（发酵工程专业论文）新型生物防腐剂纳他霉素生产方法的研究.pdf

天津科技人学明、l 二学位论文 摘要 本文研究了一种新型生物防腐剂纳他霉素生产菌的选育，发酵t 艺的确定 及发酵条件的优化，纳他霉素的提取工艺以及纳他霉素对部分真菌的抑菌谱。 以褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) s - 7 l 为出发茼株，通过紫外 诱变，采用琼脂块法筛选，获得了一株高产菌株s g 2 0 0 2 ，摇瓶产量达到2 6 5 9 l ， 为出发菌株的1 6 1 倍。并通过与链霉素抗性筛选法进行比较分析，表明链霉紊 抗性不是纳他霉素高产的必要条件。 确定了菌株s g 一2 0 0 2 在5 l 发酵罐和2 0 0 l 发酵罐上的发酵工艺控制参数。 在该工艺下，发酵9 6 1 4 4 h ，5 l 发酵罐最终纳他霉素产量达到5 1 9 l ， 2 0 0 l 发酵罐最终纳他霉素产量达到了5 9 9 l ，比原始菌株摇床发酵广量提高了2 5 8 倍。 确定了纳他霉素的初提i ：艺，使纳他霉索回收率和纯度均达到8 0 以l 一。 通过活性炭柱脱色对纳他霉素进行精制，产品纯度达到9 8 ，回收率为1 2 1 。 采用活性炭浸泡法，获得脱色条件：活性炭加入量为0 5 ，在6 5 下处理3 0 r a i n 。 在该工艺下，活性炭只划色素有吸收，对纳他霉素没有吸收，获得产品纯度达 到9 1 6 ，回收率为8 2 5 。 对提纯样品进行了紫外光谱、高压液相色谱、抑菌活性、红外光谱和核磁 共振图谱检测，证明该提纯样品为纳他霉素。 测定了纳他霉素对部分霉菌和酵母的抑菌谱，发现纳他霉素对供试霉菌和 酵母的最小抑制浓度在1 0 p p m 以下 关键词：褐黄孢链霉菌 发酵工艺 纳他霉素 提取 菌种选育 抑菌谱 摘要 a b s t r a c t t h i sp a p e rf o c u s e do nt h eb r e e d i n go f h i g h p r o d u c i n gs t r a i nw h i c h c o u i dp r o d u c e n a t 咖y c i n 一n e wb i o a n t i s e p t i c ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i v ec o n d i t i o n i n5 l f e r m e n t o ra n d2 q o lf e r m e n t o r , e x t r a c t i o no f n a t a m y c i nf r o mf e r m e n t a t i o nb r o t ha n d a n t i f u n g is p e c t r u m o f n a t a m y c i n o r i g i n a t e df r o mg t r e p t o m y c e sg i t v o s p o r e u ss - 7t ，ah i g hn a t a r a y c l n p r o d u c i n g s t r a i ns g 2 0 0 2w a so b t a i n e db ya g a rb l o c km e t h o da f t e ru v i r r a d i a t i o n a n dt h e p r o d u c t i o no fn a t a m y c i nw o n26 5 li n5 h a k e qw h i c hw ；t s 】61 o f t h eo r i g i n a l s t r a i n t h ec o n c l u s i o nt h a ts n l 7w a sn o tt h e n e c e s s a r y c o n d i t i o no fa b i l i t yo f n a t a m y c i ns 3 _ ，n t h e s i s w a sd r o w na f t e rc o m p a r i n gb e t w e e na g a rb o c km e t h o da n d s t r e p t o m y c i nr e s i s t a n c es c r e e n i n gm e t h o d t h ep a r a m e t e r so f5 lf e m e n t o rt e c h n i c sa n d2 0 0 lf e r m e n t o rt e c t u l i t sw e r e o b t a i n e d u n d e rt h o s et e c h n i c s ，y i e l do f n a t a m y c i ni n5 lt e r m e n t o rw a s5 1 9 l ，a n d t h a tj n2 0 0 lf e n m e n t o rw a s 5 9 9 l w h i c hw a s 25 8f o l d st h a nt h a to f o r i g i n a ls t r a i n i ns h a k e r r o u g he x t r a c t i o nt e c h n i c so fn a t a m y c i nw a so b t a i n e d ，a n dt h er e c o v e rr a t ea n d p u r ed e g r e ew e r ea b o v e8 0 a f t e rp u r i f i e db y a c t i v ec a r b o nc o l u r r m i a t h 2 n 曲ep a r e d e g r e eo fp r o d u c t i o nw a s9 8 r e c o v e rr a t ew a s1 2 1 a c t i v ec a r b o nm a r i n a t a l m e t h o dw a ss t u d i e d ，a n dt h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o nw a so b t a i n e d ：a d d i n g q u o n t t y w a so 5 ，t e m p e r a t u r ew a s6 5 ，t i m ew a s3 0 r a i n u n d e rt h a t t e c b a r i c s a c t i v e c a r b o nc o u l ds o r bp i g m e n to n l y , b u tn o tn a t a m y c i n ，a tl a s ll h ep u r e d e g r e eo f p r o d u c t i o nw a s9 1 6 ，r e c o v e rr a t ew a s 8 2 5 t h ep u r e s a m p l e w a si d e n t i f i e da s n a t a m y c i nb yu v s p e c t m 、h p l c 、 r e s i s t a n c e f u n g ib i o l o g i c a la c t i v i t y 、i n f r a r e ds p e c t r u m a n dn m r h 1 s p e c t r u m m e t h o d s ， t h ea n t i b a c t e r i a ls p e c t r u mo f n a t a m y c i nw o ns t u d i e d ，m a di tw a sf o u n dt h a tm i c w a sb e l o w 】0 p p m ， k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e s g i t v o s p o r e u sn a t a m y c i n s t r a i ns c r e e n i n g f e r m e n t a t i v et e c h n i c se x t r a c t i o n a n t i f u n g is p e c t r u m 2 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 纳他霉素的发现 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非纳他州的土壤中分离到纳塔尔链霉菌 s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ，并从中分离出了一种新的抗真菌物质，称为p i m a r i c i n ( 匹马菌素) 1 1 ；1 9 5 9 年，b u r n s 等人在美国田纳西州的土壤中分离到了一株 恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s 打，并从其培养物中分离到了 t e n n e c e t i n ( 罔纳西菌素) 。此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物 质，并被世界卫生组织w h o 统一命名为n a t a m y c i n ( 纳他霉素) 2 1 。 1 , 2 纳他霉素的理化性质 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种白色或乳白色， 几乎无臭无味的结晶粉末。分子式为c 3 3 h 4 7 n o l 3 ，分子量为6 6 5 7 5 ，化学结 构如图1 1 所示。 o h 2 n 图i - i 纳他霉素的分子结构 f i g 1 1m o l e c u l es t r u c t u r eo f n a t a m y c i n v 纳他霉素是一种四烯大环内酯，四烯系统是全顺式，内酯环上c 。_ 一c ， 部位是半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱 氧甘露糖( m y c o s a m i n e ) 。纳他霉素是两性物质，分子当中含有一个碱性基团 和一个酸性基团，其电离常数p k a 值为8 3 5 和4 6 ，相应的等电点为6 5 ，熔 点为2 8 0 6 c 。其结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，这就决定 了它在许多溶剂中的低溶解性。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性随着p h 的降低或升高而增加，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高于9 时 溶解度增大。 纳他霉素的紫外光谱如图1 - 2 所显示，在2 9 0 、3 0 3 、3 1 8 1 a f n 处有尖锐的 吸收峰，在2 8 0 r i m 处有肩，2 2 0 r t m 处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环，因 此在2 8 0 3 2 0 n m 之问出现吸收峰，而在2 2 0 r i m 的最大吸收是由于纳他霉素 含有发色团。 图l 一2 纳他霉素的紫外光谱 f i g 1 2u v s p e c t r u mo f n a t a m y c i n 纳他霉素的四烯发色囝给分子一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的 化合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用；另方面，它以环氧族 的形式保待弱氧诧住，当纳位霉素在冰醋酸孛用热豹碘他物处理居会析出碘， 纳他霉素通过酸水解作用可以释放出海藻糖氨，内酯可以通过碱水解作用皂 化f 1 = 2 】。 1 3 纳他霉素的活性和稳定性 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物，室温下傈存几年只有很小 部分失去活性。三水化合物同样稳定，但其无水形态不稳定，在室温封闭 的瓶子中保存4 8 h 失去1 5 的活性。中性豹纳他霉素水溶液几乎和于粉样 稳定。纳他霉素的稳定性受p h 值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影 响而变化 3 , 5 8 j 。 ( 1 ) p h 值：纳他霉素在p h 4 5 9 之间非常稳定，在极端p h 下纳他霉素 迅速失活，形成各种各榉的分解产物。在低p h 值时其主要的裂解产物是海藻 糖胺；在高p h 值时，如p i l l 2 ，由于内酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理 导致进一步的分子破裂，产生一系列的后醛醇反应。p h 值对于纳他霉素的稳 天津科技大学倾士学位论文 定性有一定的影响，但对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响。据报道， 纳他霉素于3 0 。c 储存三星期，在p h 5 7 的范围内，纳他霉素的活性仍保持 1 0 0 ，p h 3 6 时保持大约8 5 ，p h 9 0 时仅剩大约7 5 ，但在大部分食品的 p h 范围内，纳他霉素十分稳定。 ( 2 ) 温度：温度对纳他霉素的活性几乎没有影响( 在中性水溶液中) 。纳 他霉素在室温条件下是稳定的，5 0 放置几天或1 0 0 。c 短时处理，其活性几乎 无损失。1 2 0 条件下加热不超过1 h 仍能保持纳他霉素的部分活性。 ( 3 ) 光照：纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。y 辐射也能使纳他 霉素分解。 ( 4 ) 氧化剂：纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑 菌活性会明显下降。防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、 丁基羟基茴香醚、丁基甲苯等。 ( 5 ) 重金属：一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、 铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中， 也可以添加e d t a 或聚磷酸盐来防止失活。 ( 6 ) 鉴别用颜色反应：把纳他霉素晶体加入滴有滴浓盐酸的点滴板h ， 颜色马上变蓝：如果滴加一滴浓磷酸，颜色马上变绿，几分钟后，都会变成 浅红色。 1 4 纳他霉素的抗微生物性质 纳他霉素是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类剂的 多烯大环内酯类抗生素。但它没有抗细菌活性。这是由于真菌的细胞膜含有 麦角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素能有选择 的和固醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比，结合后形成膜一多烯化 合物，引起细胞膜结构的改变，导致细胞膜渗透性的改变，造成细胞内物质 的泄漏【4 】。纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于破坏休眠 的细胞则需要较高的浓度。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。1 9 5 6 年，t r e s n e r 2 1 曾测试过纳他霉素对5 0 0 种霉菌的抗性，所有菌种都被l i o p p m 的纳他霉素抑制。1 9 5 9 年，k l i s 口】比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制 霉菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他霉素对1 6 种在肉汤和琼脂中培养 的霉菌是最有效的抑制剂，绝大多数霉菌在0 5 6 p p m 的纳他霉素浓度下被 抑制，极个别的种在1 0 2 5 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制，多数酵母菌在 1 o 5 0 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制。表1 一l 和表卜2 为部分霉菌和酵母菌 的纳他霉素最小抑菌浓度。 i 前言 ，r _ _ _ 一一 表卜l 纳他霉素对霉菌的最小抑菌浓度 t a b 1 1m i co f n a t a r n y c i no nm o l d s 一一 。 霉菌 最小抑制浓度( p p m ) 棒曲霉( a s p e r g i l l u sc l a v a t u s ) o 1 2 5 瓦崎霉( 4 c h e v a t i e r i ) 4 2 9 8 o 1 2 5 构巢曲霉( 爿n i d u l a n s ) 0 1 2 5 赭曲霉( ao r h r a c e u s ) 4 0 6 9 0 1 2 5 黄曲霉( 4 细v 硒) c b s 3 0 0 5 4 0 8 0 黄曲霉( 爿f l a v u s ) b b 6 7 4 0 8 ，0 黄曲霉( a 刀台v n s ) m a d a g a s c a r 4 0 8 o 黄曲霉( a f l a v u s ) p o r t l a m y 4 0 - - 8 0 黑曲霉( 彳r o g e r ) 4 0 8 0 杂色曲霉( 爿v e r s i c o l o r ) 4 0 - 8 0 米曲霉( ao r y z a e ) 1 0 产黄青霉( p e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m ) 0 卜2 5 岛状青霉( pislandium)01-25 指状青霉( pdigitatum)408、0 扩展青霉( pexpansum)4080 特异青霉怛n o t a t u m ) 4 6 4 0 4 0 8 ，0 黑青霉”枷1 i e a n s ) 4 0 8 0 鲜绿青霉v i r i d i c a t u m ) w e s t l i n g 4 0 8 0 娄地青霉( pr o q u e f o r t iv a r p u n c m m m ) 6 0 1 8 1 0 疣孢青霉但v e r r u c o l o s u mv a t c y c l o p i u m ) o j 2 ，5 芽枝状枝孢霉( c l a d o s p o r i u mc l a d o s p o r i o i d e s ) o 1 2 、5 白色胶孢子菌( g l o e o s p o r i u ma l b u m ) o 。1 - 2 5 果生核盘菌( s c l e r o t i n i a f r u c # c o l a ) o 1 2 5 犁头霉纠b s i d i a 妒) 4 0 - 8 ，0 交链孢霉口l t e r n a r i asp)408、0 大毛霉( m u c o rmucedo)4080 犁孢帚霉( s e o p u l a r i o p s i sa s p e r u l a ) 4 0 8 ，o 链孢霉( f u s a r i u ms p ) 10 白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u m ) 1 0 米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 4 7 5 8 1 0 灰葡萄孢霉( b o t r y t i s 曲z e 邝日) i 2 5 4 天津科技夫学硕士学位沦文 表l 一2 纳他霉素对酵母菌的最小抑菌浓度 t a b 1 2m i c o f n a t a m y e i n o n y e a s t s 酵母菌最小抑菌浓度( p p m ) 布鲁塞尔酒香酵母( b r e t t a n o m y e e sb r u x e l l e n s i s ) 白假丝酵母菌( c a n d i d aa l b i c c m s ) 维尼氏酵母菌( c v i n i ) 白球拟酵母菌( t o r u l o p s i sc a n d i d a ) 吉利蒙氏假丝酵母菌( c a n d i d a g u i l l i e r m o n d i i ) 多形汉逊酵母菌( h a n s e n u l ap o l y m o r p h a ) 拜耳酵母菌( s a e c h a r o m y c e s b a i l l i ) 贝耳酵母菌( b a y a n u s ) 酿酒酵母俘c e r e v & i a e ) 8 0 2 1 酿酒酵母椭圆变种晖c e r e v i s i a ev a r e l l i p s o i d e u s ) 少孢酵母菌偶e x i g u n s ) 路德酵母菌岱l u d w i g i 0 0 3 3 9 鲁氏酵母菌强r o u x i i ) 0 5 6 2 清酒酵母菌阻s a k e ) 0 3 0 5 炼乳球酵母菌( t o r u l o p s & l a c t i s e o n d e n s o 柠檬形克勒克酵母菌( k l o e e k e r aa p i c u l a t a ) 细小红酵母菌( r h o d o t o r u l ag r a c i l i s ) 罗斯有孢圆酵母菌( t o r u l a s p o r ar o s e i ) 伯克力接合酵母菌( z y g o s a c c h a r o m y c e sb a r k e r i i ) 1 5 纳他霉素的安全性及毒性 纳他霉索无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。纳他霉素很 难被消化道吸收，由于其难溶于水和油脂，大部分摄入的纳他霉素会随粪便 排出。给奶牛饲喂高剂量的纳他霉素，结果表明，9 0 的纳他霉素及其分解产 物经粪便排出 5 1 。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等【5 j 研究纳他霉素的急性毒性和慢性毒 性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也不产生伤害。1 9 7 3 年h a m i l t o n m i l l e r ”峙艮道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。1 9 7 7 年，d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s 5 研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，他们在连续几 年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证据，使用大于 m i c ( 最低有效抑制浓度) 的纳他霉素量，人为诱导也没有发现真菌形成抗性 的证据。1 9 8 2 年，r a y 和b u l l e r m a n ”峙艮道纳他霉素能减少黄曲霉产生的黄 曲毒素、赭曲霉产生的赭曲毒索、圆弧青霉( p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m ) 产生的 j 5 5 5 旧5 5 5 5 5 5 5国mc：c：眦眦眦眦眦胞他他眦他眦帅帅帅，王，王土土王王王孓 青霉酸、展开青霉产生的展开青霉素。因此，纳他霉素能减少真菌毒素给人 类造成的危害。 1 6 纳他霉素的应用 1 6 1 世界各地法规 w h o 和f a o 规定消费者每天纳他霉素最大摄入量( a d i ) 为0 3 m g k g 体 重，奶酪和香肠的一般消费者每天摄入量为0 0 0 2 r r l g k g 体重 3 】。1 9 9 8 年g r a s 专家组p 1 认定纳他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和农家干酪非常 安全。目前，荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞典等国家都允许纳 他霉素用于干酪和硬香肠的防腐，荷兰还批准纳他霉素用于苹果和梨的防腐。 在中国，纳他霉素被批准用于千酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易 发霉食品加工器皿的表面，一般采用2 0 0 3 0 0 m g k g 悬浮液浸泡或喷洒，残 留量不超过l o m g k g 。纳他霉素也被批准添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中， 限量为1 0 m g k g ( 食品添加剂使用卫生标准：g b 2 7 6 0 9 6 ，1 7 o ，坊腐剂) 。 1 6 2 纳他霉素在食品工业中的应用 1 9 8 2 年6 月，美国f i j a 正式批准纳他霉素可用作食品防腐齐寸f “。1 9 9 0 年 1 月9 日，我国卫生部食品监督厅签发了国内第一个生物食品防腐剂n i s i n ( ! l 酸链球菌素或称乳链球菌肽) 的使用合格证明，到1 9 9 6 年，中国食品添加剂 标准化技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂【8 1 。乳链球菌肽对革 兰氏阳性腐败细菌有抑制作用，对酵母菌及霉菌等丝状真菌无效；而纳他霉 素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用，这一点正好与乳链 球菌肽的抑菌谱互李卜【6 j 。纳他霉素与乳链球菌肽是目前国际上批准使用的仅 有的两种生物食品防腐剂。 纳他霉素由于溶解度很低，被用作食品表面防腐剂以延长货架期，主要 在奶酪、肉制品、葡萄酒、茶饮料及果汁中添加，它不会干扰其它食品组分， 也不会带来异味。它在食品中的抗真菌作用是双效的：既可防止真菌引起的 食品腐败，减少经济损失；又可防止真菌毒素给人类造成的毒素型食物中毒。 与传统的抗真菌剂比较，纳他霉素有其独特的性质，它在很低的浓度下仍具 有1 活陛，例如：在奶酪中纳他霉素比山梨酸钾活性高4 0 0 倍。在葡萄酒中， 纳他霉素能取代山梨醇和其它抗真菌剂，它允许减少所使用的s 0 2 量【4 1 。目 前，全世界已有三十多个国家采用纳他霉素作为食品防腐剂。 ( 1 ) 干酪 纳他霉素应用于奶酪生产的工艺已很成熟。有关的报道从7 d 年代至今多 不胜举。纳他霉素用于干酪皮防止其表面发霉，它不会渗透到干酪内部，仅 仅停留在酪皮外层l m m 处，而这一部分一般不会被取食，干酪放置5 一】0 周 6 天津利技大学删h 学位论文 后，纳他霉素基本消失，此时酪皮变硬不易受到霉菌侵染，纳他霉素对细菌 无效，因而不会影响干酪和干酪制品的熟化。使用方法一般有浸泡、喷洒或 乳剂覆膜。2 0 0 1 年6 月，b a s i l i c oj c 等人”峙艮道，o 5 ( w v ) 的纳他霉素用 于奶酪就可有效防止丝状真菌的污染。 ( 2 ) 肉制品 在肉制品中使用2 0 0 0 m o j k g 的纳他霉素混悬液对其进行浸泡或喷洒，可 达到纳他霉素含量为8ug c m 2 安全而有效的防霉水平。对于香肠来说，纳他 霉素可在以下数个步骤中添加：发酵前：肠衣浸泡；己灌料香肠的浸泡；已 灌料香肠的表面喷洒。对于硬香肠来说，纳他霉素的推荐用量为肠衣浸渍液 质量的0 0 5 0 2 5 l 。 ( 3 ) 果汁 纳他霉素在果汁中的应用也很广泛。对于葡萄汁，添加2 0 m g k g 纳他霉 素就能防止酵母菌发酵；对于2 5 4 下保存的橙汁，自然条件下保存一周就 会受到真菌的污染，而仅使用i 2 5 m g k g 低剂量的纳他霉素就能保质8 周； 对于苹果汁，3 0 m g k g 的纳他霉素能在6 周内防止发酵变质，并且使果汁的原 有风味基本保持不变。 ( 4 ) 茶饮料 1 9 9 9 年，c i r i g l i a n o m c 等人1 7 】报道，纳他霉素用于茶饮料，可以有效防 止真菌腐败，并给予茶饮料更加可接受的感官特性。 ( 5 ) 水果 1 9 8 1 年，j g o o s t e n d o r p i s 报道，纳他霉素用于水果储存中，可有效防止 真菌引起的有氧降解。我国也有关于纳他霉素应用于水果的报道。将整个苹 果浸泡在含有5 0 0 p p m 纳他霉素的悬液中l 2 m i n 后，经过8 个月的存放，能 有效降低苹果变质的数目。 ( 6 ) 焙烤食品 已经研究过纳他霉素在各种焙烤产品中的应用。当黑面包和白面包表丽 洒有1 0 0 5 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液时，防霉效果不错。用纳他霉素对生面 团进行表面处理，也收到了理想效果。 此外，j g o o s t e n d o r p 【8 】还报道纳他霉素用于卷心菜叶的防腐，以及在草、 马铃薯种子和水仙花球茎中的应用，都取得了满意的效果。目前，纳他霉素 在我国的应用也越来越广泛。纳他霉素用于沙拉酱、人造奶油、果冻、酱菜 和广式月饼，防霉效果均很好 9 j o 。 1 6 3 纳他霉素在医药工业中的应用 纳他霉素除了用作食品防腐剂，还可药用。近几年，报道纳他霉素用于 医疗的文献越来越多，它的临床应用范围也越来越广泛。纳他霉素以几种制 前高 剂形式( 悬浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等) 被典型地用于抗皮肤和粘液膜 的真菌感染，既可以单独使用又可以与新霉素、氢化可的松及其它类固醇共 同使用。纳他霉素还可用于阴道和肺部真菌感染的治疗 3 ：8 ，1 2 】。 1 9 9 7 年9 月，k a l i u z h n a i al d ，m u r z i n ae a 【l 【l 报道，将不同剂量的纳他霉 素用于治疗儿童由真菌引起的皮肤和粘液膜感染非常有效。 最新的文献显示，纳他霉素已成功的用于真菌性角膜炎的治疗中，纳他 霉素口服不吸收，限于局部用药。因其难溶于水，临床上使用5 混悬液滴眼， 眼部能耐受且无毒性旧“j 。 目前，纳他霉素已被广泛用于食品、医疗、饲料、粮储等领域中，特别 是在食品原料保鲜、成品防腐方面的应用显示了良好的前景。 1 7 纳他霉素的生产概况 1 7 1 纳他霉素生产菌特征 纳他霉素产生菌为链霉菌，基内菌丝体通常发育良好，多分枝，无隔膜 而连贯；它的气生菌丝丰茂，气生菌丝通常较基内菌丝粗，颜色较深，当菌 丝逐步成熟时，大部分气生菌丝分化成孢子丝，产生呈长链的孢子，孢子为 外鞘所包，鞘表面平滑或带各种装饰物，在电子显微镜下表现为双短杆镶嵌 图，有鳞片或形状和大小不同的突起、剌或毛发等；孢子的分裂方式也有差 异，有的沿横膈中央平切，有的两端浑圆，由残余的鞘相连。 目前，报道的纳他霉素产生菌有三种： ( 1 ) 恰塔努加链霉菌( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ) a t c c1 3 3 5 8 ，孢子 丝圈至螺旋形，有时柔曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。 ( 2 ) 纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ) i s p5 3 5 7 ，孢子丝2 5 圈松 敝螺旋形：孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺。 ( 3 ) 褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e s g i l v o s p o r e u s ) a t c c1 3 3 2 6 ，孢子丝螺旋 形；孢予呈球形或卵圆形，孢子表面带刺。 1 7 2 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径可以分解为活化前体的生成( 乙酰 辅酶a 和丙二酰辅酶a ) 、内酯大环的生物合成( 多聚乙酰途径) 和氨基糖的 形成。如图1 3 所示。 天津科技大学硕士学位论立 n a o p h 口一 “# * # t 蘸* 镥 t 碍么i 嚣笛l 鬣嚣 ， * 二* # 傅 、 m 罐 注：代表能量代谢 代表应阻断的代谢途径 图1 3 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 f i g 1 3b i o s y n t h e s i z ep a t h w a yo f p o l y e n e m a c r o l i d ea n t i b i o t i c s 1 7 3 国内外发酵法生产纳他霉素的概况 早在1 9 6 0 年，c y a n a m i d 1 5 】就报道了发酵生产纳他霉素的传统方法。但 接下来的相关报道比较少，直到九十年代，有关纳他霉素的生产研究才重新 受到关注。 1 9 9 3 年，m a 艾森申克i i 卅的专利( c n1 0 7 1 4 6 0 a ) 报道了发酵法生产纳 他霉素的种菌培养和繁殖方法。要求用一种适宜的生孢予琼脂培养基，种菌 繁殖所用的孢子悬浮液应包含的孢子浓度约为1 0 5 1 0 1 0 c f u m l 。适宜的种 菌细胞密度含有约1 5 9 l 的干细胞重，并且是纳他霉素生产培养基体积的 0 1 1 0 。专利l l ，j ( c n1 0 7 2 9 5 9 a ) 报道了通过控制发酵培养基的p h 值可 以提高纳他霉素的生产速率。在纳他霉素发酵主阶段即抗生素生产阶段，向 发酵液中加入适宜的p h 控制剂( 如n a o h 、k o h 、c a ( o h ) 2 等) 以控制发酵 液p h 值，使其维持在5 9 6 1 ，可提高纳他霉索生产速率和产率，一般生产 时间可减少2 0 6 0 ，产量可达5 9 l 。同年，奥尔森【1 8 1 的专利( c n1 0 7 0 6 8 8 a ) 报道了连续发酵法生产纳他霉素。第一阶段，进行有效的种菌繁殖，伴随部 分纳他霉素的产生。在发酵的第二阶段进行连续生产，维持发酵液的体积基 本不变，使加入培养基的速度和取出发酵液的速度基本一致，维持至纳他霉 w 薯2 如 一 前言 素不再以成本有效的方式产生，产量可达6 1 2 9 l 。 1 9 9 4 年，e i s e n s c h i n k ，m i c h a e la l l e n 等人1 9 的专利报道了流加碳、氯源 进行纳他霉素发酵的过程。指出发酵培养基中至少应有1 5 9 l 的蛋白氮源和 8 0 2 5 0 9 l 的碳源，其中碳源要不断流加，使碳源浓度保持在5 3 0 9 l ，纳 他霉素产量可达至少5 9 l 。 2 0 0 0 年，e n s h a s yh a ，f a r i dm a 等人 2 0 t 报道了接种物类型和培养条件对 纳塔尔链霉菌产生纳他霉素发酵的影响。指出用孢子悬液而不用营养细胞进 行种菌繁殖，用于接种的孢子悬液浓度应为1 0 8 个m l 。培养条件主要研究了 溶氧水平对发酵的影响，并指出向培养基中添加水溶性生物聚合物如褐藻酸 钠可以降低溶解氧，使纳他霉素的产量下降。同年，他们报道1 “1 通过最佳碳、 氮源的选择及其比例的优化，只使纳他霉素产量提高到1 5 9 l 。 1 7 4 基因工程研究进展 目前，世界上对纳他霉素产生菌基因工程方面的研究仅刚刚起步，有关 的文献很少。 1 9 9 9 年，a p a r i c i oj f c o l i n a a j 等人【2 2 1 研究了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉 菌的生物合成基因簇，染色体组包含11 0 k b 碱基对。他们还报道了由功能基 因分隔的两个亚簇编码的聚酮合酶基因组，包含两个主要的基因p i m s o 和 p i m s l ，p i m s o 编码一个相对较小的乙酸激活聚酮合酶( p k s ) 基因( 大约 1 9 3 k d a ) ，p i m s l 编码一个巨大的多酶基因( 大约7 1 0 k d a ) 。 2 0 0 0 年，a p a r i c i oj f f o u c e sr 等人【2 3 】报道了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉 菌的一个含1 6 个开放读码框，8 4 9 8 5 b p 基因簇的序列，它是继制霉菌素后报 道的第二个多烯大环生物合成基因簇，它编码聚酮合酶( p k s ) 的1 3 个同源 酶基因，p k s 被分配在五个巨大的多酶系统中( p i m s 0 p i m s 4 ) 。同年，m a r t a v m e n d e s ，j e s u sf a p a r i c i o 等人【2 4 】又研究报道了纳塔尔链霉菌中的一个隐蔽 质粒p s n a i 的基因图谱和全部核苷酸序列，d n a 分子大小9 3 6 7 b p ，g + c 的 含量占7 1 3 ，拷贝数3 0 。p s n a l 包含七个开放阅读框，分别编码不同的蛋 自质。 2 0 0 1 年，m a r t avm e n d e s ，e l i s e or e c i o 等人【2 月报道了从纳他霉素产生菌 纳塔尔链霉菌中获得的目的基因片段p 切d ，它编码细胞色素p 4 5 0 环氧酶， 负责将4 ，5 一去环氧匹马霉素( 4 ，5 d e e p o x y p i m a r i c i n ) 转变成匹马霉素。4 ，5 一 去环氧匹马霉素是一种生物活性物质，是从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的 一个重组突变体中分离得到的。 目前，基因工程在抗生素生产中的应用还是初步的，关键问题是对抗生 素生物合成途径和代谢调节机理的认识非常有限，但随着人们对抗生素合成 基因研究的不断深入，基因工程在提高抗生素产量方面是大有可为的，它是 天津科技人学硕士学位论文 目前生物技术研究中最接近产业化的领域之一。 1 8 纳他霉素分离提取的研究概况 纳他霉素的分离提取方法有很多。包括从发酵液中用混合性极性溶剂如 甲醇、r 醇和丙酮，采用吸附、洗脱法提取纳他霉素；用限制性水溶性有机 溶剂萃取纳他霉素；盐析法提取纳他霉素，包括溶剂溶解，蒸发和纳他霉素 析出；体积浓缩并从过滤后的发酵液中用丁醇回收纳他霉素，获得一种抗真 菌混合物原液，从中可分离纳他霉素以及在低p h 条件f 用甲醇溶解纳他霉 素，然后除去固形物，提高口h 以沉淀析出纳他霉素。这些提取过程。般要求 多级纯化，操作费用比较昂贵，而且纳他霉素对酸降解非常敏感，存在提取 量低的缺点。 1 9 9 9 年8 月，美国专利5 9 4 2 6 1 l 【2 刨报道了一种有效的提取高质量纳他霉 素的方法，该方法的提取过程主要包括四步： ( 1 ) 用错流过滤发酵液，浓缩至发酵液浓度达到1 0 5 0 ( w ) ，浓 缩过程中，可以在5 0 7 0 。c 条件下加热发酵液以提高蒸发量和过滤速率。 ( 2 ) 调节发酵液的p h 在1 0 1 1 ，添加足够量的水溶性有机溶剂如乙醇、 丙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等溶解发酵液中的纳他霉素。可通过加抗氧 化剂如抗坏血酸、b h a 、b h t 等来进一步提高纳他霉素的稳定性。 ( 3 ) 通过错流过滤除去没有活性的发酵不溶物。 ( 4 ) 调节过滤液的p h 在5 5 7 5 范围内，使纳他霉素沉淀。过滤得到 析出的晶体，可用于进一步纯化，干燥。 通过这种方法，干燥产品纯度可达9 4 9 9 ( 无结晶水计算) ，纳他霉素 回收率可达4 0 7 0 。 1 9 发酵罐工艺参数及放大原则 1 9 1 发酵工艺参数 纳他霉素是典型的微生物次级代谢产物。微生物的次级代谢是指微生物 在一定的生长时期( 一般是稳定生长期) ，以初级代谢产物为前体，合成一些 对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。初级代谢的生理功能是为 机体提供能量和中间产物，并利用它们合成复杂的细胞物质，这是维持生命 活动所必须的代谢过程，贯穿于生命活动始终，与菌体生长平行。而次级代 谢一般只是在菌体对数生长后期或稳定生长期进行，次级代谢中酶的专一性 低，次级产物的合成从起始物到终产物，并不是沿着一个途径以同一路线进 行合成，而是一种“代谫f 网络”( m e t a b o l i cn e t w o r k ) 途径。由于培养条件差 异或菌稃不同，微生物次级代谢产物的主要合成途径不同。因此，控制好发 酵过程各项工艺条件，才能使代谢朝着有利于合成纳他霉素的方向进行。 为了满足菌体大量增殖和合成抗生素对氧的需要，可以通过两种途径来 i 前毒 增加设备的供氧能力： ( 1 ) 增加搅拌系统的功率 ( 2 ) 增加空气流量即提高空气线速度 搅拌功率和通气效率之间的关系可用如下经验公式表示： k l a = k ( p v ) “( u 。) ”( n 。p p ) 。 k l a 供氧系数，h 1 。； p v 单位体积液体实际消耗的功率( 指通气情况下的功率) ， k w m 3 ： 1 3r 空气直线速度，1 l ； r l 。p p 液体的表观粘度，厘泊： n 、b 、u 指数。 一般地讲，a 比b 大，即搅拌转速对溶解氧的影响远比空气流速大，因 此，在发酵过程中低通气量可以用增加搅拌转速的方法来弥补供氧，但低搅 拌转速用高通气量来弥补时，k l a 增加有限。在实际发酵过程中，通气量和 搅拌转速的增加都有一定的限度，过大的通气量和过高的搅拌转速有时会给 抗生素生产带来负面影响。通气量过大会形成“过载”现象，也就是说，随 着u 。值的增加，大气泡造成更强的湍动，使叶轮不能分散空气，此时气流形 成的大气泡从轴的周围逸出，形成“过载”现象，k l a 值不再随u ，的增加而 增加。通气量过大还会造成泡沫增加、发酵液蒸发浓缩、祜度上升等不利因 素。搅拌转速过高不仅消耗大量的动力，还会造成菌丝体断裂，从而影响抗 生素的产生。因此，在抗生素发酵华产中，通常采用低空气流量和适宜的搅 拌转速以控制一定的溶解氧水平。 1 9 2 发酵罐放大原则 发酵罐的放大是发酵过程中的一个重要课题。在发酵罐放大中，主要需 解决放大后生产罐的空气流量、搅拌转速和搅拌功率消耗等三个问题。 发酵罐的放大一般采用以下方法【5 “： 1 几何尺寸放大 2 空气流量放大 以单位培养液体积中空气流量相同的原则放大 以空气直线流速相同的原则放大 以k l a 值相同的原则放大 3 搅拌功率和搅拌转速的放大 以单位培养体积所消耗的功率相同原则放大 以单位培养体积所消耗的通气功率相同原则放大 以气液接触中溶氧传质系数k l a 相同原则放大 ( i ) 几何尺寸的放大 天津科技大学顾f - 学位论文 几何尺寸放大就是按照放大倍数呈比例迸行发酵罐容积的放大，但在实 际操作过程中，随着发酵罐体积的放大，罐中的参数如搅拌转速、罐高、通 风量等对发酵将会产生较大的影响，在抗生索发酵中，很少采用几何尺寸的 放大原则进行发酵罐的放大。 ( 2 ) 功率和搅拌转速的放大 一般工业发酵过程中，采用的较多的是以单位培养液体积通气搅拌功率相等 的原则进行放大，但该方法必须有现有设备的前提，即对现有设备参数有一 定要求，如体积，搅拌功率等。 ( 3 ) 空气流量放大 因抗生素发酵对溶氧要求相当高，因此在发酵过程中溶氧的控制相当重 要。发酵开始由于溶氧高，因此搅拌速度和通风量都不应要求过高，在进行 发酵放大时，采用单位培养液体积中空气流量相同的原则放大相对丽言比较 可行。 1 1 0 活性炭性质简介 活性炭是一种多孔吸附材料，内部孔隙结构极其发达，其比表面积较高， 具有良好的吸附性能，经验表明大部分的有机分子被截留在活性炭的表面， 所以它有范围很广的吸附活性。活性炭常用无烟煤、烟煤、石油焦、泥炭、 木材和椰子【2 ”制成。它主要有粉状炭与粒状炭两种，本实验所用的活性炭就