（发酵工程专业论文）黄原胶寡糖生物活性的研究.pdf

摘要 摘要 本实验利用新分离细菌c e l l u l o m o n a s s p x t l l 的胞外酶对黄原胶进行降解，得到不 同聚合度的寡糖样品，以粘度还原末端标记对不同的寡糖样品进行了区分，对这些寡糖 样品进行生物活性的检测。 采用f e n t o n 反应体系检测寡糖清除羟基自由基的活性，检测结果发现酶解黄原胶 所得的不同聚合度的黄原胶寡糖具有清除羟基自由基的活性，并且不同的寡糖样品清除 羟基自由基的能力各不相同。 采用抑菌圈法对降解黄原胶所得的各种寡糖样品进行了抑制有害病原菌的活性检 测，包括野油菜黄单孢菌、大肠杆菌和金黄色葡莓球菌。检钡4 结果表明：野油菜黄单孢 菌出现了踢显的抑菌圈，而对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无抑制作用。 寡聚糖可作为激发子诱导植物产生抗性反应，提高防御酶活力，积累植保素，从而 增强自身抵抗力。并在大豆子叶上接种野油菜黄单孢菌性，结果说明黄原胶寡糖能激活 大豆子叶的防卫系统以抵御病原菌的侵染，并保证植物的在相对稳定的生理环境下生 长。 关键词：黄原胶寡糖自由基野油菜黄单孢菌大豆子叶 a b s t r a c t a b s t r a c t x a n t h - o l i g o s a c c h a r i d ew i md i f f e r e n td e g r e eo fp o l y m e rw a so b t a i n e db ye n z y m a t i c a l l y d e g r a d i n gx a n t h a nf r o mc e l l l u l o m o n a ss p 搬1 1 t h eb i o a c t i v i t yo f w h i c hw a sd e t e r m i n e d t h ea c t i v i t yc l e a r i n gt h eh y d r o x y lr a d i c a l sw a se x a m i n e dw i t lf e n t o ns y s t e m t h er e s u l t s s h o w e dt h a tx a n t h o l i g o s a c c h a r i d ec o u l dc l e a rt h eh y d r o x y lr a d i c a l sa n ds u c ha c t i v i t yi s r e l a t e dw i t ht h ed e g r e eo f p o l y m e ra n dt h er a d i oo fv i s c o s i t ya n dr e d u c i n gs u g a re n d 。t h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fx a n t h o l i g o s a c c h a r i d ew a sa l s ob e e nd e t e r m i n e dw i t hm e t h o d so f s p r e a da n dt u r b i d ，i n d i c a t e dt h a tt h ex a n t h - o l i g o s a c c h a r i d ec o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho f x a n t h o m o n a s c a m p e t r i s b u tn o ti n h i b i tec o l ia n d s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s x a n t h - o l i g o s a c c h a r i d ew a sa p p l i e d0 1 1s o y b e a nc o t y l e d o nt oe n h a n c et h ea c t i v i t yo f d e f e n s ee n z y m ea n dc o n t r o ls o y b e a nc o t y l e d o np l a n tp a t h o g e n i cb a c t e r i a ld i s e a s e s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tx a n t h o l i g o s a c c h a r i d ec o u l db eu s e dt oi m p r o v et h er e s i s t a n c eo f p l a n t sb e c a u s ei th a dt h es a m ef u n c t i o no fb a c t e r i a lb yi n d u c i n gt h ep r o d u c t i o no fp ai n p l a n t k e y w o r d ：x a n t h 0 li g o s a c c h ar i d e 。h y dr o x y ir a d i c a i x a n t h o m o n a sc a m p e t r i s s o y b e a nc o t y ie d o n 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：查匾监鎏瘟蚴盐监盔面建 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保 第一章绪论 1 1 黄原胶 第一章绪论 在开发“有用的微生物”的研究中j e a n e s 等人发现野油菜黄单孢杆菌_ j = c a m p e s t r i s n r r l b - - 1 4 5 9 可使淀粉转化为水溶性多糖黄原胶【l 】。此后又发现了锦葵黄单孢杆菌、胡 萝p 黄单孢杆菌、菜豆黄单孢菌、木薯萎蔫病黄孢菌、美人蕉枯叶黄单孢杆菌等都产黄 原胶。美国经过多年毒理学实验在1 9 6 9 年食品与药物管理局( f d a ) 批准黄原胶作食 品添加剂。其后，丹麦、英国、爱尔兰、荷兰、西班牙和加拿大等国对黄原胶用于食品 也给予了法律认可。 我国黄原胶研究起步于2 0 世纪6 0 年代末。1 9 8 5 年南开大学生物系率先在国内研究 食品级黄原胶，并于1 9 8 6 年通过了食品级黄原胶产品和生产菌株的毒理学安全性试验。 经国家有关部门病理学试验与毒性试验后，1 9 8 8 年8 月卫生部批准了食品级黄原胶的卫 生标准，并被列入食品添加剂名单。 一、黄原胶的结构 黄原胶( x a n t h a ng u m ) 又称汉生胶，是由野油菜单胞菌( x a n t h o m o n a sc a mp e s t r i s ) 以 淀粉为原料发酵生产的具有诸多优良特性的胞外多糖 2 1 ，黄原胶结构如下图所示： 0。 第一章绪论 其分子量为2 1 0 6 。黄原胶以纤维素链结构为碳骨架，其分子的基本构成为d 葡萄糖、 d ，甘露糖、d 一葡萄糖醛酸、乙酸及丙酮酸【3 】，其中前三者的比率接近3 ：3 ：2 【4 】，本身 带有负电荷，是阴离子型聚电解质。 二、黄原胶的生产现状 目前，已有1 0 多个国家和地区生产黄原胶，但能够大规模生产黄原胶的只有美国、 法国、奥地利和日本。黄原胶工业化生产技术日趋完善，尤其是生物技术的发展使黄原 胶的发酵产率，糖转化率，发酵液胶浓度等指标大幅度提高，发酵周期缩短。黄原胶生产 最高水平已达到5 0 m 3 单罐发酵，年产量2 0 0 - - 2 4 0 吨；淀粉投料质量分数由4 一5 提高 到8 一9 。1 9 7 9 年全世界黄原胶产量为1 8 万吨，1 9 9 0 年世界黄原胶产量超过5 万吨， 1 9 9 6 年世界黄原胶产量超过6 万吨，2 0 0 0 年达到1 0 万吨。 国内前期试产黄原胶的几家工厂由于发酵设备，主要是溶氧问题和后提取工艺的问 题，都没能形成规模生产。1 9 9 2 年，全国产量尚不足1 0 0 吨，1 9 9 3 年以后，由于国内需 求不断扩大，黄原胶价格持续上扬。一些科研、生产单位联手合作加强对生产工艺及设 备的攻关，生产技术有所突破。1 9 9 8 年，全国黄原胶产量在1 5 0 0 吨左右。至i 2 0 0 0 年底， 我国已有十多家黄原胶生产企业，但其中很多因多种原因难以达到设计时的产量。此后， 随着山东省食品发酵工业设计研究院在黄原胶生产技术上的突破，山东省成为我国黄原 胶的主要的生产基地，其中淄博中轩集团生产能力已达1 万吨年。至t j 2 0 0 3 年，国内黄原 胶总生产能力约为2 万吨年。 三、提高黄原胶产率的研究 在黄原胶生产中，发酵培养基是决定生产成功与否的重要因素之一，它不仅严重影 响黄原胶的产量，而且还可影响产物的质量和性能，因此选择适合工业生产的发酵培养 基尤其重要。通过姚仕义等的试验1 6 发现，采用x c c n a u 2 9 2 菌生产黄原胶的工业发 酵培养基成份是：蔗糖、玉米淀粉、酵母浸粉、鱼粉、c a c 0 3 、m g s 0 4 、k 2 h p 0 4 ，适宜 的c n 比为：蔗糖( 玉米淀粉) 酵母浸粉= 6 0 0 1 0 0 ，蔗糖( 玉米淀粉) 鱼粉= 6 0 0 1 0 0 。其 中氮源用量减少，不仅降低了生产成本，同时也改善发酵液了的颜色，进而改善产品色 泽的目的。高碳氮比的培养基对黄单胞杆菌的生长发育还起了明显的促进作用。常春i 7 1 等证明了发酵液粘度即产胶率的影响因素由大到小依次为：无机盐 氮源 有机酸 碳源； 并通过进一步试验验证，得到了较佳的发酵培养基配方：淀粉2 ，蔗糖2 ，蛋白胨0 1 3 ， 豆饼粉0 1 2 ，c a c 0 3 0 1 3 ，柠檬酸0 11 。 除了选择合适的培养基，还可通过其他的方法来提高黄原胶的产量，如菌种诱变和 第一章绪论 改善工艺条件等。姚仕义等【8 j 用甘蓝黑腐黄单胞菌x c c n a u 1 经硫酸乙二脂d e s 和氯化 锂l i c l 复合诱变所得的高产黄原胶菌株。近几年有研究表明1 9 j 在黄单胞菌发酵过程中将 温度从2 7 增加到3 2 的变温发酵对细胞生长和黄原胶生产都有利；薛雄志等0 】发现斯 达油脂酵母u 9 0 1 8 胞外多糖对黄原胶有明显的增粘作用。 工业发酵中，提高黄原胶的产量，克服发酵中胶体形成后对菌体代谢的抑止，减少 发酵液因粘度增加而产生的溶氧不足等问题，一直是黄原胶生产工业中专家关注的问 题。为了提高黄原胶产量和避免因粘度增加导致溶氧不足等问题，国外黄原胶生产有的 亿采用双液相发酵或连续发酵等方法。我国目前仍采用传统的阳j 歇发酵方式，由于连续 发酵中的操作条件、设备水准要求都较高，国内尚难在生产中应用。 四、黄原胶陛质 黄原胶是一种类白色或浅米黄色的可流动的粉末，是目前国际上集增稠、悬浮、乳 化、稳定于一体胜能最优越的生物胶。黄原胶无味、无臭、无毒、食用安全，易溶于水， 具有独特的理化性质。具体表现为l ：( 1 ) 其水溶液属于高粘度的非牛顿型流体，在极 宽的剪切率和浓度范围内保持极高的假塑性；( 2 ) 在热水和冷水中有良好的溶解性；( 3 ) 有良好的增粘性和悬浮能力，在低浓度下具有较高的粘度；( 4 ) 有很高的稳定性，耐酸碱、 高盐环境，抗高温、低温冷冻，抗生物酶解，抗污染能力强：( 5 ) 可同多种物质( 酸、碱、 盐、表面活性剂、生物胶等) 互配，具有满意的兼容性；( 6 ) 有良好的分散作用、乳化稳 定作用。 1 2 寡糖 一、寡糖的定义及分类 寡糖又称寡聚糖或低聚糖，是指2 1 0 个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的一类 糖1 2 1 。构成寡糖的单糖结构单元一般为五碳糖和六碳糖，主要包括葡萄糖、果糖、半乳 糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖等。目前已确认的寡糖在1 0 0 0 种以上。依据构成寡糖的单 糖种类又可将寡糖分为同源性寡糖( 由间一种单糖相互连接而成的寡糖) 、异源性寡糖( 由 两种或两种以上单糖构成的寡糖) 及寡塘的衍生物( 结构单位中的某些基团被修饰后的寡 糖1 。根据寡糖的功能性可分为普通寡糖和功能性寡糖。普通寡糖如蔗糖、麦芽糖、乳 糖、麦芽三糖等，可以被动物直接消化吸收；功能性寡糖如乳果糖、寡果糖、异麦芽糖、 半乳糖基寡糖等，不能被动物体消化吸收，但却为双歧杆菌等肠道有益菌增殖的因子。 第一章绪论 二、寡糖的生产 生产寡糖的方法有很多，可以从天然产物中分离，但由于其含量很低，而且无色、 不带电荷，因此提取十分困难f ”】。目前适用于此法生产的寡糖主要有棉子糖、大豆寡糖 和黑曲霉寡糖等。 利用酶催化多糖水解制备寡糖是一种经济实用的方法。随着生物技术和酶工程技术 的发展，用酶法水解或酶法合成来生产各种寡糖，不仅成为可能，而且生产成本将大幅 度下降，利于在食品工业、饲料工业等行业应用推广。 此外，还有天然多糖酸水解法，但产物复杂，生产率低，不易得到高活性寡糖，而 未实际应用推广。 三、寡糖的生产现状 寡糖生产起步于日本，自2 0 世纪7 0 年代开始研究开发，8 0 年代批量生产异麦芽寡 糖及果寡糖，到9 0 年代已开发出7 0 余种功能性寡糖，产值近3 亿美元。1 9 9 5 年在日本 政府批准的3 5 种保健食品中，添加寡糖的就有1 7 种。到了1 9 9 6 年，在6 9 种保健食品 中则有4 0 种以寡糖为主要成分。在最近十多年里，对寡糖产品的开发研究已转向工艺 改进、降低成本、精炼产品和开发新功能等方面。 除日本外，韩国( 三星集团果寡糖) 、我国台湾省( 幸诚贸易公司分支寡糖) 、法国 0 3 e g h i n s a y 制药厂果寡糖) 、比利时( o r a f t i 公司菊粉寡糖) 、荷兰e r c a l o 公司半乳寡 糖) 、美国( 威斯敏斯特金技术公司果寡糖) 、德国、意大利等园均有工业化生产的寡糖厂 家f 1 4 1 。 国内从2 0 世纪8 0 年代开始研制功能性寡糖，但真正从事寡糖生产的企业还非常有 限。1 9 9 5 年无锡开始异麦芽寡糖的工业化生产，1 9 9 9 年产量达8 0 0 0 - - - 1 0 0 0 0 吨。国内市 场已出现了少量添加寡糖的食品，以乳酸饮料和奶粉为主。饲料行业近年来出现了数个 产品，以异麦芽寡糖、果寡糖为主。一些功能显著、市场前景好、附加值高的寡糖产品 的开发则处于相对滞后的地位。 1 3 寡糖的生物活性 目前，对寡糖生理活性的研究方兴未艾。寡糖具有多种生理活性功能，如提高机体 免疫力，抗真菌活性和抑制细菌活性等等，具体说来有如下几个方面。 一、寡糖对微生物生长的影响 4 第一章绪论 1 抑菌作用 寡糖抑菌作用目前研究较多的有壳寡糖、果寡糖和半乳糖苷寡糖等，尤其对壳寡糖 抑菌性的研究取得了突破性的进展 1 5 , 1 6 , 17 。j e o n 等以4 种革兰氏阴性细菌，5 种革兰氏 阳性细菌及4 种乳酸菌为实验菌种对壳寡糖迸行了抑菌实验发现除乳酸菌外壳寡糖对其 它九种细菌的生长均有不同程度抑制作用【l5 1 ，在c h r i s t a k o p o u l o s 和t e r a k u b o 的实验中也 得到了类似的结果f 1 6 】”，且寡聚糖的种类和聚合度决定抑菌的效果。 脂寡糖( l o s ) 是炎奈瑟氏菌的一种主要外膜抗原【1 8 】，奈瑟氏菌可引起b 型脑膜炎。 酸水解脱去其脂类获得的募糖( o s ) ，仍保留一定的抗原性但毒性比l o s 降低7 2 0 万5 0 万倍。寡糖对病原菌的抑制作用决定了它在医药领域的应用。此外，抗生素的广泛应用 导致了病原菌的抗药性，寡糖作为既有效又非抗生素类的代替品可以从根本上解决目前 的问题。 2 增殖肠道有益菌 目前已经证实寡糖可以增殖肠道有益菌，无论是体外微生物培养实验【19 j 还是动物体 内实验都取得了良好的研究效果。从目前已报道的双歧杆菌促生长因子研究结果分析 【2 0 】，寡糖是双歧因子中很重要的类，它能被双歧杆菌、乳酸菌等肠道有益菌利用，促 进双歧杆菌生长繁殖，降低肠道n h 值，抑制有害菌生长，调整微生物群落的分布。但 对于寡糖增殖有益菌机理的研究尚处于剐刚起步的阶段，h a n d o n t m l 等作了寡糖在乳酸菌 体内新陈代谢的研究，认为寡糖在乳酸菌代谢过程中依赖于a t p 的运输系统，是菌体 内少量酶的作用底物，生成的产物可促进菌体的生长。 3 抗病毒活性 寡糖有很强的抗病毒活性，对h i v 、h s v 都有抑制作用，单独的寡糖作用比较不明 显，当其侧链上含有疏水基团时作用较明显。盐藻低聚糖、卡拉胶低聚糖具有明显的抗 h i v 病毒，合成的磺酸化寡糖有很好的抗h i v 活性【2 0 】。对寡糖抗h v 构效关系的研究 发现，单糖数越多其抗h i v 活性越高，寡糖磺酸化程度越高活性也越高。 二、对植物的诱抗作用 寡糖作为植物外源诱导子的研究始于6 0 年代末。诱导子是植物抗病生理过程中诱 导植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应( 抗性反应或自我防御反应) 的因子1 2 2 j ，包 括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。1 9 7 6 年a y 0 2 3 j 等发现植物细胞壁上的寡糖 碎片能诱导大豆产生植保素( 指在植物防御系统内具有拮抗微生物作用的小分子物质， 第一章绪论 一般是次级代谢产物) 的合成，这是最早有关寡糖信号分子的报道。此后人们逐渐开始 关注寡糖作为植物免疫激活因子的基础研究。这类物质安全无毒无害，能激活防御反应 和调控植物生长，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成。寡糖在植物防卫反应 系统的激活作用在高等植物中普遍存在，能诱导植保索的合成与积累【2 ，如：寡半乳糖 醛酸可在大豆中诱导植保素累积 2 扪，寡半乳糖醛酸在高等植物中诱导植保素以抵抗真菌 和细菌病原的侵入【2 6 】；壳寡糖能够诱导悬浮的水稻细胞产生稻保卫素【2 7 】等。目前已发现 具有诱抗活性的寡糖包括寡聚葡萄糖、寡聚几丁质和寡聚脱乙酰壳多糖等【2 引。 寡聚糖在植物与病原体相互作用过程中诱导植物产生抗性反应，提高作物本身的抗 病能力，具体说来寡糖对植物的诱导作用主要表现在以下三方面。 1 对防卫反应的基因调控 目前对寡糖激发子引起的植物舫卫反应基因的调控研究较多，已经确定的寡糖激发 子诱导植物防卫反应中调控的基因包括：植保素和木质素合成的关键酶基因、富含羟脯 氨酸糖蛋白基因、几丁质酶基因及病程相关蛋白基因等，这些基因对激发子的应答迅速。 s i m p s o n 等【2 9 j 研究证实葡聚糖能诱导苯丙烷类代谢途径中苯丙氨酸解氨酶和香豆素辅酶 a 连接酶的m r n a 水平瞬时大量增加，这种现象表明增加的m r n a 中有部分是新合成的。 分子杂交试验证实，基因表达首先表现为m r n a 量升高，进而导致其模板活性升高和翻译 速度加快p 。 还有研究表明f 3 ”，寡聚糖激发子的活性在转录水平上也有所表现，主要表现为对蛋 白质可逆磷酸化作用的调节，即磷酸酯酶活性受抑制，蛋白激酶活性增强，如寡糖激发 子可诱导番茄悬浮细胞发生抗性反应，加入磷酸酯酶抑制剂产生的反应与激发子处理的 反应相似，而用蛋白酶抑制剂处理的反而表现为抑制抗性反应。蛋白磷酸化是在信号传 递中的早期发生的，这说明寡糖激发子对防卫反应的调控可能是通过信号物质调控蛋白 质的可逆磷酸化反应，而在转录水平上即己进行。 在内部调控方面，寡糖激发子引起的信号传导到防卫反应基因启动子的顺式因子和 反式因子的研究是近年来研究的一个热点。由于分子生物学手段的发展，从分离到的防 卫基因中，找到了许多激发子响应性顺式因子，在水稻、菜豆、拟南芥等的苯丙氨酸解 氨酶基因、葡聚糖酶基因、几丁质酶基因中都发现了激发子响应性顺式因子。这种正负 调节可能是防卫基因在时空表达中的交互作用，是转录调控的一种机制p “。 2 诱导病程相关蛋白 病程相关蛋白最早是在由烟草花叶病毒( t m v ) 诱发产生过敏反应的烟草叶片中检测 第一章绪论 到的，至今己在7 个科的3 0 多种植物中发现了病程相关蛋白【3 ”。近年来，人们对寡聚糖 在不同植物中诱导的病程相关蛋白与抗病性关系作了较为广泛的研究。研究表明：苯丙 氨酸解氨酶( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i al y a s e ，p a l ) 和过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) 等 酶类在植物的抗病反应中起着十分重要的作用p 4 1 。p a l 是酞类物质、植保素、木质素等 抗菌物质合成过程中的关键酶，可作为植物抗性的一个生理指标；p o d 在木质索合成和 酞类物质氧化过程中起重要作用。因此这些酶活性的提高对植物的抗病能力的增强是十 分有利的。v a n d e r 等f 3 卸用壳聚糖对小麦进行处理，发现处理组的幼苗叶片p a l 、p o d 活 性均高于未经壳聚糖处理的对照组。 外源施用壳聚糖或受病原菌攻击时，许多植物一病原菌作用系统中都可诱导产生大 量几丁质酶和b 1 , 3 葡聚糖酶i s 6 , s 7 1 ，但在高等植物中尚未发现这两种酶的底物且在植物 自身代谢中没有作用，因此推测其具有抗病菌的作用。g h a o u t h l 3 卅指出，在经壳聚糖处 理后的草莓果实中，几丁质酶活性的提高与其抗腐能力呈显著正相关；壳聚糖诱导的菜 豆几丁质酶和b 1 , 3 葡聚糖酶的活性的提高与其抗病性能有密切关系f 3 9 1 。 3 积累次级代谢产物 植物的苯丙烷类代谢途径是植物体内次生物质代谢的一条重要途径，寡聚糖处理可 诱导植物p a l 活性，从而激发苯丙烷类代谢，产生酚类和异黄酮类植保素以及木质索， 在植物抗病过程中起化学屏障和植物抗毒索的作用。在植物和病原菌的相互作用中，植 物细胞壁在感染病菌后积累植保素和木质化是植物抵抗感染反应的特性，为植物阻止病 原菌的侵染提供了有效的保护。早在1 9 8 0 就已有学者证实了施用0 0 9 的壳聚糖即可诱 导植物抗毒索的产生i 帅1 。目前的研究也表明1 4 1 1 ，在植物的病菌侵染点处，酚类物质会大 量积累，而酚类物质是木质素形成的前体，植物体内酚类物质增多，可使植物抗病能力 增强。同时壳寡糖处理植物后可诱导其在受病菌侵染点周围木质化，形成物理屏障，从 而阻止病菌的扩散。 寡糖的聚合度只有在一定范围内才具有激发子的活性，聚合度太小的寡糖不能诱导 植物产生防卫反应，而聚合度太大的寡糖又由于细胞壁的屏障作用无法与细胞膜接触， 一般来说具有活性的寡糖聚合度都在4 1 6 之间f 2 0 1 。植物受刺激后所发生的生理生化反 应包括可溶性碳水化合物和酚类物质含量增加、植物保卫素的产生、多种酶活性的变化 及病程相关蛋白的产生等【4 2 1 。防御酶激活过程中，诱导子与细胞膜的受体高度结合，原 生质膜上的离子通道改变，引起c a 2 + 、i - r 内流，k + 、c l 外流，同时迅速发生h 2 0 2 胞内 依赖c a 2 + 的蛋白质磷酸化作用 4 3 】，激活核内的防御基因，引起防御反应，诱导合成植保 7 第一章 绪论 素的酶以合成植保素，最后完成信号传递作用。 1 9 9 5 年y o s i l i h f f 0 1 2 7 对比研究了几种不同的寡糖及其它营养因子对植物生长的作 用，发现寡糖还具有促进植物生长发育的作用。国内已有中科院等机构( 2 0 0 2 ) 【2 0 l 在做 寡糖生物农药方面的研究并取得了可喜的进展，中科2 号、3 号、6 号寡糖生物农药已 开展示范实验，对真菌、细菌、病毒引起的植物病害防效率可达7 0 8 5 ，同时可增产 1 0 3 0 。 目前寡糖类植物诱抗剂的研究十分活跃，但从诱抗剂作用与植物到植物抗性反应的 发生，整个信号识别及传递过程还不清楚。b o l l e r 、e b e l 2 2 , 6 3 1 等作了关于信号识别方面的 研究，包括信号分子的活性位点结构的相关性分析、接受信号物质的特性、信号传递的 分析及响应信号分子的基因等。 三、寡糖对机体的免疫作用 1 寡糖的抗肿瘤作用的研究 1 9 8 5 年，s u z u k i 等【4 3 l 发现鼠静脉注射壳六糖也产生明显肿瘤抑制效果，但壳六糖无 直接杀伤肿瘤细胞作用。许多学者已证明一些具有免疫活性的细胞表面存在n 乙酰d 糖胺( g i c n a c ) 或d 一糖胺( g l c n ) 残基受体。因此认为g i n a c 或g l c n 残基和受体的结合可能 与抗肿瘤密切相关。接着，s u z u k i 等【4 4 】又证明壳六糖对m c t h a 瘤细胞也有明显抑制作 用。1 9 9 9 年，o u c h i 【4 5 】等研究发现3 个壳寡糖通过六亚甲基空间通道与5 氟尿啼啶( 5 - f u ) 共轭结合后，其抗肿瘤作用强于5 f u ；并通过皮下注射应用于m c t h a 纤维肉瘤或 m h l 3 4 肝细胞癌小鼠，发现产生对肿瘤的生长抑制作用，而且此复合物不引起急性中毒， 不引起体重的迅速下降。s h o r t 等1 4 叼于2 0 0 3 年发现壳寡糖有抑制鸟氨酸脱羧酶的活性，它 是多胺( 有强烈的致癌作用) 合成的关键酶，即壳寡糖能够抗癌。另外，目前国内也有 低分子多糖应用于肿瘤放疗患者检测其对免疫功能影响的报道。王中和等1 4 7 用低分子多 糖口服液对临床患者进行辅助治疗，结果发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，t 淋 巴细胞的数量显著上升，说明低分子多糖能调整机体免疫机能，减少放疗对患者免疫功 能的影响，有较好的抗肿瘤辅助疗效。这些免疫指标的研究再一次表明，其作用机理与 细胞免疫密切相关。综上所述，我们不难发现壳寡糖在作为一种抗肿瘤药物上的研究和 开发尚待进一步深入，但其前景却将是十分乐观的。 2 寡糖抗感染作用的研究 寡糖的抗感染作用目前已被许多学者实。s u z u k i l 4 4 1 发现提高了鼠腹腔渗出细胞的 活性氧生成和杀菌能力，由此认为这些寡糖可作为疫苗试剂而进行开发，尤其对那些幼 8 第一章绪论 畜，它们自身免疫系统尚不发达，一般的疫苗不能注射，而这些寡糖无抗原性，故很适 合。1 9 8 9 年，s u z u k i 等1 4 s 】又发现几丁六糖可以刺激t 淋巴细胞产生巨噬细胞激活因子 ( m a f ) ，从而促使巨噬细胞释放h 2 0 2 ，对l m o n o c y t o g e n e s 的生长产生抑制作用。当然， 直接使用几丁六糖也能激活巨噬细胞从而产生生长抑制作用，但联合应用效果更好。另 外，寡糖对绿浓杆菌的抗感染作用也有所报道f 4 9 1 。 四、对机体的其他功能 寡糖还有其它如预防蛀牙、降低血脂及促进矿物质吸收等十分重要的功能。大豆低 聚糖还有拮抗机体过氧化损伤及降脂作用。果寡糖( f r u e o o l i g o s a c c h a r i d e ) 饮用后钙、铁、 镁的吸收率有上升趋势。某些纯寡糖也有一定的副作用，如大豆低聚糖中的棉子三糖和 水苏四糖不能被胃和肠上段的消化酶消化，而被结肠中的细菌发酵产气，引起肠胃胀气， 被称为大豆胀气因子，是大豆的抗营养因子之一【4 ”。 从中药中提取出的寡糖有效成分有很多，其中地黄多糖，甘草及巴前苷戟天中的多 糖研究尤其引人瞩目。地黄低聚糖是从地黄多糖中进一步分离提取的有效成分p 。实验 研究证明地黄低聚糖可以使快速老化模型小鼠s a m p 8 的造血干细胞含量、造血祖细胞 含量、成年小鼠红系组细胞含量和幼年小鼠红系组细胞含量明显增多，并可使外周血中 降低的血细胞数明显增加【5 ”。由此提示地黄低聚糖可刺激s a m p 8 小鼠的造血干细胞、 主细胞的增殖分化。集落刺激活性实验显示地黄低聚糖可使小鼠体内的集落刺激因子产 生明显增多。小鼠骨髓组织学研究结果也进一步证实了地黄低聚糖可增强s a m p s 小鼠 造血功能的作用。上述这些实验结果揭示地黄低聚糖可以增强s a m p 8 小鼠的造血功能。 此外，地黄低聚糖对实验性糖尿病与高血糖大鼠糖代谢也有调节作用。 甘草根的果胶多糖类中提取出的中性低聚糖多羟糖酸组分，具有抗补体和促有 丝分裂活性【5 2 】。其中，最长和最短的低聚糖多羟糖酸组分，具有相对强的抗补体活 性，而其余所有低聚糖多羟糖酸组分，仅表现弱的抗补体活性，但有显著的促有丝 分裂活性。 中药巴戟天1 5 3 】是茜草科巴戟属植物巴戟天的根经炮制而成的传统中药，具有补肾壮 阳、强筋祛风之功效。崔承彬等经各种抑郁模型筛选发现，巴戟天提取物有明显的抗抑 郁活性。经进一步萃取、透析、凝胶柱色谱及高效液相色谱等分离手段得到4 个具有显 著抗抑郁活性的寡糖单体。 除了上述寡糖的活性外，目前寡糖还被证实具有预防龋齿，保护肝脏，调节糖尿病 与高血糖患者代谢洲，降低血清胆固醇降低血压等作用，抗炎抗凝作用等许多生 第一章绪论 理活性。 由于寡糖种类繁多、结构复杂，我们对寡糖在生物体内的活性功能虽有了定的了 解，但远不如对蛋白质及核酸的认识深入。人们目前还无法系统的研究寡糖结构与功能 的关系，而且分离检测寡糖的方法技术尚不完善，这些客观的因素制约着人们对寡糖的 进一步研究。随着分子生物学、细胞生物学的高发展，寡糖的生物学功能不断被揭示， 寡糖之谜终会解开。 1 4 寡糖的应用 一、作为功能性食品添加剂 由于人体不具备分解、消化寡糖的酶系统，在摄入之后，它很少或根本不产生热量， 而且，一些寡糖如异麦芽寡糖、蔗果低聚糖、乳果低聚糖具有一定程度的甜味，因此可 代替蔗糖等食用糖，不会影响食品原有的风味，并可有效地防止肥胖、高血压、糖尿病 等f 5 6 1 。 二、新型的绿色饲料添加剂 寡糖益生素属于微生态制剂，是由益生素和益生元共同构成“合生素”，是绿色饲 料添加剂。益生素通过改善宿主动物肠道菌群平衡，增殖有益影响的活性微生物饲料添 加剂，也叫益生菌剂。目前使用的益生菌剂主要含有芽胞杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、 双歧杆菌、酵母菌等几大类有益微生物，光合菌和梭状芽胞杆菌属的部分菌株及噬菌蛭 弧菌等也偶然被作为益生菌添加到仔猪和仔鸡饲料中。益生元是指不被动物体直接分解 消化的寡糖类化合物，包括寡聚甘露糖、寡聚果糖和寡聚半乳糖等，具有低热、稳定、 安全无毒等良好的理化性能，能够选择性地促进肠道有益菌群的活性和繁殖，属于益生 协同剂。 动物以饲料添加剂的形式摄入寡糖，在动物体内，它们以术降解的形式进入大肠， 作为有益微生物的专门底物，被有益微生物分泌的消化酶进一步消化为单糖，供有益微 生物或机体利用，从而起到有益蔚的增殖因子作用。同时抑制大肠杆菌、沙门氏杆菌增 殖，帮助和维持寄主肠道菌群平衡，建立双歧杆菌的优势种群。还保护寄主肝脏，促进 营养转化，刺激免疫细胞活性，提高免疫功能。 三、绿色环保型新农药 中国科学院生态环境研究中心正在努力，力争使葡萄寡糖的大量合成简单化、经济 1 0 第一章绪论 化，从而将寡糖类农药的研究成果转化为生产力。由于寡糖素在激活植物的防卫系统及 调节植物生长方面都有非常显著的作用，提供了制成高效无毒，对环境友好的生物源农 药的新途径，必将改变未来农药和农业制剂的产业结构，成为农业发展的新方向。 1 5 寡糖的发展前景及课题研究意义 一、寡糖的发展前景 近年来，寡糖类的生理功能受到了重视。随着功能性寡糖种类的增多，许多寡糖 的其它生理功能也得以发现。因此寡糖不仅是大有前途的功能性食品，而且由于糖链与 细胞信息传递及免疫应答关系密切，在植物抗病、疾病诊断及防治方面的应用潜力也很 大。 寡糖类还是具有信息传递作用的信号传递物质，这是新兴学科糖生物学研究的重 要内容。植物受外来病原菌人侵时，细胞会合成一种低分子量的抗菌性化合物防御 素【5 7 ，这种物质在健康的植物体中是不存在的，如一种在植物体内合成开始的信号物质 毛苷就是一种寡糖。这种寡糖不仅在细胞防卫上起作用，而且在细胞生长、分化、 形态形成上也起着关键的信息传递作用。据报道，几丁质寡糖的六糖、七糖，对小白鼠 有显著的免疫促进效果及抗肿瘤活性，同时它还与植物防御有关，可诱导几丁质酶的活 性及毛苷的活性。这种六糖、七糖对植物病原菌具有抑制作用，并对鞘豌豆产生的抗菌 物质豌豆素具诱导活性【5 8 】。 此外，寡糖无毒副作用，易溶于水，无抗原性和在宿主体内较弱的累积效应。而且 如前所述，寡糖具有多种生理功能，在抗癌药物、诊断试剂、植物生理、食品、化妆品 等方面得到广泛应用。因此，其开发前景是十分广阔。但由于到目前为止，寡糖的制各 和作用机制的研究尚不够深入，目前所能制备得到的非常有限的寡糖价格昂贵，在应用 上受到很大的限制。如何低成本、高产率地大规模生产这些寡糖，阐明其作用机制，并 制成体内环境下易溶、易吸收、使用方便的药剂已是当前研究的重点方向。相信随着科 学技术不断发展，预期在寡糖合成结构分析等方面将会有许多新的方法出现，使得对寡 糖生物学作用的认识提高到一个新的水平，相信不久的将来在众多科学家的努力下寡糖 在诊断试剂食品药物等方面会得到广泛的应用，实现寡糖为人类造福的目的。 二、本课题研究的意义 综上所述，寡糖有许多生物活性，在日常生活中，寡糖有着广泛的应用，但人类对 第二章材料与方法 2 1 试验材料 第二章材料和方法 一、菌种 黄原胶降解菌 c e l l u l o m o n a ss p x t l l 大肠杆菌ec o i l 金黄色葡萄球菌 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 野油莱黄单孢菌x a n t h o m o n a sc a m p e t r i s 二、培养基 黄原胶降解菌用培养基 固体培养基：黄原胶o 3 ；葡萄糖o 5 ； 溶液各0 5 ( 5 c a c l 2 ；5 k 2 h p 0 4 ；8 n a c l 调p h 值至7 。 种子培养基：黄原胶o 3 ；葡萄糖0 0 8 调p h 值至7 。 蛋白胨o 3 ；酵母浸粉0 3 ；五种盐 2 5 m g s 0 4 ；7 k n o3 ) ；琼脂1 7 。 酵母浸粉0 1 ；五种盐溶液各o 5 。 发酵培养基：黄原胶0 3 或0 1 ：酵母浸粉0 1 ；五种盐溶液各0 5 。调p h 值 至7 。 野油菜黄单孢菌用培养基 固体培养基：蛋白胨1 ，牛肉膏0 3 ，n a c io 5 ，琼脂1 7 。调节p h 值至7 。 种子培养基：葡萄糖2 5 ；酵母膏0 3 ；磷酸氢二钾o 2 ；七水硫酸镁o 0 1 。 调节p h 至7 。 液体培养基：蔗糖o 4 ；蛋白胨o 6 ；柠檬酸o 0 2 5 ；碳酸钙0 3 ；磷酸氢二 钾0 5 ；七水硫酸镁0 0 2 。调节p h 至7 。 2 2 实验方法 第二章材料与方法 一、糖标准曲线的制作 葡萄糖标准曲线的制作f 5 9 】：葡萄糖于5 0 。c 烘箱烘干4 h ，配成2 4 0 扯g m l 的葡萄糖标 准储备溶液，取0 4m l 稀释成不同浓度的葡萄糖溶液和o 1m l3 , 5 一二硝基水杨酸试剂 ( d n s ) 混合，沸水浴5 m i n ，迅速用冷水冷却，再加l m l 去离子水使总体积为1 5 m l 后，测定5 2 0 n m 处测吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，以5 2 0 n m 处的o d 值为纵坐标 绘制标准曲线。 总糖标准曲线的制作i 删：精确吸取葡萄糖标准液( 1 0 0 肛g m 1 ) 2 0i x l 、4 0 “l 、6 0 扯l 、 8 0p l 、1 0 0p l 、1 2 0l a l 定容至4 0 0p 1 ，再于各管内加5 酚溶液3 0 0 9 l ，混匀，加浓硫酸 1 2 0 0 “1 ，摇匀后在室温放置2 0 m i n ，于4 9 0 n m 下比色。以葡萄糖浓度为横坐标，以测得 的o d 值为纵坐标绘制标准曲线。 二、黄原胶降解酶8 9 i ；m j 备 将对数生长期c e l l u l o m o n a s s p x t l l 的种子培养液以3 接种量接入o 1 黄原胶为 碳源的发酵培养基，2 8 。c 摇床培养6 6 h 后，于2 0 。c ，6 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃去菌体沉淀， 得到上清粗酶液。 取l m l 粗酶液于1 5 m l 的离心管中，分别加固体硫酸铵至3 0 - - 7 5 饱和度，在 0 * c 一4 冰箱中，静置3 h ，再于i o * c ，1 0 0 0 0r p m 离心1 5m i n ，将上清液转移至干净的 离心管中，分别测定上清液及沉淀中的酶活，根据沉淀及上清液中的酶活分布确定合适 的饱和度。 三、酶活的测定 1 黄原胶降解酶 将o 5 m l 溶解于5 0m m 磷酸缓冲溶液( p h 7 o ) 的o 5 黄原胶溶液和0 5 m l 黄原胶 降解酶酶液混合均匀后，4 0 。c 水浴保温3 0 m i n ，沸水浴加热5 m i n 终止反应，冷却至室 温，测定反应液的粘度变化。酶活力单位定义为：在上述反应条件下，使黄原胶溶液每 下降一个粘度单位所需要的酶量为一个酶活力单位。 粘度采用黄原胶溶液的自然沉降速度表示：取支o 1 m l 的移液管吸取反应液至满 刻度，记录发应液下降5 个刻度所需要的时间( 秒) ，并以时间“秒”为粘度计量单位。 2 纤维素酶 参照h o n k o s h 的方法【6 j 】，x a n t h o m o n a sc a m p e t r i s 的发酵液，8 0 0 0 r p m 离一l , 1 0 r a i n ，上 4 第二章材料与方法 清液即为待测粗酶液。1 0 m g m l 的羧甲基纤维素( c m c ) 溶液取0 4 m l ，于5 0 。c 水中预热 2 - 3 m i n ，再加入粗酶液0 1 m l ，保温3 0 m i n 。3 ，5 一二硝基水杨酸比色法测定i 5 9 酶解后还原 糖的生成量，以表示酶的活力。另取小离心管，以不发生酶反应的还原糖量作空白。纤 维素酶，在反应该条件下使底物生成l 岬o l 葡萄糖的酶量为一个酶活单位。相对酶活的 定义：本文定义为l m l 发酵液的酶活与发酵液o d ( 6 0 0 n m ) 值的比值。 3 蛋白酶峥2 1 取x a n t h o m o n a sc a m p e t r i s 的发酵液，8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，上清液即为待测粗酶液。 在小离心管中加入0 4 m l 酪素溶液和0 2 m l 粗酶液，于4 0 。c 水中精确保温1 0 r a i n ，加o ，4 m o l 1 三氯乙酸终止反应。1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清夜0 2 m l ，加入0 4 m o l t 的碳酸钠溶液 1 o r a l 及福林试剂( 稀释二倍) o 2 m l ，于4 0 水中保温3 0 m i n ，测定6 8 0 r a n 下的吸光值。 蛋白酶，在该反应条件下，产生1 g 酪氨酸为一个活力单位。相对酶活的定义：本文定 义为l m l 发酵液的酶活与发酵液o d ( 6 0 0 n m ) 值的比值。 4 几丁质酶 按b o i l e r l 6 3 1 方法，取x a n t h o m o n a sc a m p e t r i s 的发酵液，8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，上清 液即为待测粗酶液。取0 0 5 9 几丁质溶于稀乙酸配成壳寡糖溶液，用5 碳酸氢钠溶液调 p h 值为3 8 ，再用水定容至1 0 0 m l ，以此壳寡糖溶液为底物。胶状几丁质0 5 m g m l 和粗酶 液以l ：1 比例于3 5 水浴1 h ，反应后沸水浴5 m i n 灭酶活，冷却，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 测定上清液中n 一乙酰葡萄糖胺的还原残基量。几丁质酶，一个酶活力单位( u ) 被定义为 在4 0 * c t 每分钟释放出相当于j 雌n 一乙酰葡萄糖胺( n a g ) 的还原糖所需要盼酶量。相对 酶活的定义：本文定义为l m l 发酵液的酶活与发酵液o d ( 6 0 0 n m ) 值的比值。 5 果胶酶【 取x a n t h o m o n a sc a m p e t r i s 的发酵液，8 0 0 0 r p m 离一d , 1 0 m i n ，上清液即为待测粗酶液。 粗酶液0 1 m l 于小离心管中，再加入0 2 m l p h 4 8 的乙酸乙酸钠缓冲溶液和0 1 m l 的果胶底 物，4 0 。c 水解3 0 m i n 后，立即加入d n s 试剂沸水浴5 m i n , 钡t j 定生成n 一乙酰葡萄糖胺的浓 度。果胶酶，一个酶单位定义为在实验反应条件下释放出1 1 t g n 一乙酰葡萄糖胺所需要 的酶量。相对酶活的定义：本文定义为l m l 发酵液的酶活与发酵液o d ( 6 0 0 n m ) 值的比值。 6 脂氧合酶活性测定 按s e k i z a w a 等【6 5 l 的方法，称取大豆子叶约2 9 ( 1 0 片) ，加5 0 m m 0 1 lp h6 5 磷酸 缓冲液，冰浴研磨，于4 下1 2 0 0 0 r p m 离一心2 0 m i n ，上清液为酶提取液。粗酶液与lm m o l l 亚油酸3 0 0 c 反应2 0m i n ，用0 1m m o t l 盐酸中止，再用2 m l 乙醚萃取，加4 m l 乙醇后 第二章材料与方法 测定o d 2 4 0 。酶活单位定义：在上述发应条件下，o d 值降低0 1 为一个酶活单位。 7 苯丙氨酸解氨酶活性测定 参照z u k e r 等1 6 6 】的方法，称取大豆子叶约2 9 ( 1 0 片) ，置于