（环境科学专业论文）脱氮硫杆菌去除地下水中硝酸盐氮的实验研究.pdf

t h e e x p e r i m e n t a ls t u d y o nt h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s r e m o v et h en i t r a t en i t r o g e ni ng r o u n d w a t e r a bs t r a c t i no r d e rt o s t u d y t h e 。i h i o b a c i l l u sd e n i t f i f i e a n sn i t r a t e n i t r o g e nr e m o v a l c h a r a c t e r i s t i c sa n df i n do u tt h eb e s ts u l f u rs o u r c e ，t a k eas e r i e so fe x p e r i m e n t s ，t r yt o r e m o v es u l f a t ei o n sg e n e r a t e db yt h er e a c t i o ni nt h eb a c t e r i au s et h e s u l f u rs o u r c e f o rd e n i t r i f i c a t i o np r o c e s sa tt h es a m et i m e t h ea t t t o t r o p h i cd e n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i a w a sc o n c e n t r a t e da n ds e p a r a t e df r o mt h r e ed i f f e r e n ts o i l ，s e l e c to n es t r a i nw i t ht h e h i g h e s td e n i t r i f i c a t i o nm e t a b o l i cc a p a c i t yt o o t h e re x p e r i m e n t s b a s e do nt h e a n a l y s i so fp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lm e a s m 。e m e n t s ，t h i ss t a i nw a si d e n t i f i e d w i t ht h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s c o m p a r i s o nt h ee f f i c i e n c yo fn i t r o g e nr e m o v a la n d d e n i t r i f i c a t i o ni nt h ep r e s e n c eo fp y r i t e ，t h i o s u l f a t ea n db r i m s t o n et od e t e r m i n et h e b e s t s u l f u rs o u r c e t h r o u g has e d e so fi n i t i a ln i t r a t e n i t r o g e n c o n c e n t r a t i o n e x p e r i m e n tt op r o v et h a tt h es t a i nh a v eah i g hd e n i t r i f i c a t i o nc a p a c i t yw h e nt h eb e s t s u l f u es o u r c ew a sa d d i n gi nt h e m e d i u m t r yt ou s et h es u l f u rs o u r c e l i m e s t o n e c o m b i n a t i o no fm e t h o d sa n da d dac e r t a i na m o u n to f l i m e s t o n ei nt h em e d i u mo f p y r i t ea sas u l f u rs o u r c e ，a n dt oo b s e r v et h ep r e s e r t c eo fs u l f a t ei nt h eb a c t e r i a t h e e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eh i g h e s tr e m o v a le f f i c i e n c yo fn i t r a t en i t r o g e ni si nt h e p r e s e n c eo fp y r i t e ，t h er a t ec a nr e a c h7 9 4 9 i nas e r i e so fi n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f n i t r a t en i t r o g e n ，b a c t e r i ac a nu s ep y r i t et od e n i t r i f i c a t i o na n dt h en i t r a t en i t r o g e n r e m o v a lr a t ec a l lr e a c hah i g h e rl e v e l w h e nt h e ：m e d i u mi n i t i a ln i t r a t en i t r o g e n c o n c e n t r a t i o nw a s2 0 0 m g l ，t h e r e m o v a l e f f i c i e n c yt a k et h eh i g h e s tr a t e a s 8 2 2 5 i nt h em e d i u mw i t hp y r i t e l i m e s t o n e m ，t h er e m o v a le f f i c i e n c yo fn i t r o g e n n i t r o g e nc a l lr e a c h7 6 3 3 ，d e s c r i p t i o nt h a tt h el i m e s t o n ea l m o s td o e sn o ta f f e c tt h e d e n i t r i f i e a t i o nm e t a b o l i cc a p a c i t y a n da tt h es a m et i m e ，t h es t r a i n sc a ne f f e c t i v e l y r e m o v et h es u l f a t ea n di tw a sa l w a y sc o n t r o l l e da tal o w e rl e v e l t h r o u g has e r i e s o fi n i t i a ln i t r a t en i t r o g e nc o n c e n t r a t i o ne x p e r i m e n tt op r o v et h a tt h es t a i nh a v ea h i g hd e n i t r i f i c a t i o nc a p a c i t yw h e np y r i t e l i m e s t o n e mw a sa d d i n gi nt h em e d i u m a n dw h e nt h ei n i t i a ln i t r a t e n i t r o g e n c o n c e n t r a t i o nw a s2 0 0 m g l ，t h er e m o v a l e f 五c i e n c yt a k et h eh i g h e s tr a t ea s7 8 5 3 a n dt ：h es u l f a t ec o n c e n t r a t i o n sc a nb e c o n t r o l l e da tal o w e rl e v e l ，t h es u l f a t ec o n c e n t r a t i o nw a sa l w a y sb ea b l et or e a c ht h e g r o u n d w a t e re n v i r o n m e n tt w oq u a l i t ys t a n d a r d s ，e v e n t u a l l yr e a c ht h ep u r p o s eo f r e m o v en i t r a t e sw i t h o u ta d d i n gi nt h es u l f a t ea sn e wp o l l u t i o n k e y w o r d s ：t h i o b a e i l l u sd e n i t r i f i e a n s ；p y r i t e ；d e n i t f t f i e a t i o n ；s u l f a t e ；l i m e s t o n e 致谢 在合肥工业大学攻读硕士研究生的这三年期，尊敬的导师钱家忠教授学习、 科研、思想、生活等方面都给予本人非常多的关心和帮助。学习上谆谆教导、 耐心解惑，指点了我的方向，科研上科学严谨，实施启发式教育，在给予我自 由发展的空间的基础上，时刻修正着我的方式方法，调动了我的积极性，培养 了我从事独立科研的能力；思想上尊重我们的意见，也积极鼓励我参加集体活 动，鼓励我保持思想上的先进性；生活上细心关照，注意着我的精神状态。在 本论文构思、撰写、审阅以及修改过程中，钱家忠教授投入了大量的时间和精 力，给予了中肯的意见，并提出了改善的建议。导师生活上的简朴、工作上的 兢兢业业、科研道路上的求真务实与开拓创新精神使我受益非浅，在此，谨向 导师钱家忠教授表示最衷心的感谢和最诚挚的敬意! 衷心感谢硕士研究生期间传道、授业、解惑的各位老师，我从学院各位老 师的授课中收获颇丰。也感谢学院提供的优良的硬件设施和科研环境，让我能 够心无旁骛的完成我的大论文。 感谢刘咏老师在研究方向的确定和实验设置方面给予的指导与帮助：感谢 师兄师姐们在学习和实验准备过程中带给我的启发；感谢我的同学王澄激、孟 磊、祝翠、高志强、杨丹丹三年来陪我一起努力，带领我共同进步；还要感谢 鹿少楠、黄辉、李赫男、陈冰宇、王潇、王沐、吴亚楠这些师弟师妹们，向他 们表示衷心的感谢! 我要把最诚挚的谢意献给我的母亲父亲，感谢他们在这三年的学习期间给 予我最无私的支援和鼓励，他们的支持是我最大的动力! 感谢论文评审委员和答辩委员会委员对论文的批评与指正! 作者：孙莹 2 0 1 2 年4 月 插图清单 图2 1 硝酸盐氮的标准曲线10 图2 2 硫酸根的标准曲线1 3 图2 3 不同来源菌株的硝酸盐氮的去除情况1 6 图2 4 不同来源菌株的硫酸根离子的生成情况1 7 图2 5 菌株的生长曲线1 9 图2 6 接入菌种与不接入菌种的培养基中硝酸盐氮浓度的变化情况2 0 图2 7 接入菌种与不接入菌种的培养基中硫酸根浓度的变化情况2 1 图3 1 菌株利用不同电子供体时硝酸盐氮去除情况2 4 图3 2 菌株利用不同电子供体时硫酸根生成情况2 6 图3 3 不同硝酸盐氮浓度下硝酸盐氮的去除情况2 8 图3 4 不同硝酸盐氮浓度下硫酸根的生成情况2 9 图4 1 添加石灰石的黄铁矿培养基中硝酸盐氮去除情况3 3 图4 2 添加石灰石的黄铁矿培养基中硝硫酸根生成情况3 4 图4 3 不同硝酸盐氮浓度下硝酸盐氮的去除情况3 6 图4 4 不同硝酸盐氮浓度下硫酸根的生成情况3 7 表格清单 表2 1 硝酸盐氮标准曲线实验结果1 0 表2 2 硫酸根标准曲线实验结果1 2 表2 3 不同来源菌株的硝酸盐氮的变化结果15 表2 4 不同来源菌株的硫酸根离子的变化结果1 6 表2 5 分离菌株生理生化实验结果总表18 表2 6 接入菌种与不接入菌种的培养基中硝酸盐氮的变化结果2 0 表2 7 接入菌种与不接入菌种的培养基中硫酸根的变化结果2 1 表3 1 含不同硫源培养基中硝酸盐氮浓度的变化结：果2 4 表3 2 含不同硫源培养基中硫酸根浓度的变化结果2 5 表3 3 不同硝酸盐氮浓度下硝酸盐氮的变化结果2 7 表3 4 不同硝酸盐氮浓度下硫酸根的变化结果2 9 表3 5 利用不同硫源反硝化代谢产生硫酸根理论和实际情况3 0 表4 1 添加石灰石的黄铁矿培养基中硝酸盐氮变化结果3 2 表4 2 添加石灰石的黄铁矿培养基中硫酸根变化结：果3 3 表4 3 不同硝酸盐氮浓度下硝酸盐氮的变化结果3 5 表4 4 不同硝酸盐氮浓度下硫酸根的变化结果3 6 前言 本文是在合肥工业大学创新群体计划项目( 2 0 0 9 h g c x 0 2 3 3 ) 的资助下完 成的。 近年来，如何利用自养反硝化菌去除地下水中硝酸盐氮污染成为了中外众 多学者广泛关注的问题。这一研究对如何快速有效地处理地下水硝酸盐氮污染、 维持良好的水环境具有理论和实验指导意义。此外，对自养反硝化细菌、尤其 是脱氮硫杆菌的研究还有助于发展在反硝化的同时同步脱除硫污染的工艺，减 少地下水净化步骤，并避免地下水引入新污染的新技术新方法。但是，自然界 含水层中物理化学环境复杂，故先利用实验室条件，对脱氮硫杆菌自养反硝化 能力进行试验，确定其具有脱氮除硫的能力。 脱氮硫杆菌进行脱氮反硝化代谢，需要一定的电子供体。而现在常用的电 子供体集中在硫代硫酸钠、黄铁矿、硫单质三者。其中黄铁矿由于其作为电子 供体时，脱氮硫杆菌具有较高的反硝化能力以及较高的硫回收率，现已逐渐成 为研究的重点。 但是，在研究中有学者发现，利用黄铁矿作为电子供体进行反硝化的过程 中，不可避免的产生了硫酸根新污染。为了去除这种新污染，并且使得脱氮硫 杆菌的反硝化能力保持在一定的水平，现尝试利用黄铁矿石灰石结合的方式来 进行反硝化反应。本文着手的主要工作有以下几个方面： ( 1 ) 从三种不同来源的土壤中各自分离提纯一株厌氧的自养反硝化细菌， 比较不同来源菌种的反硝化活性，选出活性最高的菌种，对其进行鉴定，并和 空白试验对比证明该菌种具有反硝化能力。 ( 2 ) 在三种不同硫源的存在下，对比该菌种反硝化能力的高低，确定最佳 硫源。并且对比在该硫源存在下、培养基初始硝酸盐氮浓度不同时，该菌种反 硝化能力的变化。 ( 3 ) 尝试在最佳硫源的培养基中加入石灰石，组合成硫源石灰石系统，研 究菌种在此系统中反硝化能力的高低，对比加入石灰石前后，菌种反硝化能力 是否受到影响，反应系统中的硫酸根离子是否被有效的去除。并且对比在该硫 源石灰石系统中、培养基初始硝酸盐氮浓度不同时，该菌种反硝化能力的变化。 ( 4 ) 总结本文不足之处以及还未解决的问题，提出了展望。 由于作者水平有限，实验室条件下的去除地下水中硝酸盐氮的反应条件比 较难以控制，文中难免有缺点和不足，请读者予以批评和指正。 第一章绪论 1 1 地下水硝酸盐氨污染情况以及除氨方法 地下水是十分重要的水资源，对人类的生存发展有着十分重要的意义。世 界上可供人类使用的淡水中，6 8 是地下水。然而地下水的健康状况却不容 乐观。长期以来，由于人类更为重视发展经济而轻视了水资源保护，导致地下 水污染日益严重，而硝酸盐污染是地下水污染中十分重要的一个方面。 1 1 1 地下水硝酸盐氮污染现状 农业化肥的使用、工业污水排放量剧增、农田大面积污灌，使江河湖泊及 浅层地下水中的硝酸盐氮污染严重【2 】。1 9 7 8 年以来，对我国5 0 个城市地下水 水质的监测数据表明，有2 1 个城市的地下水已经受到不同程度的硝酸盐污染 3 - 5 1 。张维理等【6 】通过对我国北方1 4 个县市的6 9 个调查点的水质监测发现，半 数以上城市的地下水超过饮用水硝酸盐的最大允许值，有的甚至高达3 0 0 m g l 。 地下水是大多数地区、尤其是我国北方地区饮用水的主要来源，大量硝酸 盐氮的存在会严重危害人类和动植物健康【_ 7 1 ，硝酸盐在人体内可被微生物还原 为有毒的亚硝酸盐，引发癌症【8 】，婴幼儿吸收高浓度的硝酸盐氮会引起高铁血红 蛋白症，严重时可能导致死亡【9 】，另外有一些研究还发现，硝酸盐引起实验动 物的心脏和行为方面的障碍【l0 1 。同时，水中硝酸盐浓度过高则会使鱼虾等水生 动物发生病变，导致大量经济方面的损失】。因此降低地表水和地下水的硝酸 盐氮的浓度是十分必要的。 1 1 2 地下水除氮方法 目前，按照硝酸盐污染的修复机理，去除地下水中硝酸盐的方法分为非生 物法f 1 2 】和生物法【1 3 】。其中非生物法主要有离子交换、反渗透和电渗析等方法， 这些方法只能将硝酸盐浓缩，并不能彻底将其除去，并且要花费高昂的处理费 用【1 4 】。生物法指利用反硝化细菌将硝酸盐还原为氮气。根据反硝化细菌的不同 类型，可以将生物反硝化分为自养反硝化和异养反硝化两类。 传统的除氮方法是先进行生物硝化处理后再进行异氧反硝化，在处理过程 中常因缺少电子供体，而外加有机物( 如甲醇、乙醇、醋酸等) ，这样做不仅增 加了有机物的投入，还会使处理系统中产生更多的污泥，增加了运行和处理的 成本，并且有引入新污染的可能。而自养反硝化作用由于其以无机物为电子受 体所以不会引入新的有机污染、无需投入有机碳源而降低了运行成本、适宜于 被污地下水源的原位脱氮处理等优点，近年来越来越受到人们的重视【l 孓1 8 】。 很多学者对地下水生物反硝化的碳源进行了探索和研究，提出了固态有机 碳源、固定化碳源、和生物反硝化墙【1 9 2 3 】等多种方法。但添加碳源会升高处理 成本，且存在后续污染的问题，而使用自养反硝化细菌则不存在这方面的问题。 2 一些细菌可以利用氢，无机亚铁等作为电子供体，进行脱氮反硝化，同时降低 含硫化合物浓度，达到同步除硫的效果。同时可利用无机碳( c 0 2 或碳酸氢根) 作为碳源来进行细胞的合成【2 4 。2 6 1 。专性自养的脱氮硫杆菌能够氧化硫和各种含 有还原铁的化合物来进行脱氮1 2 。 自养反硝化工艺是利用某些化能自养型微生物，如硫杆菌及氢细菌的特殊 性质进行脱硝。自养反硝化又能根据添加的电子供体不同，可分为氢自养反硝 化和硫自养反硝化。经自养反硝化处理后，出水具有水质好、生物污染低的优 点，因此近年来自养反硝化细菌、特别是脱氮硫杆菌在去除地下水硝酸盐污染 的应用方面引起了国内外学者们的广泛关注【1 7 ，2 8 】。刘玲花等【2 9 1 以脱氮硫杆菌接 种、以硫磺为电子供体、以石灰石作碳源和保持酸碱平衡，利用硫石灰石滤柱 去除地下水中硝酸盐氮，结果表明：进水硝酸盐氮浓度为2 5m g l 、水温为2 2 - - 2 4 时，1h 左右就能将进水中硝酸盐氮去除9 8 以上，出水中硝酸盐氮浓度 则可低至o 0 3m g l 。在后续处理时，以细沙滤：滤去细菌死亡产生的生物膜， 过滤后水浊度最高仅为1 1 2 度，能够达到饮用水水质标准。 1 2 脱氨硫杆菌的特性 1 2 1 脱氮硫杆菌的生理性能 脱氮硫杆菌( t h i o b a c i l l u sd e n i r i f i e a n s ) 属于硫杆菌属，革兰氏阴性化能自养 菌，是一种严格自养和兼性厌氧型细菌【3 0 1 。脱氮硫杆菌广泛的分布于河水，各 种矿水，海洋，污泥和土壤中。脱氮硫杆菌对高盐环境的适应性不强，如当硫 酸根浓度超过2 5 0m m o l l 时，由于总离子强度的升高其生长将受到抑制【3 。 迄今为止，人们已经证实硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) 有8 种【3 2 】：脱氮硫杆菌 ( t h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s ) 、排硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s ) 、那不勒斯硫杆 菌( t h i o b a c i l l u sn a p l e s ) 、氧化硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 、氧化亚铁硫杆 菌( t h i o b a e i l l u sf e r r o o x i d a n s ) 、新型硫杆菌( t h i o b a c i l l u sn o v e l l a s ) 、中间硫杆菌 ( t h i o b a c i l l u si n t e r m e d i u s ) 、代谢不全硫杆菌( t h i o b a c i l l u sp e r o m e t a b o l i s ) 。其中 脱氮硫杆菌是较为特殊的一个种，它能在胞外聚集单质硫，在厌氧条件下以硝 酸盐作为电子受体进行生长。脱氮硫杆菌为革兰氏阴性茵，细胞形态为短杆状， 长度约0 5 x ( 1 0 - - 一，3 o ) “m ，具有内褶结构，端生鞭毛，运动性强，专性自养， 兼性厌氧，最适p h 值为中性，在8 3 7 范围内均能生长，最适生长温度为2 8 3 0 ，是中温菌。 1 9 0 4 年b e n j e r i e 首先分离到脱氮硫杆菌( t h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s ) ，之后 b a a l s u r d 研究了它的生理特性【3 0 1 。脱氮硫杆菌广泛存在于土壤、淡水和海洋沉 积物、污水处理池中，特别是厌氧条件下能够大量生长。脱氮硫杆菌是化能自 养型细菌，在氧化硫化物的过程获得能量，并以硝酸盐为电子受体。因此，这 是一类在废水同步脱硫反硝化处理工艺中起主要作用的微生物。脱氮硫杆菌能 够利用的氮源范围很广，包括氨盐、硝酸盐、亚硝酸盐以及氨基酸等。在厌氧 条件下，硝酸盐因作为电子受体而被还原并生成氮气。在硫循环体系中，好氧 条件下，脱氮硫杆菌以氧为电子受体氧化还原硫化合物而获得能量。厌氧条件 下，脱氮硫杆菌以反硝化反应的方式同时参与硫、氮循环，以硝酸盐中的氧来 氧化硫化合物。 1 2 2 脱氮硫杆菌的相关应用 脱氮硫杆菌是一种专性自养和兼性厌氧型细菌。在好氧条件下可以将硫单 质和硫化物氧化为硫酸盐【3 3 1 。在厌氧条件下，利用硝酸盐作为电子受体，可以 进行自养反硝化。由于该菌株有脱硫反硝化的特性，近年来越来越多的研究利 用脱氮硫杆菌来抑制微生物腐蚀、从工业废气或者天然气中去除硫化氢( h 2 s ) 气体，去除受污染水体中的硝酸盐和废水同步脱氮除硫处理等应用。 在工业生产中，金属管线，外壳等常因为腐蚀而报废，造成高昂的经济损 失。在油田、矿场等处，由硫酸盐还原菌( s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i a ，简称s r a ) 异化硫酸盐还原为h 2 s 气体而引起的管线腐蚀日益严重。刘宏芳等【3 4 】的研究表 明，脱氮硫杆菌可以与s r b 共同生存，并且将其代谢产物h 2 s 气体和硫化亚铁 ( f e s ) 氧化成硫单质( s ) 和硫酸根离子( s 0 4 2 - ) ，即抑制还原性硫化物的积累，从而 抑制硫化物对金属管材所造成的腐蚀 s a n d b e c k 等通过向油藏中添加硝酸盐和亚硝酸盐等电子受体，改变微生物 生态条件，抑制了f e s 和h 2 s 气体的产生，消除了由f e s 和结蜡造成的堵塞， 油产量也有所提高。汪梅芳等【1 9 】采用静态挂片、交流阻抗法( e i s ) 等方法，研究 了q 2 3 5 钢在接种硝酸盐还原菌以及硝酸盐还原菌( s b r ) 和脱氮硫杆菌共存培养 基介质中的腐蚀行为；并借助扫描隧道显微镜、电子探针等表面分析手段，研 究了q 2 3 5 钢腐蚀过程中生物膜的形貌及致密程度的变化，生物膜中细菌的新 陈代谢产物。研究结果表明：s b r 的存在能够加速q 2 3 5 钢的腐蚀。若与脱氮 硫杆菌共存，则可以明显降低q 2 3 5 钢腐蚀的程度，因为脱氮硫杆菌的新陈代 谢能够消耗s b r 代谢的腐蚀性产物硫化物，使得侵蚀基体材料的硫化物减少， 从而达到抑制腐蚀的作用。 由于脱氮硫杆菌有脱硫的性质，近年来利用脱氮硫杆菌氧化二价硫、从沼 气或天然气中去除h 2 s 气体的研究十分活跃。李志章【35 】等研究了h 2 s 气体的生 物脱除，比较了光合硫细菌、排硫硫杆菌、脱氮硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌、异 养菌等多种细菌的脱硫效果和混合菌群的脱硫效果。何品晶1 3 6 等提出，接种纯 菌种的脱臭装置，其处理能力与脱除率比混合接种脱臭装置有明显的提高。在 此基础上，张承中【3 7 】通过将脱氮硫杆菌接种到生物滴滤塔上脱除h 2 s 气体，表 明该种细菌具有良好的缓冲和除臭的效果。 4 1 3 脱氮硫杆菌在去除硝酸盐氨方面的研究 1 3 1 脱氮硫杆菌脱氮除硫的研究 王爱杰等【3 2 研究了脱氮硫杆菌在废水脱氮、脱硫处理工艺中的应用，提出 了同步脱氮除硫的新技术，即控制适宜的条件，使硫化物氧化过程( s 厶一s o ) 和 硝酸盐还原过程( n 0 3 一n 2 ) 中的电子转移达到平衡，实现同步脱氮除硫并回收 单质硫的目标。并且说明了脱氮硫杆菌在有氧和无氧条件下的脱氮除硫代谢途 径、作用效果和关键影响因素。其中有氧条件下硫氧比( s 厶0 2 ) 是生物脱硫工艺 的重要控制指标，而在无氧的条件下，可以利用硝酸盐氮作为电子受体而达到 去除硫的目的。在此基础上，王爱杰等【3 8 】又进一步推出推导出脱氮硫杆菌同步 脱硫反硝化的化学计量关系式，并且提出硫氮比和硫化物浓度是影响同步脱硫 反硝化效果的关键因素。 车轩等【”】总结了脱氮硫杆菌利用硫代硫酸钠做硫源进行反硝化代谢的方 程式。方程式如下： 0 8 4s 2 0 3 2 + o 3 5 c 0 2 + n 0 3 。+ 0 4 3 h 2 0 + 0 0 9 n h 4 + + o 0 9 h c 0 3 一o 0 9 c 5 h 7 0 2 n + o 5 n 2 + o 0 9 h + + 1 7 s 0 4 2 。 从反应式可以得知，脱氮硫杆菌在二氧化碳的存在下，可以利用硫代硫酸 钠中的+ 2 价硫元素将硝酸盐氮还原成氮气排出：降低硝酸盐氮的污染，同时硫 代硫酸钠中的+ 2 价硫元素会失去电子，被氧化成+ 6 价的硫酸根离子。并且此 过程中还生成一定的氢离子，使得菌液的p h 值随着反硝化反应的进行而逐渐 下降。 1 3 2 脱氮硫杆菌利用硫单质去除硝酸盐氮的应用 脱氮硫杆菌在好氧条件下与一般硫杆菌相似，能将硫单质和亚硫酸盐氧化 为h 2 s 0 4 【4 0 1 。在厌氧的条件下，以单质硫和硫代硫酸盐作为电子供体氧化硫化 物而获得能量，同时还原硝酸盐氮为氮气，实现反硝化作用，达到同步脱氮脱 硫的效果1 4 。脱氮硫杆菌尤其适合处理同时含有高浓度硝酸盐氮和硫酸盐的污 水。 硫磺的主要成分是单质硫，且有少量钙、铁、铝、镁和微量硒、碲等元素。 外观为淡黄色脆性结晶或粉末，有特殊臭味。分子量为3 2 0 6 ，蒸汽压是0 1 3 k p a ，闪点为2 0 7 ，熔点为11 9 ，沸点为4 4 4 6 ，相对密度( 水= 1 ) 为 2 0 。硫磺不溶于水，微溶于乙醇、醚，易溶于二二硫化碳。目前，对于硫磺应用 于地下水脱氮的研究多集中利用硫石灰石自养反硝化系统的探索 1 8 , 2 9 , 4 2 】，对硫 磺直接作为脱氮硫杆菌作用的电子供体进行脱氮的方法则较为少见。 目前有研究者对硫磺石灰石自养反硝化( s i 。a d ) 系统做了较多的研究， k o e n i n g 1 8 j 利用s l a d 系统处理硝酸盐氮浓度高达4 0 0m g l 的垃圾填埋渗透液 污水，当水力停留时间为5 17h 时效果接近1 0 0 。早在1 9 9 1 年荷兰就已经建 成了s l a d 系统以处理硝酸盐氮。异养反硝化细菌需要提供碳源作为电子供体， 5 而以脱氮硫杆菌为代表的自养反硝化细菌在脱除硝酸盐氮时往往会出现p h 升 高的现象，为此任延丽【4 2 】提出了将自养反硝化细菌和异养反硝化细菌共同使用 以脱除水体中的硝酸盐氮。而刘玲花等【2 9 】以脱氮硫杆菌接种、以硫磺为电子供 体、以石灰石作碳源和保持酸碱平衡，利用硫石灰石滤柱去除地下水中硝酸盐 氮，结果表明：若硫石灰石滤柱的进水浓度为2 5m g l ( n 0 3 - n ) ，运行滤滤速 为1 5m h ，滤柱的运行周期为2 1d 时，则在运行周期内，硝酸盐氮的去除率 可高达9 8 。 张忠智等【3 l 】总结了脱氮硫杆菌利用硫单质做硫源行反硝化代谢的方程式。 1 1s + o 4 c 0 2 + n 0 3 。+ o 7 6 h 2 0 + o 0 8 n h 4 + 一o 0 8 c 5 h 7 0 2 n + 0 5 n 2 + 1 ，1 s 0 4 2 + 1 2 8 h + 从反应式可推论得知，脱氮硫杆菌在二氧化碳的存在下，可以利用硫单质 中的硫元素将硝酸盐氮还原成氮气排出，降低硝酸盐氮的污染，同时硫单质中 的0 价硫元素会失去电子，被氧化成+ 6 价的硫酸根离子。并且此过程中还生成 一定的氢离子，使得菌液中p h 值有所下降。而在硫源过量电子供应充足的情 况下，硫元素失去电子被氧化的产物中的硫元素可能不完全是+ 6 价。反应最初， 0 价的硫元素氧化不完全时可能会生成一部分含+ 4 价硫元素的亚硫酸根离子。 随着反硝化反应的继续进行，作为电子供体的硫单质逐渐被消耗，电子供应相 应不足时，+ 4 价硫元素也会被氧化为+ 6 价，亚硫酸根离子逐渐转化为硫酸根 离子。 1 3 3 脱氮硫杆菌利用黄铁矿去除硝酸盐氮的应用 黄铁矿的主要成分是f e s 2 ，熔点11 7 1 ，密度5 0g c m 3 ，在室温下为非 活性物质，温度升高后则变得活泼。空气中能够被氧化为三氧化铁和二氧化硫。 目前对黄铁矿的研究主要集中在矿山中黄铁矿的分布，以及对找矿的意义【4 3 】 上。另外对黄铁矿在选矿和浮选【4 4 j 中的研究也比较多。黄铁矿中的1 价硫元素 失电子被氧化，不仅能生成+ 6 价的硫酸根，在条件适宜的时候还可能生成0 价 的硫单质和+ 4 价的二氧化硫，而硫单质和二氧化硫能够继续被氧化，最终生成 + 6 价的硫酸根。 目前对利用黄铁矿去除硝酸盐氮的自养反硝化细菌的研究还比较少，自养 反硝化细菌脱除硝酸盐氮需要电子供体，而地下水中缺少氧气，且有机营养物 质匮乏，硝酸盐氮的去除常常受到电子供体不足的制约，因此需要额外添加电 子供体。张彦浩等【4 5 】提出了利用氢自养反硝化细菌处理硝酸盐污染的地下水。 万东锦等【4 6 】提出了利用硫自养反硝化去除地下水中硝酸盐。而利用黄铁矿作为 电子供体的在国内研究中还很少见。 国外一些学者已经进行了相应的研究，证明了天然的反硝化的发生是和地 球化学或是和黄铁矿氧化相耦合【4 7 。5 7 】，并总结了利用黄铁矿作硫源的反硝化反 应的表达式。 6 黄铁矿提供电子的反硝化反应的表达式为： 1 4 n 0 3 + 5 f e s 2 + 4 h + 一7 n 2 + 1 0 s 0 4 2 + 5 f e 2 + + 2 h 2 0 如果反应过程中f e 2 + 被氧化： n 0 3 + 5 f e 2 + + 6 h + 一1 2n 2 + 5 f e 3 + + 3 h ：z o 和黄铁矿氧化相耦合的反硝化反应整体的表达式为【5 8 】： n 0 3 。+ 0 3 3 f e s 2 + o 6 7 h 2 0 0 5n 2 + o 6 7 s 0 4 厶+ 0 3 3 f e ( o h ) 3 + o 3 3 h 十 从反应式可推论得知，黄铁矿中的硫元素可以作为电子供体将硝酸盐氮还 原成氮气排出，降低硝酸盐氮的污染。同时黄铁矿中的1 价硫元素会失去电子， 被氧化成+ 6 价的硫酸根离子，黄铁矿中的+ 2 价亚铁离子也可能被氧化，失去 电子生成+ 3 价的铁离子。并且此过程中还生成一定的氢离子，使得菌液中p h 值有所下降。而在硫源过量电子供应充足的情况下，硫元素失去电子被氧化的 产物中的硫元素可能不完全是+ 6 价。反应最初，1 价的硫元素氧化不完全时可 能会生成一部分0 价的硫单质和含+ 4 价硫元素的亚硫酸根离子，并且亚铁离子 的氧化也可能进行缓慢或暂时不发生氧化反应。随着反硝化反应的继续进行， 作为电子供体的硫铁矿逐渐被消耗，电子供应相对不足时，硫单质和亚硫酸根 中的0 价和+ 4 价硫元素也会被氧化为+ 6 价，生成硫酸根离子，同时+ 2 价亚铁 离子也会被氧化生成+ 3 价的铁离子。 现在国内外的研究主要集中在描述以黄铁矿作为硫源的反硝化反应，并评 估其可行性。并且对通过增加投入几种无机电子供体来提高自养反硝化，如零 价铁、亚铁离子、以及硫元素【5 9 币6 】的研究较多，由黄铁矿和其他硫化矿进行硝 酸盐还原的研究则相对较少【6 7 一们。在这些研究中，黄铁矿作为电子供体一直受 到质疑，只有约根森等【7 l 】圆满完成了反硝化与黄铁矿氧化的偶联。他们利用沙 质含水层中的沉积物进行了黄铁矿的反硝化实验，表明了黄铁矿的加入能够提 高硝酸盐还原率。 1 4 石灰石的应用 石灰石主要成分是碳酸钙( c a c 0 3 ) ，是一种使用十分广泛的建筑材料，也是 许多工业生产中重要的原料。 1 4 1 石灰石的理化性质 碳酸钙是一种白色粉末，无臭无味，放置在空气中不发生反应。几乎不溶 于水，不溶于醇，呈碱性，和酸性液体会发生中和反应。分子式为c a c 0 3 ，分 子量为1 0 0 0 9 ，熔点为1 3 3 9 ，相对密度为2 9 3g c m 3 。碳酸钙经过高温灼 烧可生成氧化钙，分子式为c a o 。氧化钙吸收水分后生成氢氧化钙，分子式为 c a ( o h ) 2 ，氢氧化钙微溶于水，会吸收空气中的二氧化碳生成碳酸钙。 碳酸钙在有水分存在时呈弱碱性，能和酸性物质发生中和反应。碳酸钙在 有二氧化碳和水存在的情况下水解生成碳酸氢钙。碳酸氢钙易溶于水，溶液呈 弱碱性，并具有一定的缓冲作用。 1 4 2 石灰石的脱氮除硫应用 石灰石投入酸性溶液中会发生一定的中和反应，使得一部分钙离子以游离 的形式进入溶液。当溶液中存在硫酸根时会生成硫酸钙沉淀，去除硫酸根污染。 邓荣喜等【7 1 】研究了石灰石石膏湿法烟气脱硫之液柱塔( d c f s ) 技术，发现 利用此法进行酸性废气脱硫具有脱硫效率高、适应性强、电耗相对较低，维护 简单方便等特点。蒋文等【7 2 】利用石灰石流化床反应器处理矿山的酸性废水，出 水p h 能够维持在中性左右，废水中硫酸根、+ 2 价、+ 3 价铁离子等也被大量的 除去，处理废水的效果明显。 脱氮硫杆菌进行反硝化过程中会产生氢离子，使菌液中p h 值随时间而迅 速降低，而该菌的最适生长p h 为6 8 7 左右【3 引，所以需要对菌液的p h 进行调 节。刘玲花等【2 9 】以脱氮硫杆菌接种、以硫磺为电子供体、以石灰石作碳源和保 持酸碱平衡，利用硫石灰石滤柱去除地下水中硝酸盐氮，取得了较高的去除率。 1 5 本课题的研究目的和意义 实验拟从三种不同来源的土壤中，各自富集分离筛选出一株具有脱氮反硝 化能力的菌株，并通过生理生化实验确定此菌株为脱氮硫杆菌。用三种菌种进 行反硝化实验，选择一种反硝化能力最强的分离菌株，证明其是否具有脱氮反 硝化的能力，并绘制该菌株的生长曲线。 利用上述实验筛选的脱氮反硝化能力较强的菌种，对比其分别利用过量硫 代硫酸钠、黄铁矿和硫单质作为硫源，去除地下水中硝酸盐氮的污染的差异。 得出该菌种反硝化代谢的最佳硫源，并通过实验确定在不同梯度的初始硝酸盐 氮浓度下该菌种的硝酸盐氮去除率。 在确定了该菌种反硝化代谢的最佳硫源后，为了去除反应中生成的硫酸根 污染，尝试在反应容器内加入过量的石灰石，对比加入石灰石前后的菌种反硝 化能力是否发生变化，并同时对比加入石灰石前后硫酸根的浓度，以确定该方 法是否能满足实验需求。 本实验通过检测水中硝酸盐氮浓度、硫酸根浓度研究脱氮硫杆菌脱氮除硫 的特性，此项研究有利于更加深入的掌握脱氮硫杆菌的反硝化能力。利用实验 证明其反硝化反应的最佳硫源为黄铁矿，并尝试用黄铁矿石灰石结合的方式同 步去除地下水中硝酸盐氮和硫酸根污染。并且利用其研究结果更好的处理地下 水，以评估此方法去除地下水中硝酸盐污染的可行性，并为进一步优化脱氮硫 杆菌脱氮除硫工艺提出有益的借鉴。 8 第二章脱氮硫杆菌的分离鉴定及其生长曲线 2 1 菌种的富集与筛选 2 1 1 培养基组成 基本培养基：五水合硫代硫酸钠5 0g ，硝酸钾2 0g ，碳酸氢钠1 0g ，磷 酸二氢钾2 0g ，六水合硫酸镁o 5g ，氯化钙i ) 0 0 5g ，氯化铵o 5g ，溶于 1 0 0 0m l 的去离子水，调节p h 到7 0 ，1 2 1 灭菌3 0r a i n 备用。 富集培养基：按2 倍于基本培养基配制，1 ：2 1 灭菌3 0r a i n 备用。 平板培养基：基本培养基中添加1 8 的琼脂，煮沸后1 2 1 灭菌3 0r a i n 备用。 2 1 2 菌种的富集与分离 选取三个地方的土壤作为脱氮硫杆菌的富集土壤，分别为合肥工业大学南 校区斛兵塘河底土壤、合肥工业大学南校区住宅区旁下水道内土壤和合肥工业 大学南门旁污水池土壤。 在上述三个地点，分别取地表下2 0c m 处土壤l og ，加入含1 5 0m l 富集 培养基的锥形瓶中，并以石蜡封住液面，密封放入培养箱中2 8 下培养7d 。 待锥形瓶中出现大量气泡，溶液非常浑浊后，进行划线涂布平板，2 8 下放 入厌氧箱充以9 5 的c 0 2 和5 的n 2 培养，如f 此反复直至显微镜下只能观察 到单一的目的菌。将纯化菌种进行液体培养并穿刺保存，备用。 2 1 3 不同来源菌株活性的研究 挑取分离纯化的不同来源的菌株进行培养。活化两天后，按接种量1 0 接 种到内含1 0 0m l 基本培养基的锥形瓶中，2 8 下放入厌氧箱充以9 5 的c 0 2 和5 的n 2 进行新一轮的液体培养，并测定各锥形瓶中初始的硝酸盐氮和硫酸 根浓度。培养7d 后，取样测定其中的硝酸盐氮和硫酸根浓度，与初始的硝酸 盐氮和硫酸根浓度比较后确定各来源的菌株的活性大小。 2 1 4 硝酸盐氮浓度的测定 论文中硝酸盐氮的浓度均使用双波长紫外分光光度法【7 3 。7 4 1 测定。 2 1 4 1 仪器与试剂 ( 1 ) 仪器： 紫外分光光度计，5 0m l 比色管，1 0m m 比色皿，移液管。 ( 2 ) 试剂： 1m o l l 盐酸溶液：取8 3m l 浓盐酸，用去离子水稀释至1 0 0m l ； 硝酸盐标准贮备液：称取o 7 1 2 8g 经干燥的优级纯硝酸钾( k n 0 3 ) 溶于水， 移入1 0 0 0m l 容量瓶中，稀释至标线，该标准贮备液每毫升含0 1 0 0m g 的硝酸 盐氮。 9 2 1 4 2 标准曲线和样品检测 校准曲线的绘制：取6 只5 0m l 比色管，用移液管分别加入硝酸盐氮标准 使用液0 、0 2 5 、0 5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0m l ，加水至约4 0m l ，加入lm l1m o l l 的盐酸，稀释至标线，混匀，此时比色管中溶液硝酸盐氮浓度分别为：0 、0 5 、 1 0 、2 0 、3 0 、4 0m g l 。以1 0m m 比色皿在紫外分光光度计上，用去离子水 作参比，分别测定水样在2 2 0 衄及2 7 5n m 波长处的吸光度。并根据a 2 2 0 与二 倍a 2 7 5 的值之差a r 对浓度作图，绘制标准曲线。 校正吸光度a r 的计算公式为：a r = a 2 2 0 2 a 2 7 5 。 水样的测定：取经过双层滤纸过滤的水样1m l 于5 0m l 比色管中，加入1 m llm o l l 盐酸溶液，用去离子水定容。以1 0m m 比色皿在紫外分光光度计上， 用去离子水作参比，分别测定水样在2 2 0n n l 及2 7 5n l n 波长处的吸光度。并根 据a 2 2 0 与二倍a 2 7 5 的值之差舡的值，在标准曲线上查出相对应硝酸盐氮的浓 度m ，进行换算得出水样中硝酸盐氮的浓度c 。 硝酸盐氮浓度计算公式：c = m vx1 0 0 0 。 式中：c 一一水样中硝酸盐氮浓度( m g l ) ； m 一一依校正吸光度值心从标准曲线上查出的相应硝