（发育生物学专业论文）五爪金龙花药发育过程中钙、多糖和脂类的分布.pdf

摘要 本实验采用焦锑酸盐沉淀技术定位钙离子，采用组织化学染色技术定位多糖 和脂类，通过光学显微镜、透射电镜的观察，对五爪金龙( 勿d m d 8 口c 口州c 口( l ) s w e e t ) 花药发育中钙离子、多糖、脂类的分布特征进行了较为详尽的研究。结 果如下： ( 1 ) 利用超薄切片和透射电镜技术，对五爪金龙花药发育过程中的内部结 构观察发现，五爪金龙花药较为特殊之处有两点：药室壁有两层中层，内中层 在二胞花粉晚期退化；绒毡层为异型绒毡层，具有双重起源。由药壁细胞在造 孢时期形成药壁绒毡层，由药隔细胞在小孢子母细胞时期形成药隔绒毡层。但两 种绒毡层在形态结构、解体时间等方面，无明显差别。 此外，通过透射电镜的观察，将五爪金龙花粉壁的发育过程概括为：四分体 时期，花粉外壁开始形成。到小孢子晚期，花粉内壁开始发育。此时，花粉外壁 可明显区分为覆盖层、基粒棒层和外壁内层。二胞花粉时期，花粉内外壁继续发 育，花粉内含物逐渐增多，花粉体积显著增大。 ( 2 ) 利用焦锑酸盐沉淀技术和透射电镜技术对五爪金龙花药发育中钙离子 的分布进行观察，结果显示： 造孢细胞时期，钙颗粒主要分布在造孢细胞的细胞质中。小孢子母细胞时期， 钙颗粒集中在胼胝质壁内。四分体小孢子中，钙颗粒分布于胼胝质壁和小孢子外 壁原基处。此后小孢子的发育过程中，钙颗粒主要分布在小孢子细胞的液泡形成 处和液泡内。此外，小孢子壁的外壁外层及内壁中也分布有较大钙颗粒，而呈片 层状的外壁内层中钙颗粒细小且数量较少，最后消失。在二胞花粉中，花粉内壁 中钙颗粒消失，只在花粉外壁外层有分布。根据以上结果推测钙离子在花粉发育 过程中的主要作用有：参与胼胝质壁的形成和解体，参与大液泡和花粉壁的形成。 在药壁组织中：小孢子母细胞时期之前，药壁细胞内钙颗粒较多。表皮细胞 的大部分钙颗粒分布在液泡中，而药室内壁和中层细胞中钙颗粒主要分布在液泡 边缘、细胞质及细胞壁中。到四分体时期，表皮、药室内壁和中层的钙颗粒略有 减少，并持续到小孢子发育晚期。形成二胞花粉之后，钙沉淀进一步减少。绒毡 层细胞中：解体前，钙颗粒分布在细胞壁边缘；在小孢子早期解体后，钙颗粒则 分布于细胞残迹中，而且由绒毡层形成的乌氏体表面有明显的钙颗粒。药隔组织 及维管束木质部的细胞壁、液泡边缘或液泡中始终有钙颗粒分布，但在二胞花粉 时期明显减少。根据以上结果推测：在花药发育早期，植物体内钙离子通过药隔 组织先运输到药壁细胞中。从小孢子母细胞到小孢子发育晚期，药壁细胞中的钙 离子被转运到药室中。此时，由绒毡层细胞形成的乌氏体，可将钙转移到解体的 胼胝质壁和小孢子壁中。二胞花粉时期之后，由于药室内花粉对钙离子的需求减 少，较多的钙颗粒集中在花粉外壁和药室腔内的营养物质中。 ( 3 ) 利用半薄切片和组织化学染色技术，对五爪金龙花药发育中多糖和脂 类的分布进行观察发现： 造孢细胞中有较多的多糖颗粒，但无脂滴。小孢子母细胞减数分裂之前，细 胞内多糖颗粒消失，出现了细小的脂滴。小孢子母细胞减数分裂之后，细胞内脂 滴减少，但重新出现了多糖颗粒。直到小孢子发育晚期，形成大液泡后，脂滴才 开始增多。小孢子有丝分裂后，二胞花粉中积累的多糖和脂滴逐渐增加，成熟花 粉中有大量的多糖和脂滴物质。造孢细胞时期，花药壁的表皮细胞已有较多多糖 颗粒，母细胞时期药室内壁细胞中也出现多糖颗粒。之后，表皮和药室内壁细胞 中一直分布有较多的多糖颗粒和较少的脂滴。从母细胞时期到四分体时期，内中 层细胞中有较多脂滴。解体前的绒毡层细胞中没有多糖颗粒，也无明显脂滴分布。 小孢子早期解体后的绒毡层转变成脂类物质，积累在药室腔内。二胞花粉时期， 内中层细胞也退化，其细胞质物质同样转变成大量的脂类物质。 根据花药中多糖和脂滴的分布，可将花粉发育中多糖和脂类物质的作用分为 两个阶段：二胞花粉之前，小孢子内的多糖可能用于胼胝质壁和花粉内壁的合成， 而脂滴则与液泡膜及花粉外壁的合成有关。二胞花粉以后，花粉中的多糖和脂滴 作为营养物质大量储备，为之后生殖细胞的发育、花粉管的萌发等过程提供原料 和动力。花药壁细胞营养物质的转运过程也可分为两个阶段，绒毡层细胞退化前， 由绒毡层细胞吸收，转运营养物质到药室中；绒毡层细胞退化后，则由内中层细 胞吸收转运。最后，内中层细胞的降解物也作为二胞花粉中营养物质的来源。 关键词：五爪金龙花药钙多糖脂类 i l a b s t r a c t t h ed i s t r i b u t i o no fc a l c i u m ，p o l y s a c c h 撕d ea n dl i p i di i ld e v e l o p i n g 锄血e r so f 勿。所d 口口柳叩( l ) s w e e tw a s s t u d i e db yu s i n gp o 缸坞s i 啪a i l t i m o m t et e c h l l i q u ea i l d l l i s t o c h e i i l i c a ls t a i l l i n gt e c h i l i q u e t h es u r f a c ec h a r a c t 耐s t i co fm em i c r o s p o r ea i l d p o l l e i lw a s a l s oo b s e r v e db y u s i i l gs c a n l l i n gm i c r o s c o p e t h er e s u l t sa r ea sf 0 1 l o w s ： ( 1 ) f r o mt l l eo b s e a t i o no f 仃a 1 1 s i i l i s s i o ne l e c t r o i l ，i tw 鹊f o u n dm a t 廿l e r ew e r e 觚。戚d d l el a y e r si i lm e 锄m e rw a l l 锄dt l l ei i l l l e rm i d d l el a y e rc e l l sd e g e i l e r a t ea tm e b i c e l l a rp o l l e i ls t a g e 证t h ed e v e l o p i n ga n m e r so f 上伽f c 口( l ) s w e e t t h et 印咖n c e l l sw e r ed i m o 印m ca 1 1 dd u a lo r i 咖a t i o n ：t l l ec o 皿e c t i v et 印e t u i l l ( c t 印e t u m ) i s d e r i v o df r o mm ec e l l so fm ec o i l l l e c t i v e ，a i l dm ep 捌e t a lt 印e t u m ( p - t a p e t u m ) 五吣m m ep a r i e t a lc e l l s t h ec - t a p e t u mw a sf o m e da tt l l es t a g eo fm i c r o s p o r em o m e rc e l l ， 觚dm ep t a p e 劬na t 也es t a g e0 fs p o r o g e i l o u sc e l l t h ep r o c e s so fp 0 1 1 吼w a l lf o m l a t i o nw a sa l s oo b s e e du s i n g 仃a i l s m i s s i o n m i c r o s c o p e s t e 仃a dm i c r o s p o r eb e g a nt of o mi t sp 矗m e x i n e ，a l l d1 a t em i c r o s p o r e f o mi t si n t i l l e t l l ep 0 1 l 钮e x i i l ec o u l d b ed i v i d e di n t ot l l r e e1 a y e r s ：t e c t u m ，b a c u l 啪 a i l de i l d e x i n e a tt 1 1 eb i c e l l u l a rp o u e ns t a g e ，m ei n t i n ea n de x i n ec o n t i m l e dt od e v e l o p ， a 1 1 dm ep 0 1 l e ni i l c l u s i o n 伊a d u a l l yi n c r e a s e d ，w 】蚯c hl e dt om eo b v i o u s l ye m a r 酉n g v o l u 】 i l eo fp o u e n ( 2 ) f r o mm eo b s e a t i o no fd i s t r i b u t i o no fc a l c i 砌i nt 1 1 ed e v e l o p i n ga i l t l l e r s ， m a i l yc a l c i u mp r e c i p i t a t e s 印p e a r e di i lm ec y t o p l a s mo fs p o r o g e n o u sc e l l t h e l lm e p r e c i p i t a t e sm o v e d i n t ot 1 1 ec a l l o s ew a l lo f m i c r o s p o r em o 廿1 e rc e l l s a tm et e 跏s t a g e ， m 锄yc a l c i u mp r e c i p i t a t e sw e r cs t i l li nm ec a l l o s ew a l l ，w m c hc o n c e i 】l t r a t e di i lt l l e p r i m e x i n e o fm e m i c r o s p o r ew a l l d u n g1 1 1 i c r o s p o r ed e v e l o p m e n t ， c a l c i u m p r e c i p i t a t e sw e r em a i n l yl o c a t e di i lv a c u o l e s 孤dp o l l e nw a l l i i lf i o n n i n gp 0 1 1 e nw a l l ， m a r l yb i gc a l c i 啪p r e c i p i t a t e sw e r ed i s t r i b u t e di i lt 1 1 ee c t e x i n ea i l di n t i n e ，b u ta f e wi i l m ee n d e x i n e ，a 1 1 dm e nm e p r e c i p i t a t e si ne n d e x i n ed i s a p p e a r e di i ll a t em i c r o s p o r e a t m eb i c e l l u l a rp 0 1 l e n ，c a l c i u mp r e c i p i t a t e sw e r eo i l l yf o u n di ne c t e x i n e f r o mm e c a l c i 啪d i s t r i b u t i o n ，i tc o u l db es p e c u l a t e dm a tc a l c i 哪m i 9 1 l tp l a ys e v e r a lr 0 1 e s 访 p o l l e nd e v e l o p m e n t ，f o re x 锄p l e ，i i lm ef o 衄a t i o na n dd i s n e 黟a t i o no fc a l l o s ew a l l ， i 1 1l a 玛ev a c u o l ef o 锄a t i o na n di np o l l e i lw a uc o n s 仇l c t i o n m a r l yc a l c i u mp r e c i p i t a t e sw e r ei n 吐1 e 锄m e rw a l lb e f o r et l l em i c r o s p o r em o m e r c e us t a g e t h ep r e c i p i t a t e sw e r em a i l l l yl o c a t e do nt l l ee d g eo ft h ev a c u 0 1 e sa 1 1 di nt l l e i i i c y t o p l a s ma n dc e l l w a l lo fe i l d o m e c i u m ，m i d d l el a y e ra n dt 印e t u m h o w e v e r i i l 印i d e m i cc e l l s ，t l l ep r e c i p i t a t e so i l l ya p p e a r c di nt 1 1 ev a c u o l e f r o mm et e t r a ds t a g et 0 l el a t em i c r o s p o r es t a g e ，c a l c i u mp r e c i p i t a t e si na n t h e rw a l ls l i g h t l yd e c r e a s e d a r e rt l l eb i c e l l u l a rp o l l e l ls t a g e ，c a l c i 啪p r e c i p i t a t e s 如n 1 1 e rd e c r e a s e d h 1 t 印e t u mc e l l ，b e f o r et h ed e g e i l e r a t i o no ft a p e 嘶，c a l c i u mp r e c i p i t a t e sw e r ed 印o s i t e d i nm ec e nw a l l a 盘e rt h et a p e t u md e g e n e r a t i o n ，s o m es m a l lc a l c i 啪p r e c i p i t a t e s d 印o s i t e di i lm ec ”o p l a s m i cr e m a i n s t h ec a l c i u mp r e c i p i t a t e sw e r ef o u n do nt l l e s u r f a c eo ft 1 1 et a p e t a lu b i s c hb o d y d u r i i 培锄血e rd e v e l o p m e 咄s o m ec a l c i 伽 p r e c i p i t a t e sw e r ea l w a y sf o u n di 1 1m ec e nw a l l ，i nm ev a c u 0 1 ea i l do nt h ee d g eo fm e v a 吼l o l emt l l ec 0 衄e c t i v ec e l l s ，b u ti i lt h eb i c e l l u l a rp o l l e ns t a g e ，i td e c r e a s e dr a p i d l y i tc o u l db ei b r r e dm a ti nt h ee a r l ys t a g eo fa 芏 l t h e r c a l c i u mw 嬲嘶l s p o r t e dt 0 锄m e rw a l lc e l l sb yc o 皿e c t i v et i s s u e b e 觚e e nt l l es t a g eo fm i c r o s p o r em o t l l e rc e l l a i l dt h el a t e1 1 1 i c r o s p o r es t a g e ，c a l c i u mw a s 仃a i l s p o r t e dt oa n m e rc h 锄b 盯t l l eu b i s c h b o d i e s ，o nw h o s es u m 赋：ss o m ec a l c i u mp r e c i p i t a t e sd 印o s i 锄，c o u l dt r a i l s p o n c a l c i u mt o 1 ec a l l o s ei n 廿l ed i s i n t e 笋a t i o nt e 仃a d ，t om e m i c r o s p o r ep r i m e x i n ea 1 1 dt l l e p o l l e nw a l l a r e rm eb i c e l l u l a rp o l l e ns t a g e ，b e c a u s em ed e i i l a i l df o rc a l c i 啪 d e c r e a s e di i lp o u e l l 黟a i n s ，ca _ i c i u mp r e c i p i t a t e sw e r em a i l l l yf o u n di nm ee x i n e ( 3 ) t h ed i s t r i b u t i o no fp o l y s a c c h 撕d e sa 1 1 dl i p i d si nm ed e v e l o p i n ga l l n l e rw e r e c h e c k e du s i n gl l i s t o c h e i i l i c a ls 诅i 血n gt e c q u e s s o m ep o l y s a c c h 撕d e sa c c u m u l a t e d i nm es p o r o g e l l o u sc e l l h o w e v b e f o r em em e i o s i so fm i c r o s p o r em o m e rc e l l ( m m c ) ，m ep 0 1 y s a c c h 撕d e si nm em m c sd i s a p p e a r e da i l d s o m es m a l l1 i p i d s a p p e a r e di 1 1m ec e l l s a r e rt h em e i o s i so fm m c s ，l i p i dd r o p sd i s a p p e a r e da i l d p o l y s a c c h 撕d e sa p p e a r e da g a i ni nt e t r a di i l i c r o s p o r e s h ll a t e ri i l i c r o s p o r e s ，al a 玛e v a c u o l ef o m e da i l dl i p i d s 印p e a r e da g a i n a r e rm i c r o s p o r em i t o s i s ，m el 鹕ev a c u o l e d i s i n t e 黟a t 酣a i l dm a j l yp o l y s a c c h 撕d e sa 1 1 dl i p i d sa c c 啪u l a t e di nb i c e l l u l a rp o l l e n 伊a i n s a ta l l t l l e s i s ，t h em a n l r ep o l l e n 伊a i n sw e r ef i l l e dw 汕p l e i 蚵o fp o l y s a c c h 撕d e s a n d l i p i d sa ss t o r a g en u 仃i t i o n d u r i n ga n t h e rd e v e l o p m e n t ，t h e r ew e r es o m ep 0 1 y s a c c h 撕d e sf i r s ta p p e 撕n gi i l t l l e 印i d e n n a lc e l l so f 卸t l l e rw a l l a tm es p o r o g e n o u ss t a g ea 1 1 d 竹l e l li i lm e e i l d o m e c i 啪a lc e l l sa tm i c r o s p o r em o t h e rc e ns t a g e a r e rt 1 1 a t ，m o r ep o l y s a c c h a r i d e s a 1 1 daf e wl i p i d sw e r ea l w a y sf o u n di nm e 印i d 锄i sa n de n d o t h e c i 啪a lc e l l s b e f o r e t 印e n l i i ld e g e n e r a t i o n ，n op 0 1 y s a c c h a r i d e sa c c u m u l a t e di n 廿l et 叩e t a lc e l l se x c 印ta f e ws m a l ll i p i d s a te a d ym i c r o s p o r es t a g e ，t a p e t a lc e l l sd e g e n e r a t e d 1 1 1e a r l y i v b i c e l l u l a rp o u e ns t a g e ，m e r 血d d l e1 a y e rd e g e n e r a t o d 趾di 招c y t o p l a s mr e m 础吣w c r e 吣f o 皿e di i l t 0m a n y l i p i d s a c c o r d i i l gt o 也er e s i l l t s ，m ep 0 1 y s a c c h a r i d e sa n d1 i p i d si i l 舢e rd i s p l a ) 罚s o m e m n c t i o n si i la n 也e rd e v e l o p m e n t ：b e f o r eb i c e l l u l a rp o l l e ns t a g e ，m ea c c i 】m u l a t c d p o l y s a c c h 撕d e sm i g h tb er e l a t e dw i mt 1 1 es y l l 也e s e so fc a l l o s ew a i lo fm m c sa n d p o l l e n 锄- 血e t h el i p i d s 皿g h tb er e l a t e d 、7 i r i 也s ) ，1 1 m e s e so fv a s c l l l a rm e m b r a n e 觚d p 0 1 l e ne x i n e a f t e rb i c e l l u l a rp 0 1 1 e i ls t a g e ，d e v e l o p i i 冯p 0 1 l e nn e e d e dt os t o r ep l e n t yo f p 0 1 y s a c c h a i i d e sa n dl i p i d s ，w 1 1 i c h w o u l dp r o v i d ep o w e ra n dm a t i 莉a l si n 也e d e v e l o p m e mo fg 吼耐i v ec e l l sa n dt 1 1 ep r o c e s so fp 0 1 1 e ng e m 血撕0 n k e yw o r d s ：勿d m d p 口f 一l s w e c t ；a i l m e r ；c a l c i ；p o l y s a c c h 撕d e s ；l i p i d s v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体己经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 鹱甬兰物屿 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 唛自兰物】3 ；) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 喀焉生物哮) 实验室完成。 ( 请在以上括号内填写 课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作 特别声明。) 声明人( 签名) ：到欢欢 2 。口f 7 年 9 0 ) 。开花过程中 柱头与花药相接触，有利于自花授粉。但繁育系统的研究表明五爪金龙是自交不 亲和植物，其种子仅能通过异花授粉获得n 捌。然而朱慧等的研究结果表明五爪 第一章前言 金龙处于兼性异交与专性异交之间，以异交为主，需传粉者。一天中的花粉活性 率和柱头可授率都较高，分别达到5 0 与7 0 以上，但花粉活性率峰值与柱头 可授率的峰值并不在同一时间段，分别出现在上午0 9 ：3 0 与下午1 4 ：3 0 - 1 5 ： 3 0 。此外五爪金龙的单花开放到凋谢仅为1 d ，其授粉的机率大大降低。作者分 析这可能是五爪金龙常年开花而极少结实的原因之一n 2 。 1 4 研究目的 高等植物的花药结构复杂，发育迅速。虽然花药的发育过程已基本清楚，但 其复杂的调控机理的研究却刚刚起步。钙离子在植物发育过程中起广泛而重要的 作用，研究花药发育过程中钙离子的动态分布特征可以作为研究这些机理的突破 口。虽然有关钙离子在花药发育过程中的分布特征已有多篇报道，但也呈现出不 同植物中的花药发育过程中钙离子分布的规律有差异的现象，需要对更多植物的 花药发育做研究总结。此外，被子植物花粉发育过程中大分子营养物质的正常运 输和转化是重要的代谢环节，与花粉的育性密切相关。但相关研究资料相对匮乏， 同样需要在不同植物中做深入研究。 另一方面，五爪金龙有重要的医药学、生态学和经济学意义，具有一定的研 究价值。目前国内外关于五爪金龙的研究主要集中在五爪金龙的化感作用、逆境 生理、化学成分、生活史特性、种子萌发、开发利用等方面。有关五爪金龙的生 殖生物学方面的研究却鲜有报道，仅见其传粉生物学和繁育体系的研究，而且结 果不尽相同，有待深入研究。 本研究采用焦锑酸盐沉淀技术定位钙离子，采用组织化学染色技术定位多糖 和脂类，并通过光学显微镜、透射电镜等设备进行观察比较，对五爪金龙花药发 育过程中小孢子和花粉的内部结构，花药中的钙离子、多糖、脂类分布特征进行 了观察、讨论和总结，以期为高等植物有性生殖过程机理的研究提供新的基础资 料，同时为五爪金龙生物学特性研究，控制和利用对策的制订提供有价值的依据。 2 4 第二章花药发育不同时期钙离子分布 第二章花药发育不同时期钙离子分布 2 1 实验材料 供试材料五爪金龙花药采摘于厦门大学校园内，地理位置位于东经1 18 。0 4 ，北纬2 4 。2 6 ，属亚热带海洋性季风气候，温暖湿润。五爪金龙为旋花科 番薯属，多年生藤本植物，在厦门地区三月到十一月开花，盛花期在九月至十一 月。单花生于叶腋，花冠喇叭状，淡紫色，雌雄蕊内藏，5 枚不等长的雄蕊，雌 蕊1 枚，柱头2 裂；蒴果球形，种子黑色，密被毛，少见种子。 2 2 实验器材与设备 电子天平，搅拌器，移液枪，离心管，量筒，称量瓶，玻璃棒，烧杯，p h 测试仪，抽湿机，干燥皿，材料瓶，单面及双面刀片，玻璃条，铜网，铜网盒， 镊子，染色架，封口膜，载玻片，盖玻片，自制睫毛笔，自制2 5 m 】弯头注射剂， 金属胶带，酒精灯，蜡块，烘片机，通风橱，电炉，解剖镜，解剖工具，l e i c a e m k m r 2 制刀机，l e i c au l 仃a c u tr 型超薄切片机，l e i c ad m 础倒置显微镜， l e i c ad m r 光学显微镜，j e m 2 1 0 0 透射电镜，暗室及相关配套设备，等。 2 3 实验试剂及配制 2 3 1 磷酸缓冲液的配制 1 m 0 1 lk 2 h p 0 4 ( n 1 1 )1 m o 儿k h 2 p 0 4 ( m 1 ) p h 7 o6 1 53 8 5 7 27 1 72 8 3 7 48 0 2 1 9 8 7 68 6 61 3 4 本实验选用p h 为7 2 的缓冲液。配制1 m o l lk 2 h p 0 4 和k h 2 p 0 4 ，分别取 7 1 7 m l 、2 8 3 i i l l ，最后将混合液稀释l o 倍，即加d d h 2 0 至1 0 0 0 m 1 。 磷酸缓冲液不具毒性，但不耐贮存，容易长霉菌，需现配现用。 第二章花药发育不同时期钙离子分布 2 3 24 锇酸母液的配制 1 9 装锇酸连安培瓶用洗衣粉洗干净，双蒸水洗两遍，先放置于干燥干净的 烧杯内置于4 冰箱中干燥，然后放置于5 0 1 1 1 l 棕色试剂瓶中，在通风橱中用干 净的玻璃棒打碎，加入2 5 m l 双蒸水，盖紧后封口膜封口，放置于摇床上室温过 夜。配制好后，4 冰箱避光保存。锇酸对皮肤和粘膜有刺激作用，是剧毒药品， 操作时要格外小心。注意在通风橱中配制，并戴手套。 2 3 34 焦锑酸钾母液的配制 称取l g 焦锑酸钾放入1 0 0 1 1 1 l 双蒸水中，在电炉上加热搅拌溶解至少1 小时， 期间需不断加入双蒸水，最后定容至2 5 m l ，封口后4 保存。 2 3 4 前固定液、洗涤液、后固定液的配制 前固定液：取5 i i l l1 0 0 舢 i l o n 。的磷酸缓冲液，1 i i l l2 5 戊二醛，2 5 1 1 1 14 焦 锑酸钾，加双蒸水至1 0 “。最终含5 蛐儿磷酸缓冲液，2 5 戊二醛，1 焦 锑酸钾 洗涤液：取5 i n l1 0 0 i 】彻。儿的磷酸缓冲液，l i i l l2 5 戊二醛，加双蒸水至l0 i i l l 。 最终含5 0 n 吼。儿磷酸缓冲液，1 焦锑酸钾 后固定液：取2 5 i i l l1 0 0 i 】m o 。的磷酸缓冲液，1 2 5 “4 焦锑酸钾，1 2 5 1 1 1 l 4 锇酸，加双蒸水至5 m 1 。最终含5 0 n u n o 儿磷酸缓冲液，1 焦锑酸钾，l 锇 酸 注意：以上试剂均现配现用。因后固定液中含有锇酸成分，有剧毒，有污染， 所配试剂要适量，只需没过材料即可。后固定液使用过后可放入酒精中和，在一 个密闭的玻璃瓶中保存，待集中回收处理，不可随便丢弃。 2 3 5 不完全树脂及完全树脂的配制 本实验采用s p u l l r 树脂，其配方如下： s p u 盯树脂配方 v c d d e r 7 6 3 ( 增塑剂) n s a ( 固化齐i j ) d m a e ( 加速剂) 标准 ( m 1 ) 1 0 o 6 o 2 6 0 0 4 2 6 硬 ( m 1 ) 1 0 0 4 o 2 6 o 0 4 软 ( m 1 ) 1 0 0 7 o 2 6 o 0 4 第二章花药发育不同时期钙离子分布 配置方法：在4 5 烘箱中预先干燥2 5 i i d 小烧杯、牙签、一次性5 i i l l 塑料吸 管。在干燥室内，将小烧杯放置于电子天平上并调零，依次加入前三种试剂，将 其混合均匀。然后加入加速剂，加一滴充分搅拌后再加下一滴，继续搅拌约半小 时。封口膜封好后，在干燥室内放置半小时后使用，以除去搅拌时产生的气泡。 使用后剩余的树脂用封口膜封好置于干燥器中或4 冰箱中备用。不完全树脂即 不加加速剂的树脂。树脂易现配现用，以免放置时间过长，树脂粘度增加而难以 取用和浸透材料。 2 3 6 甲苯胺蓝染液的配制 1 甲苯胺蓝一o 溶于1 四硼酸钠( 硼砂) 中，过滤后使用。 2 3 7 孚尔瓦膜( f o r m v a rf n m ，聚乙烯醇缩甲醛) 的配制 ( 1 ) 配制o 2 o 5 的孚尔瓦氯仿溶液； ( 2 ) 室内预先干燥，并注意防尘。取2 5 m l 烧杯，倒入0 2 o 5 的孚尔瓦 氯仿溶液。用干净的载玻片浸入约3 c i i l ，停留2 秒左右即垂直匀速取出，自然 风干； ( 3 ) 用锋利的刀片沿膜四周刮一刻痕后，将其缓缓斜插入直径1 0 c m 左右 盛有双蒸水的培养皿中，膜即从载玻片上脱落并浮于水面，成暗灰色。若漂浮的 膜显示五颜六色或似白雾并有条纹，说明膜过厚或不均匀，应弃之不用。如将载 玻片两面的膜均切划出刻痕，垂直插入水中，载玻片两边的薄膜可同时脱离载玻 片，得到两张孚尔瓦膜。 ( 4 ) 在漂浮的膜上摆上铜网，排列尽量均匀且不可重叠。摆好后用镊子轻 压一下，以粘牢； ( 5 ) 用载玻片大小的一片干净封口膜轻轻压住膜的一侧边缘，顺势粘住并 翻动，将膜及铜网一起捞出，放在铺有滤纸的培养皿中自然干燥。 2 3 8 醋酸双氧铀染色液的配制 称取2 0 m g 醋酸双氧铀溶于1 m l5 0 的甲醇溶液中，放入搅拌子，在搅拌器 上搅拌2 h 。充分溶解后取下，静止3 h 后方可使用。染色时取用上清液，动作要 轻缓，避免染液浑浊。最好现配现用，不可长期保存。 2 7 第二章花药发育不同时期钙离子分布 2 3 9 冲版，印相与放大所需溶液的配制 2 3 9 1d 一19 显影液及d 一7 2 显影液的配制 d 1 9d 7 2 原液配方：温水( 3 0 5 0 )7 5 0 “7 5 0 m l 米吐尔 2 2 93 1 9 ( 无水) 亚硫酸钠 9 6 94 5 9 对苯二酚 8 8 91 2 9 碳酸钠 4 8 96 7 5 9 溴化钾 5 91 9 9 加水至1 0 0 0 l i l l 依次加入水中，待在搅拌器上充分溶解后再加入下一种药品。d 1 9 直接用 于底片的显影。d 7 2 用于冲印相片，使用前需稀释，原液：水= 1 ：2 ( v ：v ) 。 2 3 9 2 停影液的配制 冰醋酸1 4 i i l l ，加双蒸水至1 0 0 0 1 1 1 1 。 2 3 9 3f 一5 定影液的配制 原液配方：温水( 4 5 5 0 )7 5 0 i i l l 硫代硫酸钠 2 4 0 9 ( 无水) 亚硫酸钠 1 5 9 2 8 醋酸4 8 r n l 硼酸 7 5 9 铝钾矾 1 5 9 加水至 1 0 0 0 m l 上述药品依次加入水中，待充分溶解后再加入下一种药品。可用于洗底片和 相片。 2 4 方法 2 4 1 压片法确定花药发育时期 根据不同长度的采集花蕾。在解剖镜下剥出花药，放置于滴有蒸馏水的载玻 片上，用镊子挤压出花粉，在倒置显微镜下确认时期。将花药长度和时期相对应， 2 8 第二章花药发育不同时期钙离子分布 以便方便取材。每一时期至少采集10 个花药进行电镜制样。 2 4 2 焦锑酸盐沉淀法定位钙离子 2 4 2 1c a 2 + 细胞化学定位原理 焦锑酸钾可使细胞中的钙离子( 主要是贮存钙或称松弛结合钙) 就地沉淀， 在电子显微镜下因电子束不能穿透而以黑色颗粒的形式显现出来。用e g t a 螯合 剂能去除这些颗粒嘞1 。波谱分析这些黑色颗粒绝大部分是钙颗粒沉淀，能谱分析 证实颗粒中锑离子与钙离子的比为2 ：1 啪1 。此法可用于原位定位钙及钙数量统 计。 2 4 2 2c a 2 + 细胞化学定位操作流程 ( 1 ) 取材与前固定 在载玻片上滴入前固定液，解剖镜下迅速取材( 不同时期的花药，用锋利的 双面刀片横切成两半) ，投入前固定液中，适量抽气，使材料沉入瓶子底部。室 温下固定3 h ，以抽气后的时间为准。 ( 2 ) 洗涤 洗涤液洗涤三次，每次3 0 分钟，可置于摇床上加速洗涤。 ( 3 ) 后固定 1 锇酸的后固定液中4 过夜。 ( 4 ) 洗涤 洗涤液洗涤三次，每次3 0 分钟。前两次更换在通风橱中进行，并将废洗涤 液放入废锇酸收集瓶中。 ( 5 ) 脱水 1 0 9 0 的丙酮逐级脱水，每级2 0 分钟。无水丙酮脱水三次，每次3 0 分钟， 均在摇床上进行。 ( 6 ) 渗透( 干燥室中进行) 丙酮：不完全树脂= 3 ：l ，2 小时； 丙酮：不完全树脂= 1 ：3 ，4 小时； 不完全树脂中过夜( 置于干燥皿中) ； 完全树脂4 8 小时( 中间换新鲜完全树脂一次) 。 本实验材料用s p u r r 树脂包埋。 。第二章花药发育不同时期钙离子分布 ( 7 ) 包埋 先往包埋板的包埋孔中注入树脂，约占模具体积一半。用牙签轻轻挑起样品， 在干燥清洁的滤纸上沾一下，以吸取多余的原树脂，然后放入包埋孔中，放置 1 2 h 后在解剖镜下将其摆正，并缓缓注满树脂，液面高度以与模具的上缘持平为 宜。置于6 0 烘箱中2 天。 ( 8 ) 修块、切片 将树脂块从包埋模具中取出，并在解剖镜下修块。用刀片先将包埋块修成约 4 5 。角的四面椎体。材料四周的树脂尽量全修去。顶面一般修成长方形或梯形。 用l e i c au 1 仃a c u tr 型切片机粗切成1 0 0 0 m 厚的半薄切片，用睫毛笔捞出，置于 滴有双蒸水的载玻片上，在烘片机上烘干。用1 甲苯胺蓝染色后，在光学显微 镜下确定发育时期和材料位置及包埋质量，以便进一步选块、修块。最后修出的 面积尽可能小，一般不超过1 硼午。挑选较好的包埋块，每一时期选取2 3 块， 切片厚度约为l o o l l i n 。切片在水面上应呈淡黄色。若为紫色或蓝色则因切片过厚， 应用睫毛笔挑出丢弃。然后用镊子夹取具膜的铜网，将切片捞出，自然晾干后放 入铜网盒中。 ( 9 ) 染色 将塑料染色片弯曲置于染色架上。用镊子将铜网置于染色片的缝隙中，小心 取下染色片，使其恢复平板状，由塑料缝夹住铜网。向铜网有膜覆盖的一面滴加 新配置的2 醋酸双氧铀，染色3 0 分钟。在烧杯中用双蒸水洗涤4 5 次，取出后 放置于滤纸上。另取滤纸剪成条状，吸掉多余水分。自然晾干后，将染色片重新 弯曲于染色架上，取下铜网放入铜网盒中。 ( 1 0 ) 观察，拍照 用j e m 一2 1 0 0 h c 透射电子显微镜，由低倍到高倍观察拍照。拍照时，光轴的 位置调到中央，曝光时间尽量统一。拍照后做一下记录，包括铜网号、切片内容、 质量和底片编号等。 ( 1 1 ) 冲版，印相与放大( 暗室中进行) 取出己曝光的底片，放到底片架上，用d 1 9 显影液显影4 6 分钟，在停影 液中1 分钟后，f 5 定影液中停留约1 5 分钟。流水冲洗3 0 分钟后，再用蒸馏水 洗一遍，置于底片架上晾干。 洗好的底片放置于放大机上，选择放大倍数并调焦。设置相纸曝光时间，调 第二章花药发育不同时期钙离子分布 节镜头光圈大小。相纸曝光后依次浸入d 一7 2 显影液( 2 3 分钟) 、停影液( 2 4 秒钟) 、停影液( 1 5 分钟) 后，流水冲洗3 0 分钟。在上光机上烤干上光。 注意：a 拿放底片时，手必须清洁。可以戴胶皮手套，专门用于拿底片。b 底片放入显影液之前，在自来水中浸泡一下，可使药液分布均匀。c 显影液显影 的时间要根据试剂的新鲜程度和冲洗次数的不同，灵活调整。配制时间越久，冲 洗次数越多，时间需相应延长。特别是底片冲洗，非常关键，最好先试2 3 张， 并洗出照片，看一下显影效果，再用底片架大批量的冲洗。d 由于球面效应，放 大机镜头光圈最好调节在中间位置。如底片不是特别薄或特别厚，不要将光圈调 到最小或最大。e 相纸从定影液中捞出后，可先放到小盆中，在用纱布轻擦药面 后，再放到大盆中流水冲洗。i i 型相纸从清水中捞出后即可上光，照片鼓起后 拔下电源，自然晾干后取下，照片即可光滑平整。 ( 1 2 ) 分析结果 对图片观察比较，分析结果。挑选图片并扫描排版。 2 5 结果 2 5 1 五爪金龙花形态观察及花药压片结果 为了方便描述，我们将花药发育分为造孢时期，小孢子母细胞时期，四分体 小孢子时期，小孢子发育早期，小孢子发育中期，小孢子发育晚期，二胞花粉时 期七个时期。 五爪金龙单花从现蕾到开花平均需要1 0 天时间。花蕾从绿色逐渐到淡紫色， 开花周期短，朝开夕合，约1 2 小时，2 3d 后花冠凋落。 压片后将花药长度和时期相对应，结果如表3 1 和图版i 所示。从造孢时期 到小孢子发育中期，在显微镜下可看到明显的时期差别。小孢子发育晚期，细胞 壁逐渐发育成熟，小孢子或花粉粒的细胞质内部已被细胞壁完全遮蔽，无法确定 详细时期( 图版i ：图1 6 ) 。所以，取材时，3 m m 以上的花药，每一个毫米分 一个材料瓶中。表中所示为一般情况，也有的花药在1 9 i 砌时，已发育到小孢 子中期，所以压片结果只能大概确定时期，以保证时期完整。准确的发育时期， 还需在半薄切片时确定。 表3 1 花药长度及对应时期 第二章花药发育不同时期钙离子分布 t a b l e3 1t l l el 朗g mo f 锄t h e ra n di t sc o 玎e