（发酵工程专业论文）高富集生物活性硒啤酒酵母的研究.pdf

攮螫 摘要 微量元素硒是维持人体正常生命活动所必需的元素之一，缺硒会导致多种疾 病的发生。富硒酵母作为人类营养的最重要的补硒形式已成为近几年研究的热点。 本课题以本实验室提供的啤酒酵母菌为出发菌株，对其进行了硒抗性的筛选和富 硒培养条件的优化，并且采用了复合酶( 蜗牛酶) 处理细胞壁、超声波处理细胞 膜以及在加压的条件下培养等一系列方法，使啤酒酵母的富硒能力大大增强，为 迸一步应用于工业生产打下了良好的基础。 采用平板菌落计数法对三株啤酒酵母菌株进行了抗性筛选，通过对其在含有 亚硒酸钠溶液的培养基中生长后所得到的生物量和硒的摄入率的检测，筛选出一 株生物量较高和对亚硒酸钠抗性较高的酵母菌株3 6 2 k ；且通过单因素实验和征交 实验对酵母中硒的检测方法亚甲蓝还原法进行了实验条件的改进，得到在弱 光照下，反应温度为3 2 、甲醛的添力羹量为i m l 时反应速度适中，利于计时，线 性良好，灵敏度较高。对啤酒酵母菌株3 6 2 k 的富硒培养条件进行了优化，并通过 单因索实验和正交实验确定了其最适培养条件：在温度为2 8 下，亚硒酸钠添加 浓度为2 0 1 a g m l 旦采用分批添拥的方式、接静量为1 0 ( v v ) 、转速为2 0 0 r m i n 、 摇床培养4 8 h 时，啤酒酵母3 6 2 k 的生长状况、生物量和富集硒元素的能力最好。 在此最优条件下，硒酵母生物量( 干重) 达到8 4 8 6 9 l ，细胞的总硒含量达到 7 0 6 4 2 3 9 9 g 千菌体，其中有机硒含量达到了6 4 2 9 1 6 9 9 g 干菌体，转化率达到 9 l 。0 1 。 通过对富硒酵母培养条件的优化可知，啤酒酵母转化无机硒为有机硒的能力 很强，均达到8 0 以上，因此细胞对硒的摄入率成为其寓硒量的关键因素，本课 题采用了三种方法：用复合酶处理细胞壁、超声波处理细胞膜以及加压培养的方 式，增大啤酒酵母细胞的硒摄入率，从_ 藤提高其总硒含量和有机硒含量。结果显 示：在3 6 h 时加入酶液效果最好，比不加酶液时总硒含量和有机硒含量有了明显 的增加，增幅分别在1 0 4 和1 2 8 ；在3 6 h 时用超声波处理效果最好，比不用超 声波处理时总硒含量和有机硒含量分别增长了约1 2 4 和1 5 。4 ，丽生物量基本不 变；加压培养时，在1 2 h 封盏时总硒含量和有机硒含量分别达到了8 2 0 8 4 和 7 4 6 2 2 u g g 干菌体，涨幅分别为l 9 2 5 和2 4 5 0 。 关键词：啤酒酵母；硒；生物量； 摄入率；转化率；亚甲蓝还原法 山东轻t 业学院硕l j 学位论文 a b s t r a c t s e l e n i u mi so n eo ft h en e c e s s a r ye l e m e n t st om a i n t a i nt h en o r m a ll i r ea c t i v i t yo f h u m a n sb o d y 。t h eu s eo fs e l e n i z e dy e a s ta se n r i c h e ds e l e n i u ms u p p l e m e n t si nh u m a n n u t r i t i o nh a sb e c o m eat o p i co fi n c r e a s i n gi n t e r e s to v e rt h el a s td e c a d e t h i ss u b j e c t u s e dt h eb e e ry e a s to fl a b o r a t o r ya st h eo r i g i n a ls t r a i n s ，s t r a i n sw e r ef i l t e r e df o rt h e r e s i s t a n c et ot h es e l e n i u ma n do p t i m i z e dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n so ft h es e r i c h ，a n db ya s e r i e so ft r a i n i n gm e t h o d sm a d et h ea b i l i t yo fs e l e n i u m r i c h e dh a dag r e a ti n c r e a s e ，s u c h a sh a n d l e do ft h ec e l lw a l l u s i n gac o m p l e xe n z y m e ( s n a i l e n z y m e ) ，u l t r a s o u n d t r e a t m e n ti nt h ec e l lm e m b r a n ea n di n c r e a s e dp r e s s u r ei nt h ec u l t u r ep r o c e s s ，a n di tl a i d ag o o df o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e ra p p l i e dt oi n d u s t r i a lp r o d u c t i o n 。 t h et h r e eb r e w e r sy e a s ts t r a i n sw e r ef i l t e r e df o rt h er e s i s t a n c et ot h es e l e n i u mw i t h t h em e t h o do ff l a t p a n e lc o l o n yc o u n t i n g t h r o u g hd e t e c t e dt h e i rb i o m a s sa n ds e l e n i u m i n t a k er a t ei nt h em e d i u mc o n t a i n i n gt h es o d i u ms e l e n i t es o l u t i o n ，a n dt h es t r a i n3 6 2 k h a dh i g h e rb i o m a s sa n dr e s i s t a n c et ot h es o d i u ms e l e n i t e t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s o ft h em e t h o df o rd e t e c t i n gt h es e l o 珏i 疆l 秘h er e d u c t i o no fm e t h y l e n eb l u ew a s i m p r o v e dt h r o u g ht h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，a n dt h er e s u l ts h o w e d ： a st h el i g h tw a sw e a k ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 2 ca n df o r m a l d e h y d ea d d e d q u a n t i t yw a slm l ，t h er e a c t i o ns p e e dw a sa p p r o p r i a t et ot i m e ，l i n e a rg o o d ，a n d s e n s i t i v i t yw a sh i g h t h e s e r i c h e dc u l t u r ec o n d i t i o n s f o rt h es t r a i n3 6 2 kw e r e o p t i m i z e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa n dc o n f i r m e di t so p t i m a l c u l t u r ec o n d i t i o n s ：t h et e m p e r a t u r ew a s2 8 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs o d i u ms e l e n i t e a d d e dw a sb a t c ht o2 0 ；t g m l ，t h ev a c c i n a t i o nw a s10 ( v v ) ，r u n n i n gs p e e dw a s 2 0 0 r m i n ，a n dc u l t u r e df o r4 8 h ，t h e3 6 2k sg r o w t hc o n d i t i o n s ，b i o m a s sa n d s e e n r i c h m e n tc a p a c i t yw a sb e s t 。i nt h i so p t i m a lc o n d i t i o n s ，s e l e n i u my e a s tb i o m a s s ( d r yw e i g h t ) c o u l du pt o8 4 8 6 9 l ，t h et o t a ls e l e n i u mc o n t e n tr e a c h e d7 0 6 4 2 3 9 9 gd r y c e l l ，i n c l u d i n go r g a n i cs e l e n i u mw a s6 4 2 916 1 t g gd r yc e l l ，t h ec o n v e r s i o nr a t er e a c h e d 9 l 。0 1p e r c e n t i tc o u l db es h o w e dt h a tt h eb e e ry e a s t sa b i l i t yo ft r a n s f o r m i n gt h ei n o r g a n i c s e l e n i u mt oo r g a n i cs e l i n u mw a ss t r o n gt h r o u g ht h eo p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n s ， i th a dr e a c h e dm o r et h a n8 0p e r c e n t s ot h es e l e n i u mi n t a k eb e c a m eac r i t i c a lf a c t o ro f s e l e n i u m e n r i c h e dr a t e i nt h i si s s u eu s e d 搬et h r e em e t h o d st oi n c r e a s et h ei n t a k eo f s e l e n i u mf o l l o w i n g ：t h et r e a t m e n tc e l lw a l lw i t hc o m p o u n de n z y m e ，u l t r a s o u n d t r e a t m e n ta n dc o m p r e s s i o nc u l t u r e ，t h u si n c r e a s e di t st o t a ls e l e n i u mc o n t e n ta n dc o n t e n t v a b s t r a c t o fo r g a n i cs e l e n i u m t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：w h e nc u l t u r e df o r3 6 h ，a d d i n gt h ee n z y m e w a st h eb e s t ，t h et o 蹦s e l e n i u mc o n t e n ta n dc o n t e n to f o r g a n i cs e l e n i u mh a di n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ，a l li n c r e a s eo f10 ，4a n d1 2 8p e r c e n t ，r e s p e c t i v e l y ；w h e nc u l t u r e df o r3 6 h 。 d e a l i n gw i t ht h ec e l lb yu l t r a s o n i cw a se f f e c t i v e ，t h et o t a la n do r g a n i cs e l e n i u mc o n t e n t h a di n c r e a s ea b o u t12 4 a n d15 4 t h a nn ou l t r a s o u n dt r e a t m e n t a n db i o m a s s r e m a i n e db a s i c a l l yu n c h a n g e d 。t h et o t a la n do r g a n i cs e l e n i u mc o n t e n tr e a c h e d8 2 0 。8 4 a n d7 4 6 。2 2l - t g gd r yc e l lw h e nd e c k e di n12 hw i t hp r e s s u r i z e dc u l t u r e t h ei n c r e a s er a t e r e a c h e d1 9 2 5a n d2 4 5 0p e r c e n tr e s p e c t i v e l y 。 k e yw o r d s ：b r e w e r sy e a s t ；s e l e n i u m ；b i o m a s s ；i n t a k er a t e ；c o n v e r s i o n r a t e ： m e t h y l e n eb l u er e d u c t i o nm e t h o d v l 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：虱：渔当 日期：弛墨年 月三生日 导师签名：要圜兰同期：圣塑登年丛月鱼日 山东轻t 业学院硕十学位论文 第1 章绪论 1 1 啤酒与啤酒酵母 1 1 1 啤酒及啤酒工业的发展 啤酒有着悠久的历史，它先于其他酒类最早出现在人类的生活之中。啤酒起 源于两河流域的古巴比伦王国( 今伊拉克境内) ，是当时生活在那旱的苏美尔人最 古老、神奇的发明。公元前3 0 0 0 年前后，随着两河流域和尼罗河流域的贸易往来， 位于尼罗河下游的古埃及也学会了啤酒酿造技术。大约公元前4 8 年以后，啤酒酿 造技术从埃及传至欧洲，并快速发展。公元8 世纪前后，德国人把大麦和啤酒花 固定为啤酒酿造原料，啤酒酿造技术实现了重大突破。许多技术的发展例如1 8 世 纪初勒沃米发明温度计，1 8 3 0 年发现酶对大麦发芽的作用，1 8 6 5 年法国巴斯德灭 菌方法的创立，18 7 8 年丹麦科学家汉森( h a n s e n ) 对啤酒酵母的纯粹培养和分类 研究以及1 9 世纪中叶加热方法和蒸汽机的改进等等，才使啤酒酿造逐步进入工业 化。 我国是世界上用粮食原料酿酒历史最悠久的国家之一。早在5 0 0 0 多年前，我 们的祖先就已经能够酿造“醴酒”了，其所用的原料、发酵的方法、酿造的时间 与世界公认的苏美尔人所酿啤酒非常相似，如出一辙。到1 9 世纪，以工业化方法 生产的现代啤酒酿造技术从西方传到了中国，并逐渐繁衍起末。1 9 0 0 年，俄国人 在哈尔滨建立了中国最早的啤酒厂乌卢布列夫斯基啤酒厂( 哈尔滨啤酒厂前 身) ；1 9 0 3 年，英德合资在青岛丌办了英德酿酒有限公司( 青岛啤酒厂前身) ；我 国在解放前夕，啤酒的产量不大，品种很少，当时全国啤酒总产量仅有7 0 0 0 千升。 新中国成立后，随着经济的逐步发展和人农民生活水平的提高，啤酒工业取得了 快速的发展，到1 9 9 3 年，我国啤酒总产量达到了1 2 2 5 万千升，超过德国，居世 界第二位。几年来，我国啤酒以每年增加1 0 0 多万千升的速度迅猛发展，在2 0 0 2 年达到了2 3 8 6 8 3 万千升，成为世界上啤酒产量最大的国家i l 】。 1 1 2 酵母与啤酒酿造 酿造啤酒的四种基本原料为：水、麦芽、酵母和酒花。其中水被称之为“啤 酒的血液”，麦芽是酿造啤酒的主要原料，酒花是不可缺少的最重要的添加物质。 而麦汁等原料必须经过啤酒酵母的发酵彳能酿制成啤酒。麦汁糖化后冷却至一定 温度，添加人工培养的酵母于发酵容器内，开始啤酒的发酵作用。啤酒发酵是一 项非常复杂的生物化学变化过程，它借助啤酒酵母细胞所分泌的多种酶系的作用， 进行厌气酒精发酵，生成酒精和二氧化碳及一系列的发酵副产物，如醇类、醛类、 酸类、酯类、酮类和硫化物等。这些因酵母的作用而产生的发酵产物决定了啤酒 第1 帝绪论 的风味、泡沫、色泽和稳定性等各项理化性能，使啤酒显示出独特的典型性。采 用不同的酵母菌株，运用不同的发酵工艺，可生产出不同风味和不同类型的啤酒。 由此可见，酵母菌与啤酒酵母的关系极其重要。酵母是啤酒酿造的重要因子之一， 质地优良的啤酒，则必须由性能优良的啤酒酵母参与啤酒发酵，方可生产出使消 费者满意酶啤酒汪l 。 啤酒的发酵分为上面发酵和下面发酵两种类型，上面发酵在发酵外观、技术操 作和发酵设备方面与下面发酵有所不同，但二者的发酵机理是一致的。上面发酵的 糖化方法以浸出法为主，而下面发酵则以煮出法为主：上面发酵的起始发酵温度及 主发酵温度都比下面发酵要高；酵母的回收方式也不同，上面发酵主要以撇去法、 落下法回收酵母，而下面发酵足从底面收集酵母p j ；上面发酵啤酒一般不进行后发 酵，而进行一些后处理；上面发酵酿制的啤酒发酵度高，啤酒成熟快，设备周转 快，啤酒有独特的风味，但保存期短。如今两种发酵方式在互相靠近，界限淡化， 二者融合形成新型的发酵形式是今后发展的方向。 在啤酒生产过程中，历经酿造工序之后，会产生大量的泥状酵母，统称为酵 母泥，它是啤酒酿造过程中的副产物。这种啤酒酵母所产生的数量，大约是啤酒 产量的0 。1 0 - - 一0 。1 5 ，即每生产1 吨啤酒约有l 1 。5 公斤的剩余酵母产生( 含水分 8 ) 。其中2 3 系经主发酵后除留用以外的剩余沉淀酵母，这部分酵母质量较好， 含杂质较少，是酵母利用的主要部分。其余1 3 来自后发酵于其他杂质共同沉淀于 贮酒罐底部的酵母，这部分含杂质较多，质量较差，以前均弃掉且造成污染，遥 年来也已受到重视而逐渐被利用起来。由于酵母的成分和营养极为丰富，对这些 啤懑生产过程中掰产生的剩余酵母加以窭收利用，其经济价值和营养价值则兼备 【4 】 0 1 1 。3 啤酒酵母简介 ( 1 ) 结构及组成 酵母细胞形态通常为球状、舞蟊状、糖菡状、柱状和香肠状等，细胞大小一 般为( 8 1 0 ) m ( 5 2 1 ) m ，在显微镜下看到的酵母细胞结构主要有细胞壁、 细胞膜、细胞质、细胞核和液泡等。幽细胞膜包围着纲胞质，细胞膜的外部又有 细胞壁保护，另外在显微镜下常可在细胞壁上看见出芽点。最热型和重要的酵母 菌是酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，细胞大小为( 2 。5 1 0 ) l a m x ( 4 5 2 1 ) p , m ，它的形态、构造如图1 1 淄。 2 山东轻t 业学院硕 ：学位论文 图1 1 酵母菌细胞构造的模式图 f i g u r e i 1t h et e c t o n i cm o d e lo f y e a s tc e ll s 酵母细胞大约含有7 5 的水。酵母绝干物质主要由蛋白质和碳水化合物组成， 见表1 1 。酵母细胞蛋白质中含有丰富的氨基酸，经分析测定含有8 种必需氨基酸 ( 见附表1 1 和1 2 ) ，其中，赖氨酸和甲硫氨酸( 蛋氨酸) 含量相对较高。此外， 酵母还含有丰富的维生素和酶，尤其是维生素含量很高( 见附表1 4 ) ，主要为水 溶性b 族维生素，特别是维生素b l 和b 6 ，因此说未过滤啤酒含有大量的维生素实 不为过。且酵母菌本身含有大量的无机离子，含量见附表1 3 1 6 j 。 表1 1 酵母的组成 t a b l e1 1t h ec o m p o s i t i o no f y e a s t 成分含量( ) 蛋白质 碳水化合物 脂肪 矿物质 4 5 - - 6 0 2 5 3 5 4 7 6 - - 9 ( 2 ) 分类 啤酒酵母是上面发酵酵母， 门：真菌门( e u m y c o p h y t a ) ； 纲：子囊菌纲( a s o c m y c e t e s ) ； 其在微生物分类学上的地位是【7 】： 亚纲：原子囊菌亚纲( p r o t o a s c o m y c e t e s ) 第1 市绪论 目：内孢霉曰( e n d o m y c e t a l e s ) ； 科：内孢霉科( e n d e m y c e t a c e a e ) ：亚科：酵母亚科( s a c c h a r o m y c e o t d e a e ) ： 属：酵母属( s a c c h a r o m y c e s ) ( 简写：s ) 种：啤酒酵母( s a c e h a r e m y c e sc e r e v i s i a e ) 其最适生长温度较高( 2 5 2 8 ) ，产酒精较快。其中有的能耐高渗透压，所以适 于高浓度发酵日l 。啤酒丁厂使用的啤酒酵母是由野生酵母经有系统的长期驯养，经 反复使用和考验，具有正常生理状态和特性，适台啤酒生产要求的培养酵母。啤 酒工厂对啤酒酵母的生理特性要求为：凝聚性较强，发酵度一般为5 0 6 8 ，死 灭温度在5 2 5 3 ，不产生孢子或产孢能力极弱。 根据其在啤酒发酵中的物理性质不同，将啤酒酵母分成两粪：上面啤酒酵母 ( 又称表面酵母或顶面酵母) 和下面啤酒酵母( 又称底面酵母或贮藏酵母) 。具有 亲水的表面，存发酵时，酵母悬浮在发酵液内，发酵终了，酵母很快称快并沉积 在器底，形成紧密的沉淀，称为下面啤酒酵母。上面啤酒酵母具有疏水的表面， 在发酵时随c o ：漂浮在液面上，发酵终了形成酵母泡盖，经过长时剐放置，酵母 也很少下沉。两种酵母形成两种小的发酵形式，即上面发酵和f 面发酵，酿制 出两种不同类型的啤酒，即上面发酵啤酒和r 面发酵啤酒。 ( 1 ) 上面啤酒酵母和下面啤酒酵母的特性比较：如图l2 和表l2 所示 o ) 下面啤酒酵博 ( 2 ) 上面啤酒酵母 目l2 上面啤酒酵母和f 面啤酒酵母的镜检照片 f i g u r e l2 t h e m i c r o s c o p ep h o t o so f t o pa n db e l o wb r e w e r s y e a s t 从圈l2 中可清晰地看到酵母细胞内的细胞器。且明显的看出：下面啤酒酵母 与上面啤酒酵母都呈圆球形；而两者的主要形态差别是酊者细胞较分散- 而后者 细胞都凝结在一起。 山东轻工业学院顾十学位论文 表1 2 上面啤酒酵母和- 卜面啤酒酵母的区别【9 1 t a b l e l 2d i s t i n c t i o no f t o pa n db e l o wb e e ry e a s t 上面酵母实际上是下面酵母的原始菌种。人们约在1 7 世纪就已经了解到上面 酵母的发酵，之后才丌始了现在大多使用的下面发酵啤酒的研究。目前，在英国 上面发酵啤酒还占有相当大的比例，在荷兰及比利时约占5 0 左右，在德国北莱茵 威斯特法伦州( n o r d r h e i n w e s t f a l e n ) 约占3 0 左右，而巴伐利亚州( b a y e m ) 约 占1 8 左右。从表1 2 可以看出，上面酵母的培养温度和发酵温度都较高，适于实 验室培养，而且它的凝聚性差，在啤酒酿造过程中不需要过滤处理而采用直接沉 鲶l 牵绪论 降的方法，除去大部分的酵母菌种，在啤酒中会剩余部分未沉降的酵母菌体，一 部分会直接通过饮用进入人体中，沉降的酵母菡体可以 乍为动物饲料，成为有效 的动物营养补充来源。因此具有巨大的经济效益。 1 1 4 啤酒酵母的应用 啤酒酵母含有丰富的营养物质及功能性成分，随着科学技术的进步和生物技 术的发展，对酵母的利用已不仅仅局限在传统的发酵食品上了【l o 】。下面将对啤酒 酵母的应用及利用前景作一详缀的食绍。 ( 1 ) 酿酒工业，包括酒精及白酒、葡萄酒、啤酒、清酒等各种饮料酒。 ( 2 ) 酵母工业，包括面包酵母，药用酵母和食品酵母，以及微量元素酵母等。其 中微量元素酵母主要有富硒酵母、富铬酵母、富锌酵母、富铁酵母和富铜酵母等i 1 2 l 。 ( 3 ) 食品工业，可作为理想的蛋白质营养源、作为食品添加剂、核酸保健食品等。 据报道日本札幌啤酒公司利用啤酒厂的副产物啤酒酵母制成“干燥啤酒酵母粉减 肥食晶”，富含多种营养物质，效果良好，深受广大女性消费者青睐。 ( 4 ) 调味品工业，利用酵母生产酵母提取物、酵母浸出物和酵母风味物质等。 ( 5 ) 饲料及畜牧业，由废酵母制备的干粉，富含蛋囱质、维生素、矿物质及某些 水解酶系，其营养价值相当于鱼粉。 ( 6 ) 医药工业，制取核酸、核苷酸、核替类药物、果糖二磷酸钠( f d p ) 、谷胱甘 肽、鞴酶a 、细胞色素c 、酵母多糖、凝赢质、麦焦菸 醇、卵磷脂、耐热多肽等。 而且啤酒酵母是糖尿病、癌症、高血压的患者很好的天然纤维食品，啤酒酵母细 胞壁成分对癌症具有免疫增强作用。对长期接受化疗的癌症病患，食用之后获得 丰富营养素，可提高噬菌体活性化，增强病人抵抗力。 ( 7 ) 作为基因工程的受体菌用来生产重组子蛋皇产物，用柬制备食用、药用和饲 料用的单细胞蛋白。 ( 8 ) 含有丰富的转化酶，可用来转化蔗糖制作酒心巧克力等。 ( 9 ) 啤酒酵母也已经应用于化妆品行业，做成啤酒酵母西膜，经使用证实具有良 好的美容效果 1 3 1 。 在欧洲、美国和亚太区一些较先进的国家琨，对于酵母的丌发已大量应用于 不同种类的营养食品和调味品工业。近年来，随着核酸营养学与核酸代谢疗法理 论的建立，啤酒酵母作为高核酸食晶和药晶己开始受到重视。美国c o o r s 啤洒公 司以焙烤过的酵母与刺槐子丌发出低热量巧克力，性状稳定。现在各国都致力于 研制添加啤酒酵母的面包点心、肉类食品等。美图农业部的微生物学家k c o l s e m a n 正在开发废酵母的新用途，试图能将其制成调节身体重量的激素、刺激头发生长 的药物及快速融化血块的维生素等。啤酒酵母综合利用课题意义重大，研究的范 围比较广，可丌发产品很多；同时某些子课题具有很深的理论深度。随着我因啤 6 山东轻t 业学院硕i j 学位论文 酒生产的速度发展，废酵母的再利用成为人们关注的焦点。而我国在啤酒废酵母 综合利用方面还存在许多问题与不足，在未来的研究中，我们应该借鉴国外经验， 结合本国实际，走出自己的新路子。 1 2 硒简介 1 2 1 硒的物理化学性质 硒，1 8 1 7 年由瑞典化学家贝采力乌斯从硫酸厂的污泥中发现，命名为s e l e n i u m ， 源自希腊文“月亮”。硒在地壳中的含量为9 l o 由。广泛存在于囱然界中，岩石、 土壤、沉积物、水体、生物体以及大气环境中都不同程度的含有硒。主要分布于 硫化物矿中，其独立矿物有硒锅矿、硒铜银矿等。 硒是一种稀有分散元素，硒的原子序数是3 4 ，位于元素周期表中第四周期的 砷和漠以及位于a 族氧族元素硫翻碲之越，电子构型【a 习3 d 4 s 2 4 p 4 ，在自然 界中以负二价、零价、四价和六价形式存在，所形成的化合物与元素硫类似。是 一种两性( 金属、非金属) 物质，其金属性介于硫与碲之间i l5 1 。其在元素周期表 中的位置如下i l6 j ： a 族 c s i 第四周期g e s n p b n0fn e psc la r a ss eb rk r s bklx e b ip oa tr n 单质硒有三种同素异形体：无定形硒、晶体硒和金属硒。无定形硒有两种无 定形形式，分别是红色无定形和玻璃体或黑色变体，其粉术的颜色是从深红到黑 色。晶体硒有三群晶体形式，分别是伐单斜晶系和单斜晶系以及红色结晶体硒。 红色晶体不很稳定，加热时可转变为稳定的灰色晶体；所有这些晶体形式在水中 都是难溶的，且固体的氧化或还原功能非常弱。金属硒能导电、导热，电导率能 随光照的强弱而急剧变化，是光导材料，可用于制造光电管、光电池和太阳能电 池：高纯度会属硒也被广泛用于高效整流器，也可用作塑料、油漆、搪瓷和墨水 的颜料等。单质硒的一些性质见表1 3 。 7 第l 章绻论 表1 3 硒原子的一些性质 t a b l e l 。3s o m ep r o p e r t i e so f s e l e n i u ma t o m s 单质硒可以氧化为s e 0 2 、s e 0 3 2 和s e 0 4 2 ，还原为s e 孓。硒化物( s e 2 ) 以硒化氢 ( h 2 s e ) 零n 会属硒化合物存在于自然赛中。h 2 s e 是一种有恶奥气味、有毒的气体， 溶于水，呈强酸性。因为s e 2 的离子半径是o 1 9 8 n m ，s 2 - 的离子半径是0 1 8 4 n m ， 故两者的替代经常发生，所以金属硒化物多在金属硫化物矿床( 如f e 、c u 、p b ) 中 发现；金属硒化物及硒硫化物难溶于水。微生物作用可产生硒的挥发性甲基衍生 物。 四价硒以s e 0 2 、h 2 s e 0 3 或s e 0 3 2 - 形式存在。硒在空气中燃烧或与硝酸反应均 可产生s e 0 2 。h 2 s e 0 3 是一种弱酸，当p h 由酸性到中性变化时，大多数亚硒酸盐 比相应的硒酸盐溶解度要低。亚硒酸盐在酸性环境中可被强还原荆( 如抗坏血酸维 生素c ( v c ) 、s 0 2 、有机微生物) 还原成元素念s e 。 六价硒以h 2 s e 0 4 和硒酸盐方式存在。硒酸是一种强酸，不会因自然界中水和 p h 的变化而变化。硒酸盐极易溶解，并且向s e 0 3 或元素态硒的转化过程较为缓 慢。硒酸盐是硒最易被植物吸收的一神形式i l ”。 l 。2 2 硒的生理功能 1 9 5 7 年，s c h w a r z $ 1 1 f o l t z 等人发现从酿酒酵母中分离的生物活性因子i l ( r p s e ) 能预防老鼠因维生素e 缺乏而引起的肝坏死。1 9 7 3 年，美国r o b r u c k 等确认硒是谷 胱甘肽酶的辅助因子，它能和维生素e 起防止不饱和脂肪氧化生成有害的过氧化 物。1 9 7 5 年由c a n t o r 等发现硒可以预防家禽渗出性素质病( e x u d a t i v ed i a t h e s i s ，e d ) 和胰腺纤维化【婚1 。1 9 7 3 年，世界卫生组织( w h o ) 和囡际营养组织确认硒是人体 必需的微量元素。 从此营养学家对硒产生了浓厚的兴趣。大量研究证明硒是入体必需微量元素 之一，因此对硒的营养认识产生了划时代的变化。特别近十多年，随着对硒的深 入研究，逐渐认识到硒对生命具有重大作用，硒已成为人类和动物的多功能营养 8 山东轻工业学院硕：学位论文 素【1 9 】。表1 4 列出了缺硒引起的疾病或与缺硒有关的疾病【2 0 】。 表1 4 缺硒引起的疾病或缺硒有关的疚病 t a b l e1 4d i s e a s e sc a u s e db ys e l e n i u md e f i c i e n c yo rs e l e n i u md e f i c i e n c y r e l a t e d 动物疾病的种类 牲 肝坏死：白肌病；子宫炎：乳房炎；缺乳；心肌损伤：对应激和注射铁剂耐受 低：桑椹心：繁殖障碍。 反刍 新生仔畜白肌病；孱弱；心肌损伤；繁殖障碍( 如胎衣不卜，受胎率低，卵巢 动物囊肿，安静发情) ；乳中体细胞数( s c c ) 升高。 ，。 鸡胚胎死亡：雏鸡脑软化症；雏鸡胰腺变性；渗出性素质；肌营养不良：羽毛 家禽 生长不良。 水生+ 虫t 鳟的渗出性素质；鲶鱼的g s h p x 活力下降；吞噬细胞杀伤能力卜降和饲料 动物转化率低。 克山病：人骨肖病：心血管病；癌：苯丙酮酸尿症：胰腺纤维囊性变；节段性 同肠炎等。 美国加利福尼亚大学细胞专业的教授们都认为，在f 常情况下，人体摄入硒 2 - - 3 天内会被排除出体外，但患有癌症的病人硒长期固定在肿瘤细胞上，导致肿 瘤细胞死亡，使肿瘤缩小或消失。美国亚利圣那大学康奈尔姆斯教授和克拉克博 士在对1 3 1 2 名参与者开展的为期1 0 年的研究结果发现，服用适量的硒使癌症的发 生率降低3 7 ，癌症死亡率亦比服用安慰剂降低5 0 以上。他们还特别发现，每天 仅服用2 0 0 m g 的硒添加剂，就可使前列腺癌的发生率降低5 0 ，肺癌和结肠癌的发 生率降低3 8 。美国亚利桑那癌病研究中心的研究结果表明，每同摄取2 0 0 m g 的硒， 肺癌、前列腺癌、直肠癌的发病率降低5 0 以上【2 l j 。 硒作为人体必需的微量元素，具有重要的生理功能及广泛的药理作用。主要 表现在： ( 1 ) 参与酶的催化反应：硒蛋白作为哺乳动物酶系统的基本成分，促进正常代谢 过程中产生的有毒过氧化物的分解，防止其堆积，进而保护细胞中重要的膜结构 不受损害；同时还直接参与膜磷脂氢过氧化物的还原，从而达到保护生物膜的目 的。 ( 2 ) 抗氧化作用：硒是若干抗氧化酶的必需组分，例如硒是人和动物体内谷胱甘 肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g s h p x ) 的辅助因子【2 2 1 ，g s h p x 广泛存在于 生命机体的肝、肾、心、肺等，硒代半胱氨酸为该酶提供其活性中心的必需基团， g s h p x 利用谷胱甘肽使有毒性的过氧化物还原为无害的羟基化合物，通过清除 h 2 0 2 防止o h 产生，并将脂氢过氧化物( r o o h ) 还原成相应r o h ，从而减轻细胞膜 9 第1 零绪论 不饱和脂肪酸过氧化作用；f i r o o h 分解产物引起的细胞损伤，保护细胞膜的结构和 功能不受损伤。因此机体硒水平的高低直接影响了机体抗氧化能力以及对相关疾 病的抵抗能力1 2 3 】。 ( 3 ) 增强机体免疫力：硒几乎存在于人体所有免疫细胞中，它能促进淋巴细胞产 生抗体，增强机体对抗原产生抗体的能力；能促进吞噬细胞的功能；缺硒时g s h p x 的活性降低，k 2 0 2 积聚，脂震过氧化物增多，抑制葡萄糖脱氢酶的活性，破坏磷 酸戊糖途径。 ( 4 ) 硒是体内拮抗有毒物质的保护剂：大量动物实验结果提示，硒可拈抗许多有 毒金属元素的毒性。如减少镉的吸收；抑制镍的诱癌作用；抑制砷的毒性和致畸 性；预防甲基汞中毒；还可降低铅、氟、顺铂、银等的毒性作用。 ( 5 ) 抗癌作用：表现在以下几个方面：抑制癌细胞生长及其d n a 、r n a 和蛋白 质的合成，抑制癌基因的转录。干扰致癌物质的代谢。抗氧化作用。许多化 学致癌剂和放射性物质致癌均与自由基形成有关。对免疫系统的影响【酬。 ( 6 ) 硒可调节维生素a 、c 、e 、k 的吸收与消耗，并与v 协同保护细胞膜，参 与c o a 和c o q 的合成，在机体代谢、电子传递中起重要作用。 ( 7 ) 研究表明，硒还能增强生育能力及生殖功能：硒是精子线粒体外膜硒蛋白的 成份之一，对予精子的形成和发育具有特冥静作用，能促进精子产生，增强其活 性f 2 s l 。 ( 8 ) 大量调查说明艾滋病毒感染者硒水平下降。通过补硒不仅可以降低患艾滋病 危险性，还能预防多种病毒性疾病强酬。 ( 9 ) 硒的抗衰老作用也正日益受到人类的重视。国外已将由硒俸为抗衰老药物应 用于抗衰老食品中【2 川。 派如世界微量元素元素权威菲尔德博士所说：“硒就像一颗原子弹，量很小很 小，作用和威力却很大很大，一旦被入们所认识，将对健康产生深远的影响”鄹l 。 重。2 3 硒的分布状况 硒在地壳中分糍极不均匀，据不完全统计，全世界有4 2 个国家和地区缺硒。 新殛兰、澳大利亚等国家及我囤部分地区都属缺硒或低硒地区。我圈除湖北恩旅、 陕西紫阳两地是富硒地区外，有2 2 个省中缺硒，7 2 的圈土为不同程度的缺硒区， 据中国微量元素科学研究会及农科院研究公稚，这些地区约有一亿多入的膳食结 构中硒含量不足，造成人体低硒状态f 2 9 , 3 0 】。焉且我国是一个水产养殖大国，畜牧 业发展速度很快，但每年因缺硒死亡的牛羊、仔猪、雏鸡等经济损失约3 0 0 万元 以上。因此补硒已是很多国家的常规措施【3 n 。世界上许多缺硒的国家都根据本国 人民的生活水平和营养状况，溉定了每人每天的补硒量。1 9 7 6 年图际硒营养学会 推荐标准是6 0 p g ，美国科学院食品与应用委员会的同推荐标准是5 0 - - 2 0 0 p g ( 七岁 l o 山东轻t 业学院硕t ：学位论义 以上) ，中国营养学会1 9 9 8 年推荐标准是每天5 0 9 9 。而我国1 3 个省市的营养调查 表明，成人每日的摄硒量仅2 6 6 3 9 9 。因此，现阶段我国缺硒现象是普遍存在的， 通过食品途径强化硒元素己成为功能性食品的研究热点之一【2 7 l 。 天然食品中的含硒量普遍较低，果蔬的含硒量较少，谷物、海洋动物、肉类( 特 别是内脏) 的含硒量稍高些，而猪肾的含量最高。仅靠天然食物中的硒并不能满 足人体的正常需要，而亚硒酸钠之类的无机硒毒性较高不能用于食品中，由于硒 的来源很不稳定，植物性食品中硒含量为土壤条件所左右，而动物性食品中特别 是鱼体中富含硒，然而多与水银结合的形式存在，不能为人所利用，因而开发含 硒食品是很有意义的p 2 。 我国的硒强化食品已涉及到乳制品、矿泉水、豆奶、饼干、谷物及其制品、 口服液、饮液( 酒) 、花茶、维生素制剂和食盐等各类食品。近年来丌发的含硒 制品有：富硒鸡蛋、富硒茶叶、富硒玉米、富硒苹果、富硒蔬菜、富硒麦芽等。 我国目前市场上富硒保健食品有：富硒茶、富硒大蒜提取物【3 3 , 3 4 l 。但发达国家获 得功能性食品基料的主要途径是富硒酵母。 1 3 硒与啤酒酵母 酵母是生物学研究中的一种理想模式生物。酵母菌具有无毒性、易生长、发 酵周期短、对微量元素吸收率高、营养成分丰富等特点，被称为g r a s ( g e n e r a l l y r e g a r d e da ss a f e ) 生物，是将无机微量元素转变为有机微量元素的理想载体1 3 5 j 。研 究表明，通过微生物合成法富集硒元素是一种开发硒食品安全有效的途径。因此， 研制富含微量元素的功能性酵母对人类及其它生物体的健康有着重要的意义，产 业化生产后可产生可观的经济价值1 36 i 。 1 3 1 酵母菌对硒的富集机制1 3 7 j 酵母富集硒元素的作用机制相当复杂，其过程一般分为胞外结合与沉积、胞 内吸收与转化等步骤。具体的富集途径有物理吸附、生物吸附、表面沉积、主 动运输和被动扩散等，其中生物吸附和主动运输为富集的主要途径。 ( 1 ) 生物吸附：生物吸附是指生物体从溶液中吸附金属离子、非金属化合物或固 体颗粒的过程，是一个吸附一解吸的可逆过程，被吸附的离子可被其它离子、螯 合剂或酸解吸下来。其机理主要为络合与离子交换。被吸附的会属离子可与生物 配位体中带负电的官能团结合而形成络合物，酵母在吸附金属离子的同时经常会 伴随其它离子，如c a 2 + 、m 9 2 + 、h + 等的释放，而且释放出的离子总电荷数大致等 于被吸附的电荷数。因而吸附的过程可以看作是一个离子交换过程，随着交换的 进行，使得硒离子在酵母细胞内得到富集。 ( 2 ) 主动运输：主动运输是微生物主动吸收胞外物质的一种方式，需要细胞提供 繁i 穆绪论 能量和载体的参与，能有效地使胞外物质在低浓度下逆浓度梯度进入细胞内，从 丽德到富集。主动运输是一个极为复杂的过程，与酵母中的糖、脂、蛋自质、无 机盐的代谢密切相关，并形成微量元素与糖、脂、蛋白质等的结合体，因此以主动运 输途径富集的硒元素具有较高的生物活性。 ( 3 ) 转运系统：通过吸收、积累的硒依靠体内的转动系统雨进入蔼体内部，进而 转化为有枫硒。g h a r i e b 等在对富硒酿酒酵母的动力学研究中发现，酵母