（发酵工程专业论文）混菌固态发酵豆粕生产富肽蛋白饲料的研究.pdf

l 天津 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究 成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发 表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科 技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密ii ( 请在方框内打v ) ，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密i 习( 请在方框内打v ”) 。 作者签名：俄 节日期：矽7 年儡月 日 导师签名： 日期：年月 日 摘要 本论文采用混菌固态发酵法，利用微生物生长过程中产生的蛋白酶等多种酶来改 善豆粕的营养品质。主要对混茵发酵菌种以及发酵工艺；发酵条件对发酵性能的影响， 发酵条件优化；发酵后蛋白质降解情况，以及发酵产物相对分子量分布：发酵后产品 中抗营养因子的去除等进行了研究。主要研究结果如下： 选择枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母作为发酵用菌株，研究了微生物发酵过程中蛋 白酶活力的变化。这两株菌混合发酵，在3 6 h 时总蛋白酶酶活力达到最大3 4 9 4 u g ( 干 基) ，混菌发酵蛋白酶酶活力比单菌发酵蛋白酶酶活力有了很大程度的提高； 通过对一步发酵法和两步发酵法这两种不同培养方式的研究，表明一步发酵法比 两步发酵法更有优势，在相同发酵时间下前者产物中酸溶性氮含量比后者高1 2 。 通过单因素试验，确定了对发酵性能影响显著的因素为培养温度、原料初始含水 率和装料量；通过响应面分析法对发酵条件进行优化，得到最佳的发酵条件为发酵温 度3 3 1 2 ，装料量为4 0 9 ，原料初始含水率为6 2 ，在此条件下，通过验证实验测得产物 中酸溶性氮含量为3 3 6 1 。 通过t r i e i n e s d s p a g e 电泳研究发酵后蛋白质的降解情况，电泳结果表明经微生 物发酵后，大分子蛋白质得到很大程度的降解，降解产物的分子量在1 0 0 0 0 d a 以下； 经过s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤色谱对发酵产物水提液进行分离，蛋白质的降解产物被分 成四个峰，相对分子量主要集中在6 0 0 d a 1 4 0 0 d a 。 检测了发酵产品中抗营养因子的含量，结果表明：胰蛋白酶抑制因子含量由 1 1 5 1 4 0 i u g ) 下降n 2 1 0 7 ( t i u g ) ，去除率为8 1 7 ，脲酶活性f l a o 1 2 7 ( m g n g 曲) 下 降到0 0 1 3 ( m g n g - m i n ) ，去除率为8 9 8 ，植酸的含量由9 0 6 ( m g g ) 下降n 8 5 6 ( m g g ) ，去 除率为5 5 。 检测了发酵产物各常规成分指标：粗蛋白含量达到4 7 3 5 ，t c a - n s i 含量达到 了3 3 6 1 ，t c a - n s i 含量占到蛋白质含量的7 1 ，说明发酵产品中富含具有多种生 理活性的小肽。粗脂肪1 8 7 ，灰分6 2 5 ，粗纤维6 8 9 。 发酵产品中枯草芽孢杆菌的含量为3 0 x1 0 9c f u g 。说明发酵产品也是一种微生 态制剂。 关键词：固态发酵；混菌发酵：酸溶性氮；饲料；抗营养因子； a b s t r a c t m u l t m i c r o o r g a n i s ms o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nw a s c h a r r i e do u ti nt h i sp a p e r ，p r o t e a s e e n z y m ew a su s e dt oi m p r o v et h en u t r i t i o n a lq u a l i t yo fs o y b e a nm e a l w em a i n l yf o c u s e do n t h er e s e a r c hs u c ha s t h es e l e c t i o no ff e r m e n t a t i o ns t r a i n sa n df e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y ；t h e e f f e c t i o no fc o n d i t i o n st of e r m e n t a t i o nc a p a b i l i t ya n do p t i m u mt e c h o n l o g i c a lc o n d i t i o n s w e r ec o n f i r m e d ；t h ed e g r e eo fp r o t e i nd e g r a d a t i o na n dt h ed i s t r i b u t i n go fm o l e c u l a rw e i g h t ； t h er e s i d u a la n t i n u t r i t i o n a lf a c t o rc o n t e n to ff e r m e n t e ds o y b e a nm e a lw a sd e t e r m i n e d t h e r e s u l t sa r ca sf o l l o w e d ： t h em i c r o o r g a n i s m - b a c i l l u ss u b t i l u sa n dc a n d i d au t i l i sw e r eu s e dt of e r m e n tt h e s o y b c a nm e a l s ，t h ep r o t e a s ea c t i v i t yc h a n g e sw e r es t u d i e dd u r i n gm u l t i - m i c r o o r g a n i s m f e r m e n t a t i o n t h et o t a lp r o t e a s ea c t i v i t yr e a c h e d3 4 9 4 u gw h i c hi st h eh i g h e s tl e v e la t3 6 h t h et o t a lp r o t e a s ea c t i v i t yo fm u l t i m i c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o ni sh i g h e rt h a ns i n g l e m i c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o n o n e s t e pf e r m e n t a t i o na n dt w o - s t e pf e r m e n t a t i o nw e r ec h a r r i e do u t , t h er e s u l e ss h o w t h a to n e s t e pf e r m e n t a t i o nw a sm o r ea d v a n t a g e s t h ef e r m e n t e ds o y b c a l lm e a lh a sm o r e t r i c h l o r o a c e t i ca c i dn i t r o g e ns o l u b i l i t yi n d e x ( t c a - n s i ) b yo n e s t e pf e r m e n t a t i o nt h a nb y t w o - s t e pf e r m e n t a t i o n ，t h eg a p i s1 - 2 b ys i n g l ef a c t o rt e s t s ，w ea f f i r m e dt h a ts i g n i f i c a n tf a c t o r sw e r et e m p e r a t u r e 、 w a t e r c o n t e n ta n dc h a r g e b yr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i st e s t s ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n w e r en a t u r e p h ，t e m p e r a t u r e3 3 c ，c h a r g e4 0 9 , w a t e rc o n t e n t6 2 u n d e rt h eo p t i m u m l e v e ld e t e r m i n e d ，t h ec o n t e n to ft c a - n s ir e a c h e d3 3 6 1 t h ed e g r e eo fp r o t e i nd e g r a d a t i o nw a sr e a e a r c h e db yt r i c i n e s d s - p a g e ，t h er e s u l t s h o wt h a tm a c r o m o l e c u l a rp r o t e i nh a sb e e nd e g r a d e d , t h em o l e c u l a rw e i g h ti sb e l o w 1 0 0 0 0 d a t h ew a t e re x t r a c to ff e r m e n t e dp r o d u c tw a ss e p a r a t e db y s e p h a d e xg 2 5 ，w h i c h w a ss e p a r a t e da sf o u rc o m p o n e n t s ，t h em o l e c u l a rw e i g h ti sm a i n l yd i s t r i b u t i n ga b o u t 6 0 0 d a 1 加0 d a t h er e s i d u a la n t i - n u t r i t i o n a lf a c t o rc o n t e n t so ff e r m e n t e ds o y b e a nm e a l w e r e d e t e r m i n e d r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea n t i - n u t r i t i o n a lf a c t o r sc o n t e n to ft h ef e r m e n t e d s o y b c a nm e a lw e r er e d u c e dg r e a t l y f o re x a m p l e ，t h ec o n t e n to ft r y p s i ni n h i b i t o rd e c r e a s e d f r o m1 1 5 1 41 1 u 儋t o2 1 0 7 r i u g , t r y p s i ni n h i b i t o rh a sb e e nr e m o v e d8 1 7 t h eu r e a s e a c t i v i t yr e d u c e df r o m0 1 2 7 ( m g n g m i n ) t o0 0 1 3 ( m g n g r a i n ) ，u r e a s ea c t i v i t yh a sb e e n r e m o v e d8 9 8 t h ep h y s i ca c i dd e c r e a s e df r o m9 0 6 ( m g g ) t o8 5 6 ( m g g ) ，t h ep h y s i c a c i dh a sb e e nr e m o v e d5 5 t h ec o n t e n to fn o r m a ln u t r i t i o nc o m p o n e n t sw e r ea n a l y s e d t h ec o n t e n ta sf o l l o w e d ：t h e c r u d ep r o t e i n4 7 3 5 ，t c a - n s i3 3 6 1 w h i c hi sa c c o u n t i n gf o rt h e7 1 o fc r u d ep r o t e i n ec e l ln u m b e ro f o np r o d u c ti sa 目录 1 前言1 1 1 豆粕1 1 1 1 豆粕的生产及属性1 1 1 2 豆粕的营养价值：1 1 1 3 豆粕中抗营养因子及其消除3 1 2 微生物发酵豆粕及其在养殖业上的应用”4 1 2 1 微生物发酵法对豆粕进行处理的特点4 1 2 2 微生物发酵豆粕在养殖业上的应用4 1 3 小肽的概述”5 1 3 1 肽类物质的营养”5 1 3 2 小肽的吸收特点5 1 3 3 小肽饲料的特殊功能6 1 4 混茵发酵6 1 4 1 混菌发酵概述6 1 4 2 混菌发酵菌种选择7 1 5 固态发酵 8 1 5 1 固态发酵概述8 1 5 2 固态发酵工艺条件的控制”8 1 5 3 固态发酵技术在饲料生产上的应用8 1 6 本课题的立题依据及研究内容“9 1 6 1 本课题的立题依据一9 1 6 2 本课题的研究内容”1 0 2 材料与方法1 1 2 1 材料与仪器1 1 2 1 1 原料1 l 2 1 2 菌种1 1 2 1 3 主要实验材料“1 1 2 1 4 主要实验仪器“1 2 2 1 5 主要溶液”1 2 2 1 6 菌种培养基1 3 2 2 分析方法1 4 2 2 1 蛋白酶活力测定1 4 3 3 发酵条件优化试验3 0 3 3 1 培养温度对发酵性能的影响3 0 3 3 2 基质初始含水率对发酵性能的影响3 1 3 3 3 拌料水p h 对发酵性能的影响3 2 3 3 4 装料量对发酵性能的影响。3 3 3 3 5 采用响应面分析法优化发酵条件3 4 3 3 6 爿、结3 8 3 4 发酵产物蛋白质降解情况的研究3 7 3 4 1 蛋白质降解情况的研究3 8 3 4 2 大豆肽相对分子量分布测定3 9 3 5 发酵产物用于保健食品的可行性4 3 3 6 发酵产物干燥温度的确定4 3 m 、 7 3 3 3 文 4 5 6 7 8 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 在动物饲料工业中豆粕是最普遍的蛋白质来源。高蛋白质含量及使用的广泛性使 得豆粕是动物饲料很好的蛋白质来源【1 1 。豆粕一直以来就是人们获取植物性蛋白质的 重要来源，其中8 种人体必需氨基酸的含量与肉、鱼、蛋、奶相近似，属于全价蛋白 【2 】o 椐报道，大豆蛋白对人体健康很有益处，它可以降低血液中胆固醇的含量，减少 乳腺癌和动脉硬化的发生率【3 ，4 习。 然而由于大豆蛋白分子结构复杂，相对分子量高，从而使得大豆蛋白的消化率和 生物效价不如牛奶、蛋类等动物蛋白，大豆蛋白的溶解度低，无法作为功能性成分在 乳品、饮料等食品体系中加以利用。由于豆粕中存在胰蛋白酶抑制因子、脲酶、植酸、 凝集素、脂肪氧化酶、致甲状腺肿素等抗营养因子成分，它们的存在，会在一定程度 上影响动物对饲料养分的消化、吸收和利用，造成畜禽生产性能下斛6 7 朋。在婴儿食 品中使用豆制品或许会产生更严重的问题，因为婴儿对这些抗营养因子具有更高的敏 感性。因而，如何通过现代生物技术手段来改善豆粕的营养品质，成了人们研究的热 点。 1 1 豆粕 1 1 1 豆粕的生产及属性【9 , 1 0 美国于2 0 世纪5 0 年代开始出现浸出制油工艺，中国于2 0 世纪8 0 年代中期实现由压 榨法向浸出法的转变。 豆粕是大豆经提取豆油后得到的一种副产品，根据提取方法不同分为一浸豆粕和 二浸豆粕，其中用浸提法提取豆油后得到的副产品为一浸豆粕；先以压榨取油，再经过 浸提取油后得的副产品称为二浸豆粕。一浸豆粕的生产工艺较为先进，蛋白质含量高， 是目前国内外现货市场上流通的主要品种。以浸提法生产豆粕的基本工序为：油脂厂购 入大豆一去杂一破碎( 一颗大豆约碎成6 - 8 块) 一加温并调整水分含量( 破坏原有的组 织，易出油) 压成片并继续调整水分一加溶剂喷淋，萃取豆油一脱溶剂一豆粕生成。在 豆粕的加工工艺中，温度控制是最重要的环节，温度过高或过低都会影响豆粕中蛋白 质的含量，并直接导致日后豆粕的质量好坏和使用效果。 豆粕具有如下的自然属性： 颜色：浅黄色至浅褐色，颜色过深表示加热过度，太浅则表示加热不足。整批豆 粕色泽应基本一致。味道：具有烤大豆香味，没有酸败、霉败、焦化等异味，也没有 生豆腥味。质地1 均匀流动性好，呈不规则碎片状、粉状或粒状，不含过量杂质。 1 1 2 豆粕的营养价值 豆粕为大豆榨油的副产物，其蛋白质含量丰富，含有丰富的营养物质，如脂肪， 碳水化合物，多种矿物质和维生素及动物体内必需的氨基酸，营养成分比较齐全、均 衡，是优良的植物性蛋白饲料源，在世界蛋白质原料供应市场上，其占有绝对优势 1 前言 n a z i 。在代谢能和蛋白质含量方面几乎没有其它的植物蛋白质原料可与豆粕相媲美， 豆粕在总氨基酸含量以及氨基酸消化率方面也均高于其它植物蛋白，其中粗蛋白含量 高达4 3 - - , 4 8 ，并有较平衡的氨基酸组成，尤其是其他植物性饲料易缺的赖氨酸，其 含量高达2 5 - - - 2 8 1 3 】。豆粕的营养成分及营养价值见表1 1 【1 4 1 ： 表1 i 豆粕的营养成分及营养价值 t a b l e l - 1c o m p a s s i o na n dn u t r i t i v ev a l u e so fs o y b e a nm e a l 营养成分单位去皮豆粕带皮豆粕营养成分单位去皮豆粕带皮豆粕 干物质 8 98 9 钠0 0 30 0 3 粗蛋白4 7 94 4 2 氯0 0 5 0 0 5 粗脂肪1 51 9 镁 0 2 8 0 2 8 粗纤维 3 35 9 钾 2 0 5 1 7 2 灰分496 1铁 m g k g 1 8 51 8 5 n d f8 81 3 6 铜 m g k g 2 42 4 a d f 5 39 6锰 m g k g 3 8 22 8 钙0 3 40 3 3锌 m g k g 4 6 44 6 4 磷0 6 5o 6 2硒 m g k g o 10 0 6 精氨酸3 4 33 3 8 胡萝卜素 m g k g 0 20 2 组氨酸 1 2 21 1 7 维生素e m g k g 3 1 3 1 异亮氨酸 2 1 1 9 9 维生素b 1 m g k g 4 64 6 亮氨酸3 5 73 3 5 维生素b 2 m g k g 33 赖氨酸2 9 92 6 8 泛酸 m g k g 1 6 41 6 4 蛋氨酸 o 6 8o 5 9 烟酸 m g k g 3 0 73 0 7 胱氨酸o 7 3o 6 5 生物素 m g k g o 3 3o 3 3 苯丙氨酸 2 3 32 2 1 叶酸 m g k g 0 8 1 0 8 1 酪氨酸 1 5 71 4 7 胆碱 m g k g 2 9 5 82 9 5 8 苏氨酸1 8 51 7 1 维生素b 6 m g k g 6 16 1 色氨酸0 6 50 5 7 维生素b 1 2m g k g 00 缬氨酸 2 2 62 0 9 亚油酸o 5 1o 5 1 去皮豆粕与带皮豆粕的矿物质组成大致相同，而去皮豆粕中b 族维生素含量较高， 总量为2 7 5 0 2 8 5 0m g k g ，其中叶酸1 3 7m g k g 、核黄素3 1m e c k g 、胆碱2 7 3 1m g 瓜g 、+ 硫胺素3 2m g k g 、泛酸1 5 0m g k g 、烟酸2 2 0m g k g 、维生素b 66 4m g l 【g 。豆粕中的 维生素通常被认为是动物日粮中所需维生素的重要来源，当豆粕在禽类日粮中的用量 达到3 5 时，大约可提供禽类所需核黄素、烟酸、泛酸、硫胺素需要量的3 0 。由于 去皮豆粕的纤维含量低，其氨基酸含量比带皮豆粕高【1 5 1 。 2 天津科技大学硕士学位论文 1 1 3 豆粕中抗营养因子及其消除 一 g o n t z e a 和s u t z e s c u ( 1 9 6 8 ) 将抗营养因子( a n f ) 定义为：由植物代谢产生的并以 不同的机制对动物产生抗营养作用的物质。后来，h u i s m a n 1 6 】等认为，把具有降低饲 料营养物质的利用、动物生长速度和动物健康水平的物质称为a n f 。随着对6 岍认识 的加深，人们认为对营养物质的消化、吸收和利用产生不利影响，以及影响畜禽生产 能力和健康的物质，统称为a n f ，这对a n f 的概念作了更精确的概括。 尽管豆粕是一种优质的蛋白质原料，但是，豆粕中还存在胰蛋白酶抑制剂、植酸、 大豆凝血素、脲酶、低聚糖、脂肪氧化酶、大豆抗原蛋白( 致敏因子) 及致甲状腺肿素 等多种抗营养因子。这些抗营养因子会对营养成分的消化、吸收、代谢以及动物的健 康和生产性能产生不良影响，一方面对动物体内某些消化酶起抑制作用或与营养物质 络合成不易消化的成分等，使得豆粕的消化率和动物的吸收率下降；另一方面对动物体 内的某些器官起到破坏作用，对动物的生理、生长、健康造成不良的影响【1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 , 2 1 1 。 按照其作用的不同可将大豆抗营养因子分为六类见表1 2 ： 表1 - 2 大豆抗营养因子的种类 t a b l e l 2t h ek i n d so fs o y b e a na n t i n u t r k i o n a lf a c t o r s 种类因子 抑制蛋白酶消化和利用的因子 影响碳水化合物消化的因子 降低矿物质元素利用率的因子 抗维生素因子 刺激免疫系统的抗营养因子 其他 胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、凝集素 单宁、寡糖 植酸等 抗维生素a 、维生素d 、维生素e 、维生素b 1 2 致敏反应蛋白等 甲状腺肿因子、皂苷、异黄酮、生氰糖苷 如果大量使用，就必须先进行消除抗营养因子处理，使大豆的抗营养因子失活、 钝化。目前世界范围内对豆粕消除抗营养因子问题的研究在不断完善，大量的研究工 作表明采用热处理、化学法、作物育种法、酶制剂法、微生物发酵法均可以在一定程 度上降解抗营养因子【础烈2 5 2 6 ，2 7 1 。 采用微生物发酵处理法可以有效地降解豆粕中主要的抗营养因子，并能积累有益 的代谢产物，提高豆粕的营养价值，获得具有多种功能的优质蛋白饲料幽刀，3 0 m , 3 2 , 3 3 1 。 h o n g 等( 2 0 0 4 ) 利用米曲霉发酵豆粕4 8 h 后发现，豆粕中的抗原蛋白几乎全部降解， 分子量小于2 0 k d 的蛋白质约占8 6 6 ，而且豆粕的粗蛋白含量也提高了1 0 ，胰蛋白 酶抑制剂降低到o 4 2 m g g ，氨基酸的组成也更为合理，必需氨基酸的含量提高了，其 中豆粕最为缺少的蛋氨酸也从0 7 7 提高到了0 8 2 ；r a n e k a r ( 1 9 9 2 ) 利用能水解酪蛋 白的乳酸菌发酵鹰嘴豆粉与大豆粗粉混合物，大豆粉中胰蛋白酶抑制因子活性明显降 低；h o f f m a n n ( 2 0 0 3 ) 利用瘤胃微生物发酵豆粕，试验发现豆粕中的胰蛋白酶抑制因子 得到降解和失活；陈斌( 2 0 0 5 ) 研究发现，经微生物发酵后的豆粕，胰蛋白酶抑制因 3 冷向军等( 2 0 0 7 ) 以8 7 5 脱皮豆粕、8 6 7 发酵豆粕等蛋白替代饲料中鱼粉用量 的2 0 ，在本试验条件下，作为为鱼粉的替代品，发酵豆粕优于脱皮豆粕，发酵豆粕可 取代饲料中鱼粉用量的2 0 而不会对虾体增重率、虾体肌肉组成产生显著影响。在罗 非鱼的试验中，以发酵豆粕可替代鱼粉用量的4 0 ( 鱼粉含量2 0 ) 而对其增重率、饲 料效率无显著影响，若代替比例达6 0 ，则罗非鱼生长显著下降；l u oz l a i 等在石斑鱼 饲料以发酵豆粕等蛋白代替鱼粉，使鱼粉用量由6 8 降为5 8 ，对鱼体增重率和成活 率没有影响；在凡纳滨对虾的试验中，可以1 2 发酵豆粕替代1 ：3 的鱼粉用量的( 基础 饲料中鱼粉含量3 0 ) ；陈萱等( 2 0 0 5 ) 用经微生物混菌发酵的豆粕与未经发酵的豆粕依 不同比例混合，连续投喂异育银鲫3 0 天后，结果表明，随着饲料中发酵豆粕添加量的上 升，供试异育银鲫不仅增重量有所提高，各项非特异性免疫指标也有所改善，s g p t 的 活性出现下降趋势。与未经过发酵的豆粕相比，发酵豆粕具有一定的促进生长、增强非 4 天津科技大学硕士学位论文 特异性免疫功能和改善肝功能的作用。刘春雪等( 2 0 0 6 ) 大豆蛋白经发酵后，大分子 的大豆蛋白被酶解成大量的小肽，这些小肽提高了机体蛋白质的合成和饲料氨基酸的 利用率，从而提高了断奶仔猪的日增重。同时微生物发酵后产生一定乳酸，使得肽多 乐具有特殊的乳香味，断奶仔猪料中添加肽多乐后，提高了饲料的适口性，进而提高 了仔猪的采食量。发酵豆粕可以提高肉鸡的日采食量、日增重，降低料肉比和腹泻率， 血清中总蛋白、白蛋白含量略有提高，降低血清中尿酸和葡萄糖含量。 1 3 小肽的概述 1 3 1 肽类物质的营养 肽是氨基酸的线性聚合物，含5 0 个以上氨基酸残基的通常称为蛋白质，低于5 0 个 氨基酸残基的称为肽。最简单的肽由两个氨基酸残基组成，称为二肽( d i p e p t i d e ) ，其 中含一个肽键。含3 个、价、5 个氨基酸残基的肽分别称为三肽、四肽、五肽。通常 把含几个至十几个氨基酸残基的肽链统称为寡肽( o l i g o p e p t i d e ) ，更长的肽链则称为多 肽( p o l y p e p t i d e ) 。有的学者把超过1 2 个而不多于2 卟氨基酸残基的称寡肽，含2 0 个以 上氨基酸残基的称为多肽。在动物营养学上一般认为“含2 个或3 个氨基酸残基的肽为 小肽一【4 2 】。 肽的营养由于受传统蛋白质的代谢观点影响，一直未得到重视，传统的消化模式 认为：动物机体对蛋白质的吸收只能以氨基酸的形式进行，动物需要蛋白质仅仅是为 了提供各种单体必需氨基酸，蛋白质被消化成氨基酸单体，并通过肠壁被吸收，蛋白 质营养就是氨基酸营养。但几十年的研究证明，不同来源的饲料在氨基酸的利用率上 存在着差异。而且当动物采食按理想模式配制的纯化日粮或氨基酸平衡的低蛋白日粮 时，也不能获得最佳的生产性能1 4 3 】。因此，一些学者提出了动物对完整蛋白质本身 或对肽有着特殊需要的观点。a g a o 等( 1 9 5 3 ) 首先观察到肠道能完整地吸收转运双甘 肽，此后n e w a y 和s m i t h 证实了肽可以被完整转运吸收的观点 4 5 1 。 f e i 4 6 1 等( 1 9 9 4 ) 克隆了小肽载体，至此人们以无可争辩的事实证明了寡肽尤其 是小肽可逃脱被消化成游离氨基酸的命运，直接以肽的形式由载体转运进入体循环。 乐国伟【4 7 】等亦证实鸡的肠道组织能够完整地吸收小肽进入循环，并可利用肠道中的游 离氨基酸合成肽转运进入循环。并提出某些氨基酸在肠道以肽的形式进入循环，可能 是肽吸收的必要方式和生理需要。由此可见小肽是蛋白质被消化后的主要产物，是肠 道氨基酸的一种重要吸收形式i 谰。业己证实，动物要获得最佳生产性能，必需在饲料 中添加一定量的完整小肽【4 9 1 ，因此可以确定小肽是一种更优质的氮源。 1 3 2 小肽的吸收特点 、 小肽可避免游离氨基酸的竞争吸收。游离氨基酸的吸收存在相互竞争，如精氨酸 和赖氨酸在吸收时相互竞争而发生颉抗。当完全以小肽的形式供给动物时，赖氨酸的 吸收速度不再受精氨酸的影响【矧。与游离氨基酸相比，肽的吸收具有速度快、耗能低、 吸收率大等优势。并且寡肽还可促进氨基酸的吸收，提高蛋白质的沉积纠5 1 j 。 5 ( 7 ) 对免疫功能的影响：某些活性小肽，能令幼小动物的小肠提早成熟，并刺激消 化酶的分泌，提高机体的免疫能力。 1 4 混菌发酵 s c k s t s a , s g 1 4 1 混菌发酵概述 微生物是一类现实和潜在用途都很大的生物资源，广泛应用于农业、工业、医药、 食品及环保等各个领域。人类对微生物的利用经历过天然混合培养到纯种培养两个阶 段，纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，能够不受干扰地对单 一目的菌株进行研究，从而丰富了我们对微生物形态结构，生理和遗传特性的认识。 但是，在长期的实验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物 不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成。微生物混 6 天津科技大学硕士学位论文 合培养( m i x e dc u l t u r e ) 或混合发酵( m i x e df e r m e n t a t i o n ) 越来越被人们所重视。科学家 们对混合培养微生物资源进行了多方面的研究，不仅具有深远的理论意义，更具有重 大的应用价值。 在固体发酵技术中应用的微生物资源非常广泛，从细菌到真菌的很多个菌属都得 到了一定的研究和应用，而且它所利用的微生物资源还在不断地丰富和增加。在过去的。 很长一段时间里，对固体发酵技术的研究很大程度上局限在对丝状真菌的利用 ( f i l a m e n t o u s f u n g i ) 和酵母( y e a s t ) 生产产品上。不过在最近的二十年间，对把细菌菌株 ( b a c t e r i a ls t r a i n s ) 作为固体发酵所利用的微生物资源进行了大量的探索和研究，也取 得了很好的研究成果。由于细菌资源库本身的丰富，以及细菌的代谢产物的丰富，更 加扩展了固体发酵技术应用的领域。 对于很多工业污染物、生物农药、纤维素、几丁质的生物降解，微生物混合培养 是必要的；微生物混合培养可用于维生素c 、维生素b 1 2 、组氨酸、缬氨酸、i 广苹果酸 等发酵生产，还可用于药物的甾体转化、沼气发酵、湿法冶金等。混合培养的微生物 资源应受到人们更多的重视。 混合发酵区别于一般微生物发酵的主要不同之处在于该体系由两种或多种微生 物组成，其中一种微生物为另一种微生物提供营养来源或互相提供营养，有的情况下 后者还可以通过利用这些产物为前者消除了降解物造成的抑制，从而组成一个使体系 中的各种微生物和谐共生的环境。 1 4 2 混菌发酵菌种选择 微生物种类多，其代谢特征各异，菌体蛋白质含量较高，能利用的物质也很丰富， 这就奠定了其在饲料开发中的重要地位。因为饲料是供动物饲用的，用于饲料生产的 微生物必须无毒，要适宜于生产过程中的各种环境。动物饲用其代谢产物或菌体后应 该有益。我国农业部使用的益生菌有六种：乳酸杆菌、乳酸链球菌、粪链球菌、芽胞 杆菌、双歧杆菌和酵母菌。在保证所用菌种安全的基础上，又要使所用菌株能够很好 地改变饲料原料的理化性状，或增加其适口性，提高消化吸收率及其营养价，因此所 用菌种需具有以下几个特性：( 1 ) 对大豆抗营养因子的消除；( 2 ) 对大豆蛋白的有效降解， 即降解为小肽而不是转化为氨类；( 3 ) 有利于动物肠道微生态平衡的建立；( 4 ) 有利于饲 养环境卫生改善及水生动物水质的维护。 我国是一个动物蛋白质严重不足，而植物蛋白质非常丰富的国家，而植物蛋白质 中又以大豆量最大。为了解决优质蛋白质源不足的问题，可以借助生物技术、微生物 工程、酶工程等生产一种优质蛋白质源，同时又保留有大量有益菌，使产品既有微生 态制剂功能，又能解决优质蛋白质源不足的问题，使微生态制剂原料化，从而可以大 大拓宽使用途径。 1 5 固态发酵 ， 1 5 1 固态发酵概述 6 0 , 6 1 , 6 2 , 6 3 l 7 1 前言 广义上讲固态发酵是指一类使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，既包 括将固态悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有( 或几乎没有) 游离水的湿固体材料 上培养微生物的工艺过程。多数情况下是指在没有或几乎没有自由水存在下，在有一 定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。 狭义上讲固态发酵( s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ) 是指利用自然底物做碳源及能源，或利 用惰性底物做固体支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程。与其他培养方 式相比，固态发酵具有如下优点：( 1 ) 培养基简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或 工业生产的下脚料；( 2 ) 投资少，能耗低，技术较简单；( 3 ) 产物的产率较高；( 4 ) 基质含水 量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工 方便；( 5 ) 发酵过程一般不需要严格的无菌操作；( 6 ) 通气一般可由气体扩散或间歇通风 完成，不需要连续通风，空气一般也不需严格的无菌空气。同时，随着微生物基因遗 传技术的应用、优良菌株的发现和筛选，以及生产工艺等方面的改进，固态发酵技术 也得到了进一步发展。 1 5 2 固态发酵工艺条件的控制 固态发酵是一种接近自然状态的发酵，它与液态深层发酵有许多不同，其中最显 著的特征就是水分活度低和发酵不均匀。菌体生长、营养物的吸收和代谢产物的分泌 在各处都是不均匀的，使得发酵参数的检测和控制都比较困难，许多液态发酵的生物 传感器也无法应用于固态发酵。至今为止，在报道的文献中还没有见到较为完善的关 于固态发酵的数学模型，虽然有一些关于固态发酵动力学研究报道，但都是以图表的 形式出现) ，固态发酵研究仍然停留在以经验为主导的水平上1 6 4 , 6 s - 1 。目前固态发酵可 测或可调的参数主要有：培养基含水量、空气湿度、c 0 2 和0 2 的含量、p h 值、温度和 茵体生长量等1 6 0 , 商s l 。 1 5 3 固态发酵技术在饲料生产上的应用 传统的固态发酵技术生产发酵饲料，是我国劳动人民长期生产经验积累的结晶， 在我国农村有广泛的应用。用谷物糠麸、蔗渣和秸秆等粗饲料，利用曲种和原料中各 种有益微生物的作用，把粗饲料加工成养份高适i z l 性好的饲料，以提高粗饲料的饲用 营养价值。研究表明，发酵不是简单的粗饲料加水堆积，而是涉及到微生物复杂的作 用，主要有曲霉把不易于消化吸收的成分转化成可给态，将粗饲料、淀粉、果胶等物 质转化成各种糖类，有酵母、细菌和乳酸菌利用其自身在生长过程中产生的各种酶类， 改善某些营养物质的成分和适口性【6 。 1 6 本课题的立题依据及研究内容 1 6 1 本课题的立题依据i 】 近年来，消费者对食品的安全、卫生等问题日益关注，而饲料安全是畜产品安全 和食品安全的一个重要环节。由于动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、 激素、重金属、镇静剂等促生长保健剂，导致畜产品中药物残留严重，畜产品品质下 8 天津科技大学硕士学位论文 降，对人类健康和公共卫生构成了很大威胁。因此加速开发、推广和应用新型安全高 效的饲料添加剂，提高饲料和食品的安全和质量已迫在眉睫。肽作为一种新型的绿色 饲料添加剂正在越来越多的受到重视。肽的营养是蛋白质营养的一个新的亮点。 大豆是世界上重要的粮食作物之一，大豆作为人膳食中的蛋白质来源已有五千多 年的历史。在本世纪引入美国以前，中国是大豆的主要生产国。大豆油是全球的主要 油脂品，大豆的加工副产品( 豆粕) 是饲料业的主要蛋白原料。起初，美国主要关心大 豆的含油量，提出油以后的豆粕和豆皮仅仅是副产品。不久豆粕中的蛋白质的优异品 质被人们所认识。从此豆粕成了猪、鸡日粮中补充蛋白的主要来源。近年来，随着生 物技术的飞速发展，基因工程技术为人类食品和动物饲料的供应提供了新的途径。目 前，大豆品种选育方向主要是使其抗营养因子最小化，提高其营养价值。全世界动物 饲料中所用的植物蛋白中6 2 源于豆粕，豆粕中的蛋白质和氨基酸组成与动物的需要 接近，豆粕在养殖业中具有很高的使用价值。 在动物饲料工业中豆粕是最普遍的蛋白质来源。高蛋白质含量及使用的广泛性使 得豆粕是动物饲料很好的蛋白质来源。然而，豆粕的使用仅限于成年动物。这是由于 大豆蛋白质的分子结构复杂，8 0 的蛋白质分子量在1 0 万以上，大多数分子内部结构 呈反平行b - h e l i x 非有序结构，分子高度压缩，折叠，大豆球蛋白三级结构、四级结构 ( 半手别二硫键使其亚基牢固结合) 高度结构化形成交通规则实体( b o o n1 9 7 9 ) ，从而使得 大豆蛋白消化率和生物效价远不如牛奶，鸡蛋等动物性蛋白。另外，豆粕中的抗营养 因子普遍产生了有害效果。因而，能够降低豆粕中的有害成分及抗营养因子的加工技 术的发展，将使生产出高质量的，便宜的蛋白质成为可能，而这些蛋白质对人类和未 成年动物都会产生有益的功能。 生产富含小肽的蛋白饲料关键是蛋白的水解，目前主要的水解方法有化学水解 ( 酸水解和碱水解) 、酶水解以及微生物发酵法，酸水解虽然便宜、简单，但是其缺 点是不能进行有规则的控制生产，同时因生产条件比较苛刻，氨基酸会受到损害而降 低其营养价值，因此现在很少采用此方法。酶水解的方法能很好地控制生产，再加上 是在比较温和的条件下进行的，所以能很好地保存氨基酸的营养价值。用于大豆蛋白 水解的酶，仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植物蛋白酶。植物蛋白酶( 如 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等) 效率低，受外界环境因素影响大，成本高，不适合工业 化生产；动物蛋白酶( 如胃蛋白酶、胰蛋白酶等) 虽酶解效果好，但价格太高，副反 应多，同样不适合工业化生产；微生物蛋白酶酶解效较好，副反应少，但是价格相对 较高。微生物发酵法生产富含小肽的蛋白饲料不需要蛋白酶的提取过程，而且直接利 用微生物生长过程中产生的各种酶类，此酶系非单一蛋白酶，而是多种蛋白酶混合的 复合酶系，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶等一系列蛋白酶。同时通过工 艺条件的控制，将大量有益菌及其产物( 芽