（发酵工程专业论文）螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化.pdf

贵州大学硕士论文摘要 摘要 综合比较了用于藻类培养的各种光生物反应器的主要类型并阐明其研究现状，根据其 设计思想和设计原则设计了一套垂直板式气升式光生物反应器，容积为1 0 0 l ，长x 宽高 为3 2 0 m m x 8 0 m m x 3 9 0 m m 。介绍了在微生物培养基及工艺条件中经常采用的优化方法，并 首次选取响应曲面法( r e s p 0 1 l s es u r f a c em e t h o d o l o g y ，r s m ) 对螺旋藻的培养条件进行优 化。以验证所设计的反应器是否适合螺旋藻的生长，能否提高螺旋藻的培养产率。 反应器的验证实验包括光合自养法和混合营养法培养螺旋藻。采用光合自养法时，利 用响应曲面法对影响藻体生长的几个主要因子，即光照强度( a ) 、通气量( b ) 、培养时间 ( c ) 和装液量( d ) 进行最佳水平优化，并得到以藻体干重( d 矿) 为响应值，光照强度、 通气量、培养时间和装液量为自变量的二次多项式数学模型： d w = 1 2 5 + 0 0 9 6 a + 4 7 9 2 e 0 0 3 b + 0 0 3 9 c - 9 7 9 2e 0 0 3 d + 3 1 2 5e 0 0 4 a b 0 0 1 8 a c + 1 6 8 8e - 0 0 3 a d + 6 2 5 0e 0 0 5 b c + 5 6 2 5e - 0 0 4 b d + 4 3 7 5e ，0 0 4 c d 0 1 a 2 - 0 0 5 7 1 3 2 0 0 2 4 c 2 1 0 0 3 3 d 2 对该模型求导，当光照强度、通气量、培养时间和装液量取最佳水平时，藻体千重最 大预测值为1 2 7 7 9 l ，模型验证实验证明该模型有很好的实际指导意义。 在光合自养法培养条件优化的基础上，进行螺旋藻混合营养培养实验研究。首先采用 单因子实验，确定能促进藻体生长的营养物质是葡萄糖、醋酸钠、硝酸钠、硝酸铵、维生 素b l 和维生素b 。2 ；使用因子分析设计进一步筛选出对藻体干重影响显著的因子为葡萄糖、 硝酸铵和维生素b i ；然后利用响应曲面法对葡萄糖( a ) 、硝酸铵( b ) 和维生素b 。( c ) 进 行最佳水平优化，得到以藻体干重为响应值，葡萄糖、硝酸铵和维生素b l 为自变量的二次 多项式数学模型： d 矿= 1 6 6 o 0 6 7 a - 0 0 4 b - 0 0 1i c + 8 1 2 5 0 e - 0 0 3 a b 一8 5 0 0 e - 0 0 3 a c 22 2 ，1 7 5 0 e 0 0 3 b c 一0 0 6 6 a - 0 0 4 2 b 一7 9 0 9 e - 0 0 3 c 对该模型求导，当葡萄糖、硝酸铵和维生素b - 为取最佳水平时，藻体干重最大预测值 为1 6 s s g l 。模型验证实验证明模型有很好的实际指导意义。最后对营养成分的补加周期 进行了研究实验结果表明以4 8 h 为补加周期时藻体干重达到1 8 2 2 9 l 。比光合自养法培 养螺旋藻时藻体干重提高了4 2 ，6 8 ，比室外开放式培养提高了3 倍多。 验证实验结果表明，所设计的反应器非常适合螺旋藻的生长，且能明显提高其培养产 率。同时，响应曲面法优化藻体培养条件过程新颖、科学，所得模型具有较好的实际指导 意义。 关键词：光生物反应器：螺旋藻：响应曲面法：光合自养法：混合营养法 贵州大学硕士论文 a b s t r a c t a b s t r a c t a na i r - l i f tp l a t ep h o t ob i o r e a e t o rw a sd e s i g n e dt oc u l t i v a t et h e 最p l a t e n s i s ，b a s e do nt h e p r i n c i p l eo fp h o t ob i o r e a c t o rd e s i g na f t e rc o m p a r i n gt h em a i nc a t e g o r i e sa n dd e v e l o p m e n t s i t u a t i o nw i t l ls e v e r a lp h o t ob i o r e a c t o r s t h e ni n t r o d u c i n gaf e wo p t i m i z a t i o nm e t h o d i e su s e di n o p t i m i z a t i o nm e d i u ma n dt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n s ，f i n a l l yd e t e r m i n i n gt os e l e c tr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g yt oo p t i m i z et h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o no fsp l a t e n s i sa c c o r d i n gt ot h ef e a t u r eo f r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yf i r s t l y e m p l y i n gt h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yt oo p t i m i z et h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o no f p h o t o a u t o t r o p h ya n dn u t r i t i o n mi n g r e d i e n to f m i x t r o p h y , r e l a t i v e l y t h ew h o l ee x p e r i m e n t sw e i e a c c o m p l i s h e di nt h es e l f m a d e1 0 0 la i r - l i f tp l a t ep h o t ob i o r e a c t o r i nt h ep h o t o a u t o t r o p h y ，f o u r c r i t i c a lf a c t o r ss e l e c t e df u ri n v e s t i g a t i o nw e r el i g h ti n t e n s i 吼a i rf l o w ，t i m eo fc u l t i v a t i o na n d v o l u m eo fm e d i u m ，r e s e a r c ht h eo p t i m i z a t i o nl e v e l sa n dt h er e l a t i o n sb e t w e e nt h e s ef a c t o r sa n d b u i l d i n gaq u a d r a t i cr e g r e s s i o ne q u a t i o nw i t hd w a st h ed e p e n d e n t ： d w = 】2 5 + o 0 9 6 a + 4 7 9 2 e - 0 0 3 b + 0 0 3 9 c 一9 7 9 2e - 0 0 3 d + 3 1 2 5e 一0 0 4 a b 一0 0 1 8 a c + i 6 8 8e - 0 0 3 a d + 6 2 5 0e 一0 0 5 b c + 5 6 2 5e 0 0 4 b d + 4 3 7 5e - 0 0 4 c d - 0 i a 2 - 0 0 5 7 8 2 - 0 0 2 4 c 2 - 0 0 3 3 d 2 b ys o l v i n gt h ei n v e r s em a w i xf i - o mt h ee q u a t i o n ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o ro b t a i n i n gt h e m a x i m u m1 2 7 7 9 lo f d w w e r e4 4 k l x ，2 1 2 2 l h ，8 8 da n d7 2l r e s p e e t i v e l y t h ee x p e r i m e n t s f o rv a l i d a t i n gt h eq u a d r a t i cr e g r e s s i o ne q u a t i o np r o o f e dt h et h em o d e lh a dp l a y e dw e l li nar o l e i l lt h ep r a c t i c e o nt h eb a s eo f t h ep h o t o a u t o h - o p h y , t h ef a s ts t e po f m l x t r o p h yw a so n e - f a c t o re x p e r i m e n t t os e a r c ht h en u t r i t i o n a li n g r e d i e n tw h i c hc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho fs po b v i o u s l y a f t e rt h a t f a c t i o n a lf a c t o r i a ld e s i g nw a sc a r r i e do u tt ol o o kf o rt h e s ef a c t o r st h a th a ds i g n i f i c a n ti n f l u e n c e t ot h eg r o w t ho f s p l a t e n s i s ，s u b s e q u e n t l y , r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e dt oo p t i m i z e t h ec o n c e n t r a t i o nl e v e l so fs i g n i f i c a n tn u t r i t i o n a li n g r e d i e n t ，t h eq u a d r a t i cr e g r e s s i o ne q u a t i o n w i t hd w a st h ed e p e n d e n tw a s ： d w = 1 6 6 0 0 6 7 a - 0 ，0 4 b - 0 ，0 1 1 c + 8 2 5 0 e - 0 0 3 a b - 8 5 0 0 e - 0 0 3 a c 一1 7 5 0 e - 0 0 3 b c 0 0 6 6 a 2 0 0 4 2 8 2 7 9 0 9 e 0 0 3 c 2 b ys o l v i n gt h ei n v e r s em a t r i xf r o mt h ee q u a t i o n ，t h eo p t i m a ll e v e l sf o ro b t a i n i n gt h e m a x i m u m1 6 s s g lo fd i p t h ee x p e r i m e n t sf o rv a l i d a t i n gt h eq u a d r a t i cr e g r e s s i o ne q u a t i o n p r o o f e dt h et h em o d e lh a dp l a y e dw e l li nar o l ei nt h ep r a c t i c e e v e n t u a l l yt h er e s u l to f e x p e r i m e n ti d e n t i f i c a t e dt h ei n t e r v a lo f4 8h o u r sw i t ha d d i n gt h en u t r i t i o n a li n g r e d i e n tw a st h e 贵州大学硕士论文a b s t r a c t o p t i m a l ，t h em a x i m u md r yw e i g h tw a s1 8 2 2 9 l ，i ti sm o r et h a n3t i m e st h a nt h ec o s m i c a l l y p r o d u c e t h er e s u l to fe x p e r i m e n tp r o v e dt h a tt h eb i o r e a c t o ri sp r o p i t i o u st oc u l t i v a t et h e p l a t e n s i s k e yw o r d s ：p h o t ob i o r e a e t o r ；s p i r u l i n a ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ；p h o t o a u t o t r o p h y ； m i x l r o p h y 贵州大学硕士论文 声明 学位论文原创性说明和关于论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 料鼍瓤掣匝址 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 导师签名：姒日期：! 鲤z 血 贵州大学硕士论文螺旋蘸高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 第一章绪论 引言 螺旋藻( s t t i r u l i n a ) 是一种具有光合作用能力的原核微生物，因其细胞呈丝状、缠绕 成螺旋状而得名，螺旋藻又称为蓝细菌。螺旋藻属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、颤藻科、 螺旋藻属( 胡鸿钧，2 0 0 3 ) ，目前发现的有5 0 多个种，而用于研究和生产的只有3 0 多个， 以钝顶螺旋藻( s p l a t e n s i s ) 和极大螺旋藻( s m a l r r a a ) 应用最为普遍( 陈峰，1 9 9 9 ) 螺 旋藻作为一种微生物，所具有的丰富营养物质是目前任何单一动物源、植物源及微生物源 食物无法相比的因此，螺旋藻已逐步应用于食品、医疗、保健等行业( 杨雪莲等，2 0 0 4 ) 1 1 螺旋藻的研究现状 螺旋藻在地球上已生存了3 5 亿年( o r ic i f e r r i ，1 9 8 3 ) ，非洲、南美洲的一些居民食用 螺旋藻也有近千年历史。直到1 5 世纪末，与哥伦布一同探险的卡斯罗最早对螺旋藻的作了 相关记载。1 9 4 0 年，法国药物学家c r e a e h 将其标本寄给当时著名的藻类学家d a n g e a r d ， d a n g e a r d 转交r i c h 作鉴定证明该标本是一种螺旋形丝状蓝藻，种名为钝顶螺旋藻( c i f e r r i o ，1 9 8 3 ) 。1 9 6 6 年，z a r r o u k ( z a r r o u k ，1 9 6 6 ) 根据螺旋藻的生长特性进行实验研究，成 功确定了适合于螺旋藻生长的培养基，即目前使用的基础培养基，z a _ r r o u k 的研究是螺旋藻 规模化生产的里程碑。1 9 7 3 年，在实验室基础上，法国与墨匿哥在特克斯科科湖畔建立了 世界上第一个螺旋藻生产工厂；1 9 8 2 年美国开始生产螺旋藻，一年后其销售额达到1 亿美 元；同年，日本d i c 公司在美国开办基地，到1 9 8 9 年干粉产量达到1 6 0 t 。 我国早在2 0 世纪7 0 年代就开发了螺旋藻研究开发，1 9 9 0 年在云南永胜县程海湖建成 了全国最大的螺旋藻生产基地，产品纯度达9 0 ，蛋白含量6 1 目前我国螺旋藻生产企 业近1 0 0 家，己成为螺旋藻养殖大国，年产量1 0 0 0 t 以上，占全球4 0 左右，作为世界第 一人口大国，螺旋藻开发在我国会有巨大的市场潜力。 目前，世界上已有墨西哥、法国、乍得、日本、德国、菲律宾、印度及我国台湾省等 l o 多个国家和地区进行螺旋藻研究和生产，螺旋藻的年产量己达到1 5 0 0 2 0 0 0 t ，销售额 达到2 0 多亿美元。 尽管螺旋藻已受到越来越广泛的关注，但到目前为至，商业化大规模生产主要依靠室 外开放式培养，培养条件受环境影响大，产率极低，只有0 5 9 1 , 左右( 李志勇等，1 9 9 8 ) 而实验研究一般都采用封闭式光生物反应器培养，尽管封闭式光生物反应器培养螺旋藻能 很好地解决培养条件对环境的依赖，但这些反应器要么成本太高、价格昂贵，要么结构复 杂、难于控制，要么不易扩大等，使其只能局限于实验研究阶段这些因素极大地限制了 螺旋藻产业的发展，使其长期以来一直处于高端消费品行业。 因此，为了使螺旋藻能成为一种大众消费品。本实验旨在设计一套即能有效提高螺旋 贵州大学硕士论文 螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 藻培养产率，又兼具价格低廉、结构简单、操作简便等优点的光生物反应器。 1 2 藻类光生物反应器的发展状况及主要类型 藻类光生物反应器的研发开始于上世纪5 0 年代，随着藻类培养技术的进步，作为其培 养的装置，各种类型的光生物反应器相继问世( 王金霞，2 0 0 2 ) 。目前用于培养藻类的反 应器类型和形状各异，其产率差别也很大徐明芳( 徐明芳等，1 9 9 7 ) 利用高效发光二极 管代替普通的光源。最终产率为4 9 8 9 l ；刘建国( 刘建国等，1 9 9 8 ) 自行组建了一套气升 式双螺旋管道串联的光生物反应器。以该反应器培养红球藻能使其细胞浓度增加近3 倍； 曹健( 曹健等，1 9 9 9 ) 设计了一种溢流喷射式光生物反应器，并用于螺旋藻连续培养，产 率最终达1 7 6 9 l ；刘晶磷( 刘晶磷等，1 9 9 9 ) 利用管式光生物反应器培养螺旋藻，在合适 的光暗比下，其体积产率为0 6 8 9 l d ；姜建国( 姜建国等，2 0 0 4 ) 设计了容积为1 o l 的玻 璃螺旋管式光生物反应器用于培养盐藻，得到很高的培养产率，同时也得到较高的胡萝h 素和b 胡萝h 素此外，其他研究人员采用不同的反应器培养藻类，也取得了不错的效果 ( 王长海等，1 9 9 9 tk a t a r z y n a c h o j n a c k a 等，2 0 0 4 ) 。 根据培养液是否直接与空气接触，光生物反应器分可为开放式光生物反应器和封闭式 光生物反应器两大类。两种类型的反应器区别见表l 二l 。 表i - 1 开放式光生物反应器与封闭式光生物反应器特点比较 t a bi - 11 h cc o m p a r i s o no f t h eo p e np h o t ob i o r e a c t o ra n dt h ec l o s e dp h o t ob i o r e a c t o r 1 2 1 开放式光生物反应器 开放式光生物反应器以室外跑道池为主。采用叶轮进行搅拌。国内外多数螺旋藻企业 都采用这种方式。其优点是：培养池建造简单，成本低：可利用自然光源：生产过程操作 简单，维护方便。由于直接暴露在空气中，所以这种培养装置具有许多亟待解决的问题( 王 金霞，2 0 0 2 ) ： 2 贵州大学硕士论文 螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 ( 1 ) 光能利用率低，仅为1 左右，光照比通常小于l o m - 1 ，单位面积产量低： ( 2 ) 易染杂藻、原生动物等，影响产品质量： ( 3 ) 占地面积大，消耗水分多，因蒸发或降水而造成培养液盐度、p h 、营养盐浓度等 的大幅度变化； ( 4 ) 温度直接受气候条件影响，昼夜温差大，造成培养损失； ( 5 ) 光照强度波动大，中午由于光照强会存在光抑制现象，而晚间无光照，呼吸作用 消耗大； ( 6 ) 开放式培养，微藻生长密度较低，给下一步培养液的分离带来困难 所以，规模化生产螺旋藻时场地选择就是培养成功与否的关键通常情况下，场地选 在光照、温度适宜的江、湖或海边，如天然的培养基地乍得湖、墨西哥特克斯科科湖以及 我国的云南程海湖等；此外，土地贫瘠，且不宜于种植农作物的地方也是培养螺旋藻的应 选场地，如e a r t h r i sf a r m s 培养池建在美国南加洲干旱少雨的荒漠地带( 胡鸿钧，2 0 0 3 ) ， 见图1 1 。培养面积从5 0 0m 2 5 0 0 0m 2 不等；美国c y a n o t e t h 公司将培养池建在无人居住的 荒岛上在我国，螺旋藻工厂的培养池多用水泥建造，但环境条件有限，如雨水较多，经 常遭受台风及暴风雨的袭击。我国部分沿海地区利用海水培养螺旋藻，与一般的跑道池相 比具有以下优点：海水自身的营养成分丰富、含量均衡，可简化培养基成分，适合于培养 螺旋藻，无需调节p h 值；可以利用大量未用的潍涂，降低生产成本等 图l - i 开放式跑道池培养螺旋藻 f i gi - ic u l t i v a t i o n s p u s i n g t h e o p e nr u n w a y t a n k 1 2 2 封闭式光生物反应器 封闭式光生物反应器研究已有近半个世纪，与开放式反应器相比，封闭式反应器具有 以下优点：可避免杂藻、浮游植物对培养物的侵染，实现纯种培养，能获得较高的产率， 提高产品质量：采用人工光源，减少对自然条件的依赖，延长光照时间，提高产品的产率； 易进行温度、p h 值、溶解氧浓度等培养参数的自动化监控，从而达到优化培养；可进行转 基因微藻等高附加值藻类的培养但由于造价高、难于放大等原因尚未应用于大规模化的 生产，但由于其种种优点，在其培养条件日臻完善的情况下，相信这种反应器今后会得到 3 贵州大学硕士论文螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 广泛的应用。已有的封闭式光生物反应器，从外形看主要有柱式、管道式和板式反应器等。 1 2 2 1 柱式光生物反应器 这种反应器最初是由搅拌式发酵罐加上简单的光照演变而来( 王金霞，2 0 0 2 ) ，由于 具有搅拌叶轮，产生的剪切力对藻体细胞，尤其是螺旋藻破坏性大，给后续分离处理带来 困难此外，光照效率低，放大困难等缺点，使这种反应器局限于实验室研究阶段。用气 升式取代机械搅拌子后，可避免剪切力的影响，气流能带动反应器内液体循环、混合效果 好、结构简单、容易对藻类生长进行优化控制等特点，在一定程度上能满足微藻的生长， 但同样具有放大困难，动力消耗大。操作复杂等缺点。这种反应器在实验研究阶段还是具 有很大的应用潜力的。 1 2 2 2 管道式光生物反应器 管道式光生物反应器是封闭式反应器中应用最为广泛的，被认为是微藻未来的培养系 统( 胡鸿钧，2 0 0 3 ) 。在柱式光生物反应器的基础上，不断提高反应器的高径比就成了管道 式光生物反应器，管径从0 0 1 m 到o 1 4 m 之间不等，有的中试规模己达1 0 ，0 0 0 l 体积( 王 金霞，2 0 0 2 ) 这种反应器具有以下优点：光照比表面积较大，光能利用率高；c 0 2 转化率 高；不易受污染；在培养过程中易于监测和控制各种参数。 最先研究和使用这种反应器的是f l o r e n t a n o 及其合作者( t o r z i l l og ，1 9 8 6 ) ，他们用 的管道直径为1 4 c m 、膜厚o 3 m m 。管道最长的达5 0 0 m 。意大利一螺旋藻企业设计了容量 为1 4 5 l ，比表面积为4 9 m 1 的管道式光生物反应器，见图l 一2 ，在夏季培养螺旋藻最高产 量达2 8 9 m 2 l 。近年来，英国和澳大利亚研制了一种垂直的管道式光生物反应器，将其称 为“生物螺卷( b i o c o i l ) ”，管道直径3 3 m m ，以低密度的塑料管旋绕在一个圆形框架上见 图l - 3 ，总容积为1 3 0 0 l ，光照面积近1 0 0 m 2 用这种反应器培养小球藻最大产量为1 0 s g l d 图l - 2 管道式光生物反应器( 意大利) f i g1 - 2 t h e n l b c 灿b i o r e a c t o f ( i t a l y ) 4 贵州大学硕士论文螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 圈i - 3 管道式光生物反应嚣( 英国和澳大利亚) f i 9 1 - 3 t h e m b e p h o t o b i o r e a c t o r ( b r i t h i s ha n d a u s t m i l ) 限制管道式光生物反应器应用和放大的主要因素是温度。特别是户外的管道式反应器， 在满足了光照的同时，反应器内温度的急剧升高成为主要问题。在夏季，管内温度可以超 过螺旋藻最适生长温度的1 0 w 1 5 ，因此需要配备相应的冷却装置( 胡鸿钧，2 0 0 3 ) 。 另一个限制因素就是脱氧问题。在光照充足情况下，通过光合作用会放出大量的氧气， 造成溶氧过饱和，若不能及时排出会抑制藻体生长。此外，藻的附壁现象、反应器的清洗 消毒等问题也是限制管道式光生物反应器放大和应用范围的因素。 1 2 2 3 板式光生物反应器 1 9 5 3 年，m i l n e r 等( m i m e r ，i - iw ，1 9 5 3 ) 首先设计了一种板式的反应器，用来培养 小球藻，这就是最早的板式光生物反应器。这种反应器是利用两板之间较短的光径来减少 反应器中的光衰减现象，从而提高光能利用。从板的安置形式上。板式光生物反应器可分 为水平式和垂直式二种( 许波等。2 0 0 0 ) ( 图1 - 4 ，1 5 ) 。 图1 4 垂直板式光生物反应器 f i g1 - 4 t h e v e r t i c a l p l a t e p h o t o b i o r e a e t o r 5 贵州大学硕士论文螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 圈1 5 水平扳式光生物反应嚣( h u 等，1 9 ) 。 f i gl 一5t h e h o r i z o n t a lp l a t e p h o t ob i o r e a c t o r 1 ，i f i l 多级串联平板：2 、压缩空气鼓泡管：3 、温度传感器；4 、冷却水和喷头；5 ，温度继电器； 6 、电磁法；7 培养液储檀；8 、泵；9 、气升管；l o 、循环管；1 1 、采收液出口；1 2 、采收渡储槽； 1 3 空压机；1 4 、舍2 0 0 2 的压缩空气；1 5 、压缩空气出口；1 6 、取样口 前者一般利用自然光源，板的倾角可调，能够最大程度的接受太阳光直射。同管道式 光生物反应器一样，板式生物反应器也需要降温和脱氧装置。后者占地面积小，其光源形 式可采用自然光源和人工光源2 种。有的垂直板反应器通过在二板间设置挡板，增加了湍 流效果，提高了产量。 2 0 世纪8 0 年代中期，法国和美国曾设计了种平板内分成许多长方形的槽状反应器。 用于作为螺旋藻规模化培养装置，但没成功，主要是因为培养液循环效果不好及成本太高。 因此板式光生物反应器还没大规模应用于生产中，但是这种反应器占地面积小，能在室内 大量生产，各参数易于控制：同时，光能利用率高，能获得较高的产率，用于高附加值产 品的培养，板式光生物反应器还是有很大的应用前景的。 1 2 3 半封闭式温室 这种培养装置介于开放式和封闭式之间。吸取了两者的优点，如建造简单、减少污染， 能避免溶氧过饱和等问题这种装置在我国比较流行。这是因为我国能完全适合螺旋藻生 长的地区少之又少。并且受环境影响大因此，只能通过人为调节培养条件以满足藻体的 正常生长这种装置在我国会有更好的应用前景 1 3 螺旋藻培养方法 除反应器外，培养方法也是影响螺旋藻产率提高的一个重要因素。根据其营养模式不 同，可将其培养方法分为光合自养型( p h o t o a u t o t r o p h y ) 、营养缺陷型( a r x o t r o p h y ) 、混合 营养型( m i xt r o p h y ) 和异养型( h e t e r o t r o p h y ) ，其主要区别如下： 1 3 1 光合自养型 光合自养法是利用光能( 自然光源或人工光源) 将无机物转化为有机产物，同时放出 6 贵州大学硕士论文 螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 氧气的代谢过程。这种培养方法对环境的依赖性大，尤其是光照强度对藻体的生长至关重 要。尽管螺旋藻是一种生长很快的光合生物( o l a i z o l a ，2 0 0 0 ) ，但是与其它微生物相比， 其生长速度仍然缓慢。因此，需要较长时间培养才能得到较高产率，而且采用不同的反应 器得到的产率差异很大。目前用于大规模商业化培养的产率一般在0 5 9 l 左右。 1 3 2 营养缺陷型 藻体在生长过程中由于发生代谢障碍，培养时至少需添加一种有机物，但这种物质并 不作为碳源或氮源。 1 , 3 3 混合营养型 在光照和c o z 都存在的条件下，向培养液中补加有机物作为碳源或氮源，生长的同时 放出0 2 这种方法不但能降低藻体生长代谢对环境的依赖，而且可以得到更大的比生长速 率和更高的产率。改变藻体利用碳源的代谢途径及藻体细胞中各营养成分的含量，这为螺 旋藻的产业化、规模化培养奠定了良好的基础光合自养法中光照强度是最重要的影响因 素，但是采用混合营养法时，加入有机成分以后能明显降低藻体生长对光照的依赖( 张义 明等，1 9 9 6 ) ，添加的物质不同，得到的产率差别也很大，其特点是产率高、成本低、产 品纯度高，特别适合于一些高价值产品的积累( z a r r o u k ，1 9 6 6 ；马成浩等。2 x ) 4 ；史成毅 等，2 0 0 5 ) 目前报道的最高产率是1 0 o g 几( 张义明等，1 9 9 9 ) 1 3 4 异养型 微藻在没有光照的条件下，利用一种或多种有机底物作为碳源或氮源进行生长代谢， 此时c 0 2 可有可无。由于螺旋藻培养条件较特别( 碱性高，几乎不含有机底物) ，加上异 养型培养时对反应器要求较高，故一般情况下不用此种方法。 这四种培养方法中以光合自养法和混合营养法应用广泛，前者主要用于大规模生产， 而后者由于技术原因主要应用于实验研究阶段，但因其能显著提高产量，故在未来会有很 大的应用前景。 1 4 立题背景与研究内容 1 4 1 立题背景、目的及意义 多年来，国内外有关螺旋藻的研究与规模化培养主要以光合自养法为主，该法对环境 依赖性强，培养条件不宜控制、生产成本高等，使螺旋藻产率只能维持在个相当低的水 平，长期以来螺旋藻价格居高不下，到目前为止仍无法成为大众消费品因此，为了减少 生产成本，螺旋藻的规模化培养一般都选在适宜藻体生长的天然湖泊或河流旁，如云南程 海湖螺旋藻培养基地，但这种野外露天培养容易感染杂菌，从而影响螺旋藻的纯度和品质。 为了克服以上以上缺点，近年来针对微藻培养国内外研发了多种的反应器，如机械搅 拌光生物反应器、气升式光生物反应嚣、管道式光生物反应器等这些反应器对提高微藻 藻产率和改善其品质取得了一定的效果，但也有不足之处，机械搅拌式反应器能提供足够 7 贵州大学硕士论文螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 的循环动力，培养液混合效果好，藻体产率高，但转子产生的剪切力易造成藻体细胞大量 破碎，增大了采集难度和后续处理，且动力消耗大，增加培养成本：鼓泡式光生物反应器 以气流作为培养液循环动力，混合均匀，光能利用率高，对藻体细胞影响小，因此能提高 微藻产率，改善产品质量，但气泡太大时会产生较大的剪切力使藻体细胞破碎；管道式光 生物反应器能很好地解决剪切力使培养液混合均匀，光能利用率高，但用这种反应器培 养微藻时溶氧过饱和、培养液温度过高、藻类附壁等问题不利于进行放大培养c r i c h m o n d ， 2 0 0 0 ) 鉴于上述原因，本实验从降低螺旋藻生产成本的角度出发，旨在设计一套不但适合于 螺旋藻开放式培养，而且兼具价格低廉、结构简单、操作简便的气升式光生物反应器并 在此基础上，分别利用光合自养法和混合营养法培养螺旋藻，并利用响应曲面法分别对两 种方法的培养条件进行优化。验证本实验所设计的反应器是否适合螺旋藻生长，并明显提 高其培养产率。 1 4 2 研究内容 1 设计总容积为l o 0 l 的气升式光生物反应器，要求价格低廉、结构简单、操作简便； 2 利用所设计的反应器进行螺旋藻培养的探索性实验，采用光合自养法和混合营养法 培养螺旋藻，以验证所设计的反应器是否适合螺旋藻生长，并明显提高其培养产 率 3 利用响应曲面法分别对两种方法的培养条件进行优化，并建立相关的数学模型。 8 贵州大学硕士论文螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 第二章气升式光生物反应器的设计思想及研制 引言 光生物反应器( p h o t o b i o r e a e t o r ) 是专门用于光合生物或具有光合能力的组织培养的一 类装置。除了与普通生物反应器有相似结构外，还具有光照系统目前，研究和应用最为 广泛的光合生物就是藻类，而光照是其生长的主要影响因子。一般情况下，植物的光能利 用率仅为0 2 左右，而设计合理的光生物反应器的光能利用率可达到1 8 ，较高的光能利 用率有利于促进藻类的生长和提高其产率。利用光生物反应器还可以对藻类进行连续或半 连续培养，这为实现藻类的商业化生产提供了必要条件。 2 1 藻类气升式光生物反应器的设计思想 气升式光生物反应器可以用来培养对剪切力敏感的动植物组织、微藻等光合生物或细 胞。与传统的生物反应器相比，气升式反应器还具有以下优点( 梁世中，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 无高能耗散热的点：在普通发酵罐中，液体运动所需要的能量是通过搅拌转子或 气体分布器在反应器的一点集中输出，而气升式反应器不存在这种高能耗散热的 点，这对所培养的组织或细胞影响较小； ( 2 ) 培养液混合均匀：气、液、固三相的均匀混合与溶液成分的均匀分散，是生物反 应器的普遍要求均匀混合及分散能避免反应器液面生成稳定的泡沫层，防止生 物细胞积聚于培养液液面而受损害甚至死亡。另外，培养基成分尤其是淀粉类易 沉降的颗粒物料更需要悬浮分散。而气升式反应器能很好地满足这些要求： ( 3 ) 剪切力小，对生物细胞损伤小：由于没有搅拌叶轮，故气升式反应器对细胞的剪 切损伤可减至最低，尤其适合植物细胞、组织、丝状细胞的培养： ( 4 ) 传热良好：气升式反应器因液体综合循环效率高，且因无机械搅拌熟产生，故发 酵产热总量低，同时在外循环管路上加装换热器以保证去除发酵产生的热量； ( 5 ) 结构简单，易于加工制造：气升式反应器罐内无机械搅拌，故无需安装结构复杂 的搅拌系统，密封也容易保证，故加工制造方便，设备投资低； ( 6 ) 操作和维修方便：因气升式反应器无机械搅拌系统，故结构较简单，能耗低，操 作方便，特别是不易发生因密封而出现的渗透染菌问题。 而气升式光生物反应器除具有气升式反应器的优点外，还需要光照。因此，为了提高 光能利用率，需要有适当的光照强度，光照过弱或过强时会导致藻体细胞停止生长，甚至 死亡。藻类进行光合作用时会放出氧气，当培养液中溶解的氧过饱和时，不利于藻体生长 代谢过程，会抑制其光合作用的进行光合作用是将无机碳源合成有机体，所以无机碳源 也是藻类光合作用的必备条件所以，为了得到较高的产率，如何设计气升式光生物反应 器，尤其是光源的设计及布置、有效地克服溶氧过饱和问题是设计的关键所在。此外，尽 9 贵州大学硕士论文 螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 管藻类是生长最快的光合生物( o l a i z o l a ，2 0 0 0 ) 。但培养时间仍比普通微生物长得多。因 此，要求反应器能在长时间无人值守的条件下能安全、稳定地运转( 王金霞，2 0 0 2 ) 。 2 1 1 光源设计 藻类的生长离不开光合作用，光照效果的好坏直接影响藻类的生长情况，是藻类能否 成功培养的关键。因此在光生物反应器的设计过程中，应首先考虑光能的提供与传输问题。 首先在选材方面，光生物反应器必须采用透光度较高的材料，减少光能损失：而开放式跑 道池直接暴露在光源下。不用考虑光源布置其次就光源来说，可选用自然光源和人工光 源。前者具有节能、价低等优点，缺点是易受气候影响、对环境依赖强，光照稳定性差， 不易控制，产率只有o 5 9 l 左右，仅有局部地区适合培养，如非溯的咋得湖、墨诬哥海湾 以及我国的云南程海湖等；后者不受天气条件影响，光照强度可根据需要进行设置，但是 能耗大、生产成本高。所以一般只用于实验室研究和小规模培养等，也可以在大规模生产 中弥补光能不足。在光能传输过程中，由于藻体细胞相互存在屏蔽效应，导致光能在反应 器中迅速衰减，造成分布不均( 胡鸿钧。2 0 0 3 ) 因此，光能衰减是藻体培养产率不高的 主要影响因子。光能衰减速度主要与藻体种类、大小、培养液浓度有关( 刘晶磷等，1 9 9 9 ： 温少红，2 0 0 1 ；曾文炉，2 0 0 1 ) 。光衰减现象在光生物反应器中广泛存在，也是藻类利用 光能的限制因子 所以如何有效的减小光衰减、提高反应器中光能利用率是研究和设计光生物反应器的 一个重要指标。通常情况下，解决光衰减的方法主要有增加入射光的强度、缩短光径、扩 大反应器的比表面积和增大反应器内部培养液的循环速度等。 2 1 2 碳源供应 藻类的光合作用主要以无机碳源为主，在藻类培养过程中添加无机碳源，可有效提高藻 类生长速度和生长密度( t a l b o t ，1 9 9 1 ；c h r i s m a d h a 等，1 9 9 4 ：g i t e l s o n ，1 9 9 6 ：l i v a n s k y 等， 1 9 9 6 ；w a t a n a b e 等，1 9 9 6 ；李师翁等，1 9 9 8 ；c h i n iz i t t e l l i 等，2 0 0 0 ；张栩等，2 0 0 0 ：z h a n g k 等，2 0 0 1 ) ，但无机碳源的供应也是藻类高密度培养的一个限制性因素。在藻类培养液中， 同时有四种离子形式的无机碳存在：c 0 2 、h 2 c o ，、h c 0 3 和c q 。，且处于一个动态的化学 平衡： c 0 2 + h 2 0 ；兰h 2 c 0 3 ；i = = = h c 0 3 - + h + ；c 0 3 ；+ 2 h + 通常，培养藻类有两种碳源供应方式。一是通入2 混合气体，= 是补给碳酸氢盐( 王 金霞，2 0 0 2 ) 前者使用较为广泛，但需要进行配气；后者适合于大规模生产中，能减少反 应器内部装置，但培养体系变化较大，不及前者容易控制，仅限于能直接利用、h c o f 的藻 类 2 1 3 ，防止溶解氧过饱和 微藻进行光合作用时固定c o ：的关键酶是r u b i s c o 酶，该酶具有羧化和氧化双重功能 1 0 贵州大学硕士论文 螺旋藻高细胞密度培养装置的设计及培养条件优化 在光照适宜且c 0 2 供应充足的条件下，藻类光合作用加快，放出大量氧气，若不能及时排 出会造成溶氧过高，使r u b i s c o 酶结合氧而起氧化作用，使羧化作用受抑制，藻体光合作 用受阻，最后导致藻体停止生长，尤其是在反应器底部，这种现象更为明显。因此在微藻 培养过程中，尤其是大规模生产中应尽量减少气液间氧的传递，以免增加溶液中的溶解氧。 此外，需要采用有效的脱氧装置以便及时排出反应产生的氧气 2 1 4 长期连续稳定运转 由于藻类培养一般都需要较长的时间因此要求反应器能长期稳定地运转，不易受培养 过程的影响。在影响反应器长时间连续稳定运转的所有因素中，藻体细胞的趋光附壁现象 是最主要的因素之一当培养进入生长对数期后，培养液浓度及藻体密度都会迅速上升， 在通气不均匀时或死角处就会出现附壁现象。藻体附壁不但影响光能传输，而且附壁细胞 由于长时间受强光照射死亡而污染培养液。另外，藻类细胞附着在检测探头上，会造成测 量误差，影响培养过程。 因此，如何有效地简化反应器内部结构，增加培养液湍流效果，消除反应器内培养死 角，是很好解决附壁现象的关键。此外，要求所用的检测仪器，如p h 、溶解氧、温度等有 较高的稳定性 2 2 气升式藻类光生物反应器的研制 2 2 1 反应器的主体尺寸 首先，为了实验需要，反应器容积确定为1 0 0 l ，设计成气升式光生物反应器。为了 减少占地、提高空间利用率，本实验研究采用垂直板式光生物反应器，由反应器主体、光 照系统和气体循环系统三部分组成。由于采用板式结构，就要求反应器长、宽和高有合理 的尺寸，故在不至于影响反应器的稳定性和放大设计时应尽量将反应器设计得窄一些。增 加高径固然