（水产品加工及贮藏工程专业论文）短蛸氨基多糖的提取分离及生物活性的初步研究.pdf

短蛸氨基多糖的提取分离及生物活性的初步研究 中文摘要 氨基多糖作为一类重要的生物反应调节剂，在抗肿瘤、抗衰老和免疫调节等 方面具有良好的应用前景。本论文以湛江产鲜短蛸为原料，对其做出营养评价， 通过蛋白酶酶解提取得到肌肉、消化腺、生殖腺三组织的氨基粗多糖，初步探讨 了三种粗多糖的免疫调节和抗氧化活性等。 本论文的试验内容与结果： 1 对肌肉、消化腺和生殖腺的主要营养成分、氨基酸及肌肉的脂肪酸组成进 行分析及营养评价。结果表明，肌肉中粗蛋白质含量最高达8 0 8 ，总糖含量在 三组织中大小顺序为消化腺 生殖腺 肌肉，脂肪含量在5 0 3 6 9 8 之间，灰分 含量非常接近，在5 3 8 6 0 1 之问；肌肉、消化腺和生殖腺蛋白质营养价分 别为1 0 0 、7 8 和1 0 0 ；肌肉中共检n 扣j 2 0 种脂肪酸，其中p u f a 含量为4 0 + 8 9 。 2 用蛋白酶提取氨基多糖条件的确定：分别用3 种蛋白酶酶解肌肉，确定所 用酶量为木瓜蛋白酶1 2 、枯草杆菌中性蛋白酶1 4 、胰酶0 7 ；试验6 组双酶 组合酶解肌肉，确定最佳酶组合条件为木瓜蛋白酶1 2 和枯草杆菌中性蛋白酶 1 4 ，5 0 。c ，p h 7 0 水解4 6 , 时。 3 采用提取肌肉氨基粗多糖( o o g l ) 的条件来提取消化腺( o o g 2 ) 和生 殖腺多糖( o o g 3 ) 。三种多糖的提取率分别为0 5 、5 和5 5 ，氨基多糖的含 量分别为粗品的2 8 8 7 、2 3 4 1 和2 4 8 7 。 4 采用细胞计数法检测三种多糖对k 5 6 2 细胞的抑制作用。结果显示o o g l 、 o o g 2 和o o g 3 均对细胞具有一定的生长抑制作用。 5 采用m t t 法检测三种粗多糖单独对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响。结果 显示，o o g l 和o o g 3 在0 5m g m l 时对静止脾脏淋巴细胞有明显的促进作用。 6 采用m t t 法检测三种粗多糖协同有丝分裂原c o n a 对小鼠脾脏淋巴细胞 增殖的影响。结果显示，粗多糖协同c o r t a 对小鼠脾脏淋巴细胞增殖不明显。 7 检测三种粗多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响，结果显示，各多糖 均有一定吞噬作用，o o g l 、o o g 2 、o o g 3 分别在浓度为0 5m g m l 、o 2 5m g m l 、 0 5m g m l 达到最好效果。 8 采用免疫器官法检测三种粗多糖对正常和免疫抑制小鼠的免疫调节作 用。腹腔注射c t x 造成免疫抑制模型，灌胃o o g 连续7 天，测定胸腺和脾脏重量， 计算脏体指数。0 0 g 3 能恢复免疫抑制组小鼠胸腺指数；o o g 2 和o o g 3 脾脏指数 明显高于免疫抑制组。各多糖组跟正常组相比，均能使胸腺指数显著增加，对于 脾脏指数影响效果不明显。 9 采用试剂盒进行羟白出基体系的清除试验。结果表明，一定浓度的o o g l 和o o g 2 对羟自由基有一定的抑制效果，o o g l 的最佳抑制效果为2 5 1 8 7 u m l 。 1 0 采用试剂盒进行抗超氧阴离子自由基试验。结果表明，o o g 2 和o o g 3 最佳抑制超氧阴离子效果分别达到1 9 7 2 6 u l 平f 1 1 0 6 8 5 u l ，并且1 0 7 m g m l o o g 2 对超氧阴离子抑制率达到1 6 2 4 ，比标准品高3 9 1 。 结论： ( 1 ) 短蛸是一种高蛋白低脂肪，蛋白质营养价值高，有益健康脂肪酸含量 较高的海洋食品。 ( 2 ) 从生物学活性试验可以得出，短峭的三种粗多糖均具有一定的细胞毒 作用和比较明显的免疫增强作用及一定的抗氧化作用。 关键词：短蛸，营养评价，氨基多糖，生物活性，免疫，抗氧化 p r e l i m i n a r ys t u d i e s0 ne x t r a c t l 0 na n d b 1 0 a c t i v i t i e so fg l y c o s a m i n o g l y c a n f r o m0 c 聊嬲d c 舰z 邢 a b s t r a c t g l y c o s a m i n o g l y c a n ，ab i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r , s h o w sf a v o r a b l ep r o s p e c t s o na n t i t u m o r a c t i v i t y , a n t i s e n e s c e n c e a n di m m u n o r e g u l a t i o n f r e s h o c t o p u s o c h e l l a t u sf r o mz h a n j i a n gw e r ed e t a c h e da sm u s c l e ，d i g e s t i v eg l a n da n dg o n a d t h e n u t r i e n tc o m p o n e n to fo c t o p u so c h e l l a t u sw a ss t u d i e da n dt h r e eo c t o p u so c h e l l a t u s g l y c o s a m i n o g l y c a n sw e r ee x t r a c t e d p r e l i m i n a r yi m m u n o a c t i v i t i e sa n da n t i - o x i d a t i o n o f t h r e eo c t o p u so c h e h a t u sg l y c o s a m i n o g l y c a nw e r es t u d i e d t h ec o n t e n ta n dr e s u l t si nt h i st h e s i sw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 t h en u t r i e n tc o m p o n e n t ，a m i n oa c i da n df a ta c i do fo c t o p u so c h e l l a t u sw e r e s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc r u d ep r o t e i nc o n t e n to f m u s c l ew a sh i g h e s t ( 8 0 8 ) ， f a tc o n t e n tw a sb e t w e e n5 0 3 6 9 8 ，a s hc o n t e n tw a sn e a r , b e w e e n 5 3 8 6 0 1 ， t h eo r d e ro ft o t a ls u g a rc o n t e n tw a sd i g e s t i v eg l a n d g o n a d m u s c l e ；t h ea m i n oa c i d s c o r e so ft h ep r o t e i ni nm u s c l e ，d i g e s t i v eg l a n da n dg o n a dw e r e10 0 ，7 8a n d10 0 r e s p e c t i v e l y t h e r ew e r et w e n t yf a ta c i d si nm u s c l ea n dt h ec o n t e n to fp u f aw a s 4 0 8 9 2 t h ea s c e r t a i n m e n to fe x t r a c t i o no fg l y c o s a m i n o g l y c a nf r o m o c t o p u s o c h e l l a t u s ：m u s c l eo fo c t o p u so c h e l l a t u sw a sh y d r o l y z e d b ys e v e r a le n z y m e s r e s p e c t i v e l y i tt u r n e do u tt h a to p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fe n z y m ew a s1 2 o fp a p a i n 1 4 o fs u b t i l l s i na n d0 7 o fp a n c r e a t i n a n do p t i m u mc o n d i t i o no fc o m b i n a t i o no f e n z y m e sw a sa sf o l l o w i n g ：c o m b i n a t i o no f1 2 o fp a p a i na n d1 4 o fs u b t i l l s i n h y d r o l y s i sa t5 0 。c f o r4h o u r s t h eo p t i m u mt e c h n i c a lc o n d i t i o no fe x t r a c t i n g g l y c o s a m i n o g l y c a nf r o mm u s c l ew a su s e di nd i g e s t i v eg l a n da n dg o n a d ，a n dt h e n t h r e eg l y c o s a m i n o g l y e a n sf r o m o c t o p u so c h e l l a t u s , n a m e l yo o g l ，0 0 0 2a n d o o g 3w e r eg o a o n t h ee x t r a c t i o nr a t eo fo o g l ，o o g 2a n d0 0 0 3w e r e r e s p e c t i v e l y0 5 ，5 a n d5 5 ，g a gc o n t e n tw e r e2 8 8 7 ，2 3 4 1 a n d2 4 8 7 4 t h ec y t o t o x i c i t yo fo o go nk 5 6 2c e l lw a ss t u d i e db yc e l lc a l c u l a t i o n t h e r e s u l ts h o w e dt h a to o g l ，0 0 0 2a n do o g 3a l lh a ds o m ec o t o t o x i c i t yo nk 5 6 2c e l l 5 o o g la n do o g 3a tt h ed o s eo f0 5 m g m lb o mh a dp o t e n te f f e c t so n p r o m o t i o no f n o a c t i v es p l e e nl y m p h o c y t ei nv i t r ob ym t tb i o a s s a y 6 e f f e c t so fo o ga n dc o n ao np r o m o t i o no fs p l e e nl y m p h o c y t ei nv i t r ow e r e n o tp o t e n tb ym t t b i o a s s a y 7 o o ga l lh a d p o t e n t e f f e c to n p h a g o c y t o s i s o fm o u s e p e r i t o n e a l m a c r o p h a g o c y t e o o g i ，o o g 2a n do o g 3r e s p e c t i v e l yh a db e s te f f e c t s a tt h e c o n c e n t r a t i o no fo 5m g m l 0 2 5m g m la n d0 5m g m l 8 i m m u n o r e g u l a t o r ye f f e c t so nn o r m a la n di m m u n o s u p p r e s s e dm i c ew e r et e s t e d b ym e t h o do fi m m u n eo 曜a n s m o d eo fi m m u n o s u p p r e s s e dm i c ew e r em a d eb y i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no fc y c l o p h o s p a m i d e a f t e ri n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o no f o o gf o r7 d a y s ，t h y m u s e sa n ds p l e e n sw e r ew e i g h e d i tt u r n e do u tt h a to o g 3c o u l d r e m a r k a b l yr e s m n et h y m u si n d e xi ni m m u n o s u p p r e s s e dg r o u p o o g 2a n do o g 3 h a dr e m a r k a b l ee f f e c t so ns p l e e ni n d e xo fi m m u n o s u p p r e s s e dg r o u p a l lt h eo o g g r o u p si n c r e a s e dt h y m u si n d e xr e m a r k a b l ya n ds h o w e dn oo b v i o u si n f l u e n c eo n s p l e e ni n d e xc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lg r o u p 9 i tt u r n e do u tt h a to o g1a n do o g 2h a ds o m ee f f e c t so fs c a v i n go n o hw i t h m e t h o do f r e a g e n tb o xa n dt h eb e s ti n h i b i t o r yr e s u l to f o o g li s2 5 1 8 7u m l 1 0 w i t hm e t h o do fr e a g e n tb o x ，i tt u r n e do u tt h a tb e s tr e s u l to fo o g 2a n d o o g 3h a dp o t e n ts c a v i n ge f f e c t so no 2w e r e1 9 7 2 6u l u n d1 0 6 8 5u lr e s p e c t i v e l y ， i n h i b i t o r yr a t eo f o o g 2w a s1 6 2 4 ，i n c r e a s e d3 9 1 c o m p a r e dw i t hs t a n d a r d c o n c l u s i o n ： ( 1 ) o c t o p u so c h e l l a t u si sas e a f o o dt h a th a sh i g h e r p r o t e i na n dl o w e rf a t ，v e r y h i g hp r o t e i nn u t r i t i v ev a l u e ，m o r eh e a l t h yf a t t ya c i d ( 2 ) o o gh a ss o m ec y t o t o x i c i t y , o b v i o u si m m u n o a e t i v i t i e sa n ds o m ee f f e c t so f a n t i o x i d a t i o nf r o mt e s t so fb i o l o g i c a la c t i v i t y k e yw o r d s ：o c t o p u so c e l l a t u s ；n u t r i t i o ne v a l u a t i o n ；g l y c o s a m i n o g l y c a n ； b i o a c i t i v i t y ；i m m u n o a c t i v i t i e s ；a n t i o x i d a t i o n c o n a c r x d m s o g a g o o g 主要缩略词及其含义 c o n c a n a a l i n c y c l o p h o s p h a m i d e d i m a t h y ls u l f o x i d e g l y c o s a m i n o g l y c a n o c t o p u so c h e l l a t u sg l y c o s a m i n o g l y c a n 刀豆蛋白 环磷酰胺 二甲基亚砜 氨基多糖 短蛸氨基粗多糖 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 本学位论文成果归广东海洋大学所有。 指导教师签名：曾珐拳 知“年6 月亿日 研究生签名： 上t 舻6 月 敬仰 垃日 广东海洋大学硕士学位论文 1 绪论 前言 浩瀚的海洋约三亿六千多万平方公里，占整个地球表面的7 l ，地球上的生 物资源8 0 生存在海洋里。海洋不仅是人类获取食物的重要来源，也是取之不尽 的天然药物宝库【l 】。海洋生物能够产生一些粘性物质或多糖类聚合物，与蛋白质、 脂肪、核酸等其它生物大分子相比，糖类具有更强的亲水性。这表明海洋生物通 过合成多糖类物质，以保持体内生命活动所需要的自由水分，柬适应海洋这个特 殊的环境；同时也启迪人们，海洋生物中多糖承担着重要的生理功能，是一类重 要的活性物质。从各种海洋生物中分离的多糖，已证明具有各种各样的生理调节 功能。 海洋生物活性多糖成分主要包括海洋动物活性多糖、海洋植物多糖和海洋微 生物多糖。目前国内外己从多种海洋动物中分离到活性多糖成分，如：甲壳类动 物的甲壳素1 2 ，软骨鱼骨中的硫酸软骨素，多孔动物海绵口】，棘皮动物海参、海 星中的硫酸多糖，软体动物扇贝、文蛤、鲍鱼、海兔等中的糖蛋白或氨基多糖等。 海藻是无机物的天然富集器和有机物的制造者，是天然活性物质的反应器，多糖 在海藻中含量丰富，约占干重5 0 以上，是海洋多糖药物开发的重要资源。海洋 微生物种类数量繁多，其中相当一部分是前所未见的新种类，加之进化地位特殊、 代谢类型多样，因此具有产生活性物质的巨大潜能 4 1 。海洋微生物已经成为开发 海洋药物的后起新秀。 1 1 氨基多糖概述 氨基多糖( g l y c o s a m i n o g l y c a n ，g a g ) 又称粘性多糖( m u c o p o l y s a c c h a r i d e ) 、 酸性多糖、结缔组织多糖等，是含氨基的一类多糖，是动物体内的一类重要大分 子物质。氨基多糖是动物组织中蛋白聚糖( p r o t e o g l y e a n ，p g ) 的糖链部分，通过共 价键( 糖肽键) 与p g 的核心蛋白的氨基酸相连。常见的连接方式有三种：d 木 糖与l 丝氨酸羟基结合成0 糖肽键、n 乙酰氨基葡萄糖与天门冬胺氨基构成n _ 糖肽键、n 乙酰半乳糖与l 苏氨酸羟基构成o 糖肽键。 1 1 1 氨基多糖的生物功能与活性 自1 9 1 6 年首次发现肝素以刑卯，肝素的特殊生物活性引起了人们的极大兴趣， 对其结构研究的同时也对其生物功能与活性进行研究。这同时也促进了其它氨基 多糖的发现，并对其构效关系进行深入探究。七十年代后，化学、生物学、生物 化学、医药学和临床医学的发展，对氨基多糖的构效关系的研究取得了很大进展。 短蛸氨基多糖的提取分离及生物活性的初步研究 目前关于动物多糖在生物学、医学范围内的研究正在不断深入展开。 氨基多糖的生物功能与其结构具有密切关系，其聚阴离子性质及其在水溶液 中的不同构象是它们多种生物学作用的基础。氨基多糖是结缔组织无定形基质的 重要成分，控制各种各样的运动分子的转运，对机体细胞和组织的代谢过程有着 深远影响；在维持组织及机体的整体结构、保持细胞外液的稳定性方面起着重要 作用；氨基多糖阴离子基团易于和n a + 、k + 、m ，+ 、c a 2 + 等离子结合，凋节这些 离子在组织中的分布，调节细胞外液中电解质浓度，并在成骨过程中起重要作用， 其持水性和高度粘滞性具有润滑与减震功能( 6 】。，氨基多糖所形成的网状结构能 阻止细菌和病毒的侵入，对组织起保护作用，并可促进创伤愈合。对于细胞而苦， 细胞膜、胶原纤维、胞外原纤维、包围胶原纤维和弹性纤维的胞外无定形基质物 质一所有这些重要物质都含有氨基多糖，并起重要作用【7 。u i f 指出，氨基多糖 影响着体内胶原和蛋白多糖的聚合，维持组织的刚性，某些氨基多糖影响体内原 胶原单体形成胶原纤维，并对胶原纤维的性质产生影响。从生物合成角度看，氨 基多糖直接或间接地影响细胞分裂、生长和分化过程；氨基多糖表现出对依赖 d n a 的d n a 核苷酸转移酶、r n a 核苷酸转移酶和依赖r n a 的d n a 核苷酸转移酶 的竞争性抑制l l 。王长云认为，氨基多糖对免疫系统的作用将会引起人们的高度 重视。免疫学试验表明，氨基多糖可作为抗原物质【1 l 】。氨基多糖的功能还有：维 持肾中尿液浓度，储存和释放生物活动所产生的胺，以保持运输媒介的稳定【“。 氨基多糖具有抗凝血活性【l2 1 ，是血小板凝集物中的辅助因子，也是角膜水合性能 的控制因素【1 0 1 。 多糖是一类结构复杂的生物大分子，与蛋白质和核酸相比，它的结构还要复 杂得多。因此每个多糖单位所携带的生物信息量也非常多 1 3 。多糖作为含生物信 息的受体识别物质，它的研究己成为生命科学的中心。 由于各种氨基多糖的结构具有特异性，每种氨基多糖都具有各自的特殊生物 功能。肝素具有抗凝血、降血脂、抗肿瘤等特殊生物活性。肝素参与脂肪运输， 并具有抗凝血酶原的特殊功能，从而阻止血栓形成【1 4 1 。所有进出细胞的物质必须 通过基质，基质的状况和组成的变化对单个细胞和组织的生命具有深远影响，而 肝素在基质的分解和合成中起着重要作用【”】。透明质酸广泛存在于各类细胞质膜 的间质中，因其分子内部的高度水合作用赋予组织高度弹性，增强了组织对压力 的抵御能力【l “。透明质酸水溶液具有最高粘性，具有润滑和减震功斛 】。透明 质酸还能形成具有过滤作用的筛状结构，从而防止组织免受细菌、真菌和病毒的 侵害。此外，透明质酸还能促进细胞聚集，形成胶状基质；调节c a 2 + 、p o 。3 + 、 k 十、s r 2 + 等离子的转运及其浓度【16 1 。m 砒e w s 【8 】提出，软骨的韧性和柔性是源于 连接在原纤维胶原上的硫酸软骨素一蛋白质复合物的大分子集合体。软骨中氨基 广东海洋大学硕士学位论文 多糖具有保护功能，其中，4 一硫酸软骨素是重要组分。6 硫酸软骨素与关节表面 的完整性有关【l 。硫酸角质素的功能主要是在维持角膜形态形成和角膜通透性方 面起十分重要的作用。氨基多糖的生物功能与活性远未被完全揭示，对其构效关 系的研究尚需进一步深入。对氨基多糖的功能与活性的研究，将在生物化学、分 子生物学、生理学、病理学、药理学以及临床医学中取得令人瞩目的成果。 1 1 1 1 氨基多糖的免疫及抗肿瘤活性 肿瘤是当今人类的重要死因，而肿瘤免疫在遏止肿瘤发生、发展及转移中有 着极为重要的作用。人体之所以会发生肿瘤，其原因一般认为是肿瘤患者的免疫 功能低下所致。一般是提高宿主免疫功能或对肿瘤细胞呈细胞毒作用，以抑制肿 瘤生长。对大量海洋动物的研究表明，海洋动物体内g a g 具有明显的抗肿瘤活 性。鲨鱼软骨素c s 4 年 i 肝素可通过n k 细胞对肿瘤细胞起抑制作用i 】9 1 。攀可通过 激活免疫细胞粘附肿瘤细胞的能力，同时增强白细胞的免疫粘附和杀伤作用，从 而抑制了肿瘤细胞的运行和淋巴结的转移1 2 0 】。从缸鱼软骨中提取出一种氨基多糖 ( r a yc a r t i l a g ee x t r a c t ，r c e ) ，药理实验证明，r c e 对小鼠s 1 8 0 肉瘤具有强大抑制 作用，使小鼠的脾脏和胸腺指数显著提高，能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞酸性磷 酸酶活性，使巨噬细胞吞噬和清除异物功能明显增强，显示具有抗肿瘤和免疫功 能1 2 ”。文蛤多糖对小鼠移植性肿瘤有显著的治疗效果，对环磷酰胺损伤免疫功能 造成的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫功能低下具有保护作用【22 1 。海参多糖 具有明显的增强机体免疫调节机能的作用f 2 3 】。从皱纹盘鲍中提取的鲍鱼多糖能够 明显增加巨噬细胞吞噬能力，增强迟发超敏反应。这种免疫增强作用可能是其抗 肿瘤作用的机理【2 4 j 。早期研究表明，阿氏辐肛参翻c t i n o p y g a a g a s s i z i ) 的粮制剂对 s - 1 8 0 肉瘤、k r e b s i i 型腹水癌有显著抑制作用 2 5 】。玉足海参( h o l o t h u r i a l e u c o s p l i l o t a ) 粗提物对h e l a 细胞株、小鼠s 1 8 0 有一定的抑制作用。 1 1 1 2 抗氧化活性 超氧阴离子自由基、羟自由基等含氧的自由基称为氧自由基。一般认为氧自 由基的增多是导致机体衰老的主要原因，多糖对物理的、化学的及生物来源的多 种活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 具有清除作用，能减少脂质过氧化产物 丙二醛( m d a ) 的生成量，增加超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( g s h p x ) 活性等。药理研究表明花刺参( s t i c h o p u sv a r i e g a t e ss e m p e r ) 提取物能显 著提高小鼠红细胞s o d 活性，具有延缓衰老作用。同时，海参可以延长果蝇的 寿命，增加小鼠免疫器官胸腺和脾脏的重量。 1 1 1 3 抗病毒作用 多糖类物质能强烈干扰病毒的初始侵染( 吸附和入侵) 过程，并最终与病毒 形成无感染力的多糖一病毒复合物，对病毒在宿主细胞中的复制和包装也有一定 短蛸氨基多糖的提取分离及生物活性的初步研究 的抑制作用。硫酸化多糖是抗h i v 等病毒的新型药物，疗效显著，已引起科学家 们的广泛关注。从海洋生物中分离的多糖往往具有高度硫酸化的特点，是开发抗 病毒特别是抗h i v 的熏要资源。中国海洋大学从海藻中提取分离的2 种硫酸多糖 9 1 1 和p s 一8 7 0 具有显著的抗h i v 作用【2 6 j 。 1 1 1 4 抗凝血作用 表1 1 各种动物g a g 的抗凝血活性( i u m g ) t a b l - 1a n t i c o a g u l a n ta c t i v i t i e so f g a gf o r md i f f e r e n ta n a i m a l s ( i u m g ) 生物种类g a g 种类 抗凝血活性( i u m g ) 海胆硫酸岩藻聚糖8 海鞘h p y r i f o m i s s p l i c a t a a m g r a 鲨鱼 海参l g r i s e a 哺乳动物 猪 硫酸皮肤素( d s ) 硫酸皮肤素( d s ) 硫酸皮肤素( d s ) 硫酸软骨素c ( c s - c ) 天然g a g 部分脱盐藻糖化g a g 脱硫g a g 羧基还原后的g a g 肝素 低分子肝素 软骨粘膜中硫酸皮肤素( d s ) 硫酸酯化硫酸皮肤素( d s ) 粘膜中的硫酸皮肤素( d s ) 冠心病是冠状动脉粥样硬化引起冠状动脉阻塞造成心肌缺血，而在动脉粥样 硬化的病因中，血液凝固过程的改变，血小扳聚集，血栓形成是重要的危险因素。 近年来，有人试图通过寻找延缓凝血过程的药物防治动脉粥样硬化。药用氨基多 糖中，肝素类药物是突出代表。肝素的抗凝特性已广泛用于医药、临床化学和生 物化学中，在预防动脉粥样硬化以及抗肿瘤等方面也有一定作用【l ”。h e m a k e r l 2 7 j 研究指出，肝素的有效抗凝作用主要是抑制凝血酶生成速率和加速凝血酶活性衰 减。肝素【2 8 】虽具有抗凝血作用，但作用强大，剂量不易控制，往往会引起出血等 副作用，人们希望寻找肝素代用品或改变肝素的分子结构，这就出现了目前应用 的一些抗凝血作用缓和的酸性粘多糖类药物，这些药物对冠心病的有益作用在一 定程度上与其抗凝血作用有关。冠心舒和硫酸软骨素a 等用于防治冠心病和脑血 管病，能缓解心绞痛，取得了肯定的效果。不同结构的g a g 其抗凝血活性有着 显著的差异，尤其是g a g 糖链上取代基团对其活性有重要的影响。如海鞘 a s c i d i a nn i g r a 中含有6 - o s 0 3 h ，无明显的抗凝血活性，而s t y e l ap l i c a t a 和 4 8q叫刮黔如2 b 4 广东海洋大学硕士学位论文 h a l o c y n t h i ap y r i f o r m i s 中是4 - o s 0 3 h ，具有一定的抗凝血活性。郝秀兰从姥鲨鱼 软骨、结缔组织中提取的g a g 具有抗凝血酶样作用，其作用机制与肝素一致【2 9 】。 玉足海参酸性粘多糖( h l p ) 的家兔体外和静注实验证明它抗凝血作用显著，效应 强度与浓度成正相关。h l p 在体外明显延长血浆凝血酶时间( t t ) 、白陶土部分 凝血活酶时间( k p t t ) 、大鼠血浆凝血酶原时问( p t ) 的最低浓度为2 8 、1 2 、 2 1 0g g m l 30 1 。 1 1 1 5 降血脂作用 许多研究指出，心血管疾病的发生往往与血中血脂及胆固醇含量偏高有关。 李德远【3 l 】发现，海带岩藻糖胶经口服能有效降低小鼠的高胆固醇血清t c 水平， 最佳剂量为1 5 0m g k g ，在入药后4h 左右作用明显，同时1 5 0m g k g 剂量也能 较好地防止高胆固醇血症的形成，因而有降脂、维护心血管正常功能的作用。海 藻多糖中的羊栖菜多糖、海带多糖、紫菜多糖经动物实验证明有显著降血- 糖作用， 具有依赖性低、毒副作用小的特点，有待于进一步研究和开发。侯建明等【3 2 】发现 以不同剂量( 1 、2 和3 ) 海洋生物多糖( a c 1 ) 掺入高能低纤饲料中饲喂大、小 鼠，能明显阻抑大鼠肠道对脂类的吸收；降低大、小鼠的血浆甘油三酯和胆固醇。 徐家敏等口3 】观察了海洋硫酸多糖9 1 6 对实验性高脂血症大鼠血浆中游离含硫氨 基酸水平的影响，结果表明，高脂血症大鼠血浆中含硫氨基酸均比对照组明显升 高；9 1 6 给药组能够明显降低血浆中含硫氨基酸的水平。 2 海洋动物g a g 的研究现状 癌症、心脑血管疾病、爱滋病等疾病已经严重影响到人类的健康。据w h o 统计，每年全世界有1 7 0 0 万人死于心脑血管病，6 3 0 万人死于癌症，1 5 0 0 万死于 高血压，1 4 0 0 多万死于艾滋病。面对如此严重的生存挑战，人类迫切需要新药的 开发和应用。随着现代医药科学技术的飞速发展和高科技领域的重大突破，占地 球表面积7 l 的海洋成为人类开发新药的重要来源。海洋药物的开发和应用成为 2 l 世纪新药研究的一大重点。 氨基多糖在许多生物学、生理学和病理学过程中起着重要的作用，诸如抗凝 血、抗肿瘤、降血脂、抗炎、抗病毒等，已引起世界医药界的广泛关注。鉴于氨 基多糖的特殊生物功能和生物活性，人们已经在利用外源性氨基多糖的生物活性 研制有效药物防治某些疾病方面取得很大进展。人们从各种动物中提取分离氨基 多糖，并进行筛选，试图找到有效的氨基多糖类药物，显示了作为药用氨基多糖 的广阔前景。氨基多糖的提取纯化和分离技术不断改进，有许多现代生化技术已 被应用。 国内对氨基多糖在海洋生化制药方面进行了尝试，主要集中在海洋动物中， 人们对鲨鱼 3 4 】( 软骨) 、海星、刺参口5 3 6 】( 体壁及内脏) 等中的糖胺聚糖进行了 研究。对刺参糖胺聚糖的理化性质、生理活性、药用价值的研究表明，刺参糖胺 短蛸氨基多糖的提取分离及生物活性的初步研究 聚糖是一种类肝素样物质，具有抗凝血、抗肿瘤活性；海星糖胺聚糖具有抗凝血 和降低血浆胆同醇的作用；避鱼软骨糖胺聚糖也显示出抗凝向作用。 近十年，国外对海洋动物( 以及海洋微生物) 糖胺聚糖的研究r i i l 益高涨。 人们从海参体壁、乌贼皮、乌贼头软骨、乌贼角膜、甲壳类动物、鲸软骨、鲨鱼 软骨、火西洋鳐鱼皮等提取分离出各种糖胺聚糖，并对其性质、结构和生物活性 做了深入研究。e h r h c h 对乌贼( 触角) 和十多种甲壳类动物( 头部及内脏) 的糖 胺聚糖的结构和抗凝活性进行了比较研究，发现乌贼糖胺聚糖类似硫酸软骨素和 硫酸乙酰肝素，而红蟹糖胺聚糖的抗凝活性达6 6i u m g ，显示了药用糖胺聚糖的 广阔前景。 1 1 3 氨基多糖提取方法概述 获得组成单一的氨基多糖是对氨基多糖的性质、结构、功能、生物合成和代 谢过程的基础。氨基多糖是蛋白多糖的糖链部分，众多氨基多糖以共价键( 糖肽 链) 与蛋白相连，自然状态下，氨基多糖与蛋白质共存。氨基多糖长链问、氨基 多糖链与蛋白链间通过非共价键形成具有螺旋、折叠、盘绕、卷曲空间构象的大 分子聚集体。氨基多糖的提取分离首要问题是在多糖不被显著降解的条件下去除 结合的蛋白质 3 7 1 。提取分离氨基多糖不仅要破坏蛋白多糖聚集体的次级键( 这只 能分离蛋白多糖) ，还要降解核心蛋白链，更主要的是要破坏多糖链与蛋白质的 共价结合( 糖肽链) ，从而释放出多糖链，提取分离后得到所需氨基多糖。 早先用于提取蛋白质氨基多糖的方法，总体上是经水、氯化钠、醋酸钠或三 氯醋酸溶解提取，再除去蛋白质、纯化后得到粗制提取物。5 0 年代以后，普遍采 用碱提取法和( 或) 蛋白酶水解法。碱提取法是基于蛋白多糖中的糖肽键对碱的 不稳定性。提取过程应该在温和条件下，以避免氨基多糖的碱降解。由于肝素、 硫酸乙酰肝素、硫酸角质素等的硫酸基经碱处理后易发生w a l d e n 转化或形成3 ，6 内醚衍生物而发生脱硫现剩3 8 l ，因此，碱提取法不适合该类多糖的提取。中性盐 - 弱碱提取法( 妻u k c l k c 0 3 混合液) 对4 一硫酸软骨素和6 一硫酸软骨素的提取十分 有效【10 1 。 近年来人们对其他提取方法进行了研究。蛋白酶水解法是提取氨基多糖的理 想方法。用蛋白酶水解时，所用蛋白作用的肽键应该广泛，以便使蛋白质充分水 解，常用的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶【3 9 1 。王长云、管 华诗的研究表明，在不改变糖链结构的前提下先用碱处理，再用蛋白酶水解，对 氨基多糖的释放十分有效。王长云认为采用两种( 或者两种以上) 酶制剂以加强 水解作用是必要的，如胃蛋白酶和胰蛋白酶结合，胃蛋白酶和胰匀浆结合。胰匀 浆本身是一种复合蛋白酶水解抑制剂。新鲜猪胰脏剔尽脂肪后捣碎，经胰蛋白酶 活化制成的胰匀浆，除含胰蛋白酶外，还含有胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羟肽 酶a 和羟肽酶b 。胰匀浆作用广泛，价值低廉，适于大量提取时使用。王长云已 6 广东海洋大学硕士学位论文 成功的将胃蛋白酶和胰匀浆运用于扇贝氨基多糖的提取分离中1 4 。 1 1 4 氨基多糖分离方法概述 几乎所有动物多糖和低聚糖都与蛋白质相连，多糖与蛋白质的结合不是物理 或离子结合，而是共价结合。鉴于蛋白酶难以断裂糖肽键及其附近肽键，提取所 得多糖可能保留较长的肽段，在一系列提取分离过程中，完全除去与氨基多糖以 糖肽键共价结合的蛋白质( 肽或氨基酸残基) 是很难的，又由于同一组织中存在 多种蛋白多糖，而每种蛋白多糖又含不止一种氨基多糖。因此，在去除蛋白质后， 对混合多糖的分级方法是提纯氨基多糖的必经之路。 1 1 4 1 沉淀法 在众多的分级方法中，沉淀法是最简便常用的方法。常用沉淀剂有乙醇、钡 盐或锌盐( 用于皮肤软骨素) 、硫醇铵一吡啶( 用于透明质酸) ，乙酸钾沉淀法已 成功用于肝素的工业化生产中 3 8 1 。 1 1 4 2 离子交换剂 离子交换色谱早已在氨基多糖的分级方法中广泛应用。离子交换树脂柱的分 离原理是根据离子特性的差异，如氨基多糖中己糖醛酸的羧基和硫酸基的取向、 类型及数量差异，用不同离子浓度的n a c l 溶液沈脱而分离。离子交换色谱相对于 其他分离方法的优点在于上柱前不必浓缩。色谱柱本身从溶液中吸附多糖，从而 起到浓缩的作用。目前许多商业化离子交换树脂，尤其是多糖基离子交换树脂己 在分离中运用，如d e a e 一纤维素 4 1 , 4 2 1 、d e a e s e p h a d e x 、e c t e o l a 一纤维素等。 低分子量氨基多糖用离子交换色谱更为理想。k e n n e d y 认为c p c 纤维素和 d e a e 一5 2 一纤维素比其他离子交换剂效果更好。迄今为止，尚无一种色谱法能将 氨基多糖完全分开。 1 1 4 3 其他方法 大量文献报道将平板技术用于氨基多糖的分离，主要应用于氨基多糖的分析 测定，如薄层色谱、纸色谱、醋酸纤维素膜色谱、双向电泳、带状电泳、平板电 泳、琼脂糖凝胶电泳。氨基多糖在电场作用下发生移动是基于重复二糖单位上的 负电荷数量，即己糖醛酸基的羧基和半脂化硫酸基组成的负电荷数量。有文献报 道将几种不同的方法结合起来使用可提高分离效果。k a r a m a n o s 将离子交换法、 凝胶色谱和密度梯度离心法结合起来用于乌贼皮中软骨素的提取分离。 1 1 4 4 再分级 对于相对“纯”的单一组分的氨基多糖样品来说，因其分子量的分散性、残留 氨基酸或肽段的不均一性以及其他结构的不一致性，还不适合进一步的精细的结 构分析，因此有必要对样品进行进一步分级分离即再分离。 1 1 4 5 电泳鉴别 电泳法是鉴别糖胺聚糖是最常用的方法之一。由于糖胺聚糖长链分子中分布 短蛸氨基多糖的提取分离及生物活性的初步研究 着羟基和硫酸基等酸性基团，使分子具有强酸性，即聚阴离子特性，在电场的作 用下，由阴极向阳极泳动。相对迁移率不同是由于各种糖胺聚糖的特性具有差异， 如糖胺聚糖、己糖醛酸的羧基和硫酸基的取向、类型及数量不同，在电场作用下 电泳相对迁移率则不同，同时，糖胺聚糖的相对迁移率与重复单位平均阴离子基 团数有关。冈此，对各种氨基多糖的电泳行为进行分析，便可对其组成进行分析 鉴定。 k e n n e d y ( 1 9 7 9 ) 指出，尽管分离方法很多，有些方法已很先进，但尚难将各 种糖胺聚糖完全分丌。这是因为有许多限制因素，如分子量的分散性、硫酸化程 度的不+ 致性、显微结构的不均匀性、肽或氨基酸残基数量的多变性以及两种硫 酸软骨素的结构相似性，所有这些因素使糖胺聚糖出现显著的化学上重叠。况且， 在一个特定蛋白多糖分子中，i 叮能含有一种以上的多糖链，这些多糖链在结构e 有局部变化，但总体结构模式相同，因此，很难获得绝对意义上“纯”的大分子样 品，而糖胺聚糖的结构也只能通过假设确定。 1 1 5g a g 的理化性质与结构研究 g a g 的理化性质主要指的是g a g 的纯度鉴定、相对分子量以及化学组成。获 得单一多糖组分后，必须对其纯度进行鉴定。多糖是大分子，纯度不能用通常化 合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观也并不均一，仅代表相似 链长的多糖分子的平均分布。通常所谓的纯品实际上也只是一定相对分子质量范 围的多糖的均一组分。目前常用于多糖纯度鉴定的方法有凝胶过滤法、高压电泳 法、超离心法、旋光测定法、毛细管电泳法等。其中应用最多的是凝胶层析法， 浚法的准确度高。也有人将旋光度作为一种纯度鉴定的标准。若多糖用两种以上 的方法分成不同的部分，都具有相同的成分和性质，可以认为此多糖是单一的， 不含有其他种多糖，判断可根据糖基的摩尔比恒定，纸层析呈现一条带，高效液 相层析，凝胶成d e a e 一纤维素柱呈现一个峰来确定。 ( 1 ) 超离心法i ”1 微粒在离心力场中的速度与微粒的密度、大小与形状有关。如果某一种多糖 在离心力场作用下形成单一区带，则表明其分子量的密度、大小和形状相似。 ( 2 ) 高压电泳法 多糖在电场作用下，按分子量大小、形状及所带电荷的不而移动不同的距离。 中性多糖虽不带电荷，但它分子中若有顺式的邻位二醇