（材料学专业论文）用于修复周围神经损伤的复合材料及其性能研究.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 摘要 论文研究了用于修复周围神经损伤的聚乳酸( p d l l a ) 复合型神经导管。采 用聚乳酸作为基体材料，添加一定比例的钙磷无机盐和神经生长因子( n g f ) ， 通过溶剂挥发法，制备出一种新型的具有良好降解性能和药物释放性能的复合 型神经导管。 进行纯聚乳酸及其与羟基磷灰石( h a ) 、0 一磷酸三钙( b - t c p ) 组成的复 合材料的体外降解实验，通过测定浸泡液的p h 值变化、复合材料质量变化以及 降解2 0 周后材料扫描电镜观察，结果表明；在聚乳酸中添加h a 、p t c p 都可 以有效控制以聚乳酸为基体的复合材料的降解，并有效调节浸泡液的p h 值。考 虑降解速率与神经再生速度的匹配，以及现有技术制各h a 、b t c p 的粒径范 围，选择h a 作为复合神经导管的添加成分。 通过对复合型神经导管的制备工艺及制备条件的研究表明：采用溶剂挥发 法，以p d l l a 作为基体材料，添加5 h a ，在2 0 温度下，以乙酸乙酯为溶 剂，采用超声波分散的方法，制备出性能良好的复合型神经导管。 对n g f 含量不同的复合型神经导管进行体外模拟降解实验，测定降解过程 中浸泡液p h 值的变化、材料质量臻失，并同时进行n g f 体外释放实验，以指 导复合型神经导管动物体内实验。结果显示：h a 微粉可以中和p d l l a 降解所 产生的酸性，降低p d l l a 的酸自动催化水解速度；药物含量影响其降解性能和 释药性能。复合型神经导管的药物释放速率在4 周达到最大，与周围神经再生 的要求是基本相符的。 动物实验采用大鼠坐骨神经缺损模型，分别用单纯p d l l a 导管、复合型神 经导管桥接修复。分别于术后3 月和6 月行大体观察、三头肌湿重恢复率、屯 生理检测等方法观察神经再生情况。结果显示：n g f 能有效促进坐骨神经损伤 的修复。适当含量的n g f 能促进坐骨神经的再生，导管中n g f 豹合适含量在 4 0 0 u 5 0 0 u 左右。动物实验后的材料扫描电镜结果表明，材料体内降解和体外 降解结果基本一致，为临床研究提供了依据。 关键字：聚乳酸，羟基磷灰石，溶剂挥发法，周围神经再生 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t a k i n do f c o m p o s i t e c o n d u i tb a s e do n p o l y ( d l l a c t i d e 了w a si n v e s t i g a t e dt or e p a i r n e r v ed e f e c t t h i sk i n do fc o m p o s i t ec o n d u i tw i t hg o o dd e g r a d a t i o na n dg o o dd r u g r e l e a s e p r o p e r t y w a s p r e p a r e db y as o l v e n tv o l a t i l i z a t i o nm e t h o d u s i n g p o l y ( d l l a c t i d e ) ，p h o s p h a t ea n d n e r v eg r o w t hf a c t o r t h ep hv a l u e ，w e i g h ta n ds e mo f p u r ep d l l a a n di t sc o m p o s i t ew i t ht 3 - t c p a n dh aw e r eo b s e r v e dd u r i n gt h ed e g r a d a t i o ni n2 0w e e k si nv i t r ot os t u d yt h em o s t s u i t a b l ec o m p o s i t ef o rr e p a i r i n gn e r v ed e f e c t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hh aa n d b t c ph a ds i g n i f i c a n ti n h i b i t o r ye f f e c t s0 1 1t h ed e g r a d a t i o no f t h ec o m p o s i t ea n dt h e p hv a l u eo f c i r c u m s t a n c e i nv i e wo ft h e d e g r a d a t i o ns p e e d o ft h e c o m p o s i t e m a t c h i n g t h en e r v er e s t o r i n gs p e e da n dt h ep a r t i c l es i z eo fh aa n d1 3 - t c p p r e p a r e d b yc u r r e n tt e c h n i q u e ，t h en e v e rc o n d u i tw a ss e l e c t e da sc o m p o s i t eo fp d l l a a n d h a t h es t u d yo nt h ep r e p a r a t i o np r o c e s sa n dc o n d i t i o no ft h ec o m p o s i t en e r v e c o n d u i ts h o w st h a th aw a sa d d e dt op d l l ai nt h es c a l eo f5 b yt h eu l t r a s o n i c d i s p e r s a lt e c h n i q u ea n dt h e c o n d u i tc o u l db ep r e p a r e db yas o l v e n tv o l a t i l i z a t i o n m e t h o d u s i n ge t h y la c e t a t ea ss o l v e n t u n d e r2 0 c t h ep hv a l u e ，w e i g h ta n dn g fr e l e a s er a t eo ft h ec o m p o s i t en e r v ec o n d u i tw i t h d i f f e r e n tn g fc o n t e n tw e r eo b s e r v e dd u r i n gt h ed e g r a d a t i o ni n2 0w e e k si nv i t r o t h e r e s u l t ss h o wt h a tb o t hh ap a r t i c l e sa n dt h ec o n t e n to fn g fh a v e s i g n i f i c a n t i n h i b i t o r ye f f e c t so nt h ed e g r a d a t i o no f t h ec o m p o s i t ew h i l e t h ec o n t e n to f n g fa l s o h a v ei m p o r t a n te f f e c t so nt h er e l e a s ep r o p e r t yo ft h ec o n d u i t t h er e l e a s er a t ew h i c h r i s e d u p t om a x i m u mm a t c h e dt h en e r v e r e s t o r i n gs p e e d e a c hr a tu n d e r w e n t r i g h ts c i a t i cn e r v et r a n s e c t i o na n dk e p ta1 0 m m n e r v ed e f e c t ， t h e nt h e s ed e f e c t sw e r er e p a i r e db yu s i n gp u r ep d l l ac o n d u i t sa n dc o m p o s i t e c o n d u i t s f u n c t i o nr e p a i ro fs c i a t i cn e r v er e g e n e r m i o nw a se v a l u a t e da t3 ma n d6 m f o l l o w i n go p e r a t i o nb yu s i n gg r o s so b s e r v a t i o n ，t r i c e p sw e i g h t ，e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l ， h i s t o l o g i c a la n da x o nm o r p h o l o g i ca s s e s s m e n to f t h eo u t c o m eo fn e r v er e g e n e r a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn g f o f c o m p o s i t i o n c o n d u i tm a y r e p a i rt h es c i a t i cn e r v ei na d o s e d e p e n d e n t m a n n e r s u i t a b l ed o s a g eo f n g fc a n p r o m o t e n e r v e r e g e n e r a t i o nt h e 武汉理工大学硕士学位论文 s u i t a b l ed o s eo fn g fi nc o m p o s i t i o nc o n d u i ti sa b o u t4 0 0 5 0 0 u t h es e m p i c t u r e s s h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o ni nv i v oa n di nv i t r ow e r ea l m o s ti nt h es a m e w a y t h i s c o n c l u s i o nc a r lp r o v i d ea n i m p o r t a n tf o u n d a t i o nf o rt h ec l i n i c a ls t u d y k e yw o r d s ：p d l l a ，h a ，s o l v e n t v o l a t i l i z a t i o n ，p e r i p h e r a ln e r v er e g e n e r a t i o n 此页若属实请申请人及导师签名。 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：趣蛰藿。日期! ：竺：墨竺 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学 校可以公布论文的全部内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究燧名：邀新虢嫩日期赳妊乡 注：请将此声明装订在论文的目录前。 武汉理工大学硕十学位论文 第1 章绪论 1 1 周围神经损伤的研究进展 1 1 1 周围神经损伤的修复方法 周围神经损伤后的再生和功能恢复一直是神经科学领域的热门问题。周围 神经损伤是指某些因素造成上述神经断裂损伤或坏死，导致传入或传出途径中 断，传导不能继续，产生相应的受支配器官功能障碍的一种临床病症。神经再 生的特点是：( 1 ) 具有再生能力，断离后能以约每天l m m 的速度从近端向远端 生长；( 2 ) 无穿透能力，神经的再生一遇到障碍就会终止：( 3 ) 无弹性，断离的 神经是不能人为地拉伸后连接的；( 4 ) 只有相同类型的神经束进行吻合修复后， 神经的功能才能得到恢复i l l 。由于周围神经解剖和功能上豹特殊性，神经缺乏弹 性，大多数情况无法直接对拉吻合，因此必须寻找一种神经替代物来修复损伤。 随着神经修复技术的发展，特别是生物技术、生物化学、生物材料等科学的介 入，为神经修复提供了许多科学理论和技术，周围神经损伤修复方法已由单一 的显微外科方法发展至4 现在的激光技术、细胞移植技术、组织工程技术、基因 工程技术等，极大地丰富了周围神经损伤修复的研究。 周围神经的损伤可分为断端间无缺损损伤和断端间有缺损2 类。对于断端 无缺损损伤目前主要采用外膜吻合、束膜吻合等手术方法直接进行吻合修复。 而对于断端间有缺损的损伤，由于断端神经胶质和神经外围结缀组织的增生均 会阻碍再生神经钎维的向前生长，使再生组织达不到原位而失去功能。因此为 了阻止过多的侵入，必须移植它物填充或进行桥接诱导修复。周围神经损伤修 复经历了自体神经移植、同种异体神经移植、自体非神经组织移植、生物材料 替代等阶段【2 。 l 、神经组织移植 来源于神经纤维组织的桥接材料主要有自体神经、同种异体神经、异种神 经。在周围神经损伤修复过程中，受损神经远端的病理和生理环境是以适应神 经再生的需要而改变的，其中神经内膜管、雪旺细胞基底膜、雪旺细胞及其分 泌的神经营养因子，在神经再生过程中起着非常重要的作用。自体神经无疑是 最理想的神经移植修复材料。同种异体神经、异种神经移植修复周围神经需要 武汉理工大学硕士学位论文 解决免疫排斥的问题。 2 、非神经组织移植 自体神经移植方法也存在许多弊病：首先，供体神经切取后，必然引起供 区感觉障碍，且有可能发生创伤性神经瘤，引起局部疼痛；其次，附加的神经 切取术使手术时间延长，增加供区疤痕，而且神经粗细的变异使切除的神经未 必适合与受区匹配，加之供体神经来源有限也大大限制了自体神经移植术的临 床应用【3 l 。人们开始寻找自体神经桥接移植的替代物，这些组织包括动脉、静脉、 羊膜管、筋膜管、小肠、骨骼肌桥接体等。使用这些非神经组织移植体的主要 理论依据是它们都含有基底膜，其基底膜与雪旺细胞的基底膜相似，为雪旺细 胞迁入提供有利环境，而雪旺细胞的迁入是轴突长入移植体的先决条件：同时 基底膜中内含粘连蛋白( 1 a m i n i n ，l n ) 、纤维连接蛋白( f i b r o n e c t i o i l ，f n ) 和 胶原蛋白等，这些成分都能促进轴突生长。但这些材料在缺血后存在管形塌陷、 再生不良、吸收疤痕组织、增生及粘连等问题。 3 、组织工程修复方法 二十世纪以来，现代科学不断发展，尤其是细胞生物学和生物材料科学的 发展，促使一门交叉边缘学科组织工程学的诞生。组织工程( t i s s u e e n g i n e e r i n g ) 一词最早由美国国家科学基金会1 9 8 7 年正式提出和确定的。它是 应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发用于修复、维护，促进改善人体各 种损伤组织结构和功能的生物替代物的一门新兴科学。组织工程理论上是将分 离的自体高浓度组织经体外培养扩增后种植子一种天然或人工合成的，具有良 好生物相容性并可被人体逐步降解吸收的细胞支架，或称细胞外基质上，这种 生物材料细胞支架可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养 物质，进行气体交换，排除废料，使细胞按预制形态的三维支架生长，然后将 这种细胞生物材料复合植入组织损伤部位，在生物材料逐步降解的同时，种植 的细胞不断增殖，从而达到修复组织损伤的目的。目前组织工程研究的领域主 要有皮肤组织工程，骨及软骨组织工程，神经、肌腱组织工程等。 周围神经组织工程的基础是以雪旺细胞( s e h w a n nc e l l s ，s c ) 为核心，相 容性良好的生物可降解材料为支架，能维持雪旺细胞存活和神经再生微环境的 细胞外基质为复合剂、内外源性神经营养因子为诱导剂的有机整合。将这种细 胞生物材料复合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被 机体降解吸收的过程中形成新的形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组 织，而达到修复创伤和重建功能的目的 2 】。 2 武汉理工大学硕士学位论文 周围神经组织工程中，用生物材料所构建的神经导管修复神经损伤早有报 道。所谓神经导管桥接修复周围神经损伤，就是用生物或非生物的材料预制成 的导管桥接周围神经损伤断端，为损伤神经再生提供再生室。由于神经再生没 有穿透性，一遇障碍生长就会中止。神经导管提供神经再生的通道，防止周围 结缔组织的侵入，避免神经瘤的形成；另一方面，神经导管能保持内源性和外 源性的神经营养因子、生长因子等促进轴突生长的刺激物质。也就是说，通过 神经导管修复神经损伤的机理是提供适合神经再生“微环境”。早在1 9 世纪就 有人开始设想使用导管来修复神经1 4 】。1 8 9 8 年f o r s s m a n 发现再生轴突总是朝向 远侧神经断端生长而不向其他组织生长，他将这种远侧神经端对再生轴突的明 显吸引作用称为神经趋化性。由于受到神经生物学知识所限，这一学说并未得 到重视。w e i s s 和t a y l o r 是神经再生接触引导学说的倡导者和发展者。1 9 4 4 年 w e i s s 5 1 等提出了用无缝线导管化( s u t u r el e s st u b u l a t i o n ) 的方法修复神经损伤的概 念。他们否认存在神经趋化性，认为两神经断端存在间隙不利于再生轴突的生 长，应通过将损伤神经远、近端组织对合加以引导，利于两断端的雪旺细胞索 直接接触，再生轴突才能较顺利的长入远端神经内膜管内。这就是对断端神经 采用直接缝合，利用神经移植来治疗周围神经损伤的理论依据。在此基础上， 7 0 年代后期发展了人工神经移植技术( a r t i f i c i a ln e r v eg r a f t ) 【6 】，即采用生物材 料制备神经导管( n e r v eg u i d a n c ec h a n n e l ，n g c ) ，并在导管内部腔中创建神经 生长的微环境，引导并促进神经再生。2 0 世纪8 0 年代，l u n d b o r g 等 7 j 通过y 型 硅胶管试验证实周围神经再生确实存在神经趋化型，并且还有组织特异性、神 经束特异性和功能特异性。在神经再生过程中神经趋化性和接触引导具有同等 的重要性。从此，许多学者利用管状物构建神经再生室修复神经损伤，由于管 状桥接体到晚期会对神经再生产生限制，因此人们在组织工程学发展基础上开 始对生物相容性及可吸收性材料进行了大量研究。总的说来，生物支架在周围 神经再生中的作用，主要是在损伤局部人为构建一个利于神经纤维生长的微环 境，利用周围神经本身具有的修复功能对损伤进行修复。 1 1 2 神经导管中神经再生的过程 神经导管中神经再生的过程如图1 1 所示。 武汉理工大学硕士学位论文 图卜1神经导管中神经再生过程 8 1 1 。术后第一天为液体充盈期( f l u i d p h a s e ) ，由神经远近断端分泌渗出的液体充 盈再生室，包括促进神经再生的水溶性因予和纤维基质。 2 术后第一周为基质桥形成期( m a t r i xp h a s e ) ，导管内液体中的非细胞成分 的基质前体逐渐融合，并形成一条纵轴支架，桥状连接远近端。基质支架中含有 的成分为大量无定型纤维蛋白聚合体，这种半国体性状的物质便于细胞移行， 起到桥梁和支架的作用。 3 术后第二周( 2 1 4 d ) 为细胞移行期( c e l l u l a rp h a s e ) ，源自远近端的细胞成 分：成纤维细胞、雪旺细胞、巨噬细胞等在富含基质的纤维中开始迁移，沿基 质桥移行入神经导管终至汇合。首先汇合的是束膜样细胞，形成柬膜样鞘，随 后便是雪旺细胞和内膜细胞的汇合。 4 术后第三周( 1 5 - - 2 1 d ) 为轴突生长期( a x o n a lp h a s e ) ，由近端长出的再生轴 索以每天1 2 m m 的速度沿基质桥生长，髓鞘的形成大约滞后予轴索生长5 d 。 大约第4 周时，部分轴突到达断端，形成有髓神经束f 5 1 。 神经再生的成功与否最终取决予延伸的轴突能否沿着b u n g n e r 带( w a l l e r i a n 变性到一定阶段后，新生的s e h w a r m 细胞有序地在基膜管内排列而形成的管状 结构) 进入合适的远端神经内膜管，从而连接准确的原靶器官，使功能得到恢 复。神经导管修复技术对神经再生的引导机理可能为接触引导( c o n t a c t g u i d a n c e ) 。同时发现远端的存在对神经再生十分重要，远端分泌的一些神经营养 因子可以引导再生的轴突从近端向远端延伸。远端对神经再生具有趋向性引导 作用。 4 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 3 用于周围神经损伤修复的材料的基本要求 理想的神经导管材料应具备以下特点驯： 1 可生物降解。神经导引管应在体内移植部位存在足够长的时间以保护再生 神经。在神经功能完全恢复后发生降解而在体内消失，不需二次手术取出。 2 通透性。材料应具有微孔或网眼结构以保证一定通透性，使o2 、营养成 份等可通过管壁进入到再生神经的微环境中去。 3 f 氐细胞毒性。轻微的局部组织不良反应是理想神经导管材料的必备特质。 除了导管的选材，导管的形态也对神经再生效果有重要影响。神经导管的 管径、壁厚都是影响神经再生的重要因素。对于由非生物降解材料制成的导管， d u c k e r 和h a y e s 的研究显示，管内径应是损伤神经直径的1 5 1 ，7 倍，以避免 压迫再生神经；同时薄壁导管有更好的弹性，可以抑制断端神经瘤生成【l 。而 生物可降解材料制成的神经导管在神经再生的同时降解，因此管内径略大于损 伤神经直径即可【1 1 】。s c h a k e r r e a d 等研究了p ( l a - - e p s i l o n c l ) 神经导管的尺寸对 大鼠坐骨神经修复的影响，由于导管在体内溶胀，厚壁导管对再生神经压迫较 大，所以应在能提供足够力学支撑情况下，采用尽可能薄的导管 j “。 为了让受损神经能与外晃进行物质和信息交换，近年来高渗透的、多孔的 神经导管受到了重视。李清峰等研究了全通透性的( 孔径1 0 l - tm 以上) 、半通透性 的( 孔径l o u m 以下) 和无孔的3 种壳聚糖基导管，结果认为半通透性的为最佳。 究其原因，全通透性的导管因能允许包括淋巴组织、成纤维细胞等所有成分通 过，易引起炎性反应和局部纤维组织增生，不利于神经纤维的生长；而不通透 性导管因不允许任何营养物质进入管内，不利于与外界物质交换，使神经不能 获得良好的微环境；半通透性导管则克服了上述不足，能允许红细胞、氧气、 小分子营养物质通过，阻隔了不利成分进入导管中，其局部微环境利于神经的 再生1 13 1 。 1 1 4 用于周围神经损伤修复的常用材料 探索寻找更适宜制备连接神经断端导管材料的研究始终在进行中。已被用 于制备导管的材料包括来源于生物体的材料和人工合成材料两大类。来源于生 物体的材料包括血管、变性肌肉、脱钙骨、胶原、明胶等。其中利用血管连接 神经断端是较为普遍采用的方法，已有很多研究及临床应用报导。使用人工合 成材料制各导管具有加工方便，可准确控制规格，性质重复性好的优点。除硅 武汉理工大学硕士学位论文 胶导管己被广泛使用外，还有应用聚四氟乙烯、聚乙烯等材料的报导”】。 随着研究的深入，不仅要求导管材料具有良好的安全性、生物相容性，还 希望能具备利于手术、能促进神经生长等特性。用可生物降解材料制备的导管 可在体内自行分解，无需二次手术取出，能避免使用不可降解导管时可能出现的 压追神经等问题，因而受到很多关注。聚乙醇酸( p g a ) 、聚乳酸( p l a ) 及其共聚 物是较为普遍使用的可降解材料，运用这些材料制备导管进行动物实验及临床 实验的报导也有很多【l “”j 。 1 2 神经生长因子( n g f ) 的作用机理 神经导管在植入早期就会被神经远端分泌的液体充满，液体中含有许多种 类的神经因子，包括神经生长因子( n g f ) 、脑源性神经营养因子( b d n f ) 、睫状 神经营养因子( c n t f ) 等。神经导管的一个重要功能就是保持神经远端分泌的这 些因子。这些因子对神经再生有明显的促进作用【1 8 】。 神经生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o r ，n g f ) 是最早发现的细胞生长调节因 子，也是迄今为止研究得最清楚的一个神经营养因子。n g f 在神经元的发育、 轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用。它促进发育中 的交感、感觉神经元的分化和成熟。维持成年交感神经元的正常功能。n g f 对 中枢和周围神经的损伤也有保护和恢复的作用。尤其，n g f 能促进神经细胞的 再生。在某些神经系统损伤时，多次给与n g f 可减轻和改善对神经元的伤害。 n g f 的来源十分广泛，不同来源的n g f 具有相似的生物学活性 1 9 2 ”。 对n g f 起反应的神经元主要有交感神经元、某些感觉神经元和中枢胆碱能 神经元。n g f 由这些神经元的靶组织产生，被神经元的轴突末梢摄取，籍逆运 行运输到胞体，为这些神经元的存活和维持所必需。所以，n g f 是典型的靶源 性神经营养因子。 i 、支持神经元存活n g f 对周围神经系统的感觉神经元和交感神经元及中 枢神经元的存活均有支持作用。 ( 1 ) 感觉神经元：n g f 能深刻影响脊椎动物神经系统的发育。n g f 具靶源 性存活因子的作用，多数感觉神经元在早期轴突生长时期不需要n g f ， 但当轴突抵达靶时则需要n g f 维持其存活f 2 ”。成年动物的感觉神经元 在生理和解剖上都是异性成分，n g f 只支持感受伤害的感觉神经元的 武汉理工大学硕士学位论文 存活。 f 2 、交感神经元：交感神经元的发育需要n g f 。所有依赖n g f 的神经元在 发育过程中都是先有一个依赖神经营养素一3 的时期。成年交感神经元仍 需n g f 维持其存活，但不需要来自外周的n g f 维持其存活。 ( 3 ) 中枢神经元：n g f 支持基底前脑胆碱能神经元的存活【2 2 】。啮齿类大部 分基底前脑胆碱能神经元发育时期的存活并不绝对依赖n g f ，但成年 时期需要n g f 维持其胆碱能表型及终末视野大小。 2 、调节神经表型 发育时期n g f 的水平改变不会影响神经元的细胞数目，但会改变其表型【2 3 】。 n g f 也调节已分化的表型。作为感觉神经元递质或调质的神经肽，其水平受n g f 效率的调节。 3 、调节神经元的连接 n o f 作为一个重要化学物质参与组织损伤时感觉神经元功能改变引起疼痛 的环节 2 4 1o 用n g f 抗体可防止组织炎症后正常发生的热和机械性痛觉过敏 2 5 2 6 】。 n g f 也能防止因切断交感神经元节前纤维而导致的功能性突触连接的丧失。在 视觉系统，视皮质的眼优势是依赖各类丘脑传入活动建立的。在视皮质中的n g f 能稳定丘脑传入的突触接触。外源性的n g f 可稳定原来的突触接触和防止突触 可塑性变化。 4 、参与神经再生 n g f 不仅能支持原代培养的感觉神经元的存活，还促进它们突起的生长。切 断大鼠坐骨神经，在其远侧段可观察到n g fm r n a 水平显著上调1 2 7 1 。感受伤害 的传入终末在其靶区内的侧技出芽需要n g f ，但神经生长并不依赖n g f l 2 8 1 。 1 3 论文选题的目的及其主要研究内容 周围神经损伤导致的神经损伤是临床处理中比较棘手的问题。周围神经损 伤是指某些因素造成上述神经断裂损伤或坏死，导致传入或传出途径中断，传 导不能继续，产生相应的受支配器官功能障碍的一种临床病症。由于至今人们 还无法用肉眼或仪器去准确地分辩神经的运动束和感觉束，因此无法人为地通 过手术去正确实现同类神经束的吻合修复，所以神经修复基本上是机体的自我 修复过程。神经损伤后能否成功的再生，主要取决于是否具有适合离断神经生 长再连接的微环境条件。 武汉理工大学硕士学位论文 由于神经自身的特点，即使是单纯的离断( 没有组织缺失) 也会在神经断端间 形成缺损空隙。对于较小的缺损，可以通过拉伸神经的办法将断端直接迸行缝 合。如果缺损较大，目前主要采用自体神经移植的方法进行修复。自体神经移 植会造成供体的部分功能丧失，还存在可修复的长度受限，可能形成神经瘤等 问题。另外，自体神经移植必然伴有供区的功能受损。由医学、生物学、工程 学等综合而成的组织工程学发展迅速，人们研究的重点已着眼于使用神经导管 或神经替代物( 人工神经等) 来促进周围神经再生以代替自体神经移植，以达到神 经快速生长、功能完全恢复的理想目标。 所谓神经导管就是用生物或非生物的材料预制成管状，再将神经的远近断 端放入管内，两断端神经外膜与管壁各缝l 2 针固定。随后神经轴突即可沿着 管腔从近端长入远端。神经导管可以防止纤维瘢痕组织的侵入，避免神经瘤的 形成，并利用远端神经的趋化因子使轴突准确对合。同时，神经导管中的生物 微环境可以人为控制和改变，使之适宜于神经再生。 与其它神经损伤修复方法相比，采用神经导管可以提供神经再生的多种有 利条件：在神经再生中暂时固定并支持损伤神经的两端：引导神经元的轴突轴 向生长，避免外生和形成神经瘤；为神经再生提供一个相对隔绝的微环境，宦 集神经再生所需的神经营养因子，减少细胞入侵，防止疤痕的形成。用生物可 降解材料制成的导管可在体内降解，无需二次手术取出；同时能避免使用非生 物降解导管时可能出现的神经压迫等问题，因而受到越来越多的关注。采用生 物降解型高分子，可以更加自由地设计神经导管的结构，以获得良好的神经修 复效果。 因此本课题研究的目的在于：利用生物可降解高分子材料，同时添加外源 营养因子，制作复合型神经导管引导神经再生。改善以往神经导管材料的降解 性能，采用药物缓释技术，持续稳定对忠处释药。通过调整材料的降解速度和 药物释放速率，使得周围神经损伤修复完成的同时，导管材料降解完成，从而 免除二次手术的痛苦。 本课题研究内容包括： 1 筛选适合用于修复周围神经损伤的复合材料及其组成配比。 2 研究神经导管的制备工艺及参数。 3 复合型神经导管体外降解性能的研究。 4 神经生长因子( n g f ) 体外释放的研究。 5 复合型神经导管的动物体内实验。 亟堡堡兰查兰堕主堂焦堕苎 一 第2 章神经导管材料及其组成的筛选实验 本实验选用外消旋聚乳酸( p d l l a ) 作为基体材料，同时添加羟基磷灰石 ( h a ) 和b 一磷酸三钙( b - t c p ) ，通过体外降解实验，研究纯聚乳酸及其复合 材料体外降解过程中的影晌因素，对制各神经导管的材料组成进行筛选。 2 1 材料制备 2 1 1 聚乳酸( p d l l a ) 的制备 聚乳酸( p l a ) 是一种具有优良的生物相容性和可生物降解性的高分子材料。 乳酸是手性分子，它以两种立体异构形式存在，这就导致了四种不同形态的聚 合物的产生：d p l a ，l 。p l a ，d l p l a ，m e s o - p l a ，其中d l - p l a 是外消旋聚 合物，无光学活性，呈非晶态，适用于作药物载体。由于聚乳酸降解的最终产 物是水和c 0 2 ，中间产物乳酸也是体内正常代谢的产物，不会在重要器官聚集而 产生不良反应。 2 i 1 1 聚合方法及机理 聚乳酸的合成主要有直接缩聚和丙交酯开环聚合法。 1 、直接缩聚 反应如下式所示： hh n h o 一6 一c o o h 雌( 一o _ p ic o 一) 。 ll o h 3c h 3 这种方法的主要特点是合成体系中无催化剂，但得到的聚乳酸相对分子量 一般不大于4 0 0 0 ，强度低，容易分解。d l 乳酸，l 乳酸和d 哥l 酸均可以通过 直接缩聚制得低分子量聚乳酸。直接缩聚无疑也是降低聚乳酸成本的重要途径。 有少量直接缩聚法合成较高分子量的报道。如持续加热减压法【2 9 1 ：先在1 8 0 下 反应4 h ，逐渐改变反应条件，最终达到2 6 09 c ，在2 m m h g 状态下反应8 h 结束， 分子量最高可达2 0 万左右。但实践证明，上述条件下会因解聚生成大量丙交酯， 武汉理工大学硕士学位论文 使系统堵塞。 2 、丙交酯开环聚合法 此类反应如下式所示： n c h 3 一o h c 0 0 h 盟楚低聚物 1 0 h 3 甚如。 裂解环化l h q 【li ：h 一【：h o ( 1 ) 阴离子开环聚合。阴离子开环聚合所采用的催化剂研究得较早，较典型 的有醇钠、醇钾、丁基锂等，其特点是反应速度快、活性高，可进行溶液或本 体聚合，但副反应极为明显，不利于制备高分子量聚合物。 ( 2 ) 阳离子开环聚合。阳离子开环聚合的催化剂根据其不同的聚合机理，可 将其分为三类，即路易斯金属盐及氧化物( 如s n c l 2 、s n o 、z n o 等) ，路易斯金 属盐一水体系( 如s n c j 2 2 h 2 0 、z n c i 2 2 h 2 0 等) 和质子酸烷基化试剂体系( 如三 氟磺酸等) 。其中sn c l 4 被认为是l 丙交酯开环聚合的高效催化剂。即在聚合过 程中，s n c l 4 先与单体中的氧原子配位、极化，然后再通过酰氧键的断裂生成嗡 氧离子，并引发单体进行增长。 ( 3 ) 配位型开环聚合。根据催化活性中心不同，配位型催化剂可以分为四大 类，即双金属催化体系、金属烷基化合物体系、金属氧基化合物体系以及金属 烷氧基化合物体系。其中研究得较多的是金属烷基化合物和金属烷氧基化合物 体系。金属烷基化合物对丙交醣的开环聚合机理一般认为是单体上的氧原子先 和催化剂上的空轨道络合，然后单体再在金属c 链上进行插入、增长。而金属 烷氧基化合物的催化机理是单体上氧原子和金属空轨道络合，然后单体在金属 一烷氧链之间进行配位插入并增长。其中辛酸亚锡是目前公认的效果较好的催 化剂，活性高，催化剂用量少，可制得高分子量聚合物。 2 1 1 2 聚乳酸的合成 本论文采用辛酸亚锡作为催化剂制备p d l l a ，属于配位型开环聚合。 ( 1 ) 药品 p d l l a 自制 武汉理工大学硕士学位论文 z n 粉分析纯 丙酮分析纯 乙酸乙酯分析纯 辛酸亚锡分析纯s i g m a 公司 三氯甲烷分析纯 ( 2 ) 实验设备 实验装置如图2 - 1 所示。 图2 - i聚乳酸合成实验装置图 f 3 1 实验过程 a 丙交酯的制备 将5 0 0 m l 约9 0 的d l 乳酸和3 2 9 z n 粉置于装有磁力搅拌器的三颈烧瓶中， 搅拌，缓慢升温至1 2 0 。c ，开始有水蒸出。继续升温至1 6 0 。c ，压力维持在1 0 1 0 0 m m h g 之间4 6 h ，不断有水蒸出。减压至o ，1 0 2 m m h g ，温度控制在2 5 0 2 7 0 。c 之间，除第一馏分外，主要馏分为浅黄色粗丙交酯，重约2 5 0 9 。 粗丙交酯用提纯过的乙酸乙酯反复重结晶，直至得到白色晶体，真空干燥 4 8 h 备用。 b 聚乳酸的合成 将安培瓶用洗液浸泡2 4 h ，洗净、干燥。再将提纯过的丙交酯装入安培瓶中， 加入一定比例的辛酸亚锡甲苯溶液。将装置接到真空系统中，随着压力逐渐减 小，溶剂开始挥发，最后在高真空度下( o 0 5 o 1 m m h g ) 密封安培瓶，最后将 安培瓶浸泡在1 3 0 l 的恒温油浴中反应3 0 h 左右，形成坚硬、透明的p d l l a ， 武汉理工大学硕士学位论文 打碎安培瓶，将高聚物溶于丙酮中，待完全溶解后，将溶液倒入水中，同时强 力机械搅拌，使p d l l a 在水中沉淀，过滤，真空干燥至恒重。 c 测定p d l l a 的分子量 p d l l a 的相对分子质量用美国w y a t t 公司生产的三角度激光散射仪 ( m i m l d a _ w n m a l l a g p c s y s t e m ) 测定重均相对分子质量( m w ) 。 2 1 2 羟基磷灰石( h a ) 微粉的制备 羟基磷灰石( h a ) 是一种生物活性材料，在组成和结构上与人体硬组织，如 骨骼、牙齿等组成相近，在生物学特性方面，具有良好的生物相容性【3 0 】。将羟 基磷灰石与聚乳酸复合可以通过羟基磷灰石的碱性和聚乳酸的酸性降解产物相 互中和【3 l 】，消除因此引起的组织炎症反应。 采用均匀沉淀法制备羟基磷灰石( h a ) 【3 “，用分析纯的四水硝酸钙和磷酸 氢二铵溶于三蒸水( 电阻为1 7 mq e r a ，除去抑制h a 晶体生长的镁) ，配制含 o ，0 2 8 m o l d m 3 的c a ( n 0 3 ) 2 和0 0 2 5t o o l d i n 3 的( n h 4 ) 2 h p 0 4 的混合溶液。用分 析纯的浓氨水和o 5 t o o l d i n 3 的硝酸调节溶液的p h 值，所得溶液为无色澄清透 明溶液，加入适量尿素作为添加剂。将3 0 0 m l 己调制好p h 值及各种原料浓度的 混合溶液加入到容积为4 0 0 m l 的石英玻璃试管中，盖上玻璃盖，置于高度与内 径比为1 2 的密闭高压釜中，快速升温至1 5 0 ，保温3 0 r a i n 后以o 2 。c m i n 的升 温速度分别将釜体底部、中部、顶部温度升至1 6 5 ，2 2 0 和2 7 0 。c ，达到温 度后保温1 2 0 h 后关闭加热电源，自然冷却至室温后开启高压釜。产物经抽滤， 用去离予水和无水乙醇洗净后于6 0 c 下真空干燥。用m a l v e r n 激光粒度分析 仪测定粒径范围为3 0 - - 4 0 n m 。 2 1 3b 一磷酸三钙粉料的制备 0 一磷酸三钙( p t c p ) 与人体骨骼组织的无机成分相似、生物相容性好、 易被生物降解吸收、无毒副作用等优良的生物性能，在近代生物医学工程领域 和生物材料科学领域一直受到人们密切的关注和广泛的研究 采用干法工艺( 即固相反应法) 制备1 3 t c p 陶瓷粉末【3 3 1 。将摩尔比2 ：l 的 分析纯c a h p 0 4 2 h 2 0 ( 上海化学试剂有限公司，含量9 9 ) 和c a c o ，( 上海 泗联化工厂，含量9 9 ) 的混合物与蒸馏水按照质量比l ：1 5 的比例配料，然 后以2 0 0 转分的转速球磨2 0 h ，之后在9 0 。c 下干燥1 0 h ，并把干燥后的粉末在 】2 武汉理工大学硕士学位论文 8 6 0 9 0 0 。c 下保温2 h ，随炉冷却。将合成的b t c p 陶瓷粉末球磨2 4 h ，干燥后 气流粉碎机粉碎筛分。用m a l v e r n 激光粒度分析仪测定粒径范围为 8 0 12 0 n m 。 2 2 组成筛选体外降解实验 2 2 1 材料和仪器 2 种聚乳酸0 d l l a ) ：m w = 4 8 - 3 万、m w = 2 0 万 羟基磷灰石、b 磷酸三钙 超声波清洗仪：k s 一1 2 0 du l t r a s o n i cc l e a n e r f a 2 1 0 4 s 型电子天平：上海天平仪器厂 复方氯化钠注射液( p h = 7 0 0 1 ) p h s 3 c 精密酸度剂( 上海虹益仪器仪表有限公司) l s y 型电热恒温水浴锅( 北京医疗设备厂) 四柱液压机( 上海浦大液压机械制造有限公司，公称压力3 0 m p a ) h l 一2 0 0 型混炼机( 吉林大学科教仪器厂) 2 , 2 2 复合材料的制备 按照与p d l l a 的比例为4 ：1 分别称取h a 和0 t c p 微粉适量置入无水乙醇 中，超声波分散制各出均匀分散的悬浮液。再称取聚乳酸适量，采用液相吸附 法，使p d l l a 表面吸附一层粉末，形成p d l l a 与2 种材料的复合体，然后取 出、晾干，再经真空干燥2 4 h 后，投入清洗干净并已恒温( 1 0 0 ) 的挤出机料 斗。当复合物受热软化并熔融，在单螺杆旋转挤压的作用下，复合物在机内完 全软化、熔融、混炼，形成成分均匀的乳白色复合材料。1 0 0 。c 下在四柱液压机 上热压5 m i n 各3 次，制备成块体， 2 2 3 实验方案 称取纯聚乳酸( m w - - - 4 8 3 万) 2 份、纯聚乳酸( m w = 2 0 万) 3 份，每份2 0 9 分别记为p d l l a l 和p d l l a 2 。 将p d l l a i 与h a 和b t c p 按照上述方法制备的复合材料分别记作： p d l l a h a 、p d l l a d t c p ，分别称取2 种复合材料各3 份，每份2 0 9 。 武汉理工大学硕士学位论文 分别称取h a 、1 3 一t c p 微粉各3 份，每份o 4 9 ，分别记做h a 、b - t c p 。 准确地将1 8 m l 的复方氯化钠注射液注入玻璃瓶，将以上材料投入其中，于 3 7 。c 恒温水浴，进行体外降解实验。