（环境科学专业论文）苯类化学品对典型海洋浮游生物的毒性研究.pdf

r e s e a r c ho nt o x i c i t yo f b e n z m o i dc h e m i c a l so nt y p i c a lm a r i n ep l a n k t o n a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fe c o n o m y , t h es h i pt r a n s p o r t a t i o nh a sb e c o m et h ec e n t e r f o rt h ed e v e l o p m e n to fe c o n o m y t h et r a n s p o r t a t i o no fc h e m i c a li si n c r e a s i n g t h e s e a c c i d e n t s s e r i o u s l ye n d a n g e t sm a r i n e e n v i r o n m e n to w i n gt o p a r o x y s m a l ，h i g h c o n c e n t r a t i o ne ta 1 t h ec o m p r e h e n s i v eq u a n t i t a t i v ea s s e s s m e n to fd a m a g et of i s h e r y a n dm a r i n eb i o l o g i c a lr e s o u r c e sr e s u l t i n gf r o mo i lo rc h e m i c a ls p i l li sv e r yi m p o r t a n ti n t h ep r o c e s so fm a r i t i m ea r b i t r a t i o na n dc l a i mf o rc o m p e n s a t i o n b u tt h en e e do fm a r i n e b i o l o g ye f f e c t i v ed a t a i su r g e n t s or e s e a r c ho na c u t et o x i c i t yt e s to fb e n z m o i d c h e m i c a l sa r eb e c o m i n gi m p o r t a n ta n dh a v i n gp r a c t i c a lm e a n i n g s t a n d a r dt e s t sm e t h o d sh a v eb e e nc o n s u l t e d u s i n gt h em e t h o do fp r o b a b i l i t yu n i t t od a t ap r o c e s s i n g ，t h eo r d e ro ft h e i rt o x i c i t yt oc h l o r e l l as p i sf o l l o w e da s ： c h l o r o b e n z e n e n i t r o b e n z e n e t o l u e n e a n i l i n e p h e n o l b c n z e n ea n d9 6 h e c 5 0a s l 8 0 1 、 2 2 2 5 、4 4 8 5 、4 7 6 4 、8 3 0 0 、1 1 0 0 0 m g l ；t h eo r d e rt oa r t e m i as a l i n a i sa n i l i n e n i t r o b e n z e n e c h l o r o b e n z e n e t o l u e n e p h e n o l b e n z e n e a n d4 8 h l c s 0f o l l o w e d a s o 7 3 、1 3 1 1 、1 4 7 2 、2 0 0 2 、2 3 2 6 、4 0 2 2 m g l t h er e l a t i o n s h i p so fd o s e - e f f e c ta n d i n h i b i t i o n - t i m ew i l lb ef o u n d s i m u l a t ea c c i d e n ta n dr e s e a r c hs h o r t - t i m ea c u t et o x i c i t y t h i sp a p e rs i m u l a t e sa c c i d e n ta n dr e s e a r c hs h o r t t i m ea c u t et o x i c i t y , a n df i n d s a n i l i n ei sm o s tt o x i c i t yt o a r t e m i a ，a n db e h a v e st o x i c i t yi n6 h s t u d y o fj o i n tt o x i c i t yb a s e do nt h es i n g l et o x i c i t y , i n j o i n tt o x i c i t ys t u d y , t w o ， t h e r eo rf o u rc h e m i c a l sa r em i x e d u s i n gt o x i c i t yu n i ta n da d d i n ge x p o n e n ta r ea d a p t e d t oe s t i m a t et h et o x i c i t yo fj o i n t ，f o r m a to fj o i n tt o x i c i t yi sf o u n db ea d d i n ge f f e c t i no r d e rt oe x p l a i nt h et o x i cm e c h a n i s m ，i ts t u d i e dt h et o x i c i t ye f f e c to fe a c h c h e m i c a lf o rc h l - aa n dp r o t e i na n df i n d st h a tc h l o r o b e n z e n eh a st h em o s tt o x i c i t yt o c h l - aa n dp r o t e i n ，b r i n g i n gm u c hp h a e o p h y t i na n de f f e c t i n gp h o t o s y n t h e s i se f f i c i e n c y f i n a l l yr e s e a r c ho nt h es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ，a n df o u n dt h ec o n n e c t i o n b e t w e e nm o l e c u l ep a r a m e t e r sa n dt o x i cd a t a ，i e i tg o tt h eq s a r e q u a t i o n ： l o g l e c 5 0 = 0 2 5 9 1 0 9 k 。+ o 0 6 5 5n o 7 0 2 ( n = 6 ，r = o 8 8 8 ，p = 0 0 3 8 苯胺 苯酚 苯。 1 3 2 联合毒性研究 a 联合作用类型的划分 最早提出联合作用理论的是b l i s s ，他在1 9 3 9 年研究两种毒物联合作用时首次 提出了“拮抗作用、加和作用、协同作用”的划分。关于联合作用的划分方法， 目前较为公认和普遍采用的主要包括以下四类： ( 1 ) 独立作用( i n d e p e n d e n te f f e c t ) ：也称无相互作用( n oi n t e r a c t i o n ) ，是指 同时存在的有害因素以不同的作用方式产生毒性效应，即各毒物对机体的入侵途 径、靶位的作用机理等均不相同，产生的生物学效应彼此无关，互不影响。 ( 2 ) 协同作用( s y n e r g i s t i c e f f e c t ) ：也称增强作用( p o t e n t i a t i o n ) 、大于相加( m o r e t h a na d d i t i v e ) 或超相加( s u p r a a d d i t i o n ) ，它是指总效应大于各有害毒物单独作用时 的总和。这可以解释为一种物质的毒性被另一种物质所增强。协同作用对环境安 全有重大威胁，也使得利用联合毒性研究成果评价化学潜在毒性及制定某些元素 的背景值具有重要意义【3 1 1 。 ( 3 ) 加和作用( a d d i t i o n ) ：也叫亚相加作用，是指总效应等于各有害因素单 独作用时的总和。这种联合作用中的各化学物质的结构比较接近，或属于同系物， 它们作用于机体的同一部位或组织的毒性作用近似，作用机理也类似，如按一定 比例用一种化学物质代替另一种化学物质，其混合物的毒性不改变【3 2 】。 ( 4 ) 拮抗作用( a n t a g o n i s t i ce f f e c t ) ：也叫照相加作用，指总效应小于各有害 化学物质单独作用时效应之和，即毒性效应被两种或两种以上污染物的交互作用 降低。 b 联合作用类型的评定 从b l i s s 提出联合作用以来，已出现了许多种评价联合作用的方法，每种方法 都有各自的特点。下面介绍三种文献中使用较多的评价方法。 ( 1 ) 毒性加强指数( t e l ) 法1 3 3 l 以两种化学物质的联合毒性作用为例，具体程序如下：1 ) 分别测定a 、b 两 个化学物质的e c 5 0 ：2 ) 将a 、b 按等毒性比例混和。即：根据单一组分的e c s o 计算出各自的加入量，使每一组分对混合物毒性的贡献相同；3 ) 测定a 、b 混合 物的e c 5 0 ；4 ) 按下式求混合物的预期e c 5 0 ( 假定是相加作用) e c 5 o q 。e c s o a + e c s o b + + e c s o n ( 1 1 ) 式中a 、b n 代表混合物的各化合物；a 、b 1 3 分别为化学物质a 、 b 、n 在混合物中所占重量比。所以a + b + + n = 1 。 如果预测e c s o 。p 实测e g 0 0 b 。，则t e i = 预测e c 5 一实测e c s 0 0 b s 一1 ； 如果预测e c 5 0 唧 0 时为协同作用；t e l = 0 时为加和作用；t e l 1 0 ，a i = 1 一s 。当a i = o 时为相加作用；a i 0 时为协 同作用；a i 一0 6 ；2 ) 五个以上的试验浓度组；3 ) 在试验中要有试验组出现抑制率3 7 和 6 3 的各一组；4 ) 受试毒物在试验结 束时损失不应超过2 0 ；5 ) 试验环境洁净，无污染。各项试验均要重复，用同 种稀释水同种毒物同一试验得到的两次急性毒性结果之间的差异不应大于2 倍。 2 3 8 试验步骤 ( 1 ) 藻种的预培养 试验前两周将保存的藻种转移到三角瓶中进行扩培养和驯化培养，记录每天 的生跃速度，用血球计数板在显微镜下细胞计数，并用7 2 1 型分光光度计在波长 5 4 0 n m 删下测定吸光度，作生长曲线并建立细胞个数和吸光度之间的线性方程。 ( 2 ) 试验步骤 a 预试验 按照藻类急性毒性试验的标准方法进行预试验，选择间隔较大的浓度1 ，1 0 ， 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，3 0 0 m g l ，同时设1 个空白对照组，观察2 4 9 6 h ，找出1 0 0 q 制浓度( 绝对抑制浓度，即e c l o o ) 和无抑制浓度( 最大耐受浓度，即e c o ) 。如 果所设浓度均未出现1 0 0 抑制，说明浓度设置偏低，需要提高浓度，直至出现 1 0 0 抑制；若所设浓度均出现1 0 0 抑制，说明所设浓度偏高，以最低浓度作为 下一次试验的最高浓度。根据预试验所得出的浓度来确定正式试验所用的浓度。 b 正式试验 根据预试验的结果按等对数间距设置5 个处理组和1 个空白对照组，每组2 个或3 个平行样。 2 3 9 数据处理方法 ( 1 ) 目前常用的抑制率及e e 5 0 的计算方法 在对藻类毒性试验结果的统计过程中，应用不同的统计方法，所得出的e c s o 值也 存在一定差异，而且e c 5 0 值的得出主要取决于藻类生长的抑制率。就所查到的统 计方法进行了归纳，总结为三大类：面积法、生长速率法和相对数量法。 a 面积法 o e c d ( 1 9 8 4 ) z o 】化学品试验准则“藻类生长抑制试验”( 2 0 1 ) 和e p a ( 1 9 9 6 ) 1 7 2 j 生态效应试验准则“藻类毒性试验”( o p p t s8 5 0 - 5 4 0 0 ) 中提到的统计方法为： 将测定时间及各处理组和对照组的细胞浓度列表，以细胞浓度的平均值为纵 坐标，以测定时间为横坐标绘制藻类生长曲线。根据生长曲线所包围的面积求抑制 率和e c 5 0 。 生长曲线下面积可以用下面的公式计算： 一= 下s , - n o 即t m + n 2 - 2 s o 吣f 1 ) + 半吣( 2 1 ) 式中：a 一生长曲线所包围的面积；o 一如时刻藻类的起始细胞数( 个m 1 ) ；n z f l 时刻藻类的起始细胞数( 个m 1 ) ；n f n 时刻藻类的起始细胞数( 个m 1 ) ；t l 一试验开始后第一次测定时间；“一试验开始后第n 次测定时间。 每一处理浓度下的藻类细胞生长抑制百分率( 1 。) 用下列公式计算： i a ；坦1 0 0 ( 2 2 ) 4 式中：厶一第一浓度下藻类细胞生长抑制百分率( ) ；a 。一对照组生长曲线 所包围的面积；a ，处理组生长曲线所包围的面积。 根据藻类细胞的生长抑制曲线，求出抑制率i a = 5 0 肘对应的被检物质浓度 e c s o ，这种方法求出的e c s o 用e e c 5 0 ( 0 7 2 h ) 表示。其他e c 值，如eb c l o ，也可 以根据对应的浓度对数值求出。 b 生长速率法 由于藻类细胞的生长繁殖是呈指数型的，因此在o e c d ( 1 9 8 4 ) 1 0 1 化学品试 验准则中还提到根据生长速率和生长抑制率求e c 5 0 。平均比生长速率( 口) 可用 下列公式计算： “；l n n , - l n n l( 2 一3 一) “= 一 l j t n t l 式中：l 一1 时刻的细胞数：n t 时刻的细胞数。 抑制率( ) = 竺出x 1 0 0 ( 2 4 ) p 。 式中：u 。一对照组的比生长速度；f 。一处理组的比生长速度。 然后求出与抑制率= 5 0 相对应的被检物质的浓度，即e c s o 。为明确表示这种 方法求出的e c 5 0 值用e ，c 5 0 表示。 c 相对数量法 目前，国家环保局和国内许多学者都是根据相对藻类数量求抑制率和e c h o 。 按下列公式计算抑制率1 7 3 , 7 4 1 ： 删率肛一0 0 告甍x 1 0 0 ( 2 s ) 式中：j v 0 一处理组第n 次测定时藻细胞数；m o 一处理组初次测定测定时藻细胞数： c 。一对照组第n 次测定时藻细胞数； 一对照组初次测定时藻细胞数。 e c 5 0 的计算有两种方法一是根据抑制率和浓度的自然对数求e c 5 0 1 7 ，建立抑 制率但) 和浓度的自然对数( l n c ) 的线性关系，求解抑制率为5 0 的浓度e c 5 0 值。另一种是根据抑制率概率单位值和浓度对数求e c 5 0 1 3 4 1 ，以各处理组的浓度对 数为因变量( y ) ，以抑制率的概率值为自变量( x ) ，绘制曲线：y = a x + b ，求e c s o 值。当y = 5 时计算e c 5 0 值。为了保证计算结果的可信度，对浓度对数与机率单 位之间的剂量反应方程进行r 检验。 目前使用较多的是第三种方法，因此本文主要参照该方法。 1 9 以上三种方法均以细胞数计算，而显微镜计数法比较费时费力，结果准确性 受人为因素影响较大。测定吸光度的方法简便，而且可以多测几次取平均值，准 确性相对较高，藻类毒性试验中大多选用此方法，但是没有明确证明这种测定吸 光度的方法的可行性。通过试验证明可以用吸光度代替细胞数直接求解抑制率。 ( 2 ) 用吸光度代替藻细胞个数进行研究的可行性 在本实验中选用的小球藻个体小，在水体中均匀分布，可以用吸光度来代替 细胞个数进行研究，下面将给出证明： 当营养物质丰富、而又没有其它限制因素时，藻类的繁殖是相当快的，特别是 单细胞藻类。藻类的繁殖细胞数可由下列函数表示【卅： 百d n 一，( ) 式中：一细胞数；f 一时间。 细胞增加的速度与初始细胞数成正比，即 d n k n d f 式中：k 一繁殖常数。 将上式积分并取以1 0 为底底对数，则有： l 。8 瓦n - l o g k t k r 由于藻类在对数生长期底生长曲线为一条直线，生长曲线底斜率即是繁殖常 数，并且k 可通过试验求得。繁殖常数的计算公式为： n i l - 。g 簧c t 一，怎s “s ， 那么第t 天的藻细胞数目为：n ( t ) - n o x l 俨 ( 2 6 ) 藻细胞个数与光密度之间存在线性关系已被众多研究者证实，一般表示为 y = k x + b ( 2 7 ) 其中y 表示细胞个数即为( 2 6 ) 式中的n ( r ) ；工为光密度，一般以吸光度表 示；k 为斜率；b 为截距，一般 ， b 。那么将( 2 7 ) 式带入( 2 6 ) 式中得到 k x + b f f i ( k x o + b ) x 1 0 r ( 2 8 ) 2 0 b 因为k b ，所以i 一0 ，整理后上式为 工= x n 1 0 k ( t = 1 ，2 ，3 ，4 ，5 ) ( 2 9 ) ( 2 9 ) 式与( 2 6 ) 式相比较看出可以用吸光度代替藻细胞的个数进行研究。 由此可见，对于个体小且分布均匀的藻类是可以只测定吸光废进行研究的，既简 单又省时省力。 ( 3 ) 小球藻生长抑制率的计算公式 通过分析可以用下式求解抑制率： 擗幛特”等老) 1 0 0 ( 2 1 0 ) 式中：a 。一处理组第1 i l l 测定的藻液吸光度；a 。一处理组o h 测定测定的藻液吸光 度；一。一对照组第n h 测定的藻液吸光度；a 棚一对照组0 h 测定的藻液吸光度。 在本试验中取对照组和处理组的o h 吸光度相等，如果处理组的吸光度小于初 始的吸光度，认为抑制率为1 0 0 。 ( 4 ) e c 5 0 的求解方法 采用概率单位法求e c 5 0 值，求解步骤如下： 1 ) 将各处理组的浓度转换为对数形式，作为因变量( y ) ； 2 ) 查死亡率一概率单位转换表( 见附录1 ) ，得出对应抑制率死亡率的概率 单位值，作为自变量( x ) ； 3 ) 绘制浓度对数与概率单位的剂量一效应曲线：y = a x + b ； 4 ) 取y = 5 ，计算z 值，然后求盖的反对数即为e c s a l c 5 0 值。 5 ) 为了保证计算结果的可信度，对浓度对数与概率单位之间的剂量方程进行 r 检验，f 的计算公式如下： 2 ( r - r i ，p ，) 2 习 式中：n 一某组试验动物数；，一某组死亡动物数；p 一期望死亡百分数。 自由度n = k 一2 ，其中k 为试验浓度组数。由自由度n 查附录2 ，比较查得 的碥。和计算得出的f 值，如果j 岛酊) r ，则所做回归线完全符合要求，反之 应重做回归线，并继续进行f 检验。 2 4 卤虫试验 卤虫( a r t e m i as a l i n a ) ，选用的是天津英伟公司提供的卤虫休眠卵，经2 4 。c 、 2 0 0 0 i x 和盐度为3 5 的人工海水条件孵化3 0 - - 4 8 h 得到的无节幼体。 2 4 1 试验设备 充气泵：日光灯；照度计；p h 计；温度计；超声振荡仪；恒温水浴锅；5 0 m l 具塞比色管：烧杯；胶头滴管；烘箱；通风橱及实验室一般常用设备。 2 4 2 试验试剂 氯化钠n a c i 氯化钾k a ；氯化钙c a c l 2 2 h 2 0 ；氯化镁m g c l 2 6 h 2 0 ； 硫酸镁m g s 0 4 7 h 2 0 ；碳酸氢钠n a h c 0 3 ；烘箱；冰箱；日光灯架等。 2 4 3 试验条件 孵化温度为2 4 + 24 c ，使用恒温水浴锅；培养温度为2 4 2 ，空调控温。光 照及仪器的清洗见2 3 3 节。 2 4 4 培养液 卤虫试验所用培养液为人工海水，具体配方如下： n a c l k c l c a c l 2 2 h 2 0 m g c l 2 6 h 2 0 m g s 0 4 7 h z o n a l l c 0 3 2 4 7 2g l 0 6 7 9 l 1 0 3 9 l 4 6 6 9 l 6 2 9e , l 0 1 8 玑 把上述各种盐溶解在少量去离子水中，再加碳酸氢钠，最后用去离子水稀释 到1 0 0 0 m l ，p h 值在7 8 8 0 之间。 2 4 5 试验方法 参照困家标准“船舶散装运输液体化学品危害性评价规范水生生物急性毒性 试验方法( g b t1 6 3 1 0 1 - - 1 9 9 6 ) ”1 7 5 j ，并参考周永欣等【冽的方法设计试验，设置 7 个处理组和1 个对照组，每组设3 个平行样，使用5 0 m l 具塞比色管为试验容 器，试验溶液体积为5 0 m l ，每个容器放1 0 个幼体，试验周期为4 8 h ，2 4 h 换液 一次。试验期间不投饵。每一试验至少2 次重复，反应终点为4 8 h l c 5 0 ( 死亡+ 不 动) 。在试验期间对照组未出现死亡。 2 4 6 实验质量控制 1 ) 对照组死亡率1 0 ，生物体健康；2 ) 水中溶解氧含量d o 6 0 饱和值； 3 ) 污染物的受试浓度等对数稀释比o 6 ；4 ) 五个或五个以上的处理浓度组：5 ) 在试验中要有处理组出现死亡率3 7 和6 3 的一组；6 ) 受试毒物在试验结束 时损失不应超过2 0 ；7 ) 试验环境洁净，无污染。各项试验均要重复，用同种 稀释水网种毒物同一试验得到的两次急性毒性结果之间的差异不应大于2 倍。 2 4 7 试验步骤 试验步骤同小球藻单一物质急性毒性试验。 2 4 8 数据处理方法 卤虫死亡率计算公式 死亡率= 等1