（发酵工程专业论文）碱性蛋白酶的发酵与酶学性质的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本文对一株碱性蛋白酶高产菌株的发酵培养基及发酵条件进行了优化， 并对酶的分离纯化工艺及酶的主要性质进行了研究。本文研究的主要内容和 结论如下： 1 、通过对菌株发酵培养基主要成分的逐个替代实验，实现了生产原料的国产 化，并确定其培养基配方为：棉籽饼粉( 8 0 目) 3 ，酵母浸粉1 7 5 ， 麦芽糊精( d e 3 0 ) 1 0 ，柠檬酸钠o 3 ，c a c l z0 3 ，k 2 h p 0 41 。 2 、对菌株的发酵条件进行了优化，确定了其最适摇瓶发酵条件：种龄1 2 h ， 接种量2 ，装液量5 0 m l 2 5 0 m l ，摇床转速2 0 0 r m i n ，培养温度3 4 ， 发酵5 4 h ，碱性蛋白酶的发酵单位可达3 3 9 8 5 u m i ，达到进口原料的生产 水平。在此基础上进行了7 l 发酵罐发酵工艺的优化，确定其工艺参数为： 装料系数o 6 5 ，接种量5 ，温度3 4 ，转速2 0 0 5 0 0 r m i n ，通风量1 ： 0 5 1 ：2 5 ，溶氧维持在3 0 4 0 。采用自动流加工艺，控制发酵液p h 值不低于7 0 ，发酵5 0 h 。采用该工艺连续发酵三批，碱性蛋白酶产量稳定， 平均为3 6 4 7 1 u m l 。 3 、采用盐析及离子交换柱层析等方法对酶进行了纯化，s d s p a g e 表明纯化 后的样品已达到电泳纯，分子量为2 8 k d a 。经过纯化，酶的比活力达 1 8 6 2 0 2 0 u m g ，纯化了5 2 3 倍，酶活力回收率为2 7 5 4 。 4 、对酶的性质进行了研究。当以酪蛋白为底物时，其最适作用p h 为l o 1 1 ， 最适作用温度为4 0 6 0 。此外，该酶在p h 7 1 2 的范围内稳定，在4 5 左右有较好的热稳定性。 关键词：碱性蛋白酶，嗜碱性芽孢杆菌，发酵，纯化，性质 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dt h ec o n d i t i o n so fah i g hy i e l ds t r a i np r o d u c i n g h i g ha l k a l i n ep r o t e a s ew e r es t u d i e d ，t h ep u r i f i c a t i o na n d t h ec h a r a c t e r i z a t i o no f t h e a l k a l i n ep r o t e a s ew e r ea l s os t u d i e d t h em a i nc o n t e n t sa n dt h er e s u l t so ft h es t u d y w e r ea sf o l l o w s ： 1 t h em a i nc o m p o n e n t so ft h em e d i u mw e r es u b s t i t u t e do n eb yo n e a n da l lo f t h ep r o d u c e r s g o o d sw e r eh o m e m a d e t h e o p t i m u mm e d i u m w e r ec o n s i s to f ： c o r o ns e e dm e a l 3 ，y e a s t e x t r a c t1 7 5 ，m a i t r i n ( d e 3 0 ) 1 0 ，n a c i t r a t e 0 3 c a c l 20 3 ，k 2 h p 0 41 。 2 t h e o p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ec o n f i r m e d ：s e e d a g e1 2 h ， i n o c u l u mv o l u m e2 ，a2 5 0 m lf l a s kc o n t a i n i n g5 0 m lm e d i u m ，2 0 0 r m i n ，3 4 ，a n dt h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t yw a s3 3 9 8 5 u m la f t e rc u l t i v a t e d5 4 h t h e e x p e r i m e n tw a sa l s os c a l e du pi nt h e7 lf e r m e n t o r c o n t r o l l i n gt h ef e r m e n t e d b r o t hp hv a l u eo v e r7 0b yt h ef e e d i n gp r o c e s s ，t h ea l k a l i n ep r o t e a s ea c t i v i t y w a sa b o u t3 6 5 7 9 u m lo f t h ec r u d e e n z y m el i q u o l 3 t h ea l k a l i n ep r o t e a s ew a sp u r i f i e d u s i n ga m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n a n di o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h es p e c i f i ca c t i v i t yw a s18 6 2 0 2 0 u m g 2 7 5 4 o f t h ea l k a l i n ep r o t e a s ew a sr e c o v e r e dw i t h5 2 3 f o i dp u r i f i c a t i o n 4 t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r et o w a r dt h eh y d r o l y s i so f c a s e i nw e r ep h 1 0 1 1a n d4 0 6 0 t h ea l k a l i n e p r o t e a s e w a ss t a b l ea tp n7 1 2a n d a b o u t8 0 o ft h ei n i t i a l e n z y m a t i ca c t i v j t yw a sr e t a i n e da f t e ra1 2 0 m i n i n c u b a t i o n p e r i o da tp h lo 5a n d4 5 k e y w o r d s ：h i g h a l k a l i n e p r o t e a s e ，b a c i l l u sa l c a l o p h i l u s ，f e r m e n t a t i o n ， p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n i i 天津科技大学硕+ 学位论文 第一章前言 碱性蛋白酶( a l k a l i n ep r o t e a s e ) 是指在p h 值为碱性的条件下水解蛋白 质肽键的酶类，其最适p h 一般为9 1 1 ，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类。 碱性蛋白酶除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的 合成。 碱性蛋白酶最早在猪的胰脏中发现。1 9 1 3 年，r o h m 首先将胰蛋白酶作 为洗涤浸泡剂使用。1 9 4 5 年，瑞士的d r j a a g 等发现了微生物碱性蛋白酶， 使蛋白酶有可能广泛应用于洗涤剂工业。1 9 6 3 年，诺和诺德公司( 现诺维信 公司) 发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶a l c a l a s e , 酶制剂被广泛地应用于 洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉；随后的2 0 年中，细菌类蛋白酶是唯一被 应用于沈涤剂的商品化酶制剂。 碱性蛋白酶主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、 食品、环保等工业也有广泛的应用。目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业 酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量的6 0 ，其中碱性蛋白酶就占2 5 。 它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的 许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。 1 1 蛋白酶 蛋白酶( p r o t e a s e ) 是指能催化肽链中肽键水解的一类酶，广泛存在于动 物内脏、植物茎叶果实和微生物中”1 。 按照国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会的规定，蛋白酶属于 第3 类水解酶类的第4 亚类。但由于蛋白酶作用方式和结构的多样性， 往往不能与通用命名系统的命名一致。目前对蛋白酶的划分主要有以下几个 标准”： 1 ) 根据蛋白酶水解蛋白质的方式，可将其划分为： 内肽酶：切开蛋白质分子内部的肽键，生成分子量较小的多肽类。 外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基 酸。其中，作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。 水解蛋白质或多肽的酯键。 水解蛋白质或多肽的酰胺键。 2 ) 按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶； 3 ) 按蛋白酶作用的最适p h 可分为：酸性、中性和碱性蛋白酶。 4 ) 按催化机制，特别是根据酶活性中心起关键作用的催化基团，可将其分为 四大类：丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸( 巯基) 蛋白酶、锌 蛋白酶。 1 2 生产碱性蛋白酶的菌种 第一章前言 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，与动、植物来源的碱性蛋白酶相 比具有适于大规模工业化生产的优点”1 。微生物作为碱性蛋白酶的主要生产 来源，是因为微生物存在物种多样性和生长的快速性。微生物繁殖速度快。 细菌在合适条件下2 0 3 0 m i n 就可以繁殖一代，其生长速度为农作物的5 0 0 倍，为家畜的1 0 0 0 倍。微生物种类繁多，酶的品种全。在不同的环境下生 存的微生物有不同的代谢途径，可以产生适应不同环境的酶分子，如高温酶、 中温酶和低温酶，耐高盐酶、耐高碱酶等。微生物培养方法简单。微生物 培养所用的原料大多为农副产品，来源丰富，机械化程度高，易于大批量生 产，连续发酵生产可以提供经济有效的产品。 碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中( 表1 1 ) ，其中以芽孢杆 菌碱性蛋白酶的研究最为广泛和深入“i 。目前用于碱性蛋白酶工业化生产的 菌种主要有：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌及地衣芽孢 杆菌等“5 。我国用于生产碱性蛋白酶的菌种主要有：地衣芽孢杆菌2 7 0 9 、短 小芽孢杆菌2 8 9 和2 0 9 菌株”、嗜碱性短小芽孢杆菌b 4 5 等。 表1 1 碱性蛋白酶生产菌株 菌株菌株 枯草杆菌旧s u b t i l i s )芽孢杆菌( b a c i l l u sk a t a s e n s i s ) 嗜碱性芽孢杆菌饵a l c a l o p h i l u s )立德链霉菌阻r e c t u s ) b a c i l l u s f i r m u sr n r r i ，b11 0 7 )费氏链霉菌限f r a d i a e ) 短小芽孢杆菌沮p u m i l u s )灰色链霉菌岱g r i s e u s ) 地衣芽孢杆菌( 丑l i c h e n - i f o ，研西)鬼伞菌( c o p r i n u s m a e r o h i z u s ) 马铃薯杆菌& m e s e n t e r i c u s )蓝棕青霉陴c y a n e o 册l v u m ) 粘质赛氏杆菌( s e r r a t i am a r e s c e n s ) 细极链格孢l t e r n a r i at e n u t s s i u m a ) 纳豆芽孢杆菌( b a c i l l u sn a t t o )嗜热圆酵母( t o r u l at h e r m o p h i l a ) 棕曲霉口o c h r a c e u s )小球菌( m i c r o c o c c u ss o c l o n e n s i s ) 米曲霉似o r y z a e )头孢霉( c e p h a l o s p o r i u m l 黄曲霉似t l a v , , s ) 节杆菌r t h r o b a c t e r s p ) 酱油曲霉似s o j a e )假单孢菌( p s e u d o m o n o ss p 1 栖土曲霉翻t e r r i c o l a )镰刀菌( f u s a r i u ms p ) 萨氏曲霉口s p e r g i l l u ss y d o w i )解脂假丝酵母( c a n d i d al i p o l y t i c a ) 硫曲霉翻s p e r g i l l u ss u l p h u r e u s )蜂蜜曲霉似s p e r g i l l u sm e l l e u s ) 1 3 碱性蛋白酶的分类 来源于b a c i l l u s 的枯草杆菌蛋白酶称为枯草杆菌溶蛋白素( s u b t i l i s i n ) ， 包括：s u b t i l i s i nc a r l s b e r g ( 即卡斯柏格枯草杆菌溶蛋白素，丹麦n o v o 药厂用 枯草杆菌制造的一种碱性蛋白酶) 、s u b t i l i s i n n o v o ( n o v o 药厂另一株枯草杆 菌生产的碱性蛋白酶) 、s u b t i l i s i n b p n ( 也称为细菌蛋白酶n a g a s e 或b p n ， n a g a s e 公司枯草杆菌n 所产的碱性蛋白酶) 以及s u b d l i s i na n y l o s a c c h a r i t i c u s 天津科技大学硕十学位论文 ( 枯草杆菌糖化型0 【一淀粉酶产生菌所产的碱性蛋白酶) 等多种。 k e a y 将不同类型芽孢杆菌生产的碱性蛋白酶分为两种类型”： a 型为c a r l s b e r g 型枯草杆菌碱性蛋白酶：由短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆 菌生产的酶，其性质和结构与枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶一致。这类菌株只生 产碱性蛋白酶一种。 b 型为n o v o 型枯草杆菌碱性蛋白酶：由枯草杆菌淀粉糖化变种及枯草杆 菌n r r l b 3 4 1 1 产生，与b p n 或n o v o 枯草杆菌碱性蛋白酶相一致。这类菌 株除生产碱性蛋白酶外，还生产中性蛋白酶。 a 、b 两型碱性蛋白酶在免疫学分析上没有交叉反应，用抗n o v o 型( b 型) 血清同c a r l s b e r g 型( a 型) 相混合后，生成沉淀极少，说明两者分子结 构很不同，这与氨基酸排列顺序和构象上存在区别是符合的。a 型p h 活性曲 线比b 型陡。在酯酶活性上，酯酶活性与蛋白酶活性之比，a 型强于b 型。 一般认为a 型酶组成的洗涤剂除污效果好，主要因为它在洗涤溶液中随温度 的降低活性下降缓慢。 两种蛋白酶的高级结构已阐明，其化学性质几乎没有差别。a 型和b 型 的分子量分别为2 7 5 3 2 d a 和2 7 2 8 7 d a ，各有2 7 5 和2 7 4 个氨基酸残基。二者 的一“级结构和酶的构象存在很大差异，彼此间有8 3 个氨基酸不同，但在活性 部分的肽段第6 4 7 4 、第2 1 8 2 2 9 个氨基酸的顺序却完全相同。它们性质相 似，最适反应温度为6 0 ，最适p h 为1 0 ；均由s e t 2 2 1 、h i s 6 4 和a s p 3 2 构 成活性中心三联体；都具有广泛的底物专一性，但a 型更宽一些，而且其稳 定性不依赖于c a ”。 1 4 碱性蛋白酶的性质 多数微生物碱性蛋白酶在p h 7 1 l 范围内有活性。在以酪蛋白为底物时 的最适p h 以9 5 1 0 5 居多，这些酶除可以水解肽键外，还具有水解酯键、 酰胺键和转酯及转肽的能力。 多数微生物碱性蛋白酶不耐热，在5 0 6 0 加热1 0 1 5 m i n ，几乎一半 酶的活性下降5 0 ，只有费氏链霉菌与立德链霉菌等所产碱性蛋白酶经7 0 。c 处理3 0 m i n ，酶活性仅损失1 0 1 5 。我国生产的几种碱性蛋白酶的耐热性 也在6 0 以下。碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用。 碱性蛋白酶的分子量在2 0 ，0 0 0 3 4 ，0 0 0 ，其等电点较高，多为8 9 ”。 大多数微生物碱性蛋白酶作用于肽链的中间，生成二个肽。除酶本身的 氨基酸残基外，不具有特定的活性基团，酶发挥作用时不需要特定的激活剂， 而需要金属离子激活，如除去金属离子就不能作用，必需的金属离子有m 矿、 m g 抖、z n 黔、c o 斗、f e 2 + 等。 碱性蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，属丝氨酸蛋白酶。因此，这类蛋白 酶遇到作用于丝氨酸的试剂二异丙基氟磷酸( d f p ) 、苯甲磺酰氟( p m s f ) 第一章前言 和其它磺酰卤化物以及来自马铃薯、大麦、大豆的蛋白酶抑制剂便失活，这 是碱性蛋白酶的一个重要特征”。但是碱性蛋白酶对金属整合剂e d t a 、重 金属和疏基试剂却不敏感”。 碱性蛋白酶作用位点要求在水解点羧基侧具有芳香族或疏水性氨基酸 ( 如酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸等) ，它比中性蛋白酶有更大的水解 能力。微生物碱性蛋白酶具有强烈的酯酶活性，可水解甲苯磺酰替精氨酸甲 酯( t a m e ) 和各种对硝基苯基酯。枯草杆菌蛋白酶最佳的合成底物是乙酰基 酪氨酸乙酯。碱性蛋白酶的专一性强烈地受到切开点两侧氨基酸残基，尤其 是p ，n 一氨基酸的影响，因此对天然底物的专一性甚广，它对酪蛋白的作 用比对血红蛋白或牛血清蛋白更容易。根据微生物碱性蛋白酶对切开点羧基 侧的专一眭可将其分为四类：类似于胰蛋白酶的碱性蛋白酶，对碱性氨基 酸如精氨酸、赖氨酸有专一性；对芳香族或疏水性氨基酸残基有专一性， 如枯草杆菌碱性蛋白酶；对小分子脂肪族氨基酸残基有专一性，如粘细菌0 【 裂解型蛋白酶，一种溶解细菌细胞壁的蛋白酶；对酸性残基有专一性， 如葡萄球菌碱性蛋白酶”。 1 5 丝氨酸碱性蛋白水解酶的催化机制 丝氨酸蛋白酶家族成员分布广泛，在细菌、真菌、病毒及哺乳动物中有 很多这样的酶，如枯草杆菌蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等， 其晶体均为棒状。按照其结构的相似性，丝氨酸蛋白酶被分为2 0 个结构家族 和6 个宗族。它们共同的催化机制是：通过活性中心的丝氨酸残基侧链上的 羟基，对底物蛋白敏感键进行亲核攻击。 丝氨酸碱性蛋白酶由一条肽链组成，形成紧密的椭圆球体，其中有若干 反平行b 折叠区和少量a 螺旋。除了活性中心的3 个起关键催化作用的s e r 、 h i s 和a s p 以外，其他带电荷的基团大都位于分子表面。 丝氨酸碱性蛋白酶的活性中心s e r 有很重要的作用，这是在早期研究中 使用不可逆抑制剂有机氟磷酸( 如d i f p ) 时发现的。d i f p 只和活性中心的 s e r 的羟基侧链不可逆共价结合，却不与蛋白酶分子的其他s e r 反应。d i f p 和活性中心的s e r 结合后，生成类似酰基一酶复合物，从而抑制了蛋白酶的 活性。这一现象提示：s e r 在催化中心中起关键作用，而且活性中心s e r 表现 的活性已非普通s e r 的性质，而是这个残基在酶的活性中心这一特定环境中 ( 靠近h i s 和a s p ) 所产生的特殊反应性。 丝氨酸碱性蛋白酶活性中心第二个具有重要作用的氨基酸残基的发现借 助于亲和标记法。该法的特点是：利用底物类似物和酶的活性中心特异结合， 并和活性中心的功能基团形成不可逆的共价键。t p c k ( 对甲苯磺酰一l 一苯 丙氨酰氯甲酮) 是丝氨酸蛋白酶的底物类似物，它可以特异结合于酶的活性 中心，它的氯甲酮基使h i s 侧链眯唑基的一个氮原子共价修饰( 烷基化) ，从 天淖科技大学硕上学位论文 而抑制酶的活性。 丝氨酸碱性蛋白酶活性中心s e r 表现出非同一般的反应性。在没有和底 物结合时，h i s 靠近s e r ，其咪唑基上一个非质子化的氮原子和s e r 的羟基侧 链之间形成氢键。在这个眯唑基的另一侧，它的另一个氮原子上的氢原子和 a s p 的羧基负电荷相互作用。于是，蛋白酶的活性中心的三个氨基酸残基形 成了催化三联体或电荷转接系统。所以，在没有底物存在时，由于a s p 羧基 负电荷的作用，h i s 的咪唑基显然倾向于从s e r 侧链获得一个质子。当底物存 在时，s e r 的羟基侧链对底物亲核攻击，它的质子被h i s 接受，失去质子的 s e r 侧链的亲核攻击能力大大增强，因此表现出异常高的催化活性。a s p 羧基 侧链的另一个作用是稳定过渡态中质子化的h i s 侧链的正电荷。 在所有已发现的丝氨酸碱性蛋白酶中，它们的催化中心都有a s p 、h i s 和 s e r 组成的催化三联体。从丝氨酸蛋白酶的转换数( k 。) 和米氏常数( k m ) 与p h 值的关系可以看出，其催化活性随d h 值的下降而减少，在p h 6 8 附近 的变化尤其明显，说明酶的活性依赖于一个p k a 约6 8 的碱性基团的存在， 此值与h i s 的p k a 相符。正是因为活性中心的h i s 在低于p k a 的p h 值环境 中被质子化，使它不能再和催化中心的s e t 形成氢键，因此大大降低了这个 s e r 的亲核攻击能力，造成酶的催化活性急剧下降。丝氨酸碱性蛋白酶的底物 结合位点的一个重要特征是：底物敏感键的羰基氧原子和酶的肽链骨架上的 一个或更多的酰胺基团之间形成氢键。 丝氨酸碱性蛋白酶催化底物肽键断裂的过程主要有两个阶段：酰化： 首先，s e r 的羟基侧链将质子传递给h i s ，其氧原子亲核攻击敏感肽键的羰基 碳原子，使这个羰基变成单键，羰基氧原子因获得一个负电荷而成为氧负离 子。这个氧负离子和酶肽链骨架的两个酰胺基团( 来自s e r 和g l y ) 之间产生 氢键，形成氧负离子穴。这时，以敏感肽键羰基碳原子为中心形成短暂的四 面体过渡态，与之键合的有四个原子，其中三个原子处于一个平面( 酰胺基 氮原子，旺一碳原子和羰基氧原子) ，第四个原子是s e r 的侧链氧原子。a s p 的羧基侧链使h i s 的咪唑环保持一定的方向和位置，并促使它从s e r 的羟基侧 链获得一个质子，同时部分中和过渡态的正电荷。然后质子化的h i s 将质子 传递给敏感肽键的氮原子，造成肽键的断裂，所产生的氨基部分以氢键同h i s 结合，迅速扩散；而酰基部分和s e r 以酯键结合，生成酰基一酶共价中间体。 去酰化：基本上是上一个阶段的逆反应，但水分子取代了酰化反应阶段的 氨基部分。首先，h i s 从水分子吸收一个质子，所产生的o h 一离子立即亲核 攻击连结酰基一酶共价中间物的羰基碳原子，又形成短暂的相似四面体中间 物。接着，h i s 又把质子传递给s e r 侧链氧原子，释放出底物的酸性部分，准 备迎接下一个底物。在上述催化过程中，可以看到丝氨酸碱性蛋白酶利用了 一般酸碱催化、静电效应和共价催化等方式。在整个催化过程中，a s p 的羧 第一章前言 基侧链并没有从h i s 获得质子，它只是通过静电作用帮助质子从s e r 转移到 h i s 。与之相似的是四面体过渡态中的氧阴离子被g l y 和s e r 的两个主链酰胺 基上的质子所稳定，但并没有发生质子转移。 多种丝氨酸蛋白酶的底物特异性有很大差异，对于底物敏感肽键氨基侧 的氨基酸残基，芽孢杆菌碱性蛋白酶需要芳香族或大的疏水性氨基酸残基， 而弹性蛋白酶则需要小的不带电荷的氨基酸残基。三维结构研究结果显示， 产生上述区别的原因是它们的底物结合位点袋形结构中有微小的氨基酸差 异。枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的结构类似袋形结构，但其氨基酸顺序和来自 哺乳动物的丝氨酸蛋白酶毫无共同之处，其三维结构也不相同，两者在进化 上可能没有同源关系，但其催化机制与哺乳动物的酶基本一致，所以，这是 较为典型的趋同进化，它们共同的催化机制是经过趋同进化产生的”“。 1 6 碱性蛋白酶的代谢途径 微生物碱性蛋白酶的合成途径较为复杂，c a l i k 报道了地衣芽孢杆菌生产 碱性蛋白酶的一般代谢途径，共涉及1 4 7 个反应和1 0 5 个代谢节点。 芽孢杆菌的碱性蛋白酶在对数期末，大量形成芽孢时生成。菌种变异或 培养基条件的改变均可能使产酶期发生变动。”碱性蛋白酶在稳定期的前期达 峰值后迅速消失”“”，这是其形成芽孢的必要环节。在芽孢形成过程中， 母细胞要广泛地更新蛋白，新蛋白质合成用的是母细胞内的营养物质。据 m u n r o 和s p u d i c h 的观察，细菌在形成芽孢时亲代蛋白质几乎全部更换，更新 速率达每小时1 8 “7 “”。因此，对数期后期大量形成的碱性蛋白酶在芽孢 形成过程中因用于新蛋白质的合成而迅速消失。 一般来说，不能形成芽孢的突变株不能合成大量碱性蛋白酶。诞失了生 成蛋白酶能力的突变株再也不能形成芽孢，但不能形成芽孢的突变株，有时 却可能合成蛋白酶”1 。 1 7 碱性蛋白酶活性测定方法 蛋白酶活性的测定方法可按照以下原理进行制订： 1 ) 酶活性可用反应前后游离羧基或氨基的增加来表示，这种方法可反映出底 物肽键的开裂程度，可测出蛋白酶( 内肽酶) 或肽酶( 外肽酶) 的真正水 解速度，在样品中有蛋白酶与肽酶共存时，测定值所表示的是二者之和。 属于此类方法的有乙醇滴定法、甲醛滴定法、v a nl y k e 法等。 2 ) 酶活性用底物蛋白质分解产物的增加值表示，这种方法不受共存肽酶的影 响，例如f o l i n 法、紫外分光光度法、残氮量测定法等。 3 ) 酶活性可根据蛋白质分解时所引起的理化性质改变的程度表示，如f u l d - - g r o s s 法、明胶粘度下降法、凝乳作用法。 目前碱性蛋白酶测定使用最广泛的方法是f o l i n 法、紫外分光光度法、甲 醛滴定法和d h t - - c a s e i n 法。 6 天津科技大学硕士学位论文 1 7 1 福林( f o l i n ) 法 福林试剂( 磷钨酸与磷钼酸的混合物) 在碱性条件下极不稳定，可被酚 类化台物还原，而呈蓝色反应( 钼蓝与钨蓝的混合物) 。由于蛋白质或水解物 中含有酚基的氨基酸( 如：酪氨酸、色氨酸等) 也呈这个反应，因此可以利 用这个原理来测定蛋白酶活性的强弱，即以酪蛋白为底物，在一定的温度与 d h 条件下，同酶液反应一定时间后，加入三氯乙酸终止反应，过滤，使残余 的酪蛋白沉淀与水解产物分开。取滤液( 即含有蛋白水解产物的三氯乙酸液) 用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色比色测定光密度的变化。由于反应 前后蓝色反应增加的强弱同溶解在三氯乙酸中蛋白水解产物的量成正比，因 此，可推测蛋白酶活性。 1 7 2 紫外分光光度法 蛋白酶在一定p h 和温度条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止 酶反应，过滤，除去未水解的酪素沉淀。蛋白质或多肽在2 7 5 n r n 具最大吸收 值，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，利用酶同酪蛋白底物 反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增值可表示酶活性的强弱。 1 7 3 甲醛滴定法 利用甲醛固定水解产物的氨基，再用碱滴定羧基。 1 7 4 重氮5 一氨基四唑酪蛋白法( d h t - - c a s e i n ) 用5 一氨基四唑重氮盐将酪蛋白部分组氨酸和酪氨酸重氮化后得黄色的 重氮5 一氨基四唑酪蛋白( d h t 一酪蛋白) 。d h t 一酪蛋白可被水解为d h t 一肽，利用二价镍离子与d h t 一酪蛋白及d h t 一肽形成稳定的可溶性红色螯 合物的性质，及锌离子迅速沉淀d h t 一酪蛋白而不沉淀d h t 一肽的性质，在 选择合适浓度锌和镍离子作为沉淀剂和显色剂的基础上，建立了快速比色测 定碱性蛋白酶活性的方法”“。 1 8 碱性蛋白酶生产菌株选育的传统技术 从工业应用的角度出发，提高菌种产酶活力是最基础的。早期的工作主 要是以各种传统技术对原始菌株进行了选育及研究。碱性蛋白酶菌株选育的 传统技术主要集中在三个方面。 1 8 1 微生物细胞的传统诱变技术 利用物理或化学诱变剂单独或复合处理微生物是选育高产变种行之有效 的方法，至今仍是选育碱性蛋白酶高产菌株的常规方法。 中国科学院微生物研究所那淑敏等人于1 9 8 7 年利用亚硝基胍和紫外线复 合处理，获得变异株b a c i l l u cl i c h e n i f o r m i s 5 3 3 一f 1 3 ，产酶活力最高达1 0 0 0 0 u m l ， 比出发菌株提高了近2 0 倍”。 1 9 9 0 年中国科学院微生物研究所邱秀宝等，从3 8 份土样中筛选到一株嗜 碱性短小芽孢杆菌r ，1 5 应用亚硝基胍诱变以及利福平抗性株筛选获得一株 第一章前言 具有高产稳产碱性蛋白酶变异株b 4 5 ，经发酵条件研究酶活力达1 8 0 0 0 u m l ”。 徐子渊等将原碱性蛋白酶生产菌2 7 0 9 进行诱变育种，获得变异株c 1 2 1 3 ， 酶产量提高了4 0 2 2 ) 。郑铁曾等进行了提高c 1 2 1 3 菌碱性蛋白酶活力的研究， 酶活力提高了1 7 0 ”。 1 8 2 微生物的原生质体技术 近2 0 年来发展起来的原生质体技术，对实现有效的遗传育种提供了很大 的方便。据报道f 2 4 1以原生质体诱变、原生质体融合或原生质体的诱变融合 相结合来改变菌种的遗传特性，从而选育出碱性蛋白酶高产菌株，是一种非 常有效的遗传育种技术。 冯清平等，从2 8 份土样中筛选到一株嗜碱性地衣芽孢杆菌5 3 一，对其 原生质体进行复合诱变处理，从中选育出了耐高温、耐碱的碱性蛋白酶高产 菌株，以期应用于工业生产”“。 徐威等以枯草杆菌a x 一4 6 为出发菌株，在原生质体形成及再生的最佳 条件下制备原生质体，并对原生质体进行紫外诱变处理，对大量的再生突变 株进行发酵筛选，获得高产菌株a p 一1 2 ，酶产量由原来的3 2 0 0 8 u m l 提高到 4 3 5 3 t t m l ，提高了3 6 。同时对a p 一1 2 进行了遗传稳定性考查，结果表明 该菌株产酶稳定”。 1 8 3 芽孢热处理技术 将细菌芽孢进行热处理，选育获得耐高温的碱性蛋白酶f2 0 ) , 特别适合于芽 孢杆菌的选育。热处理的对象可以是菌体、芽孢或原生质体，将其在高温下处 理一定时间，使低温菌淘汰而高温菌得以纯化，连续多次交替处理就可获得所 需耐高温菌株。 徐威以枯草杆菌a 4 3 为出发菌株，其产量为2 4 1 2 u m l 。用芽孢热处理方法 处理a 4 3 菌株的芽孢，得到变异株a s 4 ，酶产量为2 7 3 2 8 u j m l 。用紫外线对a s 4 菌株进行诱变处理，得变异株a x 4 6 ，酶产量为3 2 1 8 8 u m l ，该菌株产酶稳定”。 1 9 碱性蛋白酶的基因工程研究进展 1 9 1 碱性蛋白酶的基因结构及功能 从8 0 年代末期开始，微生物蛋白酶的研究逐渐向基础理论和应用的纵深 发展，主要集中在对蛋白酶基因结构、蛋白质三维空间结构、结构与功能的 关系以及蛋白质工程等方面的研究。 信号肽的存在是区分胞质蛋白和输出蛋白的唯一显著特征。研究发现， 在b a r n y t o l i q u e f a c i e n s ，b s u b t i l i s ，b s t e a r o - t h e r m o p h i t u s 中分泌的中性蛋白 酶与在b a m y t o l i q u e f a c i e x l s ，b s u b t i l i s ，b 1 i c h e n i f o r m i s 中分泌的碱性蛋白 酶中信号肽段有同源程度很高的保守序列。这些信号肽的保守序列在带正电 荷的n 端紧跟一段疏水残基、在极性c 区有一个共有序歹0 切割位点a l a x - a l a ， 切割一般在c 端a l a 之后。这两个a l a 残基常被其他短肽链氨基酸残基取代， 天津科技大学硕士学位论文 x 位优先选择大体积的氨基酸残基。中国科学院生物物理研究所雷虹等人早在 1 9 9 2 年就依据地衣芽孢杆菌n c i b 6 8 1 6 的s u b s t i l i s i nc a r l s b e r g 基因序列设计引 物，通过p c r 技术从地衣芽孢卡t 菌2 7 0 9 菌株的染色体d n a 中扩增了2 7 0 9 碱性蛋白酶基因中编码成熟的2 7 0 6 碱性蛋白酶的序列，全序列分析结果显示： 2 7 0 9 碱性蛋白酶的编码序列与相应的n c i b 6 8 1 6 序列相比有3 左右的碱基组 成差异；与已发表的两种s u b t i l i s i nc a r l s b e r g 型氨基酸序列长度( 2 7 4 个氨基 酸) 一致，仅5 个氨基酸差异，同源性为9 8 - - 9 9 ，属典型的s u b t i l i s i nc a r l s b e r g 类。通过对已知的s u b t i l i s i n 类蛋白酶的氨基酸序列和空间结构比较可知， s u b t i l i s i n c a r l s b e r g 在5 个位置上所发生的氨基酸置换均在其它s u b t i l i s i n 类蛋 白中有所出现，其中1 0 2 位、1 2 8 位、2 1 1 位氨基酸位于空间结构保守区内， 1 5 7 位、1 6 0 位氨基酸位于空问结构可变区内，1 0 2 位、1 2 8 位氨基酸参与酶 与底物的相互作用。随后，洪扬等人又在上述基础上通过原位杂交从2 7 0 9 基 因文库筛选出含有完整的2 7 0 9 碱性蛋白酶基因的阳性克隆，测序结果显示： 2 7 0 9 与n c i b 6 8 1 6 基因序列具有极高的同源性，其中信号肽与导肽部分无论 在氨基酸序列还是在d n a 序列上均与n c i b 6 8 1 6 基因完全一致。由此可见， 不同菌株产生的碱性蛋白酶其翻译加工切除信号肽和导肽的过程及调控机制 基本一致“。 1 9 2 基因工程研究进展 应用基因工程技术可以分离到那些高产量的微生物菌株，还可以人工增加 编码该基因的拷贝数从而构建高产菌株，这促进了研究工作将理论与实践紧密 结合，缩短了从探索研究到实际应用的时间，克服了传统育种方法的盲目性。 目前，世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司生产酶制剂的菌株几 乎全为基因工程菌。 江盛梅等利用p u c l 8 质粒作载体，将嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因克 隆到e , c o l i ( t g i ) 中，获得克隆株g 3 ，其酶活是出发株的3 4 倍1 。雷虹等 利用p c r 技术从地衣芽孢杆菌2 7 0 9 菌株的染色体d n a 中扩增了2 7 0 9 碱性蛋 白酶的编码序列，肯定了2 7 0 9 菌碱性蛋白酶属典型的s u b t i l i s i nc a d s b e r g ”。 刘永亮等利用枯草杆菌碱性蛋白酶e 基因的信号肽序列构建分泌表达载体获得 成功“。赵云德等对地衣芽孢杆菌2 7 0 9 碱性蛋白酶基因进行了克隆和序列分 析”。王培之等用遗传工程的方法构建了一个高表达的枯草杆菌碱性蛋白酶e 的枯草杆菌质粒一宿主系统13 2 ) 。1 9 9 4 年，南开大学微生物系杨文博、冯耀宇通 过基因工程手段构建了一株直接利用淀粉作为发酵碳源的菌株，摇瓶发酵酶活 力高达1 4 0 1 4 u m l ”。2 0 0 1 年，江南大学的诸葛健、唐雪明构建了一株整合型 工程菌，其酶活力最高可达2 4 4 8 0 u m l ”。 1 1 0 碱性蛋白酶的蛋白质工程研究进展 蛋白质工程是指通过天然蛋白质或蛋白质衍生物的结构分析，确定其三级 第一章前言 结构模型，然后通过分子设计合成突变基因，经过筛选突变体、d n a ，合成相 应蛋白质的方法。其目的就是为了使产物高表达，或获得性能改进的产物。在 芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶的蛋白质工程研究中，焦点集中在提高碱性蛋白酶 的稳定性、抗氧化性及改变蛋白酶的专一性等方面。 我国8 6 3 项目中的超氧化剂碱性蛋白酶已获得成功。中国科技大学的王贤 舜等用蛋白质工程的方法首先在计算机图象系统上对预定的分子改造方案进行 预测、设计方案，成功地完成了构建一个分泌热稳定性比野生型枯草杆菌蛋白 酶e 高4 倍的工程菌。王培之等用蛋白质工程的方法完成了构建一个分泌枯草 杆菌蛋白酶的工程菌p w 8 8 8 8 ，所分泌的碱性蛋白酶具有较强的抗氧化性，以 期应用于增白加酶洗涤剂。中国科学院生物工程中心杨胜利和中国科学院生物 物理所朱榴琴分别对枯草杆菌碱性蛋白酶e 进行了定点突变，获得了稳定性提 高的突变酶，为突变酶的高效表达打下了一定的基础”f3 7 ) 。 天然碱性蛋白酶虽然在生物体内能发挥各种功能，但在生物体外，特别是 在工业条件( 如高温、高压、机械力、重金属离子、有机溶剂、氧化剂、极端 p h 等) 下，则常常很容易被破坏。因此，人们很自然地想到能否运用迅速发展 的蛋白质工程技术来改造天然酶，使其适应特殊的工业过程；或者设计制造出 全新的人工酶或人工蛋白，以生产新型酶来替代天然酶不能催化的或催化效率 低的反应过程。 近1 0 年来，随着定向改造天然碱性蛋白酶或设计制造新型碱性蛋白酶研究 的不断深入，除了期待新型碱性蛋白酶应用于工业之外，蛋白酶还是进行蛋白 质工程研究的很好的模型，是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在 解决生物理论方面所起的作用可以和任何重大的生物研究方法相提并论，同时 也为其它工业酶的性能改造提供了范例和理论指导依据。 1 1 1 碱性蛋白酶的主要应用 酶作为生物催化剂，在许多化学反应中具有不可低估的作用。酶催化剂 作为生物进化的高级形式，与一般的化学催化剂相比，它可以在非常温和的 条件下高效、专一地催化底物转变为产物。酶工程技术已成为生物工程技术 的重要组成部分，无论是基因工程、蛋白质工程、细胞工程和发酵工程都需 要酶分子的参与。酶催化的高效性、特异性及产品的高效回收、简单的反应 体系等优点使酶工程技术成为现代生物技术的主要支柱之一。 自2 0 世纪中叶以来，工业用酶制剂市场得到了蓬勃发展。据统计数据表 明，1 9 8 1 年工业酶制剂生产量约6 5 ，0 0 0 吨，产值4 亿美元；1 9 8 5 年工业酶制 剂约生产7 5 ，0 0 0 吨，产值约6 亿美元；l9 9 8 年全世界工业酶制剂销售额高达 1 6 亿美元。进入2 0 世纪9 0 年代后，市场对酶制剂的需求进一步增强，以世 界上最大的酶制荆生产商丹麦的n o v on o r d i s k 公司为例，1 9 9 3 年的酶制剂销 售额为9 亿美元；1 9 9 8 年产业用酶的销售额为1 5 1 8 亿美元。从总体来看， 1 0 天津科技大学硕士学位论文 世界酶制剂的生产量正以每年8 左右的速度递增，酶制剂的生产品种已由原 来的十多个发展为数十个。1 9 9 4 年以来，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶 ( 图1 一1 ) ，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工、制酒工业、纤 维工业和饮料业等( 3 8 ) o 卜k 圈j 洗涤剂淀粉乳制品制酒纤维乙醇酿造面包业其他 图1 1 酶制剂在各行业中所占百分比 注：其他是指在制革、造纸、告牧、医药、日化及废水处理等_ _ _ 【。业中的应剧。 自然界发现的酶已达数千种，工业上常用的酶只有数十种，而目前大量 生产的酶仅有十余种。其中，蛋白分解酶是工业酶种中用得最多的一种酶， 约占酶总量的6 0 ，其中碱性蛋白酶就占2 5 ( 图1 - - 2 ) 。 图1 2 国际市场各种重要酶制剂所占份额 碱性蛋白酶可以在碱性条件下保持良好的活力，并催化蛋白水解，可用 于制革、丝绸、医药、食品和生物化学试剂等领域，其最大用途是作为添加 剂生产加酶洗涤剂。碱性蛋白酶最早在猪的胰脏中发现。1 9 1 3 年，r o h m 首 先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1 9 4 5 年瑞士的d lj a a g 等发现了微生物 碱性蛋白酶，使蛋白酶有可能广泛应用于洗涤剂工业。1 9 6 3 年，诺和诺德公 蚰 加 o 第一章前言 司( 现诺维信公司) 发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶a l c a l a s e ，酶制剂被 广泛地应用于洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉；随后的2 0 年中，细菌类蛋 白酶是唯一被应用于洗涤剂中的商品化酶制剂。 1 1 1 1 在洗涤剂中的应用 洗涤剂借助于生物酶使其质量和性能获得了全面发展，洗涤剂用酶制剂 也在含酶洗涤剂的普及和生物工程技术进步的推动下得到了飞速发展。1 9 6 2 年丹麦n o v o 公司首次推出了加酶洗衣粉，但在使用的初期由于粉尘的影响， 应用一时中断。后来采用了颗粒化洗涤剂形式，加酶洗衣粉得到了普及。据 统计，1 9 9 8 年全球洗涤剂用酶销售额达4 9 8 亿美元，已成为工业用酶的最大 应用领域”。洗涤帮j , o n 酶是国际发展趋势，世界洗涤剂产量2 7 0 0 万吨，西欧 人均2 4 公斤，日本人均9 公斤，美国人均3 2 公斤，世界人均7 公斤，亚洲 人均2 5 公斤，我国人均只有2 0 5 公斤，因此洗涤用品发展潜力很大。 日常生活中遇到的污垢，特别是衣服上的污垢组成是十分复杂的，一般 来说，主要有尘土的微粒、人体分泌的皮脂和汗液、食物的汁液和残余物等， 1 5 4 0 的有机污垢是以蛋白质与纤维结合的方式存在的。用于洗涤这些污 物的洗涤剂