（环境科学专业论文）石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究.pdf

石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o f d c np c t f o l e u mi n d u s t r y ；t h ep o l l u l i o nc a u s e db yo i l b e c o m e sm o r ea n dm o r es e r i o u s t h e0 i lp o n u t i o nn o td e s t r o yt h ee n v i r o n m e t a l e c o l o g j c a lb a l a n c eb u ta l s 0t h r e a t e nt h eh u m a n sh e a l l h ，s om o f ea n dm o r ec o u n t r i e s p a ya l t e n t i o nt ot h eo i lp o l l u t i o np r o b l c ma n dm a k eg r e a te f f b r t st of i n dab e t t e r t f e a t i n gm e t h o d l or e s o l v ei t m i c r o b i o l o g i c a lf e m e d i a t i o nt e c h n o l o g yh a sb e e n c o n s i d e r e das a t e ，毛c o n o m i c a la n dr e l i a b l em c t h o dt of e m e d i a t eo i li ns o i la n d o i l d e g r a d a t i n gm i c f o o r g a n j s m sp l a yai m p o r t a n tr o l ei nt h et e c h n o i o g y as e r i e s l a b o r a t o r ys t u d i e sh a v eb e e nc o n d u c t e dt 0e v a l u a t et h ee c o n o m i c e f f e c t i o no fg a s o l i n et ot h em i c i d o r g a n i s m si nt h es l u d g e ， i n d e n t i f yt h eg a s o l i n e d e g r a d a t i n gs t r a i n si s l a t e df t o mg a s o l i n c - c o n t a m i n a n t e de n v i r o n m e n t ，e v a l u a t et h e f a c t o r st h o s ew i l la f f e c tt h ed e g f a d a t i o nr a t e0 fs t r a i n s t h er e s u l t e ss h o w ：2g a s o l i n e - d e g r a d a t i n gs t r a i n s ( n a m e da sxa n dz ) i s o l a t e d f 幻mt h es l u d g ed i s c h a r g e df r o mac h a n g s h ao i lf a c t o r yh a v eb e e ni d e n t i f i e da s j e h d d 聊d 以口s 置p ( x ) a n d曰口c f f z “j 5 p ( z )b ym o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a l - b i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n t h e1 6 sr d n as e q u e n c eo fzs h a r e d9 9 h o m o i o g i e s w i t hb 口c f z 地sc e ，e “s ( a h113 4 ) ，w h i c hw a sap u b l i s h e ds e q u e n c eo fr e l a t i v eb a c t e r i a f r o m g e n b a n k ， a n db o t h s e q u e n c e s c o n s t i t u t c dab r a n c h i n p h y l o g e n e t i c t r e e t h e r e f o r e ，t h es t r a i nzw a sc o n s i d e r e da s0 n es t r a i no f 曰口c f ，砌sc e ，p “s t h e 0 p t i u mc o n d i t i o nf b rt h eg a s o l i n ed e g r a d a t i o nb yt h e2s t r a i n si ns h a k i n gn a s ki s ：t h e i n t i o n a lp ho ft h ei n c u b a t i o nm e d i ai s7 0 8 0 ，t h ei n c u b a t i o nt e m p e r a t u r ei s3 7 ， t h es h a k e rs p e e di s1 8 0 r m i n ，t h es e e dv o l u m e1 5 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fg a s o l i n ei s 5 0 0 m g l ，t h en a c lc o n c e n t r a t i o ni s1 0 9 l ，t h co p t i m a lc e n t f a t i o ns d si s1 0 0 m g l ， c u 计i so 1m g l ；t h ep t i m u mc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sf o rxa r eg l u c o s ea n d n h 4 c l ，za r es u g a ra n d ( n h 4 ) 2 s 0 4 t h em u t a n t sb yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n t r e a t m e n th a d g r e a t e rd e g r a d i n ge f f i c i e n c yt h a nt h eo r i g i n a lo n e s ，w i l h1 5 wu l t r a v i o l e tl i g h eh a v i n g b e t t c rm u t a t i o ne f ：f c c to nt h es t r a i n st h a n3 0 wu l t r a v i o l e tl i g h t k e yw o r d s ：g a s o l i n e ；d e g r a d a t i o ns t r a i n ；i s o l a t i o n ；d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ；1 6 s r d n a l i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名：蛮军乡又日期：洲年，月口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：覆舅3 云日期：m 李年，月p 日 导师签名：乞扒v 日期：浏年厂月( 。日 硕士学位论文 1 1 引言 第1 章绪论 石油是一种含有多种烃类( 正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃) 及少量其他 有机物( 硫化物、氮化物、烷烃酸类等) 的复杂混合物，有的石油样品可含2 0 0 3 0 0 种烃类，分子量从1 6 ( 甲烷) 至1 0 0 0 左右，其物理状态包括气体、挥发性液体、 高沸点液体以及固体。全世界大规模开采是从2 0 世纪初开始的，1 9 0 0 年全世界 消费量约2 0 0 0 万吨，1 0 0 年来这一数量已增长百余倍，石油已成为人类最主要的 能源之一【1 1 。当今世界石油工业飞速发展，石油的总产量每年约有2 2 亿吨，其中 1 7 5 亿吨是由陆地油田产生的。但是，在石油勘测、生产、贮运、炼制加工及使 用过程中，由于事故泄漏、操作不当及检修等原因，都会有石油烃类的溢出和排 放，原油、重油、残油以及含油废水均可以进入水体或土壤中，造成严重的石油 污染，使原本脆弱的自然环境更加恶化1 2 ，3j 。自从1 9 6 7 年“t 0 r r yc a n y o n ”油船在 英吉利海峡触礁，将近1 0 万吨石油泄入海域，污染了1 4 0 英里海岸的事件发生后， 世界各国因油轮失事、油井井喷和战争所造成的严重溢油事故时有发生。近2 0 年来，我国油田开发、海运等事业有了很大的发展，但同时百吨以上油污事故已 发生数十起，各港口、近岸水域少量溢油事故也不断发生，石油污染水体和上壤 的面积不断扩大【4 ，5 8 1 。石油采炼业排污的无序管理，私营小规模采炼业无视环境 污染过度膨胀发展，更加加剧了生态环境的恶化。另外从污染性质来看，即使油 井关闭后，其对环境的影响仍会持续相当长的时间1 9 j 。这些都引起了社会各界的 普遍关注，近年来，从中央到地方各大主要媒体对这一问题均作了大量专题报道 【1 0 1 。 1 2 石油污染的危害 随着人类对石油开发的不断增加和石油工业的飞速发展，石油泄漏的途径与 机会变得越来越多。石油烃类大量溢出，应当尽可能予以回收，否则会对环境( 土 壤、地表和地下水) 造成污染，对生态环境造成重大危害。 1 2 1 石油污染对空气的危害 石油燃烧产生的硫的氧化物二氧化硫和三氧化硫会严重污染大气。硫氧化物 对人体的危害主要是刺激人的呼吸系统，吸入后诱发慢性呼吸道疾病，甚至引起 肺水肿和肺心性疾病。如果大气中同时有颗粒物质存在，颗粒物质吸附了高浓度 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 的硫氧化物、可以进入肺的深部，就会大大地加大危害程度。石油燃烧产生的氮 的氧化物和硫的氧化物在高空中为雨雪冲刷、溶解，雨成为了酸雨；这些酸性气 体成为雨水中的杂质硫酸根、硝酸根和铵离子，会严重污染土壤以及水体，造成 生态的失衡。 1 2 2 石油污染对土壤的危害 由于石油特殊的物理化学性质，在它进入土壤后难以去除残留时间长，使土 壤中的碳源大量增加，直接导致土壤中c ：n 比失调以及酸碱度的变化，破坏了 土壤结构，给受污染土壤带来一系列的危害，对污染地区的生态、作物以及人类 健康造成负面影响。具体体现在以下五个方面： ( 1 ) 石油的密度小，粘着力强且乳化能力低，因此在上壤中容易与土粒粘连， 影响土壤的通透性，降低土壤质量。 ( 2 ) 石油类物质进入土壤后，改变了土壤有机质的组成和结构，从而影响了 土壤微生物的生长繁殖，引起土壤微生物群落、微生物区系的变化，大量的石油 不仅堵塞上壤孔隙，对土壤微生物也有抑制作用。 ( 3 ) 石油会附着在植物的根表面，形成粘膜，阻碍根系的呼吸与吸收，引起 根系腐烂，影响作物的根系生长。 ( 4 ) 石油中富含反应基，能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用， 从而使土壤有效氮、磷含量减少，影响作物的吸收。 ( 5 ) 石油烃中不易被土壤吸附的污染物成分可以随地面降水渗透到地下水， 污染浅层地下水环境，影响饮用水的质量。 ( 6 ) 石油经过土壤生态系统的一系列作用后，其某些具有致癌、致突变、致 畸变等作用的成分( 多环芳烃) 在作物各部分中形成积累，从而影响粮食质量， 并进入食物链，进而危及人类健康，被列为重点污染物【3 4 1 1 ，因此对其进行治理， 是摆在我们面前急需解决的问题。 同其它环境介质与污染物类型相比，土壤同石油污染物之间具有更强的亲和 能力，增加了分离的难度和费用。特别值得注意的是这种亲和力随时间增加而加 强，这就是所谓的陈化和封锁【1 2 】。由于土壤环境的组成、结构、功能、特性以及 在自然生态系统中的特殊地位和作用，使土壤环境污染比大气污染、水体污染更 为复杂。 1 2 3 石油污染对水体的危害 据联合国环境规划署报告，流入海洋的石油每年为2 0 0 万吨至2 0 0 0 万吨，以 至在主要的航道上有明显的油膜分布【1 3 】。大西洋及所属海域主航道承担了大量石 油及其产品的运输任务，也是石油污染物最为集中的地方，在公海也聚集着大量 2 石油污染物。太平洋属于污染较轻的，但日本周围、我毽东海、南海及北海沿岸 海面上也常被石油薄膜或团充斥。石油污染物进入水体后，不仅使水体的化学需 氧量升高，面且由于油类降解蔼消耗大量的溶解氧，同时水表层的油膜又阻止了 空气中的氧向水中扩散，造成局部水域的厌氧状态，使水生动物因缺氧而死亡， 水生植物的光合作用也会遭到破坏，给生态系统带来严重危害，污染严重的区域， 还会造成一些抗性弱的物种死亡，其生态系统的恢复需要十年以上的时间，进而 危及人类的健康1 1 4 l 。另外，石油和石油产品具有一定的毒性，鱼类在极微的浓度 下就会成为油臭，不宣食用，同时极少量的硫化物和酚类对鱼类的生存会造成威 胁，严重影响海洋及淡水渔业资源的经济价值【”l ，污染严重的区域，还会造成 些抗性弱的物种死亡，其生态系统的恢复需要十年以上的时闻，进而危及人类的 健康。许多研究表明，在石油开采废水受纳水域及海上油井平台周边水域，水生 生物的生长均受到不同程度的影响，采出水对多种生物的毒性作用存在限量浓度， 化合物的毒性主要来自苯、甲苯、二甲苯、多环芳烃、酚类等物质【l6 ，1 7 】。而对于 水生生物，墨前也已证实多种胍珏s 可对内分泌造成破坏l 珀t 戤。 1 3 石油烃去除方法的研究 目前，石油污染问题引起了国内外人们越来越多的关注，刺激人们发明有效 的石油烃类化合物去除技术方法。对之进行治理的物理和化学处理方法已研究褥 比较成熟，生物降解方法的研究虽仍有争论，健也已取得了较大成果。微生物的 生物降解作用已成为消除环境中石油烃类污染的主要机制。 1 3 1 物理法 物理法的原理是根据石油烃类化合物的物理特性，利用吸附、气提、萃取等 方法将其从气、液、固相中分离出来。主要有以下几种机制： ( 1 ) 吸附法 吸附法是利用多孔性固体吸附剂或表面积较大的亲油疏水多孔材料来处理石 油烃废水的方法【1 9 l 。吸附剂有很强的吸附能力，可以把废水中的可溶性有机物或 无机物吸附到它的表面面除去；亲油疏水多孔材料可以从承面吸附浮油，然后设 法通过解吸从吸附剂中回收附油，而吸附剂可以重复利用。但是作为吸附剂的活 性炭或其它吸附裁的解吸再生往往是一件需要较大投入的工作。 ( 2 ) 自然浮上法 自然浮上法主要用于水面上浮油的处理，是一种最简单的去除浮油的方法。 其作用原理就是利用刮板直接将水面上的石油刮在一起，然后用挡油板收集l 侈】。 ( 3 ) 气提法。 气提法是利用石油烃类化合物高挥发性的特点，透过概械撵用使气流穿过土 3 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 壤其中挥发性或半挥发性的石油烃类。其主要设备是气提塔。 ( 4 ) 萃取法 萃取法是利用与水不相溶解或极少溶解的萃取剂与废水充分混合接触，由于 萃取剂对废水中的某些杂质有更高的亲合力而使它们转入溶剂，然后将溶剂与已 脱除污染物的废水分离，从而达到净化废水和回收污染物两个目的【1 9 ，2 们。萃取法 可用溶解度更小的溶剂去除溶解度较大的油或烃类化合物，也是破乳、集油的一 种方法，而萃取剂可以重复使用。该方法可以用于去除水中的废油和土壤中的废 油。 ： 杂环烃 低分子量多环芳烃 高分子量多环芳烃。1 2 周以后，表土低分子 量的多环芳烃的平均降解率大于5 0 ，而高分子量多环芳烃的降解率很低。同一 时间内，底土的多环芳烃仍然保持较高的浓度。 1 5 2 2 预制床法 预制床技术是在不泄漏的平台上，铺上石子和沙子，将受污染的土壤平铺其 上，厚度大约2 0 c m 左右，加入营养物和水，必要时加一些表面活性剂，定期翻 动充氧，以满足土壤中微生物生长的需要。处理过程中的渗滤液回灌以彻底清除 污染物。该方法实际上是土耕法的一种延续，但是它将污染土壤集中在生物修复 1 7 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 预制床上，具有滤液收集和控制排放系统，可保证理想的工艺条件与处理效果， 防止处理过程中污染物向环境转移，是一项极具应用前景的处理技术。李培军等 人建立污染土壤预制床工程，对不同类型原油污染土壤分别进行堆腐处理，历时 2 个阶段，污染土壤中易分解的石油烃污染物大部分在第l 阶段得到降解，第二 阶段降解率明显降低i _ 7 0 j 。 1 5 2 3 堆肥法 土壤的堆肥处理传统上用于处理农业废物，近年来也用于处理含油污泥和石 油污染的土壤。其目的是为防止污染物向地下水或更广大范围扩散，将受污染的 土壤从污染地区挖掘出来，运输到一个经过各种准备的地点( 布置防渗透底，通 风管道等) 堆放，形成上升的斜坡，并进行生物处理，消除污染物后的土壤可返 回原地或用于农业生产，是生物修复技术中的一种新型替代技术。处理过程中， 向系统加入粪肥、营养物质等土壤调节剂提高土壤渗透性，改善土壤质地，并为 微生物生长和石油生物降解提供能量。微生物既消耗土壤调节剂，又能消耗石油 产品，处理时间一般是1 4 个月。 魏小芳【7 1 】用生物堆肥法处理炼厂含油污泥，经过1 2 0 d 处理后，油泥油含量 低于g b 4 2 8 4 8 4 所规定的3 0 0 毗g 干泥，硫化物含量大幅度的降低，从2 即影g 降到和g g 。 1 5 2 4 生物反应器法 生物反应器法是最灵活的方法，能很好地控制降解条件，最大程度满足微生 物降解所需的最适条件，从而达到较高的处理效率【7 2 1 。用生物反应器处理石油污 染土壤的最典型代表是生物泥浆法( b i o s l u r r y t r e a t m e n t ) 。其主要特征是以水为处 理介质，将受污染土壤置于一专门的反应器中处理，其工艺类似于污水的处理方 法。生物反应器一般建在现场或特定的处理区，通常为卧鼓形和升降机形，有间 隙式和连续式两种。因为反应器可使土壤与微生物及其他添加物如营养盐，表面 r 活性剂等彻底混合，能很好的控制降解条件，因而处理速度快，效果好。生物反 应器处理的过程为：先将受污染的土壤挖掘起来过筛后与水混合成泥浆，在接种 了微生物的反应器内进行处理，同时加入营养物质、表面活性剂、电子受体，鼓 入空气充氧。处理后的土壤与水分离后，经脱水处理再运回原地。反应装置既包 括各种可拖动的小型反应器，也有类似稳定塘和污水处理厂的大型设施。据研究， 使用此反应器，生物降解速度比直接土壤处理快7 0 倍。 巩宗强【7 3 】等通过小型泥浆反应器的运行，确定了生物泥浆法修复多环芳烃污 染土壤的温度、水土比和通气量参数。不同水土比对菲和花的降解影响差别不大， 因此利用生物泥浆反应器进行多环芳烃污染土壤的修复可以采用2 0 ：1 的水土比， 1 8 硕士学位论文 这样既可节约用水，又能保证运行期内土壤不至于结块，也可以充分地利用泥浆 反应器的空间，增加单位体积反应器处理土壤的量。 1 5 2 5 厌氧生物处理法 修复受石油烃污染土壤的研究己开发了生物堆层、堆肥及土壤泥浆反应器等 好氧修复工艺，但分离获得某些降解菌时，一些降解菌伴有产生高生态风险的产 物。最近的研究表明以厌氧还原脱氯为特征的厌氧微生物修复技术有很大的潜力。 徐向阳【7 4 】等研究了士壤泥浆反应器在投加厌氧颗粒污泥条件下修复芳香烃 污染土壤的性能。结果表明，对浓度为3 0m g k g 模拟污染十壤，其土壤泥浆中土 著性厌氧微生物对五氯酚( p c p ) 具有一定的还原脱氯降解活性，2 8 d 平均p c p 的降解速率为o 2 5 8m g k g 。土壤泥浆反应器在厌氧操作条件下对p c p 降解速率 大于好氧条件，而且p c p 降解速率随颗粒污泥投加量的增加而增大。 虽然石油污染土壤的微生物处理方法各有不同，但它们仅仅是工艺技术上差 异，其原理都是微生物降解。例如生物反应器处理，实质上是土耕法和土壤堆肥 法的重新构造，使处理方式更为灵活，提供更优的控制，创造更理想的条件，其 目的仍在于强化微生物降解这一过程，这也正是这一技术的关键。 1 6 分子生物学的应用 环境中存在的大量微生物中，仅有1 可通过传统培养方法在培养皿上进行 培养和进一步分离，而绝大多数细菌要求非常严格的营养条件或是难以培养。近 年来为了更准确、更广泛地研究石油烃降解菌，随后不采取培养手段，而利用基 因组学和现代分子生物技术对石油烃降解微生物进行生物生态分析和基因测序。 自1 9 8 5 年p a c e 等以核酸测序技术研究微生物的生态和进化问题以来，对微生物 的多样性研究进入了一个新的阶段，并逐步发展形成了成型的分子微生物生态学 方法和技术。国际上大量的研究和开发实践证明，分子微生物生态学方法不受微 生物是否可以分离培养的限制、不受微生物在实验室中是否活泼的限制，可以快 速、准确、全面和真实地分析复杂的微生物群落结构。因此，分子生物学方法的 发展为研究石油微生物群落提供了一个新的工具。 目前微生物分子生态学研究的焦点集中在具有保守序列的1 6 sr r n a 上，研 究方法包括1 6 sr r n a 序列分析、核酸探针杂交法、p c r 法、d g g e 法、t g g e 法、r f l p 法等( 见表1 1 ) 。以下分别介绍几类当前主要的分子生物学研究方法 及其在石油微生物生物多样性研究的应用【7 5 】。 1 9 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 传统培养( c u i t i v a t i o n ) 1 6 sf d n a 测序( 1 6 sr d n a s e q u e n c i n g ) d g g e t t g e ( d e n a t u r i n gg c l e l e c t r o p h o r e s i s ) t r f l p ( t e r m i n a lr e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o f p h i s m ) s s c p ( s i n g l e - s t f a n dc o n f b f m a t i o n p o l y m o r p h i s m ) f i s h ( f 1 u o r e s c e n c ei ns i t u h y b f i d i z a t i o n ) 分离可培养微生物不具代表性、j 耗时费力 系统进化分析耗时且易受p c r 偏差的影响 检测群落的迁移，快速 比对行分析 检测群落的迁移，快速 比对行分析 精确，有大量样品的优 势 探测，有可能的自动对 比性分析 印迹杂交( d o t b l o th y b r i d i z a t i o n )探测，评估相对丰度 定量p c r ( q u a n t i t a t i v ep c r )探测，评估相对丰度 易受p c r 偏差的影响，半定 量，需建立克隆文库 易受p c r 偏差的影响，半定 量，需建立克隆文库m 一 易受p c r 偏差的影响，半定 量，需，建立克隆文库 需要序列信息，在种的研究水 平上比较费力 需要序列信息，在种的研究承 平上比较费力 费力 1 6 11 6 sr d n a 序列分析 ： 对r d n a 进行直接测序是检测微生物群落的常用方法之一，r d n a 测序大大 增强了人们检测和鉴定环境微生物的能力。1 6 sr d n a 序列测定与分析方法对不 同细菌的1 6 sr d n a 序列进行同源性比较分析是推断细菌的系统发育及进化关系 的一个重要方法。基本原理是从微生物样本中的1 6 sr d n a 的基因片段，通过克 隆、测序或酶切、探针杂交获得1 6 sf d n a 序列信息，再与1 6 sr d n a 数据库中 的序列数据或其他数据进行比较，从序列差异计算它们之间的进化距离，确定其 在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。y a ht a k a h a t a 等 7 6 】对 日本新泻县k u b i k i 油藏内的超嗜热菌( j i l 即e ，- 肪p ，删d 础f 跆s ) 及其生化性质进行研 究，通过1 6 sr d n a 序列分析，发现其中的超嗜热菌主要是由热球菌属 ( 砌e r 肌d c d c c h s ) 和栖热袍菌属( 砀p 册d f d g 口) 。 1 6 2 核酸探针杂交技术 核酸分子杂交技术是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一种的分子生物学技术。以 核酸分子杂交技术为核心，利用探针分析d n a 序列及片段长度的多态性，具有 特异性强、灵敏度高等特点，所以在生物多样性及生态功能的研究中具有十分重 要的应用价值。杂交方式主要有以下几种： ( 1 ) 荧光原位杂交( f i s h ) 硕士学位论文 荧光原位杂交( f i s h ) 是目前原位杂交技术中较为常用的方法。其原理是： 根据已知微生物在不同分类级别上种群特异的d n a 序列，以利用荧光标记的特 异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中的d n a 分子杂交，检测该特异微 生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，应用于环境 中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测等。 f l s h 技术采用固定细胞，利用1 6 s 或2 3 sr r n a 与荧光标记的特异寡聚核苷 酸探针杂交，再由扫描共焦激光显微镜观察固定的细胞。由于杂交的是整个细胞， 省去了提取d n a ，p c r 扩增仪及克隆等步骤。y u m i k ok 0 d a m a 等i 厂7 j 利用针对古 生球菌属的特异性探针对被原油污染的地下水微生物群落进行f i s h ，对其中的古 生球菌的多样性、丰度及活性进行了研究。 ( 2 ) 数量印迹杂交( q u a n t i t a t i v cd o tb l o t ) 对环境样品中提取的d n a 作数量印迹杂交，可获得有关特定d n a 序列丰度 的信息。其原理是基于专一性探针( 如特定1 6 sr r n a 基因探针) 、通用型探针( 如 总1 6 sr r n a 基因探针) 和环境样品中分离的总d n a 可分别进行杂交，其特定 d n a 的相对丰度可用此两类探针杂交信号的比值确定，间接反映特定的微生物细 胞的数量或特定种群的相对生理活性等。s h a r o n a c h u r c h i l l 等【7 6 l 对被原油污染的 土壤中的多环芳烃( p h a ) 降解菌进行研究，使用编码萘加双氧酶的n a h a 基因 作为探针，评估了萘加双氧酶和分枝杆菌属菌株c h l 中p h a 降解酶的相似度。 ( 3 ) 生物芯片( b i o c h i p ) 生物芯片又称基因芯片，成千上万的网格状密集排列的基因探针。可以分为 c d n a 芯片和寡核苷酸芯片。c d n a 芯片在基因表达研究上具有重大意义；寡核 苷酸芯片主要应用于杂交测序、单核苷酸多态性分析和突变检测。 1 6 3 聚合酶链式反应法( p c r ) p c r 主要特点是能够在短时间内人为地控制目的基因得到无限的扩增，为微 生物分子生态学研究提供非常方便的手段。竞争性p c r 是其中较为常用的方法， 具体是在同一反应条件下，同一试管内同步扩增一段靶序列和另一段内参序列， 作为竞争模板的内参序列与靶序列使用相同的引物，并以相同效率扩增。扩增后， 当二者的终浓度相同时，理论上其模板浓度也应相同。将待测标本与1 0 倍系列稀 释的竞争模板混合，扩增后分别用各自的荧光探针杂交，当混合标本中目的基因 和内参序列信号值相同时，待测标本浓度即为该份混合物中竞争模板的稀释浓度。 1 6 4 基于p c r 的基因指纹图谱技术 实验研究，现在已经有多种d n a 指纹技术，如变性梯度凝胶电泳( d g g e ) ， 温度梯度凝胶电泳( t g g e ) ，限制性片段长度多态性分析( r f l p ) ，末端限制性 2 1 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 片段长度多态性分析( t r f l p ) 。其中d g g e 、t g g e 和r f l p 在石油微生物研 究中使用较为广泛，下面将着重加以介绍。 ( 1 ) 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 1 9 9 3 年m u z y e r s 等首次将d g g e 技术应用于分子微生物学研究领域，并证 实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的 优越性。d n a 序列由于含有的碱基不同，各片段的t m 也就不同，甚至一个碱基 对的不同都会引起t m 很大的差异。d g g e 就是应用这种差异来区分不同的基因 序列。这种电泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺( d g g e ) ，从正极到负极梯度递 加。电泳中的d n a 到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳 动速度发生变化，从而达到分离效果。染色后的凝胶用成像系统分析，还可以半 定量的测定样品d n a 浓度的大小，反映微生物群落组成的变化。 ( 2 ) 温度梯度凝胶电泳( t g g e ) t g g e 技术的基本原理与d g g e 技术相似，利用温度梯度变性的原理，对不 同核苷酸片段进行分离分析，具有方便、结果分辩率高等特点，因此在分子微生 物生态学研究中取得广泛的应用。但t g g e 与d g g e 相比，梯度形成更加便捷， 重现性更强。p u y ic h e u n g 等【7 9 1 年对石油污染土壤微生物降解多环芳烃( p a h ) 进行研究，他们使用分枝杆菌( 坳易口c 纪厂觑柳) 的特异性引物对环境样品进行扩 增，对产物进行t g g e 分离，t g g e 图谱显示，重度污染土壤中微生物群落的多 样性低于轻度污染的土壤中微生物群落。 ( 3 ) 限制性片段长度多态性分析( r f l p ) 1 9 8 0 年，b o t s e i n 提出d n a 限制性片段长度多态性( r f l p ) 可以作为遗传 标记。r f l p 最初比较简单，基于s o u t h e r n 印迹杂交的技术。它是指应用特定的 核酸内切限制酶切割有关的d n a 分子，经过电泳、原位转膜印迹、探针杂交、 放射性自显影后，分析与探针互补的d n a 片段在长度上的简单变化。它可以在 群落水平上提供几乎无穷尽的、反映基因多样性的可靠证据，可作为一种能高度 灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法。 ( 4 ) 末端限制性片段长度多态性( t r f l p ) t r f l p 是一种新兴研究微生物多态性的分子生物学技术，已被成功地应用到 了各种微生物群落的比较分析及结果特征等方面。t r f l p 是根据1 6 sr r n a 的 保守区设计通用引物。其中一个引物的5 端用荧光物质标记，常用荧光物质有 h e x 、t e t 、6 f a m 等。t r f l p 不仅可以进行微生物种类的的定性分析，还可 以进行定量分析；同时技术重复性好，平行样峰也是几乎完全一样的。 硕士学位论文 1 7 石油污染治理的发展方向 1 7 1 存在的问题 石油生物降解是一个复杂的过程，虽已取得很大的发展，但由于受生物特性 的限制，它的降解受各方面因素影响，其还存在许多的局限性。微生物降解菌的 类群、石油本身的组分和理化性质及环境的因素等都可影响石油污染物的降解。 ( 1 ) 微生物不能降解污染环境中的所有污染物，污染物的难降解性、不溶解 性及污染物土壤腐殖质和泥土结合在一起常使生物修复难以进行。 ( 2 ) 一些低渗透性土壤往往不易采用生物修复技术。 ( 3 ) 特定的微生物只能够降解特定的化合物类型，化合物形态一旦变化就难 以被原有的生物酶系降解。 ( 4 ) 生物活性易受温度和其他环境条件的影响。 ( 5 ) 有些情况下，生物修复不能将污染物全部去除，因为当污染物浓度太低 不足以维持一定数量的降解菌时，残余的污染物就会留在土壤中。 1 7 2 石油微生物降解的趋势 石油污染的生物处理是一种环境效益高、经济效益好的技术。虽然己取得一 些成果，但仍很不完善，还需要在以下几个方面进行深入研究。 ( 1 ) 共存物质( 如重金属) 对微生物降解的抑止效应及外源物质( 如表面活 性剂) 对微生物的促进效应。 ( 2 ) 高分子有机污染物降解过程中的共代谢机理。 ( 3 ) 将分子生物学等最新技术引用到石油污染处理上来，开发新的高效遗传 基因工程构建高效降解菌，利用其特异的基因或质粒将污染物快速降解。 ( 4 ) 分子水平上研究石油污染对环境生态的影响及降解过程中菌群变化。 ( 5 ) 生物降解潜力的指标与生物修复水平的评价。 ( 6 ) 生物修复技术的环境风险水平及其评价。 总之，在石油污染治理过程中，一方面要进一步完善生物技术使其成熟；另 方面要注意将传统方法、生物处理方法及现代基因工程技术结合，进而从根本 上治理石油对环境的污染，保护我国微生物的菌种资源。 1 8 研究意义和研究内容 1 8 1 研究意义 目前，随着石油的开发，运输的不断发展，石油污染问题也变得日益的突出 重要。1 9 6 5 年j 0 n e s 和s m i t h 利用微生物处理石油，使石油发生了“物理化学” 变化，从而诞生了微生物降解法。微生物降解是消除环境重污染的一种重要手段， 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 微生物对土壤和水环境中的石油降解起着重要作用。利用微生物对石油污染进行 原位修复，筛选高效降解石油的微生物进行人工接种来强化石油污染物的降解， 已有许多成功的报道。微生物对石油的代谢主要有矿化、代谢和共代谢等方式。 由于微生物治理技术费用低、对环境影响小、适用范围广等优点，因此微生物强 化处理石油污染是近年来研究的热点，对石油污染控制具有重要意义。本课题拟 利用本学院的技术优势，从长沙市某炼油厂排污口污泥中进行样品的采集，通过 系统的筛选工作，以期获得高效稳定、能利用汽油为唯一碳源进行生长的菌株， 并用筛选得到的菌株进行石油降解最适条件的试验，对其降解性能进行了初步研 究，分析了各因素对汽油降解的影响，并研究了其分类学地位，为该菌株进一步 实际应用奠定了基础。 1 8 2 研究内容 本课题的研究目的在于开发出能够真正用于实际大规模工业生产和应用的高 效石油烃微生物降解菌，围绕目的，本课题开展了包括以下几个方面的工作： ( 1 ) 降解功能菌的筛选，驯化：从富含石油烃物质的炼油厂废水的活性污泥 中，通过唯一碳源实验，收集汽油降解菌群，并富集培养： ( 2 ) 细菌鉴定：通过菌落和菌体形态观察及生理生化试验，结合1 6 st d n a 全序列分析，对筛选得到的菌株进行初步鉴定，建立相应的石油降解菌菌种库； ( 3 ) 降解功能菌的影响因子的优化：摇瓶培养，利用紫外分光光度法定量表 达汽油的浓度，测定其降解率，绘制细菌的生长曲线，掌握该微生物的生长特点； 通过单因素实验探索适合菌株生长和汽油降解的最适发酵条件； 硕士学位论文 第2 章汽油降解菌的筛选分离与鉴定 对石油污染土壤的治理，近年来国内外己在物理、化学、生物治理方面取得 了一定进展。但石油是多种烃类的混合，较难降解彻底。利用生物修复技术治理 石油污染操作简便，费用低廉，无二次污染，被公认为进行石油污染修复比较好 的方法。石油污染环境的微生物治理技术，近十几年来在国外做了大量研究，取 得了较大的发展。但由于石油具有较低的溶解度且易吸附到土壤颗粒上等原因， 很难被普通的微生物利用，石油烃类污染降解速度缓慢，致使治理过程延续时间 较长，一直是这项技术的一个突出缺点。因此进行高效石油降解微生物菌株的筛 选、分离是微生物修复技术处理石油的关键。本实验以长沙市某炼油厂排污口的 污泥为菌源，以汽油为唯一碳源，利用直接分离和富集培养分离的方法从中进行 高效降解菌的筛选和分离，并对其进行了初步鉴定，为石油生物降解研究提供了 很好的理论和应用基础，有很大的研究和应用前景。 2 1 实验材料与方法 2 1 1 主要实验仪器 c a 9 2 0 3 超净工作台、电子万用炉、岛津u v 2 5 5 0 紫外分光光度计、高压蒸 汽灭菌锅、电子天平、l r h 2 5 0 a 生化培养箱、b s 1 e 振荡培养箱、冷冻高速离 心机( 上海安亭，t g l 1 6 g ) 、恒温干燥箱、奥林巴斯显微镜、p c r 仪、p h 计、 酒精灯、灭菌培养皿、冰箱、锥形瓶等。 2 1 2 实验菌株 污泥来源：采自长沙市某炼油厂排污口，放入密封袋，带回实验室放置4 冰箱，尽快进行驯化实验； 供试菌种来源：采用常规细菌分离方法从石油污染污泥土著微生物中筛选、 驯化得到。 2 1 3 实验试剂 2 1 3 1 基础实验试剂 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 表2 1 基础实验试剂的规格与生产厂家 2 1 3 2 生理生化试剂 ( 1 ) 革兰氏染色试剂【8 0 i a ：草酸铵结晶紫染液：结晶紫酒精饱和液( 1 0 ) 2 0 m l 、1 草酸铵水溶液 8 0 m l ： b ：卢哥( l u 9 0 1 ) 氏碘液：碘1 9 、碘化钾2 9 、蒸馏水3 0 0 m l ，先用数毫升 蒸馏水溶解碘化钾，再加入碘，不断搅拌使之溶解均匀，最后加蒸馏水至3 0 0 m l ； 溶液应贮藏在棕色试剂瓶中，储于低温暗橱内。有效期为一个月左右。 硕士学位论文 c ：，番红复染液：2 5g 番红( s a f r a n i n eo ，番红花红o ，藏红o ) ，体积分数 9 5 乙醇溶液1 0 0 m l ，取2 0 m l 番红乙醇溶液与8 0 m l 蒸馏水混匀成番红稀释液。 d ：9 5 乙醇溶液 ( 2 ) 甲基红试剂 甲基红0 1 9 ，9 5 乙醇3 0 0 m l ，蒸馏水2 0 0 m l o ( 3 ) 芽孢染色液 a ：孔雀绿染液：孔雀绿5 9 、蒸馏水1 0 0m l 。 b ：番红复染液：番红0 5 9 ，蒸馏水1 0 0m l 。 c ：苯酚品红溶液：碱性品红1 1 9 ，体积分数9 5 乙醇溶液1 0 0 m l 取上述溶 液1 0 m l 与1 0 0 m l 5 的苯酚溶液混合，过滤备用。 ( 4 ) 格里斯氏( g f i c s s ) 试剂 甲液：将对氨基苯磺酸0 8 9 溶解于2 5 m o l l 乙酸溶液1 0 0 m l 中。 乙液：将甲萘胺0 5 9 溶解于2 5 m o l l 乙酸溶液1 0 0 m l 中。 ( 5 ) 3 过氧化氢试剂 ( 6 ) 吲哚试剂 ( 7 ) 奈氏试剂( n c s s l e r ) 将2 0 9 碘化钾溶于5 0 m l 水中，并在此溶液中加碘化汞小粒至溶液饱和为止， 此后再加4 6 0 m l 水和1 3 4 9 氢氧化钾，将上清液贮于暗色瓶中备用。 2 1 3 3c t a b 法提取细菌基因组d n a 所需试剂 5 m o l l n a c i ；t e ：1 0 m m o l l1 一r i s - c l ，1 m m o l le d t a ，p h 8 o ； c t a b n a c l 溶液：4 1 9 n a c l 溶解于8 0 m lh 2 0 中缓慢加入l o gc t a b ，加水 至1 0 0 ml 【8 1 l ： 5 0 t a e 电泳缓冲溶液：在8 0 m l 水中加入2 4 2 9t r i s 碱，5 7 l m l 冰乙酸， 1 0 m l5 0 0m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，加水定容至1 0 0 m l ； 以上试剂1 2 1 灭菌备用。 1 0 s d s ：在9 0 0m l 水中溶解1 0 0 9 电泳极s d s ，加热至6 8 助溶，加入几 滴浓盐酸调节溶液的p h 值至7 2 ，加水定容至1 l ，分装备用，过滤除菌； 酚氯仿异戊醇( v ：v ：v ) = 2 5 ：2 4 ：1 ； 氯仿异戊醇( v ：v ) = 2 4 ：1 。 2 1 4 实验培养基 2 1 4 1 基础培养基 无机基础盐培养基：( n h 4 ) 2 s 0 40 5 9 ，无水c a c l 2o 1 9 ，n a h 2 p 0 41 0 9 ，n a n 0 3 o 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，k h 2 p 0 41 0 9 ，蒸馏水1 l ，用n a o h 调节p h 值至7 。o 。 2 7 石油降解菌的分离鉴定和降解条件研究 无机含油培养基：含油培养基为无机基础盐培养基1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 后加入9 3 # 汽油作为唯一碳源。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 0 9 ，蛋白胨1 0 0 9 ，氯化钠5 o g ，蒸馏