（发酵工程专业论文）酿酒酵母氧化应激反应活性衍生物的初步研究.pdf

天津科技大学硕士论文 摘要 活性酵母细胞衍生物( l i v ey e a s tc e l ld e r i v a t i v e ，简称l y c d ) 是酵母细 胞在人为控制的伤害条件下产生的具有促进细胞呼吸和修复作用的保护性物 质，有重要的医用和美容价值。 本文对酿酒酵母氧化应激反应活性衍生物进行了初步研究，确定了h 2 0 2 刺激酿酒酵母产生高活性l y c d 的条件；对l y c d 中两种重要的抗氧活性成 分还原型谷胱甘肽( g s h ) 和超氧化物歧化酶( s o d ) 在氧化应激反应 中的含量及活力的变化进行了研究，对l y c d 中的应激蛋白进行了电泳分析。 另外，本文还对酿酒酵母在紫外线照射条件下所产生的l y c d 进行了初步的 研究。 本文通过对酵母细胞破壁方法的研究，确定了液氮法为酵母细胞的破壁 方法，其破壁率可达8 0 左右。通过对瓦勃氏呼吸法和紫外分光光度法进行 比较，确定了紫外分光光度法为检测l y c d 活性的一种简便适宜的方法。通 过对实验菌株的筛选，确定酿酒酵母t q 2 2 0 1 5 为制备l y c d 的实验菌株。通 过单因素实验及正交实验，确定了产生高活性l y c d 的最佳条件为：h 2 0 2 的 作用浓度为o 2 m m o l l ，作用时间为1 5 m i n 。 对h 2 0 2 刺激所产生l y c d 中g s h 含量和s o d 活力进行测定的结果表明： 经h 2 0 2 刺激，酿酒酵母细胞中g s h 含量和s o d 活力均高于正常细胞中的水 平；h 2 0 2 刺激1 5 m i n ，所产生l y c d 中s o d 的比活力最强；h 2 0 2 刺激3 0 m i n ， o s h 的含量最高，说明不同的应激产物产生的最佳时间不完全相同。 s d s p a g e 凝胶电泳和二维凝胶电泳实验结果表明：在h 2 0 2 的作用下， 酵母细胞发生应激反应，蛋白的表达发生了变化：合成了一些新的蛋白质， 同时又有某些蛋白的合成受到了抑制。 对紫外线照射或h 2 0 2 刺激引起的酵母细胞的应激反应的初步研究表明： 尽管这两种应激反应在反应机理上可能存在着差异，但其产生的l y c d 却具 有相似的生物活性，并都能引起g s h 含量和s o d 活力的增高，说明这两种 应激反应具有一定的相关性。 关键词：活性酵母细胞衍生物氧化应激 二维凝胶电泳 还原型谷胱甘肽超氧化物歧化酶 a b s t r a c a b s t r a c t l i v ey e a s tc e l ld e r i v a t i r e ( l y c d ) ，ak i n do fp r o t e c t i v es u b s t a n c e w h i c h c o u l di n c r e a s ec e l l u l a r r e s p i r a t i o n a n dw o u n d h e a l i n g ，w a s p r o d u c e db y1 i v i n gc e l lr e s p o n s et oac o n t r o l l e di n j u r e l y c dw a s e x t e n s i v e l yu s e d i nc o s m e t i ca n dp h a r m a e e u t i c a lf i e l d s t h i ss t u d yw a sb a s e do nl y c dp r o d u c e du n d e ro x i d a t i v es t r e s s ，a n d t h e o p t i m u m c o n d i t i o nt o p r o d u c e l y c dw a sd i s c u s s e d r e d u c e d g l u t a t h i o n e ( 6 s h ) a n ds u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，t h et w oi m p o r t a n t i n g r e d i e n t si nl y c d ，w e r ed e t e r m i n e da n da n a l y z e d ，a n dt h es t r e s s p r o t e i n si nl y c dw e r es t u d i e dt h r o u g hg e le l e c t r o p h o r e s i s i na d d i t i o n ， l y c dp r o d u c e du n d e ru vs t i m u l a t i o nw e r ea l s os t u d i e d t h ee x p e r i m e n ts u g g e s t e dt h a t8 0p e r c e n td e s t r o y i n gr a t ec o u l db e r e a c h e db yb r e a k i n gu pt h ey e a s tc e l lw a l lw i t h1 i q u e f a c t i o nn i t r o g e n a n ds a c c a h a r o m v c e sc e r e v i s i a et q2 2 0 1 5w a ss e l e c t e da st h eb e s ts t r a i n t o p r o d u c el y c d t h r o u g hs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a ld e s i g n ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gl y c d w e r ea sf o l l o w ：t h ec o n c e n t r a t i o n o fh 2 0 2i s0 2m m o l l ，a n dt h et r e a t i n gt i m ei s1 5 m i n t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sw e r ed r a w nf r o mt h ee x p e r i m e n t s ：t h e s p e c i f i ca c t i v i t yo f s o di nl y c dw a ss t r o n g e s ta f t e rt h ec e l lw a s t r e a t e dw i t hg o lf o r 1 5 m i n ，w h i l et h eq u a n t i t yo fg s hr e a c h e dt h e h i g h e s ta t3 0 m i n t h e ys h o w e dd i f f e r e n ta v a i l a b l et i m er e s p e c t i v e l y t h r o u g h s d s p a g ea n dt w o d i m e n s i o n a l g e le l e c t r o p h o r e s i s e x p e r i m e n t ，t h es t r e s sp r o t e i n s i nl y c dw e r ea n a l y z e d ad r a m a t i c c h a n g eh a p p e n e du n d e rh 2 0 2s t r e s s ：s o m en e wp r o t e i n sw e r es y n t h e s i z e d ， w h i l et h es y n t h e s e so fs o m eo t h e rp r o t e i n sw e r er e p r e s s e d i tw a sc o n c l u d e df r o mc o n t r a s te x p e r i m e n t st h a tn om a t t e rh o wt h e y w e r ep r o d u c e d ，u n d e rh = 0 2s t r e s so ru vs t i m u l a t i o n ，l y c dh a da l m o s tt h e s a l i l eb i o l o g i c a la c t i v i t i e s a tt h es a m et i m e t h es p e c i f i ca c t i v i t i e s o fs o dw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o l ，a n dt h eq u a n t it i e so fg s hw e r e i n c r e a s e da l s o t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e s et w os t r e s sr e s p o n s e s w e r ec o n c e r n e dw it he a c ho t h e ra ts o m ee x t a n t ，t h o u g ht h e ym i g h tb e p r o d u c e dt h r o u g hd i f f e r e n tm e c h a n is m s k e yw o r d s ：l y c d o x i d a t i v es t r e s sr e d u c e dg l u t a t h l o n e s u p e r o x i d i s ed i s m u t a s e t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o d h o r e s i s 2 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 自由基理论4 j 1 1 1 自由基 自由基( f r e er a d i c a l ) ，从化学结构来看是指含有未配对电子的基团、原 子或分子。活性氧是最主要的自由基，包括超氧阴离予( 0 2 一) 、羟基自由基 ( o h ) 、过氧化氢分子( h 2 0 2 ) 、氢过氧基( h 0 2 一) 、烷氧基( r o ) 、烷过氧基 ( r o o ) 、氢过氧化物( r o o h ) 和单线态氧( 1 0 2 ) 等。细胞在正常的代谢 过程中，或者在受到各种理化刺激时都会产生活性氧自由基。 自由基有很大的自由能和很强的氧化反应能力，很容易与其它分子或自 由基反应生成新的自由基，由此引发了连锁反应。自由基的反应包括3 个阶 段，即引发、增长和终止阶段。反应初始，引发阶段占主导地位，随着反应 物浓度的增多，增长阶段为反应的主体。待到一定阶段，体系中的反应物浓 度越来越少。自由基本身互相碰撞的机会越来越多，最终导致反应的终止。 自由基清除剂可以通过与引发剂起作用，或者通过直接捕捉自由基的形式， 阻碍连锁反应的顺利进行。 在正常情况下，机体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中， 但是，如果某些条件下造成机体内的自由基清除过多或过慢，细胞内不能维 持一定水平的自由基，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的 各种损伤，加速机体的衰老进程，对机体的生命活动带来不利影响。 1 1 2 自由基对生命大分子物质的损害 自由基是细胞的正常代谢产物，对维持机体正常代谢具有一定的促进作 用。但是，由于自由基是具有高度的活泼性与极强的氧化反应能力的物质， 它能通过氧化反应来攻击其所遇到的任何分子，自由基的代谢一旦失去平衡， 就会使机体内大分子物质产生氧化变性、交联或断裂，从而引起细胞结构和 功能的破坏，对机体产生极强的破坏作用。 1 1 2 1 自由基对核酸的损害 自由基作用于核酸类物质，引起氨基或羟基的脱除、碱基与核糖连接键 的断裂、核糖的氧化和磷酸二酯键的断裂等。羟基自由基( o h ) 主要加成到核 酸的胸腺嘧啶的5 、6 位双键和瞟呤的4 、5 或7 、8 位双键上，它还可以从核 糖与脱氧核糖中夺取氢原子而产生脱氢自由基，并通过进一步的连锁反应， 使得核酸及其组成部分间出现共价连接键，从而产生对核酸的破坏作用。自 由基还可造成对碱基的破坏，产生遗传突变，当自由基对d n a 的破坏作用不 能修复时，就会导致细胞的死亡。 1 1 2 2 自由基对蛋白质的破坏作用 自由基可直接作用于蛋白质，也可通过脂类过氧化物间接作用于蛋白质 1 前言 产生破坏作用。烷过氧基( r o o ) 可使蛋白质分子发生交联生成变性的高聚 物，其它的自由基可引起蛋白质的多肽链断裂，并使个别氨基酸发生化学变 化，改变酶的化学结构，导致酶生物活性的丧失。 1 1 2 3 自由基对糖类的损害 自由基的氧化性可使多糖断裂，还可使细胞膜寡糖链中的糖分子的羟基 氧化生成羰基或使糖分子形成双聚物，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响 膜的正常功能。 1 1 2 4 自由基对脂质的损害 由于含有多个双键，脂质中的多不饱和脂肪酸的化学性质非常活泼，易 受自由基的破坏而发生过氧化反应，最终生成丙二醛。丙二醛可以与具有氨 基或巯基的蛋白质、磷脂酰乙醇胺和核酸等形成席夫碱，导致生物分子间发 生交联作用，结果生成比原分子大许多倍的聚合分子，从而使蛋白质正常的 结构受破坏而丧失功能，一些以- n h 2 和s h 来维持活性的酶蛋白分子都会被 抑制或失活。而丙二醛与核酸物质的交联，则会引起突变。 磷脂是构成生物膜的重要部分，因富含多不饱和脂肪酸故极易受自由基 破坏。膜中磷脂发生过氧化作用，会引起膜中蛋白质及酶的交联或失活，导 致膜通透性的变化，这将严重影响膜的各种生理功能。亚细胞器膜磷脂所含 的不饱和脂肪酸比质膜还要多，对过氧化反应更为敏感。线粒体膜受损，则 会使能量生成系统受破坏，溶酶体膜受损，则会释放出其中的水解酶系，轻 则使细胞内的多种物质水解，重则造成细胞自溶组织坏死。所以，如果自由 基对生物膜组织破坏严重，会引起细胞功能的极大紊乱。 1 2 酿酒酵母的氧化应激反应 活性氧类物质是机体内自由基的主要形式，可在细胞的正常代谢中产生， 外界环境如辐射、氧化还原活性药物、金属离子也会刺激活性氧类物质的生 成 “。当活性氧类物质的含量达到一定的浓度时，就会破坏细胞内的氧化还 原的平衡状态，从而导致对脂质、蛋白质、d n a 的损伤，甚至是细胞的死亡。 为了消除活性氧类物质引起的伤害作用，生物体已经进化出若干的保护 机制。当外界刺激引起机体内活性氧类物质增多时，机体发生基因转录调节 水平上的变化，诱导合成一些应激产物，保护自身不受活性氧类物质的伤害。 细胞对氧化物的刺激的应答反应已经在原核生物生物体进行了大量的研究。 研究发现：当细菌处于亚致死剂量的氧化物中时，它们将很快适应这种应激 条件，从而对致死剂量的刺激产生抗性【7 】。在过氧化氢或超氧阴离子的诱导 下，大肠杆菌将产生3 0 4 0 种蛋白质分子【8 j 。 酵母细胞也具有很强的应激反应能力，当它受到光、热、化学损伤等不 良刺激时，很快就会合成许多具有自我修复性的物质，以抵御这些不良的条 件所引起的伤害作用。过氧化氢、超氧化物等都能引起酿酒酵母发生氧化应 天津科技大学硕士学位论文 激反应。 1 2 1 酿酒酵母的氧化防护体系 酿酒酵母拥有酶系和非酶系两种防御体系，以保护自身在氧化应激状态 下细胞成分的稳定以及维持细胞内的氧化还原状态的平衡。 1 2 1 1 非酶系防御体系 非酶系防御体系主要由小分子可溶于水( 某些情况下可溶于脂类) 的一 些物质组成。它们是自由基清除剂，与活性氧类物质发生反应而除去这些氧 化剂。 ( 1 ) 谷胱苷肽( g s h ) 还原型谷胱甘肽( g s h ) 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的一个三 肽。它是酵母细胞在应激反应中产生的一个重要的代谢产物，也是细胞内最 重要的抗氧剂之一。g s h 的主要生物学功能是保护细胞内蛋白质的巯基，进 而维护蛋白质的正常的生物学活性，维持细胞内氧化还原状态的平衡。另外， g s h 还是多种酶的辅酶和辅基，正常细胞一般具有很高的g s h g s s g 比率。 研究发现，如果细胞缺乏g s h ，细胞就会对过氧化氢表现出高度的敏感性。 g s h 是非酶系的防御系统中研究的最为透彻的一个，对维持细胞内氧化 还原状态的平衡起到了重要的作用一j 。在酿酒酵母细胞内已经鉴定了合成 g s h 的两个基因g s h l 、g s h 2 ，并分离得到了g s h 的两个缺陷型菌株g s h l 和g s h 2 。虽然g s h l 和g s h 2 这两个缺陷株能够存活，但与野生型相比其延滞 期长、生长速率低，且不能形成子囊孢子，对过氧化氢、维生素k 及镉等具 有高度敏感性。只有在基本培养基上添加g s h 。缺陷株才能正常生长。谷氨 酰半胱氨酸可以替代g s h 添加到培养基中，但它并不能完全取代g s h 的作 用。因为只有在培养基中添加了g s h 后，g s l l 2 缺陷株才能获得与野生型同样 的生长。 g s h 除作为自由基清除剂之外，还可以与毒性亲电体结合，然后分泌到 液泡中，这种功能是通过g s h 结合泵来完成的。 ( 2 ) 金属硫蛋白( m t ) 金属硫蛋白是具有低分子量、富含氨基酸和半胱氨酸，并能大量结合重 金属离子的具有抗氧剂活性的蛋白质【l 们。m t 对细胞内的自由基有着非常强 的清除作用，它还可以与细胞内的重金属离子配位结合成无毒或低毒络合物， 起到消除重金属的作用。酵母细胞的m t 由基因c u p l 和c r s 5 编码，对于 保护细胞免受氧化还原活性物质的伤害作用重大。在酵母细胞中由于缺乏 c u z n s o d 引起的对氧化剂的敏感可以通过过量表达m t 来改善。1 ”。 ( 3 ) 黄素血红蛋白i ”1 黄素血红蛋白是在酵母氧化应激反应中起作用的一个金属蛋白，它的缺 陷株对二酰氨轻度敏感。氧气可以诱导编码黄素血红蛋白基因的表达，但关 i 前言 于黄素血红蛋白抗氧作用确切的生理功能还有待进一步研究。 ( 4 ) 硫氧还蛋白 1 4 - 1 5 1 硫氧还蛋白是一个富含s h 的小分子蛋白，是硫氧还蛋白过氧化物酶和 核苷酸还原酶的还原剂。酿酒酵母细胞有两个编码硫氧还蛋白的基因：t r x l 和t r x 2 。虽然这两个基因的完全缺失或仅缺失一个不会引起细胞的死亡， 但t r x 基因双缺型的菌株中g s s g 水平明显提高，而细胞周期中的s 阶段也 明显延长，这说明硫氧还蛋白对调节细胞内g s h g s s g 的比率起着一定的作 用，它的缺失会刺激调节细胞分裂周期的基因的转录。然而，尽管t r x i 基 因的缺失会增加细胞对h 2 0 2 的敏感性，但与此同时细胞对二酰胺的抗性也有 所提高。 ( 5 ) 谷氧还蛋白1 1 6 1 与许多其他生物一样，酿酒酵母细胞也拥有谷氧还蛋白。谷氧还蛋白是 一类含有两个对氧化条件敏感的半胱氨酸的小分子蛋白，与硫氧还蛋白一样， 属于核苷酸还原酶的电子供体。基因g r x i 和g r x 2 编码酿酒酵母细胞中的 谷氧还蛋白，尽管二者编码的蛋白高度相似，但其作用却迥异。g r x l 编码 的谷氧还蛋白保护细胞抵御h 2 0 2 的作用，而g r x 2 的产物则对0 2 一起作用。 与硫氧还蛋白一样，谷氧还蛋白是氧化应激反应所必须的一种抗氧剂。 ( 6 ) 脂溶性抗氧剂 迄今为止，对酿酒酵母细胞的脂溶性抗氧剂还缺乏深入的研究。不过， 已有实验表明细胞脂膜成分对起氧化抗性有很大作用。细胞膜由高度饱和脂 肪酸组成的酵母细胞比由高度不饱和脂肪酸组成细胞膜的酵母细胞对氧化剂 具有更强的抗性。 ( 7 ) 海藻糖“ 许多研究表明：海藻糖对酵母细胞的氧化耐受性有很重要的作用，一定 浓度的海藻糖对细胞发生氧化应激反应的作用非常重要。不过，也有学者对 海藻糖的抗氧剂作用表示质疑。因为个别菌株的海藻糖水平并不与其对h 2 0 2 的抗性作用大小相关，而且用h 2 0 2 处理细胞也不会诱导海藻糖基因的表达。 1 2 1 2 酶系防御体系 在酿酒酵母细胞的酶系防御体系中，有几个非常重要的酶，可以起到清 除自由基或者修复氧化应激引起的细胞损伤的作用。主要包括过氧化氢酶、 超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶等。 ( 1 ) 过氧化氢酶 过氧化氢酶催化细胞内的过氧化氢降解为h 2 0 和0 2 。酿酒酵母主要有两 种过氧化氢酶：过氧化氨酶a 和过氧化氢酶t ，分别由基因c t a l 和c t i i 编码【1 8 _ 19 1 。过氧化氢酶a 存在于过氧化物酶体中，其主要作用是去除脂肪酸 0 氧化所产生的h 2 0 2 ；过氧化氢酶t 的生理作用尚待研究，但c t t l 基因的 4 天津科技大学硕士学位论文 表达却受氧化应激反应的调节。在细胞对过氧化氢的应激反应中，过氧化氢 酶起着非常重要的作用。细胞若缺失过氧化氢酶，即使处在稳定期，对过氧 化氢也高度敏感，而且不能对过氧化氢产生适应性的应激反应。 ( 2 ) 超氧化物歧化酶( s o d ) 【2 0 】 超氧化物歧化酶属于金属酶，随着金属的差异，该酶可分为c u z n s o d 、 m n s o d 和f e s o d 三种。这三种酶活性部位的金属离子与酶蛋白都在催化 反应中起到关键作用，但是酶的性质与分子结构有所不同，其中c u z n s o d 与其它两种s o d 的差别较大，而另外两者之间的差别却很小。f e s o d 在自 然界中的含量很少，主要存在于原核生物中；动物、植物、藻类以及某些原 核生物体内都含有c u z n s o d 和m n s o d ，在真核细胞中两者分别存在于细 胞质及线粒体内。从不同来源提纯的c u z n s o d 酶，除个别性质有较大的差 异外，都有类似的性质。相对分子质量一般为3 1 0 0 0 3 3 0 0 0 k d ，有2 个相同 的亚基，每个亚基都含有一个原子的铜和一个原子的锌。 酵母细胞内的s o d 包括线粒体s o d ( m n s o d ) 和细胞质s o d ( c u z n s o d ) 两种。s o d l 编码细胞质s o d ，而s o d 2 则编码线粒体s o d 。s o d 是酵母细 胞内重要的抗氧剂，它是歧化作用的主要酶，线粒体s o d 起到了保护线粒体 免受呼吸作用时产生的0 2 一的伤害作用。当细胞中存在某一种s o d 时，细 胞就获得了氧化应激的耐受性。m n s o d 还可以使细胞获得对热和乙醇的耐受 性，当细胞缺失c u z n s o d 时，则会导致细胞内活性氧类的不平衡，从而启 动m n s o d 基因转录，产生对热和乙醇的耐受性。 圆硫氧还蛋白氧化物酶( t p x ) 和硫氧还蛋白还原酶。” t p x 是一种2 5 k d 的蛋白，其基因已经得到了克隆和测序，与已知的过氧 化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶不具同源性。t p x 分为t p xi 、t p x i i 型两种，i 型t p x 主要还原过氧化氢，而i i 型t p x 则主要还原烷基化合 物。t p x 是酿酒酵母中存在的一种重要的保护因子，可以和硫氧还蛋白发生 反应，还原过氧化氢或烷基化合物，同时消除了硫氧化系统对谷胱甘肽合成 的抑制作用。 ( 4 ) 谷胱甘肽还原酶 由于谷胱甘肽的重要的生物学作用，维持细胞酶的g s h g s s g 的比率就显 得非常重要。谷胱甘肽还原酶的作用就是把g s s g 还原为g s h ，维持细胞内较 高的g s h g s s g 比率。已经分离鉴定了编码谷胱甘肽还原酶的基因g l r i ，该 基因缺失后可引起细胞内积累较多的g s s g ，因此，细胞表现得对过氧化氢相 当敏感。 ( 5 ) 谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) “” 生物细胞中有两种g p x ：典型的g p x 和磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧 化物酶p h g p x 。p h g p x 为单体形式，部分与膜相连；而g p x 则为四聚体， 二者具有不同的作用底物。在酿酒酵母中，缺乏四聚体型的g p x ，却有三个 前言 基因( g p x i 、g p x 2 和g p x 3 ) 分别编码三种不同的p h g p x s 。这种现象在 生物界是独一无二的，因为在一般的细胞中，编码p h g p x 的基因一般不超 过一个。这种独特的现象是酿酒酵母在特殊的条件下为应付各种应激环境而 发展的一种高度自我修复作用的结果。g p x 3 维持着细胞正常代谢条件下的 抗氧作用，它的表达不需要任何特殊应激条件的诱导；在糖饥饿、氧化应激 条件下，细胞诱导g p x l 、g p x 2 的表达，因而加强了机体对各种不良环境的 适应能力。 g p x 对过氧化氢和磷脂氢过氧化物都有催化作用，当编码g p x 的基因 高拷贝表达时，会提高细胞对过氧化氢及掇丁基过氧化物的抗性。另外，g p x 对g s h 的合成也有一定的调控作用。 1 2 2 氧化应激反应中转录因子的调节作用 蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合 成的时序的信息都由核酸编码，表现为特定的核苷酸序列，所以在机体的氧 化应激反应中最本质的变化发生在基因的表达调控上。基因在转录水平的调 控反应主要表现为信号传导调控、转录因子调控和r n a 剪辑3 个方面“。 转录因子是一群能与57 端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因 以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。许多研究证明，酿酒 酵母的氧化应激反应是在转录水平上的调控，目前，已经分离鉴定了一些转 录调节因子，它们在氧化应激反应中起着重要的调节作用。 1 2 2 1b z i p 转录因子 b z i p 转录因子具有亮氨酸拉链结构，以特定碱性区域与d n a 结合，发挥 转录调节作用。在该类调节因子中，研究的最为广泛的是y a p l ，y a p 2 和g e n 4 三种转录调节蛋自，目前已经有几个实验室分离得到了y a p i 的转录基因 y a p l 。y a p l 属于转录活化因子a p 一1 家族中的一员，它是酵母氧化应激反应 中的主要调节因子，通过与结构基因启动子中的a r e 序列结合而达到调节作 用。对于启动子中不含a r e 序列的基因，y a p l 的作用尚有待研究1 2 。y a p l 具有多种调节作用，调控着与硫的氧化还原及谷胱甘肽的合成及再生有关的 反应，通过控制谷胱甘肽生物合成，起到了消除活性氧类的作用。另外，y a p l 还对细胞的增殖起着双重的调节作用：在通常的生长条件下，y a p l 刺激细胞 的分化；在细胞受到过氧化氢刺激的条件下，y a p l 则阻遏核苷酸合成途径的 基因表达。降低d n a 的合成速度，从而使细胞分化速度下降【2 ”。 缺乏转录因子y a p 2 的细胞对各种氧化荆高度敏感，丽y a p 2 基因的高度 表达会导致细胞对镉的抗性的增加【2 9 】。由于目前尚未得到y a p 2 的目的基因， 所以它对氧化应激反应基因表达的调节作用还有待研究。 h i n n e b u c h 研究发现，转录调节因子g e n 4 具有调控多种氨基酸基因表达 的作用，它的结合位点与y a p l 非常相似。e n g e l b e r g 研究表明调节因子g e n 4 在一定程度上调节着酵母细胞的紫外线应激反应，对氧化应激反应也起着某 些调控作用3 0 1 。 6 天津科技大学硕士学位论文 1 2 2 2 与c u 结合的转录因子p 1 i 与c u 结合的转录因子主要有两个：a c e i 和m a c l 。二者的结构很相似， 都具有富含半胱氨酸的氨基酸片段。a c e l 调控与c u 稳态水平有关基因( 如 c u p l ) 的表达，它还能结合到c u z n s o d 的启动子上，调控细胞质s o d 的 表达，不过a c e l 的这种调控作用并非氧化应激反应的决定性因素。到目前为 止，还未彻底了解a c e l 对氧化应激反应的确切作用。 转录因子m a c l 调控f e 和c u 离子的还原基因的转录水平，同时它对过氧 化氢氧化应激反应中c t t l 基因的表达也起一定的调节作用，其调控机制相 当复杂，可能是一种间接的调节作用。 1 2 2 _ 3 锌指转录因子 锌指转录因子是转录因子家族中比较典型的一类，由于结合有z n 离子而 形成特殊的锌指结构。酵母细胞中锌指转录因子主要包括转录因子h a p l 、 m s n l 和m s n 2 等。h a p l 蛋白调节氧化应激反应中的两个重要的基因c y c l 和c y c 2 的表达，且与m n - s o d 基因的表达有关。许多与氧化应激反应有关 的酶如c t t l 、c t a l 和m n s o d 都受h a p l 的调节【3 2 j 。 研究表明：由m s n 2 和m s n 4 编码的两个锌指蛋白是s t r e 的结合蛋白， 在应激反应中有很重要的作用。缺乏这两个基因的突变株由于不能合成相应 的调控蛋白而增加了细胞对热休克、渗透压和氧化刺激的敏感性【33 1 。但对过 氧化氢刺激所引起的应激反应，m s n l 和m s n 2 的调控作用表现出了一定的局 限性，这说明一定还存在着另外的转录因子来识别s t r e 并调控着该反应中 的基因表达，但目前还未完成这些因子的鉴定。 1 2 2 4 转录抑制因子 迄今为止，在酵母的氧化应激反应中人们只发现了一种转录抑制园子， 即x b p l 蛋白。它是一种分子量为7 2 k d 的蛋白质，属于s w i p m b p l p 转录因 子系列。它含有一个螺旋一转角一螺旋的结构片段，以结合d n a 分子。x b p l 基因启动子包含5 个重复的s t r e 序列、一个g s e ( 热激因子转录基因) 序 列和一个a r e ( y a p l 的结合位点) 序列。目前还不清楚具体是哪个转录因子 在调节着x b p l 基因的表达，但从其表达模式来看，该基因的表达可能是受 s t r e 因子控制的。迄今为止，氧化应激反应造成的某些蛋白的水平的下降是 由于转录抑制还是由于蛋白分解速度的提高尚无定论。虽然m a i 等人提出了 许多拥有x b p l p 结合位点的基因，但是实际上还并未鉴定到该转录调节因子 的目的基因。x b p l p 可能起到了抑制基因的表达从而使蛋白水平降低的作用。 鉴定x b p l p 的目的基因并确定其表达水平与氧化应激反应的关系将具有非常 重大的意义。 1 2 3 信号转导途径 目前，酿酒酵母氧化应激反应调节方式中的信号转导途径还有待于进一 步的研究。很明显，调节细胞内c a m p 水平的r a s 信号转导途径具有非常重 要的作用。c a m p 调控包括热应激、冷应激以及n 、c 源饥饿等在内的许多 的应激反应，细胞内c a m p 的水平影响着许多应激诱导基因( 如c t t l 、s s a 3 、 h s p 2 6 和h s p l 2 等) 的表达，当细胞内c a m p 水平下降时，这些基因即被活 化m “j 。当细胞由于缺乏腺苷酸环化酶而使c a m p 合成速度下降时，酒会启 动应激诱导基因的表达，增强细胞对多种应激环境的抗性作用。另外，许多 受m s n 2 p m s n 4 p 调节的蛋白也受c a m p 水平变化的影响，但c a m p 水平调节 m s n 2 p 和m s n 4 p 的活性的机理还有待研究。 1 2 4 氧化应激反应与其它应激反应问的关系 辐射、氧化还原活性药物、金属离子等都会引起酵母细胞发生各种应激反 应。研究结果表明，在酿酒酵母中，细胞的氧化应激反应与其它的应激反应之 间存在着明显的不同，但是各种应激反应间又存在着一定的交互作用。调节因 子s t r e 普遍存在于各种应激反应中，受其调节的基因产物是各种氧化应激环 境下必须的保护因子。 热激反应是一类研究得较为透彻得应激反应。对热激反应中所检测的5 0 0 个蛋白质样品的分析结果表明，有8 0 种蛋白质的合成受热激反应的诱导( 其 中2 0 多种蛋白质是主要的热激蛋白) ，而有3 0 0 多种蛋白质的合成减少，其中 合成受抑制的蛋白主要是核糖体蛋白。热激反应与氧化应激反应的交互实验表 明，热应激反应可以引起酵母细胞对h 2 0 2 的适应性应激反应，细胞受热刺激 后，对高浓度的h 2 0 2 具有更强的抗性，然而反过来用h 2 0 2 处理细胞却不能使 细胞获得对热应激的耐受性。 另外，酿酒酵母细胞的应激反应还与细胞的生长状态有关。当分批培养的 细胞达到稳定期的时候，与对数期相比，细胞对各种应激环境将产生很大的抗 性。有研究表明，g s h 在酵母细胞稳定期的应激反应过程中具有非常重要的作 用。 1 3 活性酵母细胞衍生物 1 3 1 活性酵母细胞衍生物及其诱导 1 3 1 1 活性酵母细胞衍生物 在研究应激反应的过程中，人们发现酵母细胞有很强的应激反应能力。 当它受到外界不良环境的刺激时，酵母细胞会很快合成许多保护性物质，以 抵御这些不良的刺激的伤害作用。人们把活的酵母细胞在人为控制的伤害条 件下所产生的保护性物质，称为活性酵母细胞衍生物( l i v e y e a s tc e l l d e r i v a t i v e ，l y c d ) 3 9 】。 1 3 1 2 活性酵母细胞衍生物的诱导 最初的l y c d 是从紫外光照处理过的酵母细胞中提取出来的。将酿酒酵 母置于2 8 6 n m 的紫外辐射之下，细胞可以产生一些能够增加细胞呼吸且促进 修复作用的未知因子，即为l y c d 。后来有人把亚致死剂量的乩0 z 加入到酵 母细胞中，处理后的酵母细胞经提取同样获得了l y c d 。g r i s t a i n g o d o n 等人 天津科技大学硕士学位论文 对此进行了深入的研究，他们利用二维凝胶电泳技术对酵母细胞在h 。0 ：的氧 化应激条件下产生的应激蛋白进行了分析。研究结果表明：在过氧化氢的刺 激下，至少有1 1 5 种蛋白被诱导生成，而同时有5 2 种蛋白的合成受到了抑制 h 。细胞受过氧化氢刺激而产生的应激蛋白可以分为七类： ( 1 ) 直接与细胞的抗氧化机制有关的蛋白质 这类蛋白质有很高的应激指数，是应激蛋白中非常重要的一类，包括主 要的抗氧化剂酶系，如超氧化物歧化酶、硫过氧化物酶、硫氧还蛋白、硫氧 还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶、细胞色素c 过氧化物酶以及细胞溶质过氧 化氢酶等。此外，在研究中还发现了另外四种与本类蛋白具有同样功能的蛋 白质：y d r 4 5 3 c 、y l r l 0 9 w 、y c l 0 3 5 和y o l l 5 1 w 。 应激蛋白y d r 4 5 3 c 是在酵母基因序列中发现的a h p c t s a 的同系物，它 利用硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和n a d p h 的传递电子作用来还原过氧 化物。蛋白y l r l 0 9 w 是另外一个与a h p c t s a 蛋白质同系的新型抗氧化剂， 作用与过氧化物酶体蛋白质极其相似，具有抵御叔丁基醇氢过氧化物的能力， 而且它还是一种依赖于n a d p h 的醛基还原酶和甘油脱氢酶。应激蛋白 y c l 0 3 5 具有谷氧还蛋白和硫醇基转移酶家族的氧化还原中心的特征，与谷氧 还蛋白非常相似。y o l i5 1 w 则类似于n a d p h 脱氢还原酶，与异黄酮类化合 物植物抗生素的形成有关。 ( 2 ) 热激蛋白 热激蛋白也有很强的应激指数，大多数的热激蛋白为伴随蛋白，在应激 条件下可促进异常蛋白的积累，从而使其折叠并促进蛋白水解物的降解，对 细胞产生保护作用。 ( 3 ) 蛋白酶及类蛋白酶体的次级单元本类蛋白也有较高的应激指数，但 低于前两种类型。 ( 4 ) 蛋白转移单位该类蛋白中除两种蛋白受过氧化氢的诱导生成外，其 余都为过氧化氢阻遏蛋白。 ( 5 ) 碳水化合物代谢酶类包括与磷酸戊糖途径、糖酵解途径、三羧酸循 环、甘油降解和海藻糖的合成有关的酶。 ( 6 ) 与硫、氨基酸、嘌呤代谢有关的酶类 ( 7 ) 功能未知型蛋白酶在应激条件下产生，但具体的作用还有待进一步 的研究。 1 3 2 活性酵母细胞衍生物的应用 1 3 2 1 酵母在化妆品中的应用 化妆品用生物制剂主要包括蛋白质、酶和辅酶、多糖、脂类、维生素、 核酸及其降解物等。它们的生产方法大致分为三种：从动物腺体中提取；从 海藻、各种植物及非动物器官中提取；从微生物培养液和微生物细胞中提取。 9 1 前言 在过去，许多化妆品活性成分都是以活性原则从动物腺体( 如胸腺、脾、胎 盘、大脑和肺) 和循环体系的血清、淋巴细胞中提取出来的。然而，由于动 物产品的不安全性以及动物保护组织的反对，愈来愈多的消费者反对将来源 于动物的产品应用于化妆品。这样，取自植物的活性成分在化妆品中的应用 大大增加，但是这种方法从成本的角度来考虑并不现实。因此，人们开始研 究酵母这种低成本、易操作的物质。 1 9 9 3 年，日本学者伊藤进提出把酵母细胞代谢物、线粒体成分和糖脂p s l 用于化妆品中。随着生物技术向化妆品领域的不断渗透，酵母的一些组分及 其代谢物、衍生物已逐渐应用于化妆品的开发和生产。在国外，目前已经有 许多以酵母及其衍生物为原料的化妆品问世，从啤酒酵母细胞壁中提取的葡 聚糖也被应用于抗衰老、防皱、增加皮肤弹性的高功能化妆品中。作为防衰 老和治疗慢性病的生物制剂，谷胱甘肽被加入到保健食品、健美饮料和功能 性化妆品中，而含有活性酵母衍生物的化妆品更是得到了极大的应用。 1 3 2 2l y c d 在化妆品中的应用 含有活性酵母衍生物的化妆品在防晒化妆品中应用很广，其主要作用是 降低和防止紫外线对皮肤的伤害作用。紫外线是指太阳中波长为2 0 0 - 4 0 0 n m 的电磁波，按波长般可分为三段：3 2 0 - - - 4 0 0 n m 的长波区似区，u v a ) ； 2 8 0 3 2 0 n m 的中波区( b 区，u v b ) ；2 0 0 2 8 0 n m 的短波区( c 区，u v c ) 。 在紫外线引起的辐射损伤中，u v b 的作用最大，占辐射剂量的8 0 9 0 ，可 造成皮肤的红斑反应、老化反应以及刺激黑色素的生成等多种伤害作用；u v a 的作用强度很弱，但穿透力强，而且伤害效应能够积累，可引起皮肤癌的发 生；u v c 能引起蛋白质和类脂体结构变性，干扰核酸代谢，大气臭氧层可以 吸收u v c 而降低它的破坏作用。 由于大气臭氧层遭到不同程度的破坏，太阳紫外线更严重地刺激和损伤 人的皮肤，而且随着人们生活水平的提高，出游的机会也越来越多，因此防 晒用品的需求也不断增大。另外，皮肤含水量的多少也是皮肤、丰满、亮泽 的关键。所以，保持皮肤水分，延缓皮肤衰老的皮肤保湿化妆品成为化妆品 市场中的重中之重。而活性酵母细胞衍生物正是满足防晒与保湿双重功效的 重要的化妆品添加荆。 l y c d 是一种特别有效、安全的活性成分，具有减轻伤害的作用。大量 毒理试验证明：l y c d 安全无毒，l y c d 的脂质体也同样具有高度的安全性。 实验表明，l y c d 能增加细胞的线粒体对氧的利用，促进细胞的呼吸和能量 代谢过程：l y c d 还具有加速胶原蛋白和弹性蛋白生成的能力，可以滋润并 更新皮肤细胞，增加皮肤细胞中毅生蛋白质对水分的吸收和促进对氧的利用， 使皮肤丰满，是奇特的保湿剂。 所以，l y c d 是一种具有强紫外吸收能力和促进细胞活性功能的化妆品 f o 天津科技大学硕士学位论文 添加剂，是配制具有消炎作用、专门用于预防晒后失水和促进晒伤皮肤重新 水合从而减少紫外伤害的新型化妆品的优良的生物材料，是晒后护理化妆品 中优良高效的生物添加剂。含活性酵母衍生物的护肤品在东南亚一带极为流 行。 1 3 2 3l y c d 在药品中的应用 痔疮是常见的一种疾病，给人们的生活带来了极大的痛苦和不便。l y c d 具有刺激血管形成和加速伤口愈合的作用，是一种治疗痔疮极为有效的药用 成分，早在二十世纪四十年代，人们就把l y c d 应用于治痔制品中，临床实 验研究表明该物质对痔疮有着良好的疗效。以l y c d 为主要成分的h 制剂是 一种效果显著的治痔制品，在临床上有着广泛的应用。另外，l y c d 还是一 种良好的治疗烫伤和机械损伤的药品添加剂，由l y c d 生产的药品对牛皮癣 等皮肤病也有良好的疗效。最近的研究发现，l y c d 对由紫外线引起的d n a 损伤具有修复作用，对鼓膜具有再生功能。目前，l y c d 的应用范围不断扩 大。美国已从药用级的活性酵母衍生物制得浓缩产品b i o f a c t o r s o m ，用于去 皱膏、疤痕净及婴儿护肤用品等产品的生产，从而将l y c d 的药用与美容作 用紧密的结合起来。 1 4 本论文研究的内容、目的和意义 1 4 1 研究内容 本论文主要研究内容是确定形成高活性l y c d 的h 。吼刺激条件，并对细 胞在应激反应中形成的重要的应激产物进行分析和测定，为探讨酵母细胞在 氧化应激反应及其它极端环境下的应激反应机理和l y c d 的发酵优化奠定基 础。具体的研究工作包括以下几个方面： ( 1 ) 破壁方法的确定。通过现有实验条件选择一种有效适宜的酵母细胞破 壁方法。 ( 2 1 菌株的选择选择一株在h 2 0 2 刺激下能产生高活性l y c d 的菌株。 ( 3 ) 确定l y c d 活性的检测方法及产生高活性l y c d 的最优条件。 (