y 6 5 组成了s l 微场所。由予s l徽场辑嚣“嚣袋”城较大，慰酶的底携特黪性几乎没影霸。习蓊认为幽5 7 、6 8 、6 9 、1 3 3 、1 5 7 和2 0 7 位点的残基梅成的s 2 微场所影响着酶的底物特弹性。冀他三秘半贱氨黢蛋白酶熬s 2 微场掰中毫度傺守熬v a i l 3 3 釉v a t l 5 7 在木瓜凝乳蛋自酶中被l e u 所代替，这两个l e u 在很大程度上改变了s 2 微场所的几何形状，扶嚣影响着酶的特性i j “。术瓜凝巍蛋白酶含有2 0 0 多个水分子藕努嗣结合在鑫密半虢氨酸c y s 2 5 稀c y s l t 7 上豹鼹个s h ，。活性部位附近有两个水分予群，篡中一个由8 个水分予组成，这8 个分子被掩蔽在两个结稔域之阕漪接触瑟处，每个承分子静鬣结合戮掰的水分子和( 或) 援自质原子上，这个水分子群魁高度保守的，是蛋囱质不可缺少翁部分；勇一个承分予群位予活性帮位裂缝攫，与一些氨蘩酸残蒸形成氢键，在其他三种半胱氨酸蛋白酶中没裔发现相似的水分子群，这也许就是术瓜凝乳蛋囊酶豹溶解戆力疆本鹰蛋舀黪大的照困泌l 。上面介绍的是b 类木瓜凝乳蛋白酶的结构，而a 类术瓜凝乳蛋白酶的结构鲜有投递。1 。2 。3 木瓜凝乳蛋白酶的性质术瓜凝溉蛋自酶其有与术瓜蛋白酶榴溜腑凝巍能力，偿其鬣自水辩能力只是本瓜凝自酶的一半，j a n s e n 麟是根据这个特点为其命名黝。术瓜凝溉蛋自酶其有广泛的感物特异性，其体用底物可以跫多种强崮震，辩明胶、酪蛋融、谷燮自、弹性蛋自、球蛋囱和肌纤维蛋囱，除了蛋白赋辨，术瓜凝嚣滏鑫酶对酯帮酸胺类赢物也表现出很高鹣添力。本蕊凝乳爨臼酶程脊丰死溶帮介质中比在水介质中具有更广泛的底物特肄性f 1 6 】。木悉凝嚣蛋自酶赫最逶嘏随瘾裼不闵两交麓，如戳漂清蛋鑫农酪鬣鑫为底耱时，酶的最邋p h 是7 0 ；而以明胶为底物时，酶的最适p h 降到5 o 【44 1 。在p h 5 0对，薅溶滚嶷蠢蠢辩酶稳定髅 4 弱。木瓜凝乳蛋白酶的活性部位中含有巯基，因此巯基试剂能掷制酶活性。当黼活瞧郏整c y s 疆氧诧帮氧佬袋与莺金属离子结合黠，酶活力被帮裁，蔼还霖剩半胱氨酸盐酸盐( 或驻硫酸盐) 或e d t a 能恢复酶的活力。还原剂的作用是使。s h腹一s s 键再生，嚣嚣d t a 熬俘霆是嫠合金瘸离子。术瓜凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶、木瓜缀白酶曲的性臌的相同之处主要在于：( 1 ) 降簿一般蛋鸯演辩穗毒稳嫠黔级剪诱模式；( 2 ) 爵避孬持续东辩，产垒较低分予质量的产品：( 3 ) 对2 个合成底物b z a r g n h p h n 0 2 和z p h e a r g n h m e e第一苹绪论有相近的k c a t k 值：( 4 ) 鸡蛋源的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白是紧密结合抑制剂；( 5 )降解牛血清白蛋白的效率和速率相近；( 6 ) 三种酶都不会破坏骨胶原【4 酬。与木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶q 相比，木瓜凝乳蛋白酶对软骨蛋白基体有相对高的活性，但对磷酸化酶a 的活性则很低的【1 5 】。这也许就是木瓜凝乳蛋白酶能治疗腰椎间盘突出症而其他两种酶不能的主要原因。与其他三种酶相比，在溶解度、耐酸性和热稳定性等方面，木瓜凝乳蛋自酶均具有更优的性质。1 9 4 1 年，j a n s e n 发现木瓜凝乳蛋白酶时就指出，在晶体木瓜蛋白酶可溶的盐浓度和p h 下，木瓜凝乳蛋白酶晶体的溶解度为前者的数倍。木瓜凝乳蛋白酶在酸性条件下的稳定性要远远高于其他三种酶，如在p h 3 0 的条件下木瓜凝乳蛋白酶仍很稳定，而其他三种酶已失活。正是基于这一特性，j a n s e n在1 9 4 1 年制备木瓜蛋白酶晶体时发现了木瓜凝乳蛋白酶；也正是基于这一特征，木瓜凝乳蛋白酶比其他三种酶具有更大的药学价值。在热稳定性方面，四种酶的顺序为：木瓜凝乳蛋白酶 木瓜蛋白酶q 木瓜蛋白酶 g l y c y le n d o p e p t i d a s e 1 9 1 。经化学修饰和特定残基突变的研究表明，氨基酸序列的不同是木瓜凝乳蛋白酶耐热性高的主要原因。1 。2 4 木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化自1 9 4 1 年发现木瓜凝乳蛋白酶后，许多研究者纷纷采用不同的方法从番木瓜乳汁中分离此酶。最初的研究认为，从阳离子层析柱中先洗脱的是木瓜蛋白酶，最后洗脱的是木瓜蛋白酶q ，中间的部分都是木瓜凝乳蛋白酶。对于中间部分洗脱峰不光滑及不同实验室之间洗脱峰不完全相同这一现象，他们认为是番木瓜的来源不同或不同实验室对番木瓜乳汁的处理条件不同引起的【3 3 】。1 9 6 7 年，k u n i m i t s u 等首先发现木瓜凝乳蛋白酶具有两种不同的类型( e n z y m ef o r m s ) 一木瓜凝乳蛋白酶a 和木瓜凝乳蛋白酶b ，人们对其复杂性才有了进一步的认识。同年，s c h a c k 【4 首次分离出与木瓜凝乳蛋白酶b 相混但仅有一个活性巯基的蛋白酶。最初以为这种蛋白是木瓜凝乳蛋白酶的一种类型，后来经过p o l g a r 、b u t t l e和t h o m a s 等【4 6 4 8 ，4 9 1 进一步的研究发现，此酶与其他木瓜蛋白酶类有着截然不同的性质。1 9 9 5 年，o h a r a 等【2 2 】获得其x 衍射结构，将其命名为g 1 y c y le n d o p e p t i d a s e 。1 9 9 6 年，m a e s 等【l2 】分离出足够纯的木瓜凝乳蛋白酶，获得其晶体，测得其x 衍射结构。鉴于番木瓜乳汁中的蛋白酶成分复杂，各成分间的结构和性质相近，而且木瓜凝乳蛋白酶自身又含有多种类型，所以提取高纯度的木瓜凝乳蛋白酶非常困难，7牮南理王大学工学硬学位论文不同祭伟下撬墩的本蕊凝巍蛋羟酶鬻含有不鬻麓杂鬣寅。自术瓜凝虢蛋稻酶发现激来，鬣舞酶学赣纷纷豢试褥不藏豹方法分蒜鲢纯该麓，蕤中有共徐层橱、离予交换晷聿厅以及亲舔层褥与离子交换鼷章厅联合缓孺等，应蠲簸多浆怒离子交换瑟辑。 2 。4 1 共徐漂祈术瓜蛋囱酶类翁与重金属离予c u 2 + 、h 9 2 + 、p b 2 、z n 静、f e 3 + 等共价结合成稳定的活性衍生物，嗣此可瑙共份鬣褥滋稻用h 9 2 + 分离本瓜凝巍蛋商酶。1 9 7 6年，j o s h i 器。诵a m b e r l i t ei r 1 2 0 ( n a + ) 靼h 9 2 + 耩褥a m b e r t i t ei r 1 2 0 ( h 9 2 + ) 柱，酶液上糕籍，本蕊凝乳蚤鑫酶与往上h 9 2 + 繁密结合，然薏荐羯o ，2 m 醋酸铰洗下与校一乏h g 瓣结合静酶。这耱荚徐滋移亍法鹣绕煮楚，本蕊凝翼避糖酶拭h 9 2 + 麓窝嚣蕻餐完全滔性，黼静露浚率高，获得豹缝分毪震臻一，两虽1 0 。c 3 0 。c 蠹傈蘸参数交亿不大，上柱滚滚速瓣轻徽交囊二不会影稳浚黼缩袋，对搡髂要求较低。健裹予术窳蛋蠢酶与本蕊凝巍蛋鑫酶筠麓与辍9 2 + 蒸徐结合，授懿术愆蛋蠡骜与本照凝襞溅整酶熬分离变要在上_ 穗囊摹毂搽 乍，溜魏这秘方法辩褥本燕凝嚣爨鑫薅筑度较低。 2 ，4 。2 蔫予交换瀑糖s i l v i as o l i s m e n d i o l a 、b a i n e s 、c a l a m 帮b u t t l e 等 s l , s 2 】稳蛰裰据罨本蘸繇汗中巯鏊鬃自愁辩等惫纛不瓣( 翔表i 1 瑟示) ，采溪瓷子交羧法分离本瓜凝翼委鑫醛。1 9 9 3 年s u m m e r f 挎】等裰鸯h g c l 2 鹣醚羧镄糖撵豢本越戡泞懿霹溶缀努，蘧磐上s - s e p h a r o s ef f 柱e 臻n a c i 撵度洗黢，薅按惫零蹑骚鑫酶，舞本蹑凝嚣鬣耋l懿，簸藤本臌缀是黪q 载爆彦镦次渡淡黢出j 挺。越法纯证戆薅嚣经蠢糗暴* s e p h a r o s e ( o r g a n om e r c u r i a ls e p h a r o s e ) 涟健，溪纯嚣滔毪本熙凝嚣鬃鑫薅含璧为9 6 。为避一步筑纯本燕凝戮聋巍酶，a z a r k a n 譬 4 2 1 炎凌蚕本薅巍承溶滚过s - s e p h a r o s ef a s tf l o w 撞，先后鼹麟酸钠缓滓滚、二硫苏糠醇的纫始缓冲液帮醚歉缓冷瀵浚脱；禽本瓜凝乳畿露酶熬缀分i | 叟集在岔m p e g m p e g ( g l y t a r y t ) ，s 。s ，p y 盼容器中，弛混合物经分馏即霹形成p e g s 本瓜凝爨蛋囱酶；然后上s - s e p h a r o s ef a s tf l o w 撞，露雳黪酸镳缓冲滚避行梯度洗脱，可愆s ，s ，。二p e g 本瓜凝巍蛋逸酶；矮藤碍二酸苏糖醇释放活性本瓜凝乳凝囊酶。这秘方法可褥到单一分予型魄本瓜凝黢蛋嶷酶。1 ，2 4 。3 亲秘堪耩与壤予屡辑联合馈雳b u t t t e 等p 6 j 终亲嬲藩凝露离予交捩层掇续合，餐罨本爨翼缀避嚣秘绥辑挫茭8第一章绪论三次过柱操作。其大体步骤如下：先制备出配基b o c g l y p h e n h c h z c n ，再将b o c 。g 1 v p h e n h c h 2 c n 和活化c h s e p h a r o s e4 b 结合，制备凝胶柱s e p h a r o s e - a h x g l y p h e n h c h 2 c n 。番木瓜乳溶液中加入二硫苏糖醇，上柱后放置过夜，用羟乙基二硫化物溶液洗脱蛋白酶。洗脱的前出峰中含不与柱结合的木瓜凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶q ，而由羟乙基二硫化物洗脱的后出峰中含木瓜蛋白酶和g l y c y le n d o p e p t i d a s e 。将两洗脱峰分别上上m o n osh r 5 5 阳离子交换柱，最后用醋酸钠醋酸缓冲液进行梯度洗脱。这种方法最后能分离出全部的四种半胱氨酸蛋白酶。经过很多学者的不懈努力，现在已能分离到纯木瓜凝乳蛋白酶，甚至得到此酶部分亚型的晶体。但目前这些分离方法的步骤都极其繁琐，这对于酶的分离是非常不利的，而且还仅适用于实验室中。寻求一种简单而有效的规模化生产纯木瓜凝乳蛋白酶的方法一直是很多学者努力的目标。1 2 5 木瓜凝乳蛋白酶的应用1 2 5 1 治疗腰椎间盘突出症木瓜凝乳蛋白酶最主要的用途是治疗腰椎间盘突出症。其作用机理是减小髓核中连接长链粘多糖的非胶原蛋白质的分子质量和粘稠度，使粘蛋白发生去聚合作用，从而溶解突出的髓核，减轻神经所受压迫，缓解疼痛1 5 3 , 5 4 】。1 9 6 4 年，s m i t h 首次将木瓜凝乳蛋白酶用于治疗腰椎间盘突出症，成功率即达到7 0 1 5 “。由于木瓜凝乳蛋白酶治疗腰椎间盘突出症有时会引起严重的并发症，该酶曾被禁止使用。经过近2 0 年的论证，1 9 8 2 年，美国f d a 批准了该酶制剂的上市。到目前为止，美国、加拿大、澳大利亚及欧洲的一些国家已有6 0 余万腰椎间盘患者接受了木瓜凝乳蛋白酶溶核术治疗。我国的滦波5 6 1 和金今5 4 1 等已展开用韩国新丰制药公司生产的木瓜凝乳蛋白酶进行治疗腰椎间盘突出的临床研究，分别得到了7 0 矛t i8 9 的优良率。木瓜凝乳蛋白酶化学溶核术是治疗腰椎间盘突出的最早的药物治疗法。与外科手术或激光直接切除髓核等方法相较，该法的疗效相当1 5 7 ，成功率高( 高5 - 2 0 ) ，病人住院时间，操作简单而费用低廉；与胶原酶化学溶核术相比，该法有更高的治愈率。如w i t t e n b e r g 等【5 8 】经过5 年的对比研究发现，木瓜凝乳蛋白酶化学溶核术的有效率为7 2 ，而胶原酶化学溶核术的有效率仅为5 2 。过敏反应是木瓜凝乳蛋白酶溶核术最危险的并发症之一，其机理估计与患者产生的木瓜凝乳蛋白酶和( 或) 降解产物的抗体i g g 有关【59 1 。注射前，使用抗过敏药物可减少过敏反应发生率及减轻过敏反应程度。神经系统并发症是另一种较严重的并发症。一般发生在术后数小时和数天内，发生率约为0 0 5 60 1 。这种并发症一般是因手术适应症选择不当或技术操作华南理工大学工学硕士学位论文失误造成的，可以通过严格操作而加以避免。 ，2 5 2 鉴懋r h 盘型r h 血型与主要的a 、1 3 、0 和a b 四种皿型在临床医学上具有同等的重要性。致囊型系统免疫反疲霹导致受盘老毵亡、终身残痰、死狳、豢生，k 溶巍等。在常规疯型实验或交叉配血实验中，只能诊断出完全性抗体所导致的血型免疫凝集反痘，疆莲分a b o 蠹耀及其稷容缓。嚣出不完全憋爨髂爱警致鲍熟盎型免疫凝集反应则需要在3 7 c 条件下，通过使用木瓜凝乳蛋白酶等试剂进行实验方可雩导出诊叛结累。木瓜凝乳蛋白酶可对红细胞膜蕉白抗原进行修饰，充分暴藤r h k i d d 等血型抗原，从面更灵敏、踅准确她进行r h 血型抗原与抗体的梭测。因际血液标准化委员会( i c s t t ) ，国际血液学会( i s b t ) ，美国食品与药物管理局( f d a ) 予1 9 9 4 年通过对比性实验认诞木瓜凝乳蛋自酶法对r h 斑型系绞免疫凝集反应，在最佼酶活力范围内，最佳操作条件下，麓最灵敏的实验方法，且费用低廉、操作简便。在国内，中国输血技术掇作规程9 7 版，全国临床检验操作规程一9 7 版，将木瓜凝乳甏白酶法作为r h 血型系统免疫学检测的首选方法收载1 6 “。2 5 3 分离细胞木瓜凝乳蛋白酶在c d 3 4 + 细胞以及一拨特殊脞瘤细熙的分离方面具有非常蓬要的应用价德。木瓜凝乳蛋臼酶能特异性降解c d 3 4 + 细胞表面c d 3 4 抗原，分离浓缩c d 3 4 + 细胞。具有c d 3 4 抗原淡面标惑的造擞于细腻和祖缨胞在器官移植、癌症化疗后造姐功能的恢复等方面裔很大的临床应用价值f 配】。水瓜凝乳器白酶还能特异性地降解恶性血液细胞表耐的多配体蛋白浆糖1 生物大分子，觚丽分离嚣髓往白血病患者的静髓瘤缓胞，这对于癜症的免疫治疗其有重要的意义【6 “。2 5 4 辅助治疗胂瘸木瓜凝乳蛋白酶述可以用于治疗肿瘤。近年来的研究发现木瓜凝乳摄白酶可以选择性地去除包裹在肿瘤寝面的强白质膜，从而使抗肿瘤药物更有效地发挥作用，对肿瘤的治疗起良好的辅助作用。1 2 5 5 用于消炎在医药短缺的非洲等她，本瓜凝乳蛋是酶豹药趣价馕终到了遴一步始证实。冈比职的医疗机构发现木瓜凝乳蛋囱酶对去除坏歹b 组织、防止烧伤创口感染和促进伤l i 愈合均肖幸# 用，甚至逐可用予皮蚨移植。其机制可能与该酶豹蛋彝承鳃活性及其抗菌性有关f 2 鲋。第一苹绪论1 2 5 6 用于医学研究木瓜凝乳蛋白酶在研究粘多糖与非胶质蛋白的缺失对滑膜问质液渗透性的影响，以及研究非胶质蛋白和结构蛋白在间质组织中的作用等方面发挥巨大的作用 6 4 6 6 1 。1 2 57 其他应用此外，木瓜凝乳蛋白酶还可用于啤酒的澄清和奶酪的制造，但一般情况下，是用含木瓜凝乳蛋白酶的木瓜蛋白酶粗品。1 3 抗体工程概述抗体是生物体内一类重要的大分子，它能与多种多样的抗原结合，参与体内免疫反应，在生物体防御外来抗原侵害的过程中起到重要的作用。近一百年来，对抗体的研究，取得了丰硕的成果，不少科学家因为在该领域中的突出贡献而获得诺贝尔奖。1 3 1 抗原与抗体1 9 世纪8 0 年代后期，在研究病原菌的过程中，发现白喉杆菌可经其分泌的白喉外毒素致病，进而发现在感染者的血清中有“杀菌素”( b a c t e r i c i d i n s ) ，“杀菌素”即为首例发现的抗体。鉴于细菌分泌的无生命的蛋白质性毒素亦可导致抗体产生，当时的科学家们把能刺激宿主产生抗体的物质称为抗原。随着研究的进一步发展，抗原与抗体都有了严密的定义。抗原( a n t i g e n ) 是指可被免疫系统识别，可与存在于t 和b 细胞表面的t c r( t 细胞抗原受体) 与b c r ( b 细胞抗原受体) 结合的物质，是引起免疫应答的始动因素。抗原分子一般具有两种特性：一是免疫原性，即能刺激机体产生免疫应答，产生抗体和( 或) 效应淋巴细胞；二是抗原性，指与抗体或效应t 细胞发生特异性结合的能力。同时具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原，即通常所称的抗原。只具有与抗体结合能力，而单独不能诱导抗体产生的物质称半抗原。使半抗原变成完全抗原的物质称为载体，通常用大分子蛋白质做载体。抗原表面决定抗原特异性的某些特定化学基团，称为抗原决定基或称表位( e p i t o p e ) 。抗原以此与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，进而引发免疫应答和免疫反应。一个抗原决定基激活一种淋巴细胞，产生一种特异性抗体，大多数抗体分子具有多个抗原决定基。抗体( a n t i b o d y ，a b ) 是b 细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应的抗原特异性结合，具有免疫功能。抗体因其与抗原结合的特异性、抗体自身的多样性和抗体生成的机制等问题，成华南理王大学工学硕士学位论文为生命科学研究中餐受重视的一类生物大分子。1 9 3 9 年，t i s e l i u s 和k a b a t 采用电泳的方法证明抗体是一种￥一球蛋白，因此，桷当一段时间内，抗体又被称为y 一球蛋白。现在进一步证明也有少量抗体是a 或球蛋囱，抗体分子是由两条相同的重链( h 链) 和两条相同的轻链( l 链) 通过链间二硫键连接褥成的四默链结构。抗钵懿氨基端能与抗原结合，决定抗原特舞性，豫f( a b7 ) 。段，抗体的羧基段不结合抗原，而具抗体的其他功能，此段易产生结晶，稼f o 段。1 3 2 抗体的形成2 0 世纪前半叶，对抗体的分子结构及其功能已研究的非常详尽，遮时，很多学者