（发酵工程专业论文）聚唾液酸修饰铜锌超氧化物歧化酶的研究.pdf

| | i j i l i | l i l j l | | | | | i i i j i | i | i i | l | j i i | j i | l f f l i l - y 18 2 9 5 8 4 聚唾液酸( p s a ) 是唾液酸单体以仅2 ，8 或和0 【2 ，9 糖苷键连接起来的线性聚合物，具 有强亲水性、生物可降解性和很好的生物相容性。因其更有效的安全性，聚唾液酸被公 认为传统药物缓释材料聚乙二醇( p e g ) 的理想替代材料。聚唾液酸修饰又称为聚唾液酸 化( p o l y s i a l y l a t i o n ) ，即在蛋白质或多肽类药物表面通过化学交联的形式共价连接聚唾液 酸，以提高蛋白质或多肽类药物的稳定性和药理学效能。 为了使聚唾液酸纯度满足药用需求，本论文在原有粗品聚唾液酸提纯工艺的基础 上，进一步延伸了聚唾液酸的纯化工艺。发酵液经离心、乙醇沉淀、碱性沉淀和氯代十 六烷基吡啶( c p c ) 络合处理得到纯度为9 0 左右的聚唾液酸粗品，粗品溶解后再经超滤 ( 1 0 0 k d a ) 和d e a eff 离子交换层析和s e p h a c 巧ls 2 0 0h r 凝胶层析处理，得到高纯度 聚唾液酸样品，累积回收率9 5 9 。该工艺得到的聚唾液酸蛋白质含量为2 1 2 1 0 4 m 咖gp s a ，内毒素去除率大于9 9 8 ，经h p g f c 分析，纯度为9 9 7 1 ，峰均相对分 子量为1 6 2 l ( d a ，各种指标均已达到医药级水平，可用于聚唾液酸化修饰药用蛋白。 本文选用铜锌超氧化物歧化酶( c u z n s o d ) 作为聚唾液酸修饰的靶向蛋白，初步测定 其原始酶活为1 7 6 1 0 4n u m gp r o t e i n ，经s d s p a g e 电泳分析，呈电泳纯，分子量为 3 2 i d d a 。 分别以高纯度聚唾液酸和c u z n s o d 为糖链供体和靶向蛋白，本文建立了一条完整 高效的聚唾液酸修饰c u z n s o d 的工艺。聚唾液酸经活化后通过共价键连接到s o d 表 面的l y s 上，再用t o s o ht o y o p e 甜lh w 5 5 f 凝胶过滤层析对聚唾液酸修饰的s o d 进 行纯化。以修饰酶交联比和酶活保留率为优化目标，通过l 9 ( 3 4 ) 双指标正交优化实验， 确定了p s a ：s o d 摩尔用量比4 0 ：l ，反应温度2 5 ，反应p h 7 4 为s o d 聚唾液酸化的 最适反应条件。该工艺下制得的p s a s o d 的平均交联比为3 8 6 士0 1 7 ，平均酶活保留率 为7 7 8 士1 6 。 s d s p a g e 电泳分析聚唾液酸修饰前后s o d 的分子量从3 2 l a 增大为9 0 l o o l ( d a 。用原子力显微镜观察到修饰酶分子粒径为1 0 1 5 1 1 l l l ，约为修饰前的4 倍。修 饰酶表面有一层云状包覆，呈单颗粒包覆和多颗粒包覆两种显微形态，分别对应单酶修 饰和多酶修饰两种修饰方式。t n b s 法测得修饰酶氨基平均修饰率为2 4 4 ，并通过蛋 白残基可及性分析，推测可能被修饰的位点为l y s ( 9 ，2 3 ，7 3 ，8 9 ，1 5 1 ) 。进一步的验证实验 表明，s o d 经聚唾液酸修饰后，不仅保留了较高的天然酶活性，而且在酸碱稳定性、热 稳定性和抗酶解稳定性方面明显优于天然酶。 关键词：聚唾液酸；铜锌超氧化物歧化酶；修饰；形态表征；酶活稳定性 a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y s i a l i ca c i d ( p s a ) i sah o m o p o l y m e ro fs i a l i ca c i d 、 r i t l la - 2 ，8o r a n d 仅- 2 ，9k e t o s i d i c l i r 止a g e s nh 弱s t r o n gh y d r o p l l i l i c i 坝b i o d e 笋a d a b i l 时锄d9 0 0 db i o c o n l p a t i b i l i 妙p o l y s i a l i c a c i di sc o n s i d e r e da i li d e a la h e m a t i v em a t e r i a lo ft l l ep o l y e t l l y l e n e g l y c o l ( p e g ) i n c o n t i o l l e d d m g r e l e 2 l s e 印p l i c a t i o nd u e t 0i t sm o r ee a e c t i v e s a f e 够 i i l t l l e r 印e u t i c s m o d i f i c a t i o n 谢廿lp s a ，a l s ok n o w n 嬲p o l y s i a l y l a t i o n ，m e a i l sc o u p l i n gl o n g c h a i np s at 0t 1 1 e p r o t e i no rp e p t i d ed m g sb yc h e i i l i c a lc r o s s l i i l l 血gm e t l l o d ，i no r d e rt oi i l l p r 0 v es 切b i l i t ) ，a i l d p h a n n a c 0 1 ( i n e t i c so f m o d i f i e de n z y m e p u r i f i c a t i o np r o c e s so fp s aw 硒s t u d i e d b 嬲e do nt l l ep r e v i o u sw o r kt 0s a t i s 匆m ep s a p 谢t ) r f o rm e d i c a la p p l i c a t i o n t h et o t a l p r o c e s s e sw e r c 嬲f o l l o w s ：f i l t e rb y 劬a l l o l p r e c i p i t a t i o n ，a l k a l i l l ep r e c i p i t a t i o na i l dc o m p l e x a t i o n 诵n 1c e t ) r lp i d i l l i 啪c 1 1 l o r i d e ( c p c ) ，a n d t l l ef i n a lp 耐t ) rw 嬲a b o u t9 0 t h e nt h ep r o d u c tw 勰如n h e rp 嘶f i e db yu l 旬阻6 l t r a t i o n ( 10 0 m a ) ， d e a effc o l u l c l 啪m a t o g r a p h y锄ds e p h a c 巧l s - 2 0 0h rc o l l 瑚n c h f o m a t o 舀a p h y a sar e s u l t ，t 1 1 ec u m u l a t i v er e c o v e 巧w a l sa b o u t9 5 9 t h em g h p u r i 妙p s a c o n t a i n e dp r o t e i n2 12 10 - 4m g m gp s a ，锄dt h er e m o v a lo fb a c t e r i a le n d o t o x i l l sw 嬲a b o v e 9 9 8 m eh p g f ct e s ts h o w st h ep “t ) ，i s9 9 7 1 a n dm pi s1 6 2 l 【d a a l lt l l e s ep a r 锄e t e r s m e e tt h em e d i c a jp u r el e v e l ，i n d i c a t i n gt h a tt l l eo b t a i n e dp s ac 锄b eu s e df o rp o l y s i a l y l a t i o n 1 1 1 i sr e s e a r c hu s e dc u z n - s u p e r o x i d ed i s m u t 勰e ( c u z n - s o d ) 嬲t l l et a r g e tp r o t e i nf o r p o l y s i a l y l a t i o n s d s p a g e e l e c 仃0 p h o r e s i s r e v e a l e d 吐哦也ec u z n - s o dw 弱 e l e c 仃o p h o r e t i c a j l yp u r e ，谢t l lm o l e c u l 盯w e i g h to f3 2 l ( d aa n dr e s i d u a le n z y m ea c t i v 时o f 17 6 10 4n u m gp r o t e i n b yu s i n gp s a 私c r o s s l i n l ( i n ga g e n t 锄dc u z n - s o d 嬲t l l et a 唱e tp r o t e i i l ，廿l i sr e s e a r c h h 嬲e s t a b l i s h e dac o n v e i l i e m 锄de f 矗c i e n tp o l y s i a l y l a t i o np r o c e s s t h ea c t i v a t e dp s aw 弱 c o u p l e dt 0 恤舶el y si 1 1m es 耐k eo fc u z n - s o du s i n gm em e m o do f _ n h 2c o v a l e n t c o u p l i n g ，t t l e nt l l em o d i f i e de n z y m ew 嬲i s o l a t e db yt o s o ht o y o p e 砌h w 5 5 fc o l u m n c l l 】的m a t o 鲫h y i no r d e rt 0 o p t i m i z ec r o s s l i i l l d i 培r a t i o 舡l d r e s i d u 面 a c t i v i 劬m e d o u b l e f - a c t o 璐b ( 3 e x p e 柚e 删m e t l l o dw 嬲狐e d 锄dt l l e0 p t i m a lc o n d i t i o 璐f o rm e m o d i 母洒gr e a c t i o nw e r e 鹊f o l l o w s ：p s a ：s o dm o l er a t i o so f4 0 ：l ，2 5 锄dp h7 4 nw 嬲 s i l 0 、nt l l a t3 8 6 士o 1 7p s am o l e c u l e sl i n k e dt 0p e rs o dm o l e c u l ei 1 1a v e r a g e ，埘t l l 廿豫 a v e r a g er e s i d u a la c t i v 埘o f7 7 8 士1 6 i i lt l l e s ec o n d i t i o 璐 s d s - p a g ee l e c 仃o p h o r e s i sr e v e a l e d 也a tt l l em o l e c u l a rw e i g h to fp o l y s i a j y l a t e ds o d w 弱i n c r e a s e d 丘o m3 2 k d at 09 0 lo o k d a a t o m i cf o r c e l i c r o s c o p y ( a f m ) s l l o w e dt h a t 也e a v e m g es i z eo ft l l ep o l y s i a j y l a t e ds o dw 弱10 l5 n m ，a b o u tf o u r f o l do fn a t i v ce n z ) ，m es i z e b e s i d e s ，a f ms h o w e dt w ol ( i n d so fm i c r o s c o p i cs p h e r i c a ls h a p e s ：c o a t e ds i i 唱l ep a n i c l eo r c o a t e dm u l t i p l ep a n i c l e s t n b sm e t h o dm e 舔u r e d 仕屺a v e r a g es u r f a c ea m i i l o m o d i f i e dm t e w 嬲2 4 4 ，孤l ds u n 】n i s e dt l l a tt h em o d i f i e ds i t e sw e 陀l y s ( 9 ，2 3 ，7 3 ，8 9 ，l51 ) b yt h e 觚a j y s i so f p r o t e i i lr e s i d u ea c c e s s i b i l i 够f u n h e re x p e f i m e n t s 砌i c a t e dt l l a tt l l es t l a b i l i 哆o fm o d i f i e d e n z y m ea g 细h e 鸸犹斌a l k a l ia n dp r o t e i n a 辩ss u c h 硒p e p s i i l 锄d 劬憎s i l lw 嬲i m p r 0 v e d s i 嘶矗咖t l y 弱c o m p a r e d t 0n a t i v ee n z y m e k e yw o r d s ：p o l y s i a h ca c i d ；c u z n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；m o d i 矗c a t i o n ；c o n f i g u i a t i o n c h a m c t e 此蕴t i o n ；e m 了m es t a b m 哆 i 目录 目录 摘要。j i a b s t r a c t i i 目勇匙i 第一章绪论1 1 1 聚唾液酸的概述1 1 1 ，1 聚唾液酸的结构1 1 1 2 聚唾液酸的理化性质2 1 1 3 聚唾液酸的生产纯化方法2 1 1 4 聚唾液酸用途与衍生化研究现状3 1 1 5 聚唾液酸修饰优点3 1 2 模型蛋白铜锌超氧化物歧化酶概述4 1 2 1 超氧化物歧化酶的理化特征4 1 2 2 铜锌超氧化物歧化酶的结构4 1 2 3 选择铜锌超氧化物歧化酶作为模型蛋白的原因5 1 3 课题来源5 1 4 本论文研究的目的和内容5 第二章实验材料与方法7 2 1 实验材料7 2 1 1 原料7 2 1 2 主要试剂7 2 1 3 层析材料8 2 1 4 主要仪器8 2 2 实验分析方法9 2 2 1 聚唾液酸含量测定9 2 2 2 聚唾液酸平均分子量分析9 2 2 3 蛋白质含量测定1 0 2 2 4 内毒素含量测定10 2 2 5 交联比的测定1 0 2 2 6s o d 酶活及酶活保留率的测定l o i i 目录 2 2 7 蛋白质羰基含量测定。1 1 2 2 8 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 1 1 2 2 9 原子力显微镜( a f m ) 1 l 2 2 1o 蛋白氨基修饰率测定l l 2 2 1 l 修饰酶稳定性研究1 2 第三章结果与讨论1 3 3 1 原料聚唾液酸纯化及聚唾液酸和c u z n - s o d 性质分析13 3 1 1 聚唾液酸的纯化。1 3 3 1 2 聚唾液酸的分子量分析1 4 3 1 - 3c u z n s o d 的s d s p a g e 分析15 3 1 4s o d 初酶活分析1 6 3 2聚唾液酸修饰c u z n s o d 的制备与优化1 6 3 2 1 聚唾液酸的活化1 6 3 2 2 活化聚唾液酸对c u z n - s o d 的修饰17 3 2 3 活化聚唾液酸修饰c u z n s o d 的条件优化：1 9 3 2 4 活化聚唾液酸修饰s o d 的工艺2 2 3 3聚唾液酸化铜锌超氧化物歧化酶修饰产物的鉴定分析2 3 3 3 1 修饰酶的s d s p a g e 电泳分析2 3 3 3 2 修饰酶的原子力显微镜分析2 4 3 3 3 修饰酶游离氨基修饰率测定和修饰位点预测2 5 3 3 4 修饰酶稳定性研究2 6 第四章主要结论与展望3 l 4 1 主要结论3 1 4 2 展望3l 致谢。3 3 参考文献3 5 附录3 9 第一章绪论 第一章绪论 随着医药生物技术的快速发展，蛋白质和多肽类药物占f d a 审批通过的新药比例 越来越高。但是，这些蛋白质和多肽类药物在常温下稳定性差，不易保存，摄入机体后， 易被体内酶降解，并且通常具有较强的免疫原性，导致其在机体内半衰期较短等缺陷， 这也成了众多蛋白质和多肽类药物广泛应用的瓶颈。目前，最常用的方法就是对蛋白质 分子进行化学修饰，如在蛋白分子上引入一些亲水性的大分子如聚乙二醇( p e g ) 、右 旋糖苷、白蛋白、明胶和淀粉等聚合物【l 】，来改变其结构和生理生化特性。其中p e g 化 ( p e g y l a t i o n ) 是目前化学修饰蛋白及多肽类药物的主流方法，并已获得美国f d a 批准 【2 】。通过p e g 修饰可以很大程度上提高蛋白质分子的结构稳定性，降低其在体内的免疫 原性和抗原性，延长其半衰期。但该方法最大的问题是p e g 修饰技术用的p e g 大分子 不可透过肾脏透析膜排出，降解缓慢，容易在体内( 膀胱中) 积累；来自体外系统的 p e g 大分子在人或动物体内缺乏相应的降解酶，不具有生物降解性；p e g 本身可能形成 新的免疫原，因此尚难评估积累该物质对机体的长期效应【3 1 。除此，活化p e g 极易水解， 在制备过程中只能存在约o 5 h ，制备价格极其昂贵，制备工艺中用到的大量有机试剂也 对生物安全性造成隐患。因此急需发现一种来自生物体内，天然安全的可替代p e g 修 饰蛋白和多肽类药物的生物缓释材料。在这样的大背景下，科研工作者发现了聚唾液酸 ( p o l y s i “ca c i d ，p s a ) 的广阔应用价值。 1 1 聚唾液酸的概述 聚唾液酸( p o l y s i a l i ca c i d ，p s a ) 是一种来自生物细胞表面糖蛋白和糖脂糖链末端的 天然多糖高聚物【4 1 ，具有链蛋白酶抗性【5 1 。1 9 5 7 年b a n 了和g o e b e l 【6 】首先在西c 办p ，砌蛔c d ，f k 2 3 5 和k 1 中发现该聚合物，以后陆续在心触p 厂肠m 加f 删f 砌sb ，勋砌d ”p 砌幻“c 阳0 4 8 ， c f 护d 6 口c 胞，痧p “甩讲f0 5 中发现该物质【4 1 。近年来，随着对聚唾液酸理化性质、生理功能、 合成与代谢等研究的深入，聚唾液酸在医学等领域的应用越来越广泛。 聚唾液酸的降解产物一唾液酸( s i a j i c a c i d ，s a ) 是一类神经氨酸的衍生物【7 j 。由 于唾液酸是动物细胞表面糖蛋白和糖脂的末端寡糖，在细胞粘附和信号识别等生物过程 中起重要作用，可干扰细胞识别和掩蔽其它分子，因此含聚唾液酸或者唾液酸的物质进 入机体则表现非免疫原性【8 】。 1 1 1 聚唾液酸的结构 聚唾液酸由唾液酸( n 乙酰神经氨酸) 单体以q 2 ，8 和或仅2 ，9 糖苷键连接起来的 同聚壬酮糖。也可以看成酸性氨基糖，呈高度线性聚合物【9 l ，分子量在1 0 6 0k d a 【1 0 1 。 聚唾液酸主要有三种结构【】，如图1 1 所示，其中伍2 ，8 糖苷键连接的聚唾液酸末端相 邻的两个单体形成内酯( 甲单体的羧基和乙单体的9 号碳位上的羟基脱水缩合形成) ， 对聚唾液酸的稳定起到一定的作用，所以大多数的聚唾液酸以a 2 ，8 连接的形式存在【1 2 l 。 江南大学硕士学位论文 同时人体中只有n 2 ，8 连接的聚唾液酸，所以只有a 2 ，8 连接的聚唾液酸可应用于蛋白 质或多肽的修饰【13 1 。 图l l 聚唾液酸的三种结构 f i g 1 1t h r s 仃u c t i l r so f p o l y s i a i i ca c i d 1 1 2 聚唾液酸的理化性质 聚唾液酸为白色粉末的不定型高聚物，在酸或碱中不稳定，容易降解。聚唾液酸 p k a 2 6 ，在中性溶液中表面呈强电负性，低黏度，具有很强的水化能力，良好的生物降 解性和天然的生物相容性【l l 1 4 1 。 1 1 3 聚唾液酸的生产纯化方法 微生物发酵法是生化反应过程，是目前的主导方法，该方法生产的聚唾液酸结构稳 定，成本低，医用附加值巨大。聚唾液酸以荚膜的形式存在于少数几种细菌细胞表面， 液体培养时，它以粘液的形式释放到发酵液中。c 幽掣1 5 】于1 9 9 0 年采用e 觥k 9 2 发酵产聚唾液酸的产量为o 4 5g l 。洲g u e z a p 撕c i o 等【1 6 j 于1 9 8 8 年采用e ，fk 2 3 5 发酵产聚唾液酸的产量为1 3 5g l 。b a s t i 觚等【1 7 】于2 0 0 8 年采用大肠杆菌k 1 分批补料 发酵产聚唾液酸，产量为1 6g l 。k 印f e 等【墙】于2 0 0 8 年通过溶氧反馈发酵产聚唾液酸 2 第一苹绪论 的产量为3 l 。郭良栋等【1 9 】利用ec d ，fc 8 发酵产聚唾液酸的产量为1 2 l 。目前德国 莱布尼兹大学，已完成1 0l 规模发酵和克级水平的提取。印度血清研究所，达到了3 0l 规模医药级聚唾液酸的制备。 本实验室对聚唾液酸的发酵生产及提取研究处于绝对的领先地位，有十多年的经验 积累。詹晓北等【2 0 1 从1 9 9 9 年开始采用e ，fc c t c cm 2 0 8 0 8 8 发酵产聚唾液酸，研究了 p h 控制工艺、分批补料工艺和分阶段控制搅拌转速工艺，产量达到5g l 。同时，本实 验室詹晓北、李文强等【2 l 】先后研究了超滤乙醇沉淀、s e v a g e 、乙醇分部沉淀方法提取 聚唾液酸，郁丹风等【2 2 】在乙醇沉淀过滤和碱性过滤结合的基础上，根据氯代十六烷基吡 啶( c p c ) 与聚唾液酸的特异性络合对聚唾液酸进行进一步分离纯化，纯度达9 0 左右。 本研究室目前已与浙江长兴制药有限公司合作，完成5 0 0l 的中试发酵生产。这些为p s a 修饰蛋白质打下了坚实的基础，因用于药物缓释材料，有必要先制备高纯度聚唾液酸。 1 1 4 聚唾液酸用途与衍生化研究现状 聚唾液酸是一类有价值的新型药物前体物质【2 3 ，2 4 1 ，是目前发现的能够替代聚乙二醇 的最好的天然可降解缓释材料【3 2 5 1 。聚唾液酸修饰又称为聚唾液酸化，是在生物活性分 子表面通过化学交联的形式共价连接上聚唾液酸。目前全球对于聚唾液酸缓释应用的研 究尚处于起步阶段。伦敦大学的g r e g o r i a d i s 研究小组以聚唾液酸为糖链供体，成功地将 聚唾液酸分子连接到天冬氨酰酶、干扰素、胰岛素和人红细胞生长素等1 2 6 2 7 】蛋白质分 子上。研究结果表明聚唾液酸糖基化修饰后的蛋白质分子，在血液中的半衰期大幅提高， 免疫原性和抗体性降低，抗蛋白酶酶解的能力增强。并临床试验了聚唾液酸化干扰素， 发现其效果比p e g 化的干扰素的半衰期更长。该研究小组成立l i p o x e n 公司，最近， 该公司与印度血清研究所( s e n 蛐i n s t i t u t eo fi n d i al t d l ) 合作生产聚唾液酸，并且获得 5 5 0 万美元的风险资金用于开发治疗糖尿病、肺炎球菌感染和丙肝药物的聚唾液酸控释 药物。聚唾液酸应用于蛋白质和多肽类药物的可降解缓释剂已取得良好效果，此类药物 即将上市，争夺全球约8 0 0 亿美元的市场份额。 1 1 5 聚唾液酸修饰优点 聚唾液酸用于修饰的优点可通过与聚乙二醇修饰的对比得出，见表1 1 。 表1 1 聚唾液酸修饰与聚乙二醇修饰的对比 t a b l el 一1c o m p a r i s o no f m o d i n c a t i o nw i t hp o l y s i a l i ca c i da n dp o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚唾液酸修饰 聚乙二醇修饰 3 江南人学硕士学位论文 1 2 模型蛋白铜锌超氧化物歧化酶概述 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是一类能够催化超氧阴离子发生歧 化反应的金属酶。它可用于治疗由氧自由基引起的一系列疾病，如：关节炎、类风湿关 节炎、缺血再灌流综合症等，此外其在抗辐射、抗肿瘤、预防衰老和自身免疫治疗等方 面也发挥着重要作用【2 引。 1 2 1超氧化物歧化酶的理化特征 根据活性中心结合的金属离子不同，s o d 主要分为三类【2 9 】，见表1 2 。其中，铜锌 超氧化物歧化酶( c u z n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，c l 亿n s o d ) 具有最深入的研究，结构明 确，应用广泛，来源丰富，故本研究选用猪血c u z n s o d 作为研究对象。 表1 2 三类主要s o d 的理化特征 t a b l e1 2p h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t h r e em a j o rs o d 1 2 2铜锌超氧化物歧化酶的结构 1 9 7 5 年，b e n o v 等【3 0 j 用o 2 衄射线衍射晶体结构分析得到c u z n s o d 的三维结构， 它是由两个相似的亚基通过非共价键的疏水相互作用和静电相互作用缔合成的二聚体， 每个亚基分子量为1 6 l ( d ，各含一个c u ( i i ) 和一个z n ( i i ) 。1 9 8 2 年，t a i n 盯等【3 1 】获得 了牛红细胞c u 2 血s o d 的o 2 m n 分辨率电子密度图，显示出其结构核心是一个由八股 反平行的p 折叠围成的圆筒状结构，整个结构中p 结构占4 1 5 ，a 螺旋仅占3 o ， 其余无序结构占5 1 9 。 c u z n s o d 的活性中心是以c u ( h ) 和z n ( i i ) 为双中心的二桥结构f 3 2 3 3 1 ，如图1 2 。 c u ( i i ) 与h i s 4 4 ，h i s 4 6 ，h i s 6 1 和h i s l l 8 咪唑环上的n 原子配位，形成畸变的平面四方 形结构，其轴向位置上还结合着一个水分子，与酶活催化有关；z n ( ) 则与h i s 6 1 ，h i s 6 9 ， h i s 7 8 和a s p 8 l 配位形成变形的四面体结构，一方面调节咪唑基与c u ( i i ) 之间的相互作 用，另一方面起稳定活性中心结构的作用。s o d 活性中心的精氨酸和组氨酸对s o d 的 催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近，而且均带有正电 荷，能诱导底物0 2 。进入活性中心，并可在催化过程中提供旷以加快歧化反应速度，如 这两个氨基酸残基被破坏或修饰，s o d 将会失活。肽链内部由c y s 5 5 和c y s l 4 4 的巯基 构成的唯一一对二硫桥，对亚基缔合起重要作用瞰】。 4 第一章绪论 图l - 2c u z n s o d 的晶体结构 f i g 1 2t h ed i m e n s i o n a lc 口s t a ls 咖c t u 陀o fc u z n - s o d 由此可见，位于s o d 活性部位的h i s 、a s p 和觚多位于分子内部，被多个d 折 叠围成的圆筒状结构所保护，不适合被修饰。c y s 形成的巯基对维持c u 2 r n s o d 的稳定 性起着重要作用，故不易采用s h 连接的修饰方法。而s o d 表面共有2 0 个可被修饰的 赖氨酸，所以本研究选用n h 2 连接的方式对s o d 表面的游离氨基进行修饰。 1 2 3 选择铜锌超氧化物歧化酶作为模型蛋白的原因 1 功能强大，可用于清除氧自由基，在化妆品，食品，医学上用于炎症，肿瘤，抗 衰老，休克，氧中毒，辐射损伤掣1 】： 2 存在半衰期短，只有6 8 m i n ，口服易被胃蛋白酶水解失活，体内注射易被血浆蛋 白水解酶降解，分子量大不易透过细胞膜，异源蛋白免疫原性等缺陷急待克服【3 5 j ： 3 c u z n s o d 来源丰富，研究较多，实验方法可行，经结构研究，表面具有多个可 修饰位点，同时在化学修饰时，酶构象结构稳定【3 6 1 。 1 3 课题来源 本课题是江南大学自主科研计划项目基金( 2 0 0 9 l y y l 4 ) 的资助项目和国家8 6 3 计划项目( 2 0 0 6 a a 0 2 2 2 0 7 ) 的重要组成部分。 1 4 本论文研究的目的和内容 为了解决s o d 在医学应用上的缺陷，本研究拟采用聚唾液酸修饰的方法来改变其 表面形态，提高稳定性。通过考察聚唾液酸修饰条件对交联比和酶活保留率的影响，期 望建立一种聚唾液酸修饰蛋白质赖氨酸的方法并对修饰酶进行一系列表征，对其它蛋白 质和多肽类药物的聚唾液酸化亦有很大的参考价值，为蛋白质类新药的开发提供新的理 论指导和技术支持。另外，这种基于体外聚唾液酸化的研究方法，为进一步揭示糖基化 修饰规律提供了新的思路。 本论文的具体研究内容主要分为以下几个部分： 5 江南大学硕士学位论文 1 在原有聚唾液酸发酵和聚唾液酸粗品提纯工艺的基础上，进一步延伸了聚唾液酸 的纯化工艺，以降低样品中蛋白质和内毒素的含量。对纯化聚唾液酸进行纯度、 分子量和分布宽度分析，对模型蛋白c u z n s o d 进行初步的纯度、分子量和酶活 力测定。 2 对特定分子量的高纯度聚唾液酸进行活化处理，得到活化聚唾液酸，用于 c u z n s o d 的修饰。建立聚唾液酸修饰c 皿1 s o d 合成及纯化方法。考察交联比 和酶活保留率两指标，对聚唾液酸修饰反应条件( 反应温度、反应p h 和p s a 与 s o d 用量摩尔比) 进行优化。 3 对聚唾液酸修饰的c u z n s o d 进行一系列表征。用s d s p a g e 电泳、原子力显微 镜( a f m ) 表征修饰酶的分子量、分子微观粒径和显微形态，并在此基础上分析 修饰酶的交联比和连接方式。用t n b s 法测定修饰酶表面游离氨基修饰率，结合 蛋白残基可及性分析，预测修饰位点。从酸碱稳定性、热稳定性和抗酶解稳定性 三方面比较c u z n s o d 聚唾液酸化前后的酶活稳定性变化。 6 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 原料 1 聚唾液酸用微生物发酵法【2 0 】制备，所用菌种为大肠杆菌西c 办p ，砌蛔c d ，fc c t c c m 2 0 8 0 8 8 ( 作者所在研究室选育3 7 ，3 引) 。 2 铜锌超氧化物歧化酶由浙江康基生物公司提供，猪血提取物，分子量3 2 l a 。 2 1 2 主要试剂 试剂名称英文名称纯度级别购买公司 高碘酸钠 氰基硼氢化钠 乙二醇 聚乙二醇2 万 碳酸铵 十二水磷酸氢二钠 二水磷酸二氢钠 氯化钠 一水柠檬酸 硼砂 氢氧化钠 间苯二酚 盐酸 正丁醇 唾液酸标准品 丁酸丁酯 s o d 酶活试剂盒 2 ，4 ，6 三硝基 苯磺酸 胃蛋白酶 胰蛋白酶 酒精 珍珠岩 n a l 0 4 n a c n b h 3 e t l l y l e n eg l y c o l p e g ( n h 4 ) 2 c 0 3 n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 n a c l c 6 h 8 0 7 h 2 0 n a 2 8 4 0 7 10 h 2 0 n a o h h c l s a | | p e p s i n 哪p s i n | 9 5 0 ，分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 5 w ，v ，分析纯 3 0 0 0 u ，m g ，生化试剂 芝2 5 0 0 u m g ，生化试剂 工业级 工业级 国药化学试剂 f l u l ( a 试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 p f a n s t i e l l ll a bi n c 国药化学试剂 南京建成生物工程研究 所 s i 舯a 试剂 上海聚源生物科技有限 公司 国药化学试剂 江南大学试剂库 信阳崇真助滤剂公司 江南大学硕士学位论文 氯代十六烷基吡啶 牛血清蛋白 考马斯亮蓝g 2 5 0 考马斯亮蓝i 匕5 0 丙烯酰胺 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基磺酸钠 过硫酸铵 t e m e d 甘氨酸 溴酚蓝 p 巯基乙醇 甘油 标准蛋白 三氯乙酸 甲醇 冰醋酸 无水乙醇 鲎试剂 细菌内毒素 工作标准品 细菌内毒素 检查用水 c p c b a | | a c r s s d s a p | g l y c i n e | | m 破e r t c a c h 3 0 h h a c c h 3 c h 2 0 h | | | 化学纯 生化试剂 分析纯 优级纯，生化试剂 生化试剂 优级纯，生化试剂 生化试剂 生化试剂 9 9 ，生化试剂 优级纯 生化试剂 分析纯 生化试剂 生化试剂 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 上海青浦试剂厂 国药化学试剂 国药化学试剂 北京索莱宝 北京索莱宝 s i 舯a 公司 北京索莱宝 北京索莱宝 北京索莱宝 北京索莱宝 北京索莱宝 北京索莱宝 国药化学试剂 上海生工 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 国药化学试剂 湛江安度斯生物公司 湛江安度斯生物公司 湛江安度斯生物公司 2 1 3 层析材料 2 1 4 主要仪器 仪器名称型号生产厂家 电子分析天平 不锈钢抽真空漏斗 a l 2 0 4 s a r t o r i u sa g 8 梅特勒托利多仪器公司 德国g e o n i n g e n 公司 第二章实验材料与方法 离心超滤管 透析袋 a k t a 分离纯化系统 金达分离纯化系统 数显恒温磁力搅拌器 摇床 旋涡混合器 数显酸度计 分光光度计 数显电导率仪 数显超级恒温槽 真空泵 蛋白电泳仪 稳流恒压电泳仪 凝胶成像系统 高效液相过滤色谱 冷冻干燥机1 2 l a f m 原子力显微镜 冷冻高速离心机 电热鼓风干燥箱 1 0 0k d a 7k d a 4 4 m m e x p l o r e r l o o p p s 1 8 5 2 型 s h p h - 6 型 x w 8 0 a p h s 3 c 型 7 2 2 型 d d s 3 0 7 s c 2 5 s h z d i i i 型 s c z y 2 + d y y 8 b g e ld o c2 0 0 0 w a t e r s6 0 0 7 9 6 0 0 3 21 9 5 泵 d i m e n s i o n 3 1 0 0 3 k 1 5 型 d h g 9 1 4 5 a 美国m i l l i p o r e 公司 q e e nb i r d 进口分装 美国g eh e a l t hc a r e 上海金达生化 金坛市大地自动化仪器厂 上海国强生化 上海精科实业公司 中国杭州雷磁分析仪器厂 上海精密科学仪器公司 上海精密科学仪器公司 宁波新芝生物科技公司 浙江黄岩求精真空泵厂 北京君意东方 南京大学陶尿大字 美国b i o r a d 美国w a t e r s 美国l a b c o n c o 加拿大v e e c o 美国s i 鲫a 公司 上海一恒科学仪器公司 2 2 实验分析方法 2 2 1 聚唾液酸含量测定 间苯二酚法【3 9 1 。 r 试剂配制：称间苯二酚2 0 0m g 用1 0m l 去离子水溶解，然后加入o 1m o 儿的 c u s 0 4o 2 5m l 和浓盐酸8 0m l ，用水定容至1 0 0m l 。 有机溶剂配制：用丁酸丁酯和正丁醇以8 5 ：1 5 的体积比配制。 测定方法：取适量待测液于具塞比色管中，用去离子水稀释至2m l ，然后加2 om l r 试剂，混匀后沸水煮1 5m i n ，冷却至室温后加4 om l 有机溶剂，剧烈振荡后静置至 分层完全，用吸管吸取上层有机相置于比色皿中，空白作为对照，在5 8 01 1 i t l 处测定 吸光值。 2 2 2 聚唾液酸平均分子量分析 9 江南大学硕士学位论文 高效液相凝胶过滤色谱法( h p g f c ) 。 样品处理：样品用流动相溶解，o 2 2 岬膜过滤。 色谱条件：色谱柱u l n 曲y d r o g e l 俐l i n e a r3 0 0 m m 7 8 舢【i l i d 2 ；示差检测器， 流动相为0 1m o 儿n a n 0 3 ，流速为0 9m 蜘：l i i l ；柱温为4 5 。 2 2 3 蛋白质含量测定 考马斯亮蓝法1 4 0 1 。 2 2 4 内毒素含量测定 凝胶法【4 l 】。 2 2 5 交联比的测定 交联比：指修饰酶中交联聚唾液酸与s o d 的摩尔之比，即平均每个s o d 分子交 联上的聚唾液酸分子数。 测定方法：收集分离纯化后的修饰酶，冷冻干燥复溶后，测定其中聚唾液酸含量