（发酵工程专业论文）渤海海域抗菌活性微生物的筛选和鉴定.pdf

摘要 在不同温度和p h 条件下，利用不同营养物浓度的海洋细菌、真菌、放线菌 分离培养基，从渤海海水样品中筛选到8 7 株海洋细菌、1 2 7 株海洋真菌( 均为 霉菌) 和1 4 株海洋放线菌。 2 8 、1 6 0 r m i n 条件下对所筛的8 7 株海洋细菌进行液体发酵，利用牛津杯法 对发酵液进行抗细菌活性检测，研究结果表明：2 8 株细菌对大肠丰t 菌( b c p r f 曲抽 肿或令黄色葡萄球菌( r 叩 y f 。c d c c w 日“旭“s ) 有不同程度的抑制作用，阳性 筛选率为3 2 2 ：8 株细菌可抑制上述2 种指示菌，阳性筛选率为9 2 ，a 4 9 菌株的 活性最强。以玉蜀黍平脐蠕孢菌( b 妒。肠，括m 印耐如) 、大丽轮枝菌( 舱r ，f c f f m 删 出h 妇p ) 、麦根腐平脐蠕孢菌( b 毋。胁括s d r 0 胁 f 以月d ) 、大豆尖孢镰刀菌( 凡l s n r j “m d 砂印o ，“m ) 、苹果黑腐皮壳菌( 胁，s m “忉、茄链格孢菌似f ，p r 月“r 汹s 。肠h f ) 、烟草 秀乏霉菌( j f ) 矗叩向f 向o r ( p d r 口s f ，c 。v d ， f c d ，f 口 盘p ) 干口立枯丝核菌( 月向j z 。c f d 门z 口s o ，d 门i ) 等8 种植物病原真菌为指示菌，采用滤纸片扩散法对2 8 株抗性细菌进行活性检测， 结果均呈阴性。通过对菌株a 4 9 进行菌落形态、个体形态观察以及生理生化试验， 依据伯杰氏细菌鉴定手册可知菌株a 4 9 属于芽孢丰t 菌科( b 口c f c p d e ) ，芽他 杆菌属( b “c i 胁js 口) 。对其l6 sr d n a 进行系统发育分析，确定其为芽孢杆菌属， 暂命名为b 盯c 肼f “5s d a 4 9 。 以8 种植物病原真菌为指示菌，采用双向培养法对1 1 6 株常温海洋霉菌进行抗 菌活性初筛，结果得到4 l 株霉菌对植物病原真菌有不同程度的抑制作用。根据真 菌鉴定手册，对其中抗菌谱较广的4 株霉菌进行了地位分类，确认3 2 # 霉菌为曲 霉属，4 0 # 霉菌为耳霉属，6 7 # 和1 8 # 霉菌为青霉属。利用滤纸片扩散法对4 1 株活性 霉菌进行复筛，得到1 株抗菌谱广、活性强的6 7 # 菌株，其他菌株没有检测到活性。 利用生长速率法检测6 7 # 菌株发酵液对日m 掣历j 、旷出a 胁p 、f o 口印d 脚、旷d 虮 p f c d 砌 口p 和| 4 邶抽 i 等6 种指示菌的抑制率和c 。，抑制率分昌0 为4 0 o 、3 0 6 、 3 6 7 、2 3 5 、3 0 0 口2 6 3 ，e c 。分男0 为3 1 6 l5 、3 5 7 5 l 、31 6 2 3 、4 8 6 8 6 、 4 3 9 1 4 和4 7 6 7 6 。以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，利用牛滓杯法对4 l 株活性霉菌进行抗细菌活性检测，没有筛选到既抑制真菌又抑制细菌指示菌的活 性霉菌菌株。 关键词：海洋微生物：分离纯化：鉴定；抗菌活性：生物活性物质 a b s t r a c t a tt h ed i f r e r e n tt e m p e r a t u r e ，p ha n dc o n c e n t r a t i o no fn u t r i e n t ，8 7s t r a i n so f m a r i n eb a c t e r i a ，l2 7s t r a i n so fm o l d sa n dl4s t r a i n so fa c t i n o m y c e sw e r ei s o l a t e d f r o mb o h a i e ，c g r f c 向面c d f fa n d & 印幻，f o c c “5 口“胛“5w e r eu s e da ss e n s i t i v eb a c t e r i a ， f e r r n e n t e dp r o d u c to f8 7s t r a i n so fb a c t e r i a ，w h i c hw e r ef e 哪e n t e da t2 8 ，16 0 r m i n ， w a sd e t e c t e db yt h em e t h o do fo x f o r dc u p t h er e s u i t ss h o w e dt ha t2 8s t r a i n so f b a c t e r i ai n h i b i t e d c d f fo rs 删，已淞i nd i f f e r e n td e g r e e ，8s t r a i n so f b a c t e r i ai n h i b i t e d t h eb o t h ，m ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fs l r a i na 4 9i n h i b i t i n gec o ，fa n ds 口“r p 淞w a s m o r es i g n i n c a n tt h a no t h e r s8s p e c i e sp a t h o g e n i cf u n g io f p l a n ts u c ha sb 印。肠r 血 m c i y d i s ，b i p o l c f i ss o r o k t n i d n d ，垤y t i c i l t i m md d h l i d e ，f s d r t u mo x y s p o r “m ，a l s dm d t t ， p h y t o p h l h o r d p d r ( 1 s i “c d v d rn i c o “n n d e ，r h i z o cc o n i os o t d h ia n da i t e r n n r i rs o l a n tw 己i e u s e da ss e n s i t i v es t r a i n s ，a n t i f u n g ia c t i v i t yo f 2 8s t r a i n so fb a c t e r i a ，w h i c hi n h i b i t e d ec o f o rs 口“r e “s ，w a sd e t e c t e db yt h em e t h o do fp a p e rd i s cd i f f l i s i o n ，b u tn o n eo f t h e mi n h i b i t e d8s p e c i e ss e n s i t i v ef u n g i a c c o r d i n gt ob e r g e y sm a n u n a lo f d e t e n n i n a t i v eb a c t e r i 0 1 0 9 y ，m o r es t u d i e sh a db e e nd o n eo ns t r a i na 4 9s u c ha s ， m o r p h o l o g i c a l ，p h y s i 0 1 0 9 i c a la n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，a n dt h er e s u l t si n d i c a t e d l h a tt h es t r a i na 4 9 b e l o n g st o 口口c 洲“s t h e16 sr d n ag e n eo ft h es t r a i na 4 9w a s s e q u e n c e da n dt h ep h y l o g e n e t i cf e l a t i o n s h i pa m o n gd e s c r i b e d6 n c f ，“s s pw a sf h n h e r a n a l y s i z e d t h er e s u l t sw e r ec o r r e s p o n d i n gt ot h ec i a s s i c a li d e n t i n c a t i o n ，a n dt h e s r a i na 4 9w a st e m p o r a r i l yn a m e db 以c f ，妇s s pa 4 9 b yt h em e t h o do fb i d i r e c t i o n a lc u l t u r e ，i n1 16s t r a i n so fm o l d s ，41s t r a i n so f m 0 1 d sw e r ef o u n dt oi n h i b i t8s p e c i e ss e n s i t i v ef u n g ii nd i 脏r e n td e g r e e 4s t r a i n so f m 0 1 d sw h i c hw e r ec o d e da s18 拌，3 2 撑，4 0 # a n d6 7 # s h o w e dc o r r e s p o n d i n g l yb r o a d a n t i f u n g is p e c t r u m a c c o r d i n gt ot h es n c t u r eo fc 0 1 0 n ya n da s e x u a lr e p r o d u c t i o n ，4 s t r a i n so fm o i d sw e r er e s p e c t i v e l yi d e n t i 6 e da s 尸p 门七i ，j “”? l k e xf r i e s ，爿点p p 苫f ，“s 砸c e ，fe xf r ，( 0 ”胁d 6 0 n ，sb ，鼍尼，da n d 。p p 盯f c f ，f f “， l ke xfr i e st h r o u g ht h em a n u a l o ff u n g i i d e n t i n c a t i o n b yt h em e t h o do fp a p e rd i s cd i f 扎s i o n ，t h e6 7 群w a sd e t e c t e dt oi n h i b i tb ， c 叫如， 矿d 口向z 胁e ，f 讲( y p o r “肌，矿埘口圮p 胛f c d f 谊n 盘已a n d 爿s d 肠n f ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t o n l yt h e6 7 拌h a sm o r es i g n i f i c a l l ta n t i f u n g ia c t i v i 妙a m o n g4 1s t r a i n so f m o l d s ，a n d t h ei n h i b i t i v er a t e so f6 7 抖f o ri n h i b i t i n gt h es e n s i t i v ef u n g ia b o v ew e r e4 0 o ，3 0 6 ， 3 6 7 ，2 3 5 ，3 0 o a n d2 6 3 ，t h ec o r r e s p o n d i n ge c 5 0 w e r e3 1 6 1 5 ，3 5 7 5 l ， 3 1 6 2 3 ，4 8 6 8 6 ，4 3 9 1 4a n d4 7 6 7 6 b yt h em e l h o do f o x f o r dc u p ，t h ea c t i v n yo f 4 l s t r a i n so fm o l d sw e r ed e t e c t e db yu s i n ge f fa n ds d “旭淞a ss e n s i t i v eb a c t e r i a ，t h e r e s u 】t sp r e s e n t e dn e g a t j v e k e yw o r d s ：m a r j n em i c r o o r g a n i s m s ；s e p a r a t ea n dp u r i f y ；i d e n t m c a t i o n ；a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y ；b i o a c t i v es u b s t a n c e s 第一章文献综述 第一章文献综述 1 海洋微生物多样性 1 1 海洋微生物及其多样性定义 浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，它覆盖着地球表面积的7 1 。海洋微生物是 海洋生物的重要成员，但我们对海洋微生物的了解却远远落后于陆地微生物。一 般认为，分离自海洋环境，其正常生长需要海水，并可在寡营养、低温等条件下 生长的微生物可视为，z 格的海洋微生物：然而有些分离白海洋的微生物其生长 不一定需要海水，但可产生不同于陆地微生物的代谢物( 如溴代化合物抗生素) 或拥有某些特殊的生理性质( 如盐酬受性、液化琼脂等) ，也可视为海洋微生物。 海洋微生物种类繁多，相对于陆地微生物而言，它们能够酬受海洋特有的高 盐、高压、低营养、低光照等极端条件，因而在物种、基因组成和生态功能上具 有多样性，是整个海洋生物多样性的重要绸成部分。通常情况下，生物多样性可 以理解为生物物种的多样化及其变异的程度和广度，是物种多样性、遗传多样性 和生态系统多样性3 个层次上的综合表述。海洋微生物多样性( m a r i n e m i c r 0 0 r g a n i s m sd i v e r s i t y ) 是指所有海洋微生物种类、种内遗传变异和生存环 境的总称，包括生存环境的多样性、生长繁殖速度多样性、营养和代谢类型多样 性、生活方式的多样性、基因的多样性以及微生物资源丌发利用的多样性等。1 1 。 海洋微生物多样性自身的特点和当前研究的手段，决定了目6 u 海洋微生物多样性 的研究通常集中于以下4 个水平，即分类多样性、功能多样性、遗传多样性和系 统发育多样性7 ”。海洋微生物多样性等基础性研究是海洋资源丌发和利用的i u 提。 1 2 海洋微生物遗传与生态系统多样。生 遗传多样性( g e n e t i cd iv e r s i t y ) 是指不同群体之间或同一群体内不同个 体之问遗传变异的总和，主要包括蛋白质多样性和d n a 多样性。生物群体的遗传 多样性是评价生物资源状况的一个重要依据，它是物种适应多变的环境条件，维 持长期生存和进化的遗传基础。从遗传学角度来讲，一个物种遗传多样性的高低 与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关。遗传多样性的降低可导致其适应 能力降低，有害隐性基因表达增加及经济性状衰退，最终导致物种退化；丰富的 第一章文献综述 遗传多样性则意味着比较高的适应和生存能力，蕴涵着比较大的进化潜能。由于 海洋微生物的生存环境与陆栖微生物迥异，它们处于高盐、低温和高压的环境下， 生存竞争特别激烈，所以产生了一些不同于陆地微生物的变异，具有很强的防御 能力和识别能力，在遗传型上表现出特异性，这些遗传差别使得某些微生物能在 局部环境中的特定条件下更加成功的生存和繁殖。 我国海洋生态系统主要包括沿海、河口、上升流、珊瑚礁、红树林、深海等。 海洋微生物作为分解者和次级消费者，影响着海洋生态系统中p o m 的溶解与沉降、 【 o m 的形成与消耗、无机营养盐的形成等生态过程：作为海洋生态系统重要组成 部分，在海洋化学循环中起着重要作用。有些海洋微生物是初级生产者，能通过 光合自养、化能自养等营养方式生产有机物。 1 3 海洋微生物的特点及物种多样性 海洋环境条件恶劣，具有高压、高盐、高温( 低温) 、低光照、寡营养等特 点。尤其是l 0 0 0 m 以下的深海，其生态环境特征更加显著。特殊的海洋环境赋予 了海洋微生物新的特点。 海洋微生物几乎包括了所有的微生物类型。有起源于海洋的种类，也有起源于 陆地而进入海洋并适应存活的种类。前者因海洋环境的独特而具有特殊的生理活 ， 性和遗传背景；后者则因生理和代谢系统上的适应性，形成了与陆地微生物不同 的生理和代谢系统。 海洋微生物具有多种多样的特殊功能。如酬盐性、耐寒性、酬高温、耐高压等 特性，光合成、固氮、硝酸盐还原、浮游、发光、吸磁、稀贵金属浓缩、环境治 理和清污、能量交换、信息传递等能力。海洋细菌通常能液化琼脂且具有盐耐受 性，而陆上细菌则很少有此能力。某些菌株含有的质粒数彼此之间与陆上生物之 问不同，即在海洋环境中出现的新质粒。 许多从海洋中分离的微生物具有和陆地微生物相同的特征。有研究表明：许多 海洋微生物来自于陆地，在适应了海洋环境之后，获得了一些特殊的能力从而生 存下来。 海洋微生物可产生多种有特殊功能的活性物质。 海洋微生物种类繁多，可以分为非细胞类生物( 如病毒) 、古细菌( 如产甲 烷古菌、嗜热酸古菌、嗜盐古菌) 、细菌( 光能自养菌、化能异养菌等) 、真核 第一章文献综述 生物( 光合自养菌的微藻、化能异养菌的原生动物门和真菌等) 等等。 2 分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用 关于海洋微生物研究方面最早的工作是z o b e l l 在1 9 4 6 年进行的，由他设计的 z o b e l l 2 2 1 6 e 培养基至今仍在海洋微生物的富集和分离纯化研究中广泛应用。2 0 世纪4 0 年代以来，人们一直采用分离培养的方法来研究海洋微生物的多样性，即 将海洋微生物从环境中分离纯化，然后通过一般的生物化学性状或者特定的表现 型来分析其多样性。然而，随着人们对海洋微生物研究的不断深入，发现这种方 法并不能全面地反映海洋微生物多样性的现状，因为海洋中微生物往往集结在一 起，一些微生物经常处于“活的非可培养状态”，而且用予分离培养的培养基具 有很强的选择作用，在培养过程中往往加入了浓度远高于自然环境的营养物质， 结果在新的选择压力下群落结构发生变化，适应富集营养的菌种成为优势种，取 代了自然条件下的优势种”67 ”，这些都导致了建立在微生物纯培养技术上的传 统方法只能反映极少数微生物的信息，不能充分反映海洋微生物的生念功能，也 使大量的具有极大应用价值的海洋微生物资源被埋没了。a n l a n n 等“0 1 根据微生物 原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学的研究结果得出：通过实验室人工培 养方法已经分离和描述的海洋微生物物种数量仅占估计数量的1 5 ，而其余 9 5 9 9 的微生物类群仍然未被分离和认识。据报道，迄今为止，人们分离获得 的可以进行培养的海洋细菌主要有以下一些种属：假单胞菌属( p s e “d o m o n s ) 、 弧菌属( 所6 r i o ) 、螺菌属( 勋j r “脚) 、交替单胞菌属( 爿f f e r d 聊o 日s ) 、无色 杆菌属( 爿c r o m d 6 口c f p r ) 、黄卡t 菌属( f f 口v o 蚰c f p r m ) 和芽孢菌属( b d c f ，“s ) ； 深海的科尔韦尔氏菌属( c o ，w 圯，曲) 、希瓦氏菌属( 跏“，口 g ，m ) 、发光杆菌属 ( j d o r d 6 d c 旭，i “坍) 、节杆菌属( 爿，f r d 6 c 地r ) 以及噬压微生物。 2 0 世纪6 0 年代开始，随着分子遗传学和分子生物学及技术的迅速发展，尤其 是1 9 8 5 年p a c e 等1 利用核酸序列的测序来研究微生物的进化问题以来，人们对微 生物的多样性的研究进入一个崭新的阶段。8 0 年代未至9 0 年代以来，分子生物学 技术被广泛应用于微生物群落结构分析，且发展非常迅速，研究的焦点集中在具 有保守序列的1 6 sr d n a 上。后来，人们采用聚合酶链式反应( p c r ) 、1 6 sr r n a 序 列分析以及a r d r a ( a m p l i f i e dr d n ar e s t r i c t i o n a n a ly s is ) 等现代分子生物学技 术，在基因水平上研究海洋微生物多样性，克服了微生物培养技术的限制，能够 第一章文献综述 对样品进行比较客观的分析，较精确地揭示海洋微生物的多样性。目前，分子生 物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用主要集中于以下几个方面。 2 11 6 sr r n a 在分子分类鉴定中的应用 1 9 8 6 年p a c e 等“”首次利用r r n a 基因来确定环境样品中的微生物，通过对5 s r r n a 基因的序列分析来研究微生物的生态和进化，这种方法很快便被应用于海洋 微生物多样性的研究中。由于5 sr r n a 基因相对较小，所携带的信息也较少，随 即丌展的1 6 sr r n a 基因序列研究则能为海洋微生物多样性的研究提供更多更全 面的信息，而且效率也高许多。1 6 sr r n a 基因序列分析主要是基于已建立的1 6 s r 刚a 基因序列数据库，大量己知微生物的d n a 被测定并输入国际基冈数据库，用 于确定细菌的系统发育关系，并使序列探针能够识别未知菌，即通过对未知微生 物d n a 序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的= 。“， 成为微生物鉴定和分类非常有用的参照系统。目前，1 6 sr r n a 基因序列已经成为 细菌系统分类研究中最常用也是最有效的一个分子生物学指标，广泛应用于微生 物的遗传特征和分子差异的研究中。“3 ，为海洋微生物多样性的研究和微生物的系 统发育以及未知菌的鉴定提供了全新的方法，并取得了一些有意义的结果。w o e s 等3 利用1 6 sr r n a 寡核苷酸序列分析技术，发现了一类在系统发育上与其它细 菌存有很大差异的微生物一占细菌奠定了有关古生物、真细菌和真核生物“三 域”理论的基础。r a v e n s c h l a g 1 从永冻的海底沉积物中分离得到了3 5 3 株微生物， 通过1 6 sr d n a 斑点杂交发现它们大部分是与硫循环有关的细菌。g 1o v a n o n i 等“ 利用1 6 sr r n a 基因序列分析技术研究了马尾藻海中浮游细菌的遗传多样性”。曾 润颖等”“应用1 6 sr r n a 作为分子标记，列从东太平洋海底分离到的一批嗜冷细菌 进行了分子分类鉴定，并对其系统发育情况进行了分析。戴欣等“i 1 通过构建 1 6 sr r n a 基因库对中国南海南沙海区沉积物中的细菌多样性进行了分析，发现沉 积物中细菌1 6 sr r n a 基因主要来自变形细菌和浮霉状菌曰( 尸胁n f ，d 卅m e ，d 7 e s ) 等类 群，并且所获得的1 6 sr r n a 基因的序列与基因库中已知的细菌的1 6 sr r n a 序列差 异较大，这一结果表明在中国南沙海区沉积物中存在丰富的微生物多样性，并潜 藏着特有的微生物资源。 2 2 核酸杂交分析技术的应用 核酸杂交分析技术是2 0 世纪7 0 年代发展起来的种崭新的分子生物学技术， 第一章文献综述 由于这种技术具有高度的特异性和灵敏性，近年来已被广泛应用于微生物多样性 的研究。目前用于海洋微生物多样性研究的探针主要有双链d n a 、单链叫a 和r n a 以及寡核苷酸探针三类，可对海洋微生物在特定环境中的存在与否、分柿模式以 及丰度情况进行研究，并且取得了很大的成功。j a i n 等”采用特异性的探针对地 下水环境中的细菌进行原位杂交，研究了细菌有关质粒基因的存在和分布情况。 l o b e t b r o s s a 等”o 。应用荧光标记的r r n a 基因探针，对海底沉积物中的微生物群落 进行了全细胞杂交分析，结果发现这种方法可以提供比用探针作s o u t h e r n 印迹杂 交更为直观的信息。l e e 和f u h r m a 1 ”通过对海水样品中提取的d n a 作数量印迹杂 交，研究了海洋浮游细菌群落结构的多样性。m u r r a y 等”利用s 。u t h e r n 杂交技术 成功地研究了南极洲a n v e r s 岛附近海水中细菌和占细菌的时空变异。k 1e i k e m p e r 等”3 1 利用荧光原位杂交技术( r i s h ) 结合磷脂酸分析技术( p l r a ) 对污染坏境中硫 酸还原菌的生理功能进行了研究，结果证明硫酸还原菌对醋酸盐化合物和丁酸赫 化合物具有很强的分解能力，在海洋沉积物环境的碳循环中发挥着重要的作用。 s c h r a m 1 等”“将f f s h 技术和微传感器相结合，可以同时分析微生物的群落结构和 代谢活性，并揭示了厌氧微生物在有氧环境中的缺氧微生态位。 2 3 基于p c r 技术的研究方法的应用 应用p c r 技术能够在短时间内人为地控制并特异性扩增目的基因或d n a 片段， 使研究的目的基因及其环境样品中的微量微生物基因得到无限的扩增，成功地解 决了由于不可培养状态而导致大部分海洋微生物不能被鉴定出来的难题，大大推 进了海洋微生物多样性的研究，是当今该领域应用最广泛的方法。目前国内外比 较常用的基于p c r 技术的研究方法主要有p c r r f l p 、p c r s s c p 、r a p d 、 r d r a 、 p c r d g g e 等。这几种方法的共同点是首先提取环境样品中的核酸，然后采用合适 的引物进行扩增。b u c k l e v 等”提取环境样品中微生物的d n a ，利用p c r r f l p 技术， 确定1 6 sr r n a 的丰度，而且他们在研究中还发现可以利用p c r 扩增的1 6 sr d n a 的 荧光标记术端多形态限制性片段来判断微生物群落的生态状况。w id m e r ”“1 采用 1 6 sr r n a 基因的p c r r f l p 技术和d n a 测序相结合的方案，对与生态、经济和人类 健康等均具有重要功能的假单胞菌进行了研究，结果表明这是分析假单胞菌种群 结构和寻找分类学汪据的有力手段。s a b i n e 等”用p c r s s c p 技术研究了海洋微生 物群落的演替和菌种的多样性，认为这种方法可以避免传统培养方法的费时费力 第一章文献综述 以及误差大的干扰，非常适合对微生物群落结构和演替的分析。陈偿等“”利用 r a p d 技术对养殖环境中溶藻弧菌的遗传多样性进行了研究，从而发现了溶藻弧菌 流行的基本规律。r a s m u s s e n 等“”提取了海底沉积物中的微生物d n a ，并对其进行 了p c r d g g e 分析，结果表明，可以利用这种方法研究海洋环境中微生物的群落结 构和多样性。b e j a 等”1 利用p c r 技术从海洋中发现了新的光合作用基因簇，并获 得了以往实验室条件下从未培养出来过的1 l 类新菌种，即好气、厌氧光合生物。 但是，基于p c r 技术的研究方法也存在着明显的不足：( 1 ) 环境样品不宜长期保存， 否则会导致其中的微生物发生变化。( 2 ) 每次提取d n a 的效率不同，造成实验结果 的重复性差。( 3 ) 某些原核生物比其它细胞容易裂解，引起裂解程度不均一，使 得不裂解细胞的丰度估计过低。( 4 ) 引物对不同样品的扩散效率不同，往往引起 丰度估计偏差。这也提醒研究人员，在今后实际的研究工作中，应当综合应用各 种技术，而不能拘泥于一种方法，这样可以避免由于方法原理本身所带来的不可 避免的误差，从而获得更加全面和更加可靠的信息。 研究海洋微生物多样性，不仅可以为开发利用海洋微生物资源提供重要的参 考依据，为人类提供更多更好的物质来源，还可以为人类了解生命起源和进化提 供重要的线索，甚至会推翻一些传统的生命理论。“1 。现代化生物技术在海洋微生 物多样性研究中的应用，克服了传统分离培养方法的限制使对海洋微生物多样 性的研究朝定量化前进了一大步，大大丰富了海洋微生物的多样性，并改变了人 们对海洋生态系统的传统理念，加速了海洋微生物学科的发展。同时，也应看到， 现代生物技术不仅所需费用较高，而且方法本身还存在不足，已有研究表明，纯 培养条件下得到的微生物的测序结果与直接对样品检测的结果相差很大。”1 。1 。因 此，在对利用现代生物技术所取得的结果进行理论探讨时，应该时刻考虑到方法 的代表性和稳定性。同时，还应对传统的微生物分离培养得到的结果，作出合理 的判断和解释。只有这样，才能使海洋微生物多样性的研究得到健康的发展。 3 海洋微生物活性物质的研究意义及进展 海洋约占地球表面积的7 1 ，其中蕴藏着丰富的微生物资源。特殊复杂的海 洋环境( 高盐度、高压力、低温及特殊的光照等) 赋予海洋微生物产生不同于陆 地来源的特殊产物。随着陆地资源的不断丌发及枯竭，发现新的活性物质的可能 性在r 益减小，再加上抗药性等问题越来越严重( 据w t o 报道目前药物失去作用 第章文献综述 的速度与发现新药的速度差不多) ，拓宽寻找新药的途径迫在眉睫。”5 1 “，因 此，研究和开发海洋微生物生物活性物质有着重大的意义。 长期以来，人们认为海洋没有生物演变的先决条件，因此，推断海洋生物物 种不会多。然而掘调查，海底环境的生物多样性比得上陆地上物种最多的热带南 林o 1 。自从1 9 2 9 年英国学者f l e m i n g 发现真菌产青霉素以来，人们就认识到真 菌和细菌是具有特殊结构的生物活性物质的丰富来源。”1 。二寸世纪4 0 年代， z o b e 、b e a r d 和m e a d o w c r o f t 等都发现了海水的杀菌作用”“”3 。g r e i n 和m e y e r s 发表了海洋放线菌产生抗生素的报道”。b u r k h o l d e r 等”在l 9 6 6 年最早报道， 从海藻表面的细菌中分离到的海洋微生物代谢产物是具有很好抗菌作用的高度 溴化的吡咯化台物一硝毗咯菌素( p y r o l n i t e 讣) ，海洋微生物活性物质的探索 真f 丌始。1 9 8 8 年之后，海洋微t ! _ | 三物的培养与发酵技术以及其代谢产物的研究 成为海洋药物研究的热点”。1 9 9 j 年f a u l k n e r 报道，从海洋无脊椎动物和海藻 的代谢产物中分离到3 7 0 0 多种天然产物，这一研究现在己扩展到海洋微生物领 域。掘中国医学科学院医药生物技术研究所微生物产物数据库的资料统计，1 9 8 8 1 9 9 2 这5 年间海洋微生物产生的化合物的报道已达到1 7 ，呈现升高趋势。在 过去的1 0 年多中人们己经从海洋微生物中分离到数百种有机化合物，其中近百 种属世界上首次发现。有的化合物结构奇特，在陆地生物中从未见过。不少具有 降血压、抗心律失常、抗癌、消炎等活性。科学界相信：2 l 世纪海洋微生物将 成为丌发新型医药品的重要资源。海洋微生物作为活性物质的新来源，f 同益受 到国内外海洋研究工作者的重视。目前，国内外已经从海洋真菌、细菌、放线菌 等微生物中分离到多种具有较强生物活性的物质，并着手于这些物质的工业化生 产。海洋微生物产生的生物活性物质主要包括抗肿瘤和抗病毒物质、抗生素、生 物毒索( 河豚毒素、海葵毒素、石房蛤毒素、黄曲霉毒素、n c o s u r u g a t o x i n 及 ( 1 js c o d e r m i d e 等) 等。海洋微生物还可以产生多种其他的生物活性物质如酶类 ( 几丁质酶、热稳定性酶、海藻解壁酶、葡聚糖降解酶、碱性蛋白酶、超氧化物 歧化酶s o d 、碱性磷酸酶、过氧化物酶等”i 1 ) 、酶抑制剂、多糖、不饱和脂肪 酸( e p a 、d h a 等) 、维生素、氨基酸、色素( 如橙色色素、灵菌红素、黑色素 等) 等，这些活性物质在医药、化妆品、保健食品、食品添加剂和着色剂等方面 也具有广阔的应用前景。 第一章文献综述 3 1 海洋真菌产生的活性物质 海洋真菌是海洋微生物的一个重要分支。据0 k u t a n i l 9 7 7 年报道，迄今所报 道和研究过的海洋真菌约有l o o o 2 0 0 0 种，估计未被研究的海洋真菌种类至少有 2 0 0 0 0 4 0 0 0 0 以上，如此巨大的海洋资源等待我们研究与丌发。许多科学研究证 明：海洋真菌分离出的次缴代谢产物7 0 8 0 具有生物活性。在我国，中山大学 生命科学系与化学系致力于南海真菌、红树林内源真菌活性物质及其化学结构的 研究，成绩相当显著。 3 1 1 抗菌活性物质 王书锦等“”从中国黄、渤海、辽宁近海地区分离海洋真菌5 0 0 多株，鉴定了 2 0 多株，i 要奄青霉慝t p e k c i l ! “确、啦霉属t a l 卯r 列z “s ) 、镰刀菌鼠( f w s r | “m ) 及新的真菌，l o 的发酵产物具有抗细菌或抗真菌生物活性。k a g a t a 等8 ”j 从| 二| 本 0 k i n a w a n 海洋双壳贝m y t 订u sc o r u s c u s 上所分离的丝状青霉：p 分离到一种新的 代谢产物c o r u s c o la ，具有抑菌活性；0 n u k i 等第一次从海洋真菌p e h f c f “ms p 中得到邻氨基苯酰氨新生物，它在1 0 h g m 1 的浓度下能抑制多种微生物。在f i 本 发现约2 7 种属的海洋微生物具有抗菌活性”，还检测了海洋微生物对金黄色葡 萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母等8 种细菌和真菌的拮抗作用，结果发现，海洋 ， 微生物中1 4 1 的细菌、4 4 的放线菌、1 1 5 的真菌都具有不同程度的拮抗性。 刘晨临等”从海葵上分离到2 3 株海洋真菌，其中3 株有较好的抗病源真菌活性， 并对其进行了鉴定。a y e rsw 等从贻贝组织匀浆液中分离到木霉属真菌，能产 生有抗菌活性的多肽类物质p e pl a i b o 耐。“。 3 12 抗肿瘤活性物质 海洋生物抗肿瘤活性物质的研究始于5 0 年代b e f g m a n 的丌拓性工作。许多 海洋真菌可产生抗肿瘤活性物质，这些海洋真菌有的分离白海水或海洋沉积物， 有的来自其它海洋生物体，它们产生的抗肿瘤活性物质大多具有新型的结构”， 是继海洋放线菌之后的又一研究热点。柔红霉素、丝裂霉素c 、博莱霉索等是目 j 应用较广泛的抗肿瘤抗生索。薛德林等”从辽宁近海的8 个地区1 0 2 个定点的 姆泥中分离得到8 株海洋酵母菌、5 株海洋真菌，其中海洋真菌大多属于青霉属 和曲霉属，青霉属菌株 i f 9 6 0 1 、h f 9 6 0 2 、 1 f 9 6 0 3 的有效成分对h e l a 、c c l 。及 c c l m 细胞具有强烈的抑制作用。王书锦等”从辽宁黄、渤海洋地区的海水、海 第一章文献综述 泥及海洋动物体中分离的海洋真菌中获得1 2 株能产生抗肿瘤活性先导化合物的 菌株，其中一株海洋拟青霉菌具有抗菌抗肿瘤活性，有一定产业化前景。p o c h 发现的海洋真菌尉，百c 5 阳加f o 旃e 胁s p 产生的k i r s c h s t e l n i n 可以抑制枯草杆菌、 会黄色葡萄球菌，而且对多种人癌细胞株具细胞毒性。日本t a k a h a s h i 等从海 水中分得的p 明f c 洲m 卅s p 菌体甲醇提取液中分离到两种次级代谢产物，在培养 的p 。小鼠白血病细胞j - 具有细胞毒素活性。盐屋链霉菌“。所r p p f o m y c p s ，f 。y d p s 曲s a 1 7 5 8 分离白海洋底泥，该菌株可代谢产生种结构新颖的生物碱 a l t e m i c i n d i n ，此化合物对肿瘤细胞l 。及i m c 肉瘤细胞的1 c 。分别为o 8 4 9 m l 和o 8 2 m 1 。另夕h ，a l t e r a m i d e 、o c t a l a c t i n s 、c u 口r o l a c t a m s 、m a c r o l a c ti n 、 q u i n a z l i n c s 、o b i o n i n 等“都是从海洋细菌或真菌体内分离得到的具有抗肿瘤 活性的物质。 3 2 海洋细菌产生的活性物质 海洋细菌在所有海洋微生物的生物活性物质研究中占主导地位。海洋细菌由 于氏期生活在海洋中，比陆栖细菌更偏爱含电解质多的环境，否则，不是生长不 好就是改变代谢产物。总之，海洋特殊的地理环境和资源环境孕育了许多有特性 的海洋细菌，在它的代谢产物中潜在着许多具有多样性、新颖性、特殊性自勺j 舌性 物质。 3 2 1 抗菌活性物质 多数海洋细菌可产生抗生素，其中包括芽孢杆菌属( b d c f f 淞) 、交替单胞 菌属、假单胞菌属、黄杆菌属( 月d v 0 6 口c f p ，m 坍) 、微球菌属( 埘f r o c o c c s ) 、 着色菌属( c r d m 口，m ) 、钦氏菌属( c 蛔f 曲) 等菌及许多未定菌，有些种类 的抗生素从未在陆生菌中见过。c u s t a f s o n 从海洋细菌中分离出具有抗病毒和抗 细菌活性的大环内酯类化合物。f 本相模湾的小单孢菌中首次发现小诺霉素( 又 称相模霉素) ，主要用于大肠杆菌、变形卡t 菌、沙雷杆菌等引起的呼吸道、泌尿 系统等感染。 研究表明，许多分离自海洋大型生物的化合物可能是由与之共生的海洋细菌 产生的。过去从海绵等海洋生物分离到的很多具有强生物活性的化合物，例如河 豚毒素、海葵毒素、麻壳鱼毒素、石房蛤毒素及d i s c o d e r m i d e 等，现在发现其真 正的来源是海洋细菌。有报道，一些软体动物、海绵动物和被囊动物的次级代谢 第一章文献综述 产物与来自蓝细菌的天然产物非常相似。s t i e r l e 等1 9 8 8 年报道，原来从海绵中 分离到的几种二酮吡嗪化合物均是由与其共生的一种微球菌属细菌产生。a c e b a l 等从海洋被囊动物中分离到两株农杆菌，它们产生具有抗肿瘤的活性物质 s e s b a n i m i d e 。 3 2 2 抗肿瘤活性物质 许多研究表明，海洋细菌在以海水配制的培养基中发酵有些可以产生多糖类 化合物，某些化合物对动物肿瘤细胞有抑制作用。基于这一研究，人们在筛选抗 肿瘤活性物质时时常选用需要海水方能产生活性物质的海洋细菌。从h 本深海海 泥中分离到需要海水配制培养基的交替单孢菌，它可产生s i d e r o p h o r e 类代谢物， 当与纤维肉瘤细胞、巨噬细胞一起培养时溶解这些细胞，显示出抗肿瘤活性。深 海细菌产生的抗肿瘤活性物质f n a c r o l a c t i n s 是一种新的大环内脂化合物，其组成 结构分为a 、b 、c 、d 等4 个组分t n l a c r 0 1 a c t in s a 既有抗菌活性又有抑制b l6r 1 0 黑色素癌细胞的活性。冈见吉郎“”等报道过从深海细菌中分离到一种新的抗肿瘤 活性物质b is u c a b e r jn ，但其没有抗菌活性。同本微生物化学研究所发现一株黄 杆菌属细菌可产生一种胞外多糖，肿瘤抑制率高达7 5 9 5 。o k a m i 于1 9 8 6 年从 海洋黄杆菌属细菌中分离到一种能明显抑制小鼠s 1 8 0 实体瘤病毒作用的多糖物 质，命名为m a n a cl a n 。 3 23 海洋生物毒素 海洋生物毒索一直是海洋生物活性物质研究的焦点之一。目前发现，许多海 洋生物毒素的真正来源是海洋中游离的或附生在海洋动植物上的海洋微生物。海 洋生物毒素主要有河豚毒素、石房蛤毒素、海葵毒紊等，其中研究较多的是河豚 毒素。河豚毒素( t t x ) 足一种毒性很强的海洋生物活性物质为典型的神经通 道阻断剂，毒性为n a c n 的1 2 5 0 倍，对人的致死量为0 3 m g ，临床药用价值很高， 呵用作镇痛剂、镇痉剂、搔痒镇静剂、呼吸镇静剂等，并具有充血功能、尿意镇 静作用及抗心律失常作用等。河豚毒素还有抗癌作用，对肝癌抑制率在3 7 以上， 对肉瘤1 8 0 的抑制率在3 0 以上。目前己报道的能够产生河豚毒素的细菌有假单胞 菌属、弧菌属、发光杆菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、别单胞菌属、不动杆菌 属、芽孢杆菌属等。j u n t o n j i n ”“3 在海洋生物、海水和底泥中发现多株能够产! i 三 钠离子通道阻断性毒素的细菌，这些毒素主要是t t x 及其衍生物。王书锦等”1 从 第一章文献综述 红鳍东方豚体内分离出能产生t t x 的海洋细菌。只本海洋生物工程研究公司已利 用海洋细菌进行t t x 生产”“。 324 酶与酶抑制剂 ( 1 ) 热稳定酶 从热泉和温湿i l 中分离的嗜热古细菌是一群罕见的海洋微生物，能在1 0 0 以上的环境中生长，需要有在高温下稳定的酶系统。己从这类海洋微生物中分离 出多种热稳定酶，热稳定酶在分子生物学中具有重要应用价值“”1 。l u n d b e r g 等研 究了由嗜热古细茁砂r o c o c c n s r f d 叫s 产生的热稳定性d n a 聚合酶，称之为d f r 聚 合酶，具有聚合和校对功能，可提高p c r 产物的精确性。 ( 2 ) 蛋白酶 蛋白酶现已用于洗涤剂中并作为膜清洗配方的组分。海洋船蛆腺体内的共生 细菌可产生碱性蛋白酶，该酶具有较强的去污活性，在5 0 可加倍提高磷酸盐沈 涤剂的去污效果，在工业清洗方面有一定的应用价值”“。一些海洋弧菌可产生多 种蛋白酶，如溶藻弧菌可产生6 种蛋白质，其中一种是比较罕见的、可抗洗涤剂 破坏的碱性丝氨酸蛋白酶。j ( ，s e p h 等认为海洋细菌可以提供多种蛋白水解类型蛋 白酶，