（发酵工程专业论文）鸡源益生芽孢杆菌的筛选、发酵工艺优化及益生特性.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 芽孢杆菌不仅有抑制常见病原菌生长的能力，还能产生多种营养物质，是益 生菌菌种开发的重要来源。本文筛选了4 株对低p h 和高胆盐的耐受性、产酶特性 和对病原菌的抑菌效果较好的芽孢杆菌，对其中一株芽孢杆菌发酵工艺进行了优 化，并以该芽孢杆菌作饲料添加剂进行了小鼠喂养实验。 根据菌体对低p h 和高胆盐的耐受性、产酶特性和对病原菌的抑菌效果，对从 家鸡肠道中分离的芽孢杆菌进行了筛选。以3 种畜禽常见病原菌( 金黄色葡萄球 菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌) 为指示菌，对这些芽孢杆菌发酵液的抑菌效果进 行分析，有4 株芽孢杆菌( a 2 、c 5 、c 1 9 和d 8 ) 具有较好的抑菌效果。这4 株菌在 p h3 0 和高胆盐条件下的存活率都达到6 0 以上，产淀粉酶和蛋白酶的能力也较 好，表明这些菌株具有作为益生菌的丌发潜力。经形念学和生理生化反应鉴定， 初步确定a 2 和d 8 为地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) ，c 5 和c 1 9 为蜡样芽孢 杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 。 为了提高芽孢杆菌a 2 发酵液的活菌含量，对其培养条件进行了优化，该菌株 摇瓶培养的最适培养条件：接种量为4 ，接种菌龄为1 6 1 8h ，初始p h 值为7 2 ， 装液量为5 0m i _ 2 5 0m l ，摇瓶转速为1 8 0r m i n ，培养时l 日j 为2 4h 。 采用p l a c k e t t b u r m a n 设计法和响应面分析法对芽孢杆菌a 2 初始发酵培养基进 行优化。优化后的培养基为：可溶性淀粉5g l ，尿素1 2 9g l ，k 2 h p 0 46g l ， k h 2 p 0 43g l ，m n s 0 4 。h 2 00 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 1g l ，豆粕1 0g l 和酵母粉 0 9 9g l 。在此条件下，发酵液中a 2 的活菌含量可以从优化前的4 7 3 x 1 0 1 0c f u m l 提高到1 3 0 x 1 0 1 1c f u m l 。 将芽孢杆菌a 2 按1 0 6c f u g 的添加量添力n n d , 鼠饲料中，对其益生效果进行 了评价。饲养小鼠2 8d 后，添加芽孢杆菌组的小鼠体重与对照组相比平均增重了 1 1 4 0 ，小鼠的料重比平均下降了1 6 3 4 ；芽孢杆菌外i 小鼠空肠内容物中蛋白酶 的活性平均增加了3 0 1 8 ，淀粉酶的活性平均增加了4 1 7 7 。小鼠胸腺指数与脾 脏指数到达峰值时，芽孢杆菌组小鼠胸腺指数与脾脏指数均显著高于对照组 ( p 0 0 1 ) 。用m t t 法作t 淋巴细胞增殖试验，芽孢杆菌组小鼠脾淋巴细胞增殖 反应显著高于对照组( p 0 0 1 ) 。以上结果表明地衣芽孢杆菌a 2 能增加小鼠空肠内 容物中蛋白酶、淀粉酶的活性，提高饲料的利用率，对小鼠免疫功能的提高能起 到定作用。 湖北工业大学硕士学位论文 关键词：芽孢杆菌，筛选鉴定，工艺优化，响应面法，动物实验 i i 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t i n h i b i t i n gt h eg r o w t ho fc o m m o np a t h o g e n i cb a c t e r i aa n dp r o d u c i n gn u t r i t i o u s s u b s t a n c e sm a k eb a c i l l u ss p p o n eo ft h em o s tp o t e n t i a ls o u r c e so fp r o b i o t i c s i nt h i s p a p e r f o u rb a c i l l u ss t r a i n sw h i c hs h o w e db e t t e rt o l e r a n c ew i t hl o wp ha n dh i g hb i l e s a l t p r o d u c t i v i t yo fe n z y m ea n di n h i b i t i o no fa n i m a lp a t h o g e n i cb a c t e r i aw e r es c r e e n e d f e r m e n t a t i o np r o c e s so fo n eb a c i l l u ss t r a i nw a so p t i m i z e d f i n a l l y ，t h eb a c i l l u ss t r a i n w a su s e da sf e e da d d i t i v et om i c ei naf e e d i n ge x p e r i m e n t b a c i l l u ss t r a i n sw e r es c r e e n e df r o mi n t e s t i n eo fd o m e s t i cc h i c k e na c c o r d i n gt o t h e i rl o wp ha n dh i g hb i l es a l tt o l e r a n c e p r o d u c t i v i t yo fe n z y m ea n di n h i b i t i o no f a n i m a lp a t h o g e n i cb a c t e r i a b a c t e r i o s t a s i se f f e c t so ft h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho ft h e s e b a c i l l u ss t r a i n sw e r ee v a l u a t e du s i n gec o l i ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u ma si n d i c a t o rb a c t e r i a f o u rb a c i l l u ss t r a i n s ，a 2 ，c 5 ，c 19a n dd 8 ，s h o w e d g o o da b i l i t yo fb a c t e r i ai n h i b i t i o n s u r v i v a lo ft h ef o u rs t r a i n sa l le x c e e d e d6 0 i nl o w p ha n dh i g hb i l ee n v i r o n m e n t t h es t r a i n sa l s os h o w e dg o o dp r o p e r t i e si np r o d u c t i o no f a m y l a s ea n dp r o t e a s e a l lt h e s ed e m o n s t r a t e dt h ef o u rb a c i l l u ss t r a i n sh a dt h ep o t e n t i a l t os e r v ea sp r o b i o t i c s p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t ss h o w e dt h a ta 2a n dd 8w e r e b a c i l l u sz i c h e n i f o r m i s w h i l ec 5a n dc19w e r eb a c i l l u sc e r e u s i no r d e rt oe n h a n c et h ec o n t e n to fli v eb a c i l l u sa 2 ，t h ec u l t u r ec o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e f o l l o w i n g s ，i n o c u l a t i o na m o u n tw a s4 ，s e e dc u l t u r et i m ew a s1 6 - 1 8h ，i n i t i a lp hw a s 7 2 ，l i q u i dv o l u m ei nf l a s k ( 2 5 0m u w a s5 0m l ，r o t a t es p e e dw a s18 0r m i n ，c u l t u r e t i m ew a s2 4h p l a c k e t t b u r m a na n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw e r eu s e dt oo p t i m i z et h e f e r m e n t a t i o nm e d i u mo fb a c i l l u sa 2 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u mw a so b t a i n e d a sf o l l o w i n g s ，s o l u b l es t a r c h5g l ，u r e a1 2 9 lk 2 h p 0 46g lk h 2 p 0 43g l m n s 0 4 。h 2 00 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 1g l ，s o y b e a nm e a l1 0g la n dy e a s tp o w d e r 0 9 9 彰l t h ec o n t e n to fl i v eb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa 2s t r a i ni n c r e a s e df r o m4 7 3 x 1 0 “ c f u m lt o1 3 0 x1 0 “c f u m la f t e rm e d i u mo p t i m i z a t i o n 1 0 0c f u go fb a c i l l u sa 2w a sa d d e dt om i c ed i e ta n di t sp r o b i o t i ce f f e c t sw e r e e s t i m a t e d c o m p a r e dt oc o n t r o lg r o u p ，t h eb a c i l l u sf e e dg r o u p sb o d yw e i g h ti m p r o v e d b y1 1 4 0 ，f e e d - w e i g h tr a t i od e c r e a s e db y1 6 3 4 ，p r o t e a s ea n da m y l a s ea c t i v i t yi n i e j u n a lc o n t e n t si n c r e a s e db y3 0 1 8 a tt h e2 8 t hd a y t h y m u si n d e xa n ds p l e e ni n d e xo f b a c i l l u sf e e dg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ( p l tl 局一6 0 2 5 1 7 3 5 1 3 3 3 4 7 2 3 6 0 0 1 7 8 0 4 犯 1 1 6 2 51 7 3 5 1 3 30 6 6 9 9 7 70 5 3 2 5 6 5 局 1 1 8 7 51 7 3 5 1 3 30 6 8 4 3 8 50 5 2 4 1 5 8 x j x l一5 7 8 7 5 2 5 5 4 0 4 7 2 2 6 6 0 10 0 7 2 8 0 1 眦一1 1 2 4 5 3 8 4 9 一o 4 4 8 2 8 0 6 7 2 7 1 2 一 xl x 35 5 52 4 5 3 8 4 92 2 6 1 7 5 30 0 7 3 1 9 1 x 2 x 21 4 1 1 2 5 2 5 5 4 0 4 7 5 5 2 5 5 4 0 0 0 2 6 6 酗一o 3 7 5 2 4 5 3 8 4 9 一o 1 5 2 8 2 0 8 8 4 5 1 5 x 诺31 6 3 6 2 5 2 5 5 4 0 4 7 6 4 0 6 5 0 0 0 1 3 7 4 ，- 9 6 5 0 8 4 3p r 肛0 0 1 1 21 4= 0 9 4 5 6a d i = 0 8 4 7 6 利用s a s 软件对回归模型进行响应面分析，得到各响应面立体分析图，见图 5 1 、图5 2 、图5 3 。由图及软件分析可知，回归方程存在稳定点。通过岭脊分析 预测，当x l ，x 2 ，x 3 的编码值分别为( 一o 5 5 4 6 1 ，0 0 6 3 5 8 ，- - 0 0 5 8 5 0 ) ，即尿素、 m g s 0 4 7 h 2 0 和酵母粉的最佳浓度分别为：1 2 9 叽、0 4 1 l 和o 9 9 l 时，响 应值y 达到最大值，即发酵液的活菌含量最高，为1 3 2 1 0 1 1c f u ，m l 。 为了检验模型的准确性，在预测最佳培养基配方条件下进行发酵实验三次， 所得的实际发酵液活菌含量平均为1 3 0 1 0 1 1c f u m l ，与预测值1 3 2 1 0 1 1 c f u m l 接近，可见该模型能较好的预测实际发酵情况；而在未优化培养基条件下 的发酵液活菌含量为4 7 3 1 0 1 0c f u m l ，可见优化后的培养基能湿著提高发酵液 中的活菌含量。 3 2 图5 - 1y = f ( x t ，噩) 的响应而盘体蚓 f i 9 5 - 1s u r f a c e r e s p o n s ep l o lo f t h ef u n c t i o n y = f i x i 丑2 图5 - 2 k ，蜀) 的j 响应州i 体h f i g5 - 2s u r f a c er e s p o n s ep l o to ft h ef u n c t i o ny = i l , a s ) 湖北工业大学硕士学位论文 53 小结 图5 - 3y = f 也，局) 的响应面立体图 f i 9 5 3 s u r f a c e r e s p o n s ep l o to f t h ef u n c t i o n y = f ( x 2 , x z ) 本项研究收集到了7 种能应用于芽孢杆葡发酵的培养基配方。将这些培养基 枉桐同的培养条件f 进行地衣芽孢杆菌a 2 发酵培养比较，以发酵液中活菌含量为 指标，其中最适合地衣芽孢杆菌a 2 的培养基配方为：可溶性淀粉5g ，l 、尿素2 玑、 k 2 h p 0 46g l 、k h 2 p 0 43g t 、m n s 0 4h 2 00 2g ，l 、m g s 0 47 h 2 01g l 、豆粕1 0g 1 和酵母粉0 4g l ，将其作为一f 步优化的初始培养基。采用p l a c k e t t b u r m a n 设计 法和响应商分析法对初始培养基进行优化。先用p i a c k e t t b u r f f l a l l 设计从8 种原料 中筛选对活茼含量有显著影响的幽素，f i 刚最陡爬坡试验及b o x bhk e n 设计进 一步优化。结染衷l 必，m g s 0 47 h 2 0 、酵母粉和尿索是影响发醉液活菌含量的显著 索，优化肝晌培嚣基为：可溶性淀粉5 l 腺紊1 2 9 l fk ：h p 0 4 6g l ，k h 2 e 0 4 3g l ，m n s o h 1 00 2 l - m g s o , 7 h , o0 4 1 g l ，豆柏1 0g ，l 和酵母粉09 9g ，l o 在此条件r ，发酵液中a 2 的活荫含量1 4 以从优化前的47 3 1 0 ”1 c f u m l 提高到 1 3 0 1 0 “c f u m l 。为地衣芽孢杆菌a 2 制备成微生态制荆打下了颦宴的皋础。 湖北工业大学硕士学位论文 第6 章动物试验 大量实验证明益生菌具有刺激机体免疫系统的发育，提高机体免疫能力，补 充机体营养成分，促进动物生长的作用1 1 1 d 6 1 。本章通过将地衣芽孢杆菌a 2 活菌添 加到小鼠饲料中，测定小鼠的体重增加情况、消化道酶活、免疫器官指数和脾淋 巴细胞增殖功能来确定该菌的益生效果。 6 1 材料与仪器 6 1 1 菌种 地衣芽孢杆菌a 2 ，本实验室自行分离和保存。 6 。1 2 实验动物 实验动物：6 0 只清洁级昆明小n ( 1 5 士2g ) ，雄性，购于湖北省疾控中心实验 动物中心。 6 1 3 实验主要试剂 ( 1 ) f o l i n 酚试剂：购于上海生物工程有限公司。使用时与蒸馏水按1 ：2 配制。 ( 2 ) 碘淀粉比色法( a m s ) 淀粉酶测定试剂盒：购于南京建成生物工程研究所。 ( 3 ) 1 0 01 tg m ll - 酪氨酸标准溶液：称取预先1 0 5 。c 干燥恒重的l 酪氨酸0 1 g ， 用0 1m o l l 的盐酸溶解后定容1 0 0m l ，即为1g l 的l 酪氨酸溶液，吸取1g l 的l 酪氨酸溶液1 0 0 0m l ，用o 1m o l l 的盐酸定容1 0 0m l ，即得1 0 0l ag m ll - 酪氨酸标准溶液。 ( 4 ) 2 酪素( 即酪蛋白) 溶液：称取酪素4 0g ，加入o 2m o l l 、p h7 0p b s 缓冲 液8 0m l ，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后转入2 0 0m l 容量瓶 中，并用缓冲溶液定容。此溶液在4 冰箱中贮存，有效期为3d 。 ( 5 ) 考马斯亮兰法蛋白质含量测定试剂盒：购于南京建成生物工程研究所。 ( 6 ) h a n k s 液 原液甲：n a c i1 6g ，k c i8g ，m g s 0 4 7 h 2 02 0g ，m g c l 2 2 h 2 02 0g ，双蒸水 8 0 0m l ；无水c a c l 2 2 8g ，双蒸水1 0 0m l 。两者充分混合后，补加1 0 0m l 双蒸 水，加2m l 氯仿防腐，4 保存备用。 3 5 湖北工业大学硕士学位论文 原液乙：n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 0 4g ，k 2 h p 0 41 2g ，葡萄糖2 0g ，双蒸水8 0 0m l ， 溶解。加入0 4 酚红液1 0 0m l 。 h a n k s 应用液：原液甲1 份、原液乙1 份和1 8 份双蒸水混合，高温高压灭 菌1 5m i n ，4 c 保存备用。用前，用灭菌5 6 n a h c 0 3 调节p h 值至7 2 7 4 。 ( 7 ) 0 4 台盼蓝( 曲利苯兰) 细胞染液：o 4 9 台盼蓝溶解于1 0 0 m l 生理盐水。 ( 8 ) 四甲基偶氮哗蓝( 3 - 【4 ，5 - d i m e t h y l t h a z o 一2 - y 1 一2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ， m 呐：s i g m a 公司产品，o 5gm t t 溶于1 0 0m l p b s 缓冲液( p h 7 4 ，0 1m o l l ) ， 微孔过滤器过滤除菌，4 避光保存备用。 ( 9 ) 刀豆蛋( c o n c a n a v a l i n a ，c o n a ) ：s i g m a 公司产品2 0ug 。 ( 1 0 ) r p m i 1 6 4 0 培养基：s i g m a 公司产品。 ( 1 1 ) 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，s d s ) ：0 0 1m o l lh c i 溶液配制成 1 0 s d s 溶液，4 保存备用。 6 1 4 主要仪器及设备 主要仪器同2 1 1 4 ，补充以下仪器： 酶标测定仪d g 5 0 3 1华东电子集团公司医疗电子仪器厂 高速冷冻离心机t g l - 2 0武汉中科仪器设备有限公司 二氧化碳恒温培养箱 m c o 1 5 a c同本s a n y o 6 2 实验方法 6 2 1 益生芽孢杆菌剂量选择 根据文献中报道的饲用芽孢杆菌剂添加剂量，选择益生芽孢杆菌的最终添加 剂量为1 0 6c f u g 5 3 1 。 6 2 2 ，j 、鼠饲料的带l j 备 将小鼠( 1 号) 颗粒饲料( 购于湖北省疾控中心，未添加任何抗尘素) 粉碎后， 按上述添加剂量添加芽孢杆菌剂。充分混匀，加少量水拌湿，捏制成近似原颗粒 料大小的颗粒，放入6 5 干燥箱除去水份，备用。 6 2 3 饲养管理 将6 0 只小鼠随机分为2 组，每组3 0 只。第一组为空白对照组，第二组为地 衣芽孢菌剂组，各组分笼饲养，每笼5 只。室温控制在2 5 2 8 c ，自由饮水，饲喂 3 6 湖北工业大学硕士学位论文 蔓! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 苎! ! ! 曼! ! ! ! ! ! ! 苎! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! i ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 曼 制备料，饲料计量彳i 限量。采样分血次，时| 、习j 分别为正式试验的第o 、7 、1 4 、2 1 、 2 8d 。每次各组需要解剖小鼠5 只，根据不同的实验目的采集所需的样品。 6 2 4 小鼠体增重的变化 0d 时，称量全部小鼠活体重，进行分组，使两组小鼠体重差异不明显。每周 称量记录禁食1 2h 的活体重。准确称量和记录每组小鼠每周的预先称料量、余料 量、损失料，掘此计算每周的总采食量及每只小鼠各阶段的平均周采食量。各阶 段的料重比根据每个阶段的平均周采食量和平均周增重之比来分别计算。 6 2 5 小鼠空肠内容物中消化酶活力的测定 6 2 5 1 制备空肠酶液 事先将小鼠空肠保存于2 0 。c 低温冰箱，用时取出，放置于室温平皿内，待其 融化后，用吸水纸吸干肠道表面水分，然后用盖玻片刮取肠黏液并挤出内容物， 秤其重量，按重量( w ) 体积( v m 2 0 加入4 冷却的去离子水，在振荡器上混匀， 然后移入离心管中于高速冰冻离心机( 4 。c ) 1 2 0 0 0r m i n 离心1 5m i n 。获取上清液为 所要空肠酶液，标号分装，置4 。c 冰箱中保存备用。2 4h 内全部测完保存样品。 6 2 5 2 测定蛋白酶活性 采用福林试剂法1 4 2 l 测定肠内容物中蛋白酶活性，蛋白酶活性定义【5 4 矧：1g 食糜肠内容物蛋自在4 0 * ( 2 ，p h7 0 的条件下，每分钟水解底物酪蛋白产生1 l ag 酪氨酸的酶量，作为1 个蛋白酶活力单位。 ( 1 ) 蛋白酶标准曲线的绘制 取6 支洁净的试管，预先灭菌干燥，标号，分别配制0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 i lg m l 标准酪氨酸溶液。 取1 6 支2 0m l 具塞刻度试管，预先灭菌干燥，取各浓度的酪氨酸溶液各1m l ( 除空白对照外，其它每个浓度做3 个平行) ，向各试管中加入0 4m o l l 碳酸钠 溶液5m l 和福林酚试剂溶液1m l ，置于4 0 0 2 。c 水浴中显色2 0m i n ，取出，用 蒸馏水将各试管定容到2 0m l 。 用分光光度计于波长6 8 0n m 处，测其吸光度值( 以不含酪氨酸的o 号试管为 空白对照) ，建立回归方程，计算吸光常数k 值。 ( 2 ) 测定步骤 先将2 酪蛋白溶液和5 0 0l al 待测样。记分别放入4 0 恒温水浴中预热5m i n ， 往5 0 0l al 待测样品中分别加入5 0 0l al2 酪蛋白溶液( 加入即记录时间) 准确反应 3 7 湖北工业大学硕士学位论文 1 0m i n ，取出立即加入0 4m o l l 三氯乙酸1m l 终止反应( 允分摇匀) ，室温静置1 0 m i n 后，3 0 0 0r m i n 离心5m i n ，取上清液5 0 01 1l ，向其中加入0 4m o l l 碳酸钠 2 5m l 和福林酚试剂5 0 0 l al ，摇匀置4 0 恒温水浴中显色2 0m i n ，用分光光度计 测定吸光值a 硝0 l i m 。空白对照在样品中先加入三氯乙酸，再加酪蛋白溶液。按如下 公式计算蛋白酶的活力： 空肠内容物中的蛋白酶活力( u 倌) = o d l _ - o d 2x k x v x n 其中：k 一由酪氨酸标准曲线求出的吸光常数o d l 一样品的吸光度值 o d 2 一空白对照的吸光度值 n 一样品的稀释倍数 v 一反应试剂总体积t 一反应时间 m 一样品中所含蛋白的质量 6 2 5 3 测定淀粉酶活性 本试验采用碘淀粉比色法( a m s ) 测定。淀粉酶活力单位定义：1m g 空肠内容 物蛋白在3 7 与底物作用3 0m i n ，水解1 0m g 淀粉的酶量，定义为1 个淀粉酶活 力单位。测定步骤如下： 将0 1m o l l 碘贮备液用蒸馏水稀释1 0 倍，配制成0 0 1m o l l 碘应用液，4 避光保存，用时取出。在测定管和空白管中各加入底物缓冲液o 4 l1m l ，3 7 水浴预热5r a i n 。向测定管和空白管中分别加入0 0 2m l 样品和蒸馏水，混匀，3 7 水浴，准确反应7 5m i n 。向各管中加入碘应用液1m l 和蒸馏水6m l ，混匀， 6 6 0n m 波长，1c m 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。酶活力计算公式如下： 彳m s ( u g p r o t ) = 号蓑半等丽3 而0 式中：o d 测定一样品的吸光度值o d 空白一空白对照的吸光度值 。 0 4 一底物缓冲液浓度1 一底物缓冲液的体积 l o l o m g 淀粉0 0 2 一测定取样体积 m 一待测样本蛋白含量 6 2 5 4 样品中蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰法测定样品中蛋白质含量，具体方法如下： 将考马斯亮兰贮备液用蒸馏水稀释4 倍，配成应用液，4 c 保存。用时取出。 准确称取待测空肠内容物的重量，按重量( w ) 体积( v ) = l 2 0 加入4 冷却的去 离子水，在振荡器上混匀，3 0 0 0r m i n ，离心1 0m i n ，然后取上清用生理盐水稀释 成l 组织匀浆，待测。 3 8 湖北工业大学硕士学位论文 分别向空白管、标准管、测试管中加入0 0 5m l 蒸馏水、0 6 2 5 9 l 蛋白标准液 和样品，再向各试管中加入3m l 考马斯亮兰显色剂，将各试管中液体混匀，静置 1 0m i n ，于5 9 5n m 处，1c m 光径，测各管o d 值( 蒸馏水调零) 。按如下公式计 算蛋白质含量： 蛋白含量( g l ) = 罟宝意0 6 2 5 x n 式中：o d 测定一样品的吸光度值o d 倒一空白对照的吸光度值 n 一样品的稀释倍数0 6 2 5 一蛋白标准液浓度 6 2 6 免疫器官指数 采用脱颈的方法处死小鼠，摘取胸腺和脾脏，去掉胸腺和脾脏上的筋膜和脂 肪，用灭菌生理盐水将其洗净，再用滤纸吸干水分，称重。计算胸腺指数和脾脏 指数，计算公式如下： 胸腺指数= 鬻 脾脏指数= 鬻 体重( g )体重( g ) 6 2 7 脾淋巴细胞转化率测定 ( 1 ) 脾细胞悬液制备 受试第2 8d 每组随机选取5 只小鼠，采取脱颈的方法处死。将其用7 5 酒精 常规消毒，无菌耿脾，将脾脏放入盛有适量无菌h a n k s 液的平皿中，洗净后，用 镊子轻轻将脾撕碎，用2 0 0 目筛网将其过滤，由此制得脾细胞悬液。此脾细胞悬 液继续用h a n ks 液清洗3 次，采用1 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 。最后获得的脾细胞悬 液置于r p m l l 6 4 0 完全培养液中。采用台盼蓝染色法计算活细胞数( 9 5 ) ，再利 用红细胞计数板进行镜检计数，将细胞浓度调整至2 1 0 6c f u l ，备用。 ( 2 ) 试验步骤 于9 6 孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液5 0ul ，每个样品做6 个平行，每孔 加c o n a 液1 0 0ul 。设置的细胞对照孔中只加r p m l l 6 4 0 培养液。将此板放于3 7 、5 c 0 2 、饱乘l 湿度培养箱中培养。培养2d 后取出，向每孑l 中加入5m g m l 无菌的m t t 试剂1 0ul ，混合后继续培养3h ，取出，每孔加1 0 0l al1 0 s d s ， 溶液，再置于3 7 。c 恒温箱中反应2h 。取出后，用酶联免疫检测仪检测，用空白对 照孔调零，于5 5 0n m 波长下的吸光度。结果用6 个平行孔的均值来表示。 3 9 湖北工业大学硕士学位论文 6 2 8 数据统计分析 所得数据以“平均值标准差”表示；采用统计软件s p s s 作t 检验，分析试 验数据的差异显著性。 6 3 结果与讨论 6 3 1 小鼠体增重的变化 各组小鼠体增重、耗料及料重比的变化见表6 1 、6 2 。 由表6 1 、6 2 可看出添加地衣芽孢杆菌改善了小鼠的体增重。o 7d 这个阶段， 芽孢杆菌组小鼠的采食量、增重及料重比与空白对照没有明显差异( p 0 0 5 ) ，这 可能是因为地衣芽孢杆菌a 2 不是肠道原籍菌，被小鼠采食后进入肠道需要一定的 时间来定植。7 1 4d 这个阶段时，与空白对照组相比芽孢杆菌组小鼠增重、料重 比则超过了空白对照组，且差异显著俾 0 0 1 ) ，说明地衣芽孢杆菌a 2 在此阶段已 很好地定植在小鼠肠道粘膜上了，产生了蛋白酶、淀粉酶等外源酶，从而使饲料 营养成份转化率和能量转化率提高，进而提高了动物的生长性能。1 4 2 1d 、2 1 2 8 d 这两个阶段，空白组、芽孢杆菌组小鼠的增重与前期相比均放缓，地衣芽孢杆菌 a 2 的促生长作用没有得到很好的体现，但芽绝杆菌组的料重比仍低于空白组。这 可能是因为益生素类产品的促生长作用，通常在敏感期才具有明显的效果，而在 全期饲养管理水平较高时，这种促生长效果反而难以体现【5 酬。从o 2 8d 整个试验 期看，与对照组相比，芽孢杆菌组的末体重平均增重了1 1 4 0 ，采食量平均提高 了3 4 0 ，小鼠的料重比平均下降了1 6 3 4 ，说明地衣芽孢杆菌有助于提高饲料 的利用率。 表6 - 1 各组小鼠体重的变化( x s ，单位：g ) t a b l e 6 1c h a n g e so nm o u s ew e i g h tg a i no fg r o u p s 组别 f l 期 0 d7 d1 4 d2 1 d2 8 d 对照组 1 4 2 1 + 1 2 11 8 0 6 + 1 3 22 3 3 4 + 1 1 72 6 9 0 + 0 9 83 0 2 1 0 5 芽孢杆菌组1 4 1 3 _ + 1 3 41 8 4 1 _ + 1 4 62 5 1 2 _ + 1 5 2 3 0 1 5 _ + 1 2 33 3 9 2 + 1 4 2 湖北工业大学硕士学位论文 表6 - 2 各组小鼠平均周增重、周平均耗料及平均料重比的变化 t a b l e 6 2c h a n g e so nm o u s ew e e k l yw e i g ht g a i n ，f e e da n df e e d - w e i g h tr a t i oo fg r o u p s 6 3 2 小鼠空肠内容物中消化酶活力的测定 本实验所测的总体蛋白酶活性可以反映肠道中各种蛋白酶、水解酶的综合作 用能力，同时也能反映机体对蛋白质消化能力的强弱【5 7 1 。而淀粉酶则可以反映动 物机体对淀粉的消化能力。对这两种肠道消化酶的检测可以很好地反映机体的消 化能力。 小鼠各阶段空肠内容物中消化酶活力的变化见表6 3 。 4 1 湖北工业大学硕士学位论文 表6 3 小鼠空肠内容物中消化酶活力( u g 肠内容物蚩白) ( x 士s ) t a b l e 6 3d i g e s t i v ee n z y m ea c t i v i t yi nj e j u n a lc o n t e n t so fm o u s e ( u 儋i nc e c u mc o n t e n t s ) 同期指标对照组芽饱杆菌组 0 d 7 d 1 4 d 2 1 d 2 8 d 蛋白酶 淀粉酶 蛋白酶 淀粉酶 蛋白酶 淀粉酶 蛋白酶 淀粉酶 蛋白酶 淀粉酶 1 1 8 2 1 1 0 5 8 2 9 4 3 5 4 8 1 2 9 2 5 8 3 1 3 2 2 7 4 3 2 1 3 9 8 6 1 1 4 3 3 6 7 2 6 0 1 1 4 4 6 3 1 3 5 4 4 0 6 4 3 2 6 1 4 6 2 5 1 0 2 4 4 1 8 7 1 8 0 1 2 0 2 4 1 1 3 6 2 9 2 0 6 2 0 1 5 9 1 9 9 3 9 3 8 6 9 3 4 3 1 7 2 3 6 1 2 3 8 4 8 1 5 3 6 9 1 8 6 2 6 1 5 6 2 5 3 2 3 4 3 1 1 9 0 3 9 1 6 3 4 5 9 3 6 2 1 7 由表6 3 可以看出：与对照组相比，芽孢杆菌组小鼠空肠内容物中的蛋白酶、 淀粉酶活性均显著增强( p 0 0 5 ) 。从全程试验期来看，2 8d 时，芽孢杆菌组小鼠与 对照组小鼠相比，空肠内容物中的蛋白酶的活性平均增加了3 0 1 8 ，淀粉酶的活 性平均增加了4 1 7 7 。试验结果说明：地衣芽孢杆菌a 2 能增j j h d , 白鼠空肠内容 物中蛋白酶、淀粉酶的活性。 6 3 3 免疫器官指数 免疫系统产生免疫反应的重要免疫器官是胸腺和脾脏。胸腺和脾脏的重量在 一定程度上可以反映其发育程度和其内部淋巴细胞的数量，因此也间接反映了体 内淋巴细胞的总体水平。根据这一参数，我们也可以了解机体非特异性免疫水平。 本试验每隔7d 对小鼠胸腺指数、脾脏指数进行测定，实验结果见表6 4 和表 6 5 。 4 2 湖北工业大学硕士学位论文 表6 4 各组胸腺指数的变化( x 士s ) t a b l e 6 4c h a n g e so ft h y m u si n d e xi nd i f f e r e n te x p e r i m e n t a lg r o u p 表6 5 各组脾脏指数的变化( x 士s ) t a b l e 6 5c h a n g e so fs p l e e ni n d e xi nd i f f e r e n te x p e r i m e n t a lg r o u p 组别 脾脏指数 0 d7 d1 4 d2 1 d 2 8 d 对照组 3 2 8 士0 1 23 3 1 士o 1 83 4 0 士0 2 3 3 8 9 士0 2 0 4 1 0 士o 2 7 芽孢杆菌组3 6 5 士0 1 13 7 1 士0 1 93 9 0 士o 2 64 8 0 士o 1 34 9 0 士o 3 1 由表6 4 和表6 5 实验结果可以发现，小鼠的胸腺指数第2 1 天时到达最高峰。 脾脏指数在第2 8 天时，到达峰值。到达峰值时，芽绝丰i 菌组小鼠的胸腺指数与脾 脏指数均显著高于对照组( p 0 0 1 ) 。这表明地衣芽孢杆菌a 2 能促进小鼠免疫器 官发育。 6 3 4 对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响 对p h a 或c o n a 的刺激呈现分裂增殖反应是t 细胞成熟的特征之一，而这种 增殖反应的强弱在一定程度上体现了细胞免疫功能状念。脾淋巴细胞经c o n a 刺激 后，测定它的转化率，结果发现芽孢杆菌组小鼠脾淋巴细胞增殖反应显著高于对 照组( p 0 0 1 ) ，见表6 6 ，说明芽孢杆菌能促进小鼠脾淋巴细胞增殖。 表6 - 6 对脾淋巴细胞增殖功能的影响( x 士s ) t a b l e 6 - 6p r o l i f e r a t i o nc a p a c i t yo fs p l e e nl y m p h o c y t ea f t e rs t i m u l a t i o nb yc o n a 组别 o d s s 0 0 2 4 9 0 0 4 1 0 8 3 1 0 1 9 4 对照组 芽孢杆菌组 6 4 小结 按1 0 6 c f u g 的添加量将地衣芽孢杆菌a 2 添加到饲料中，饲养小鼠2 8d 。与 4 3 湖北工业大学硕士学位论文 对照组相比，芽孢杆菌组的术体重平均增重了1 1 4 0 ，采食量半均提高了3 4 0 ， 小鼠的料重比平均下降了1 6 3 4 ：2 8 天时，空肠内容物中的蛋白酶的活性平均增 加了3 0 1 8 ，淀粉酶的活性平均增加了4 1 7 7 。说明地衣芽孢杆菌a 2 能增加小 鼠空肠内容物中蛋白酶、淀粉酶的活性，提高饲料的利用率。小鼠胸腺指数第2 1d 时到达最高峰，脾脏指数在第2 8d 时，到达峰值。到达峰值时，芽孢杆菌组小鼠 胸腺指数与脾脏指数均显著高于对照组( p 0 0 1 ) ；用c o n a 刺激脾淋巴细胞，测 定其转化率，结果发现芽孢杆菌组小鼠脾淋巴细胞增殖反应显著高于对照组 俾 0 0 1 ) 。说明饲喂地衣芽孢杆菌a 2 对小鼠免疫功能的提高能起到一定作用。 湖北工业大学硕士学位论文 7 1 主要结果 第7 章结论与展望 本研究根据菌体对低p h 和高胆盐的耐受性、产酶特性和对病原菌的抑菌效 果，对家鸡肠道中的芽孢杆菌进行了筛选，得到具有益生茵丌发潜力的菌株4 株， 对这4 株菌进行了鉴定。然后，对地衣芽孢杆菌a 2 的发酵工艺进行了优化，并以 该益生菌作饲料添加剂进行了小鼠喂养试验。具体试验结果如下： ( 1 ) 以3 种畜禽常见病原菌为指示菌，对这些芽孢杆菌发酵液的抑菌效果进行分 析，发现所筛选的菌株a 2 、( 2 5 、c 1 9 和d 8 具有较好的抑菌效果，这四株菌在p h 3 0 和高胆盐条件下的存活率达6 0 以上，产淀粉酶和蛋白酶的能力也较好，表明 这四株菌具有作为益生菌的丌发潜力。 ( 2 ) 通过对各菌株个体形态特征、菌落形念特征观察以及有关生理生化特性，初 步鉴定分离到的菌株a 2 和d 8 为地衣芽孢杆菌，c 5 和c 1 9 为蜡样芽孢杆菌。 ( 3 ) 经培养条件优化，地衣芽孢杆菌a 2 的最适培养条件为：接种量为3 ，接种 菌龄为1 6 - - 1 8h ，初始p h 值为7 2 ，装液量为5 0m l 2 5 0m l ，摇瓶转速为1 8 0r r a i n ， 培养时i 日j 为2 4h 。 ( 4 ) 采用p l a c k e t t b u r m a n 设计法和响应面分析法对地衣芽孢杆菌a 2 初始发酵培 养基进行优化。优化后地衣芽孢杆菌a 2 的最适培养基为：可